CN105372370A - 一种红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭iii的检测方法 - Google Patents

一种红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭iii的检测方法 Download PDF

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CN105372370A CN201510819130.2A CN201510819130A CN105372370A CN 105372370 A CN105372370 A CN 105372370A CN 201510819130 A CN201510819130 A CN 201510819130A CN 105372370 A CN105372370 A CN 105372370A
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Abstract

本发明涉及植物有效成分质量研究技术领域，尤其涉及一种红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：(1)制备供试品溶液：将红豆杉枝叶用有机溶剂浸泡超声，过滤，得到供试品溶液；(2)制备对照品溶液：用有机溶剂配制10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品，过滤，得到对照品溶液；(3)检测方法：用高效液相色谱对步骤(1)得到的供试品和步骤(2)得到的对照品进行检测。本发明的检测方法在准确度、精密度、线性范围、中间精密度、耐用性和溶液的稳定性等方面均能达到要求，采用的分析方法科学、合理，且所述方法相比于现有方法更快速、简便、有效，解决了基线波动较大的问题。

Description

一种红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭III的检测方法
技术领域
本发明涉及植物有效成分质量研究技术领域，尤其涉及一种红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的检测方法。
背景技术
10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)为红豆杉中有抑制肿瘤作用的紫杉烷萜类化合物。它同时是合成多西他赛和紫杉醇的重要原料。紫杉醇是具有抗癌活性的天然二萜类化合物，其结构新颖、抗癌机理独特、抗癌效果显著、抗癌谱广，对转移性卵巢癌和乳腺癌具有很好的治疗作用，并且对肺癌、食管癌也有一定疗效，因此紫杉醇被认为是迄今所发现最好的抗癌药物之一，已在40多个国家被批准上市。然而，紫杉醇供应匮乏大大限制了它在临床上的应用。
目前，药用紫杉醇的主要来源是从天然红豆杉属植物的根部中提取分离。但由于该种属植物数量少，生长慢，含量低，且提取难度颇大，从长远考虑根本无法满足日益增长的临床需求。近年来，紫杉醇类化学半合成是具有实用价值的一种制备方法，该方法是以红豆杉属植物(以枝叶为主)中提取分离的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)为前体，通过几部反应得到紫杉醇，其中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)为前体的半合成紫杉醇已占据紫杉醇销售总量的2/3。
目前，已有研究者研究了红豆杉中测定10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法，CN103808850A公开了一种红豆杉中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的薄层色谱检测方法，所述方法包括如下步骤：(1)10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品溶液制备；(2)样品溶液制备；(3)薄层色谱检测，该方法虽然检测简单，但是检测不准确，只能进行半定量检测，不能够准备知道10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量。浙江大德药业集团有限公司研究人员建立红豆杉中10-DAB的含量测定(《现在中药研究与实践》2013年第27卷第5期11-13页)，但是运用该方法在含量检测时，供试品溶液处理时间比较长，并且洗脱方式为梯度洗脱，影响基线的波动较大，影响了10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量测定。
因此有必要进一步研究更有效的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量测定方法，新方法的建立可以帮助我们快速、准确获知红豆杉中10-DAB有效含量，便于我们大规模从红豆杉枝叶提取10-DAB。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的检测方法，所述检测方法检测时间短，检测限低，操作简单且能够准确的测量红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的含量。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：将红豆杉枝叶用有机溶剂浸泡超声，过滤，得到供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：用有机溶剂配制10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品，过滤，得到对照品溶液；
(3)检测方法：用高效液相色谱对步骤(1)得到的供试品和步骤(2)得到的对照品进行检测。
本发明中，首先，所述检测方法由于红豆杉只需要浸泡超声和过滤两个环节即可进行检测，整个过程只需3h即可完成，而相比于现有的色谱检测方法的检测时间都需要1天以上，时间上大大缩短了；其次，本发明的检测方法，检测限低，可以检测到万分之二浓度的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ，且HPLC的特征峰明显，10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的浓度与峰面积的线性关系良好，检测稳定，误差低。
优选地，步骤(1)所述的有机溶剂为甲醇。
优选地，所述甲醇与红豆杉枝叶的体积质量比为(5-12)：1，例如可以是5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1或12：1，优选为(6-10)：1，进一步优选为8：1。
优选地，所述浸泡超声的时间为80-160min，例如可以是80min、81min、82min、85min、88min、90min、92min、95min、98min、100min、105min、110min、115min、120min、125min、130min、135min、140min、145min、150min、155min或160min，选为100-150min，进一步优选为120min。
本发明中，所述甲醇溶剂可以溶解部分细胞壁，加上超声可以充分破坏细胞壁，同时细胞中的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ可以溶解在甲醇中，故此方法可以提取红豆杉中的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ。
优选地，步骤(2)所述的有机溶剂为甲醇和醋酸的混合液。
优选地，所述甲醇和醋酸的体积比为(150-300)：1，例如可以是150：1、151：1、152：1、155：1、160：1、165：1、170：1、175：1、180：1、185：1、190：1、195：1、200：1、210：1、220：1、230：1、240：1、250：1、260：1、270：1、280：1、290：1或300：1，优选为(180-240)：1，进一步优选为200：1。
优选地，步骤(2)所述的对照品的浓度为0.05-0.5mg/mL，例如可以是0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL或0.5mg/mL，优选为0.1-0.3mg/mL，进一步优选为0.2mg/mL。
优选地，步骤(3)所述的高效液相色谱中的色谱柱为ShimpackC18分析柱。
优选地，所述分析柱的规格为250mm×4.60mm，5.0μm。
优选地，步骤(3)所述的高效液相色谱检测时的进样量为10-20μL，例如可以是10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL或20μL，优选为15-20μL，进一步优选为20μL。
优选地，步骤(3)所述的高效液相色谱检测时的流动相为水、甲醇和乙腈的混合溶液。
优选地，所述混合溶液中水、甲醇和乙腈的体积比为(20-35)：(5-20)：(3-12)，例如可以是20：5：3、21：6：4、22：7：5、23：8：6、24：9：7、25：10：8、28：12：9、30：12：10、31：14：10、32：16：11或35：20：12，优选为(25-30)：(10-18)：(5-10)，进一步优选为29：13：8。
优选地，步骤(3)所述的高效液相色谱检测时的流动相的流速为0.9-1.1mL/min，例如可以是0.9mL/min、1mL/min或1.1mL/min，优选为1mL/min。
优选地，所述高效液相色谱检测时的洗脱方式为等浓度洗脱。
优选地，步骤(3)所述的高效液相色谱检测时的检测波长为200-250nm，例如可以是200nm、201nm、202nm、205nm、210nm、215nm、220nm、225nm、227nm、228nm、230nm、231nm、235nm、236nm、238nm、240nm、245nm或250nm，优选为210-230nm，进一步优选为228nm。
优选地，所述的高效液相色谱检测时的柱温为25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃。
作为优选技术方案，所述红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：将红豆杉枝叶用甲醇浸泡超声80-160min，甲醇与红豆杉枝叶的体积质量比为(5-12)：1，0.45μm的滤膜过滤，得到供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：用体积比为(150-300)：1的甲醇和醋酸混合液配制10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品，配制的浓度为0.05-0.5mg/mL，0.45μm的滤膜过滤，得到对照品溶液；
(3)检测方法：用高效液相色谱对步骤(1)得到的供试品和步骤(2)得到的对照品进行检测，采用色谱柱为ShimpackC18分析柱，规格为250mm×4.60mm，5.0μm；
其中，检测条件为进样量为10-20μL，采用流动相为水、甲醇和乙腈的混合溶液，水、甲醇和乙腈的体积比为(20-35)：(5-20)：(3-12)，流动相的流速为0.9-1.1mL/min，检测波长为200-250nm，柱温为25-35℃。
优选地，所述红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：将红豆杉枝叶用甲醇浸泡超声120min，甲醇与红豆杉枝叶的体积质量比为8：1，0.45μm的滤膜过滤，得到供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：用体积比为200：1的甲醇和醋酸混合液配制10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品，配制的浓度为0.2mg/mL，0.45μm的滤膜过滤，得到对照品溶液；
(3)检测方法：用高效液相色谱对步骤(1)得到的供试品和步骤(2)得到的对照品进行检测，采用色谱柱为ShimpackC18分析柱，规格为250mm×4.60mm，5.0μm；
其中，检测条件为进样量为10-20μL，采用流动相为水、甲醇和乙腈的混合溶液，水、甲醇和乙腈的体积比为29：13：8，流动相的流速为1mL/min，检测波长为228nm，柱温为30℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的检测方法由于红豆杉只需要浸泡超声和过滤两个环节即可进行检测，整个过程只需3h即可完成，而相比于现有的色谱检测方法的检测时间都需要1天以上，时间上大大缩短了；
(2)本发明的检测方法，检测限低，可以检测到万分之二浓度的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ，且HPLC的特征峰明显，10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的浓度与峰面积的线性关系良好，检测稳定，误差低；
(3)本发明的检测方法在准确度、精密度、线性范围、中间精密度、耐用性和溶液的稳定性等方面均能达到要求，采用的分析方法科学、合理，且所述方法相比于现有方法更快速、简便、有效，更大限度减少了每次配制流动相的人为误差和由于溶剂挥发所引起的流动相比例变化的误差，也解决了基线波动较大的问题。
附图说明
图1是本发明10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品高效液相色谱图；
图2是本发明红豆杉供试品溶液高效液相色谱图；
图3是本发明10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品标准曲线。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
本发明所用的仪器与试剂如下：
仪器：高效液相色谱仪：Agilent1200；电子天平：梅特勒(型号：XS105du)；
试剂：甲醇(色谱纯，Tedia)、纯水(自制)、醋酸(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)、乙腈(色谱纯，Tedia)；
对照品：E.P(厂家：加拿大TRC公司，含量99.8％)；
10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ样品：企业自制(批号：H20151001)。
实施例1：红豆杉中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的含量测定
所述红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：将红豆杉枝叶用甲醇浸泡超声，0.45μm的滤膜过滤，得到供试品溶液；
表1
样品批号 甲醇的添加量(mL/g) 超声时间(min)
20151001 5 80
20151002 6 90
20151003 7 100
20151004 7 120
20151005 8 110
20151006 8 120
20151007 9 130
20151008 10 140
20151009 11 150
20151010 12 160
(2)制备对照品溶液：用体积比为200：1的甲醇和醋酸混合液配制10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品，配制的浓度为0.2mg/mL，0.45μm的滤膜过滤，得到对照品溶液；
(3)检测方法：用高效液相色谱对步骤(1)得到的供试品和步骤(2)得到的对照品进行检测，采用色谱柱为ShimpackC18分析柱，规格为250mm×4.60mm，5.0μm；
其中，检测条件为进样量为20μL，采用流动相为水、甲醇和乙腈的混合溶液，水、甲醇和乙腈的体积比为29：13：8，流动相的流速为1mL/min，检测波长为228nm，柱温为30℃。
检测结果如图1-2所示，具体如下表2所示：
表2
进样批号 峰面积 含量‰ 厂家含量‰ 偏差
20151001 839.5 15.4 16.2 0.8
20151002 899.5 16.8 16.3 0.5
20151003 813.6 14.9 14.2 0.7
20151004 886.7 15.9 15.2 0.7
20151005 834.7 15.3 15.7 0.4
20151006 859.4 15.2 15.1 0.1
20151007 809.3 14.8 15.2 0.4
20151008 870.6 15.8 15.3 0.5
20151009 815.2 15.0 15.7 0.7
20151010 832.7 15.2 15.6 0.4
从表2可以看出，对10批红豆杉中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量的检测发现，此方法检测的含量和厂家提供的数据不超万分之一，其中20151006批采用8倍体积比和超声120min的方法偏差最小。
实施例2：验证检测方法的精密度
精密称取10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品约20mg，加溶剂适量使溶解，定容至100mL，制成每1mL中约含紫杉醇0.2mg的溶液，取该溶液连续进样6次，记录峰面积，计算进样精密度，结果见表3。
表3
从表3可见，进样精密度的峰面积的RSD％为0.30，小于1.0，符合要求。
实施例3：验证检测方法的重复性
取10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ样品(H20151001批)约20mg，用溶剂溶解并定容至100mL的容量瓶中，制成每1mL中约含10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ0.2mg的溶液，摇匀，同法配制6份，照10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量检测的方法，测定每份样品10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的含量，计算精密度，结果见表4。
表4
从表4可见，重复性的RSD％为0.1，小于2.0，重复性好，符合要求。
实施例4：验证检测方法的稳定性
精密称取10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ样品(H20151001批)约20mg，用溶剂溶解并定容至100mL容量瓶中，制成浓度为0.2mg/mL的溶液，摇匀，置室温下放置，分别于0h、2h、6h、12h、24h进样，计算主峰含量的变化程度，结果见表5。
表5
由表5可见，在溶液状态下10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的峰面积随着时间的推移变化较小，溶液在24h内稳定性较好。
实施例5：检测方法的线性关系
精密称取10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品，加溶剂适量使溶解，分别配制成0.02mg/ml，0.05mg/mL，0.08mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL，0.2mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL。照10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量检测的方法操作，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表6，10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照线性如图2所示(线性回归方程为：A＝14.4228c+335.0777(r＝0.9998))。
表6
由表6可见，10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ浓度在0.02-0.5mg/mL范围内，有较好的线性，相关系数r＝0.9998。
实施例6：检测方法的回收率
精密称取10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ样品(企业自制批号：H20151001)适量，置容量瓶中，分别以限度0.8倍(80％)、限度1.0倍(100％)、限度1.2倍(120％)的量加入10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。各配制3份，照10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量测定项下的色谱条件测定10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的含量，结果见表7。
表7
由表7可见，10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的的平均回收率为99.72％，RSD％为0.015，符合要求。
实施例7：验证检测方法的中间精密度
取供试品(企业自制批号：H20151001)，在不同的时间，由不同的实验者，在不同的仪器上，照10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量测定项下的方法测定10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的含量，计算中间精密度，测定结果见表8。
表8
从表8可见，RSD％为0.13，小于1.0，中间精密度好，符合要求。
实施例8：验证检测方法的耐用性
取供试品(企业自制批号：H20151001)，分别微调波长、流速及柱温，照10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量测定项下的方法测定，考察10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量的变化程度，测定结果见表9。
表9
由表9可见，此色谱系统的耐用性良好，但流速的变化对含量的测定有影响。
综上所述，本发明所述的方法在准确度、精密度、线性范围、中间精密度、耐用性和溶液的稳定性等方面均能达到要求的分析能力，采用的分析方法科学、合理，可以用于红豆杉中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的含量测定，并且所述方法相比于现有方法更快速、简便、有效，更大限度减少了每次配制流动相的人为误差和由于溶剂挥发所引起的流动相比例变化的误差，也解决了基线波动较大的问题。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：将红豆杉枝叶用有机溶剂浸泡超声，过滤，得到供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：用有机溶剂配制10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品，过滤，得到对照品溶液；
(3)检测方法：用高效液相色谱对步骤(1)得到的供试品和步骤(2)得到的对照品进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述的有机溶剂为甲醇；
优选地，所述甲醇与红豆杉枝叶的体积质量比为(5-12)：1，优选为(6-10)：1，进一步优选为8：1；
优选地，所述浸泡超声的时间为80-160min，优选为100-150min，进一步优选为120min。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的有机溶剂为甲醇和醋酸的混合液；
优选地，所述甲醇和醋酸的体积比为(150-300)：1，优选为(180-240)：1，进一步优选为200：1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的对照品的浓度为0.05-0.5mg/mL，优选为0.1-0.3mg/mL，进一步优选为0.2mg/mL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的高效液相色谱中的色谱柱为ShimpackC18分析柱；
优选地，所述分析柱的规格为250mm×4.60mm，5.0μm。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的高效液相色谱检测时的进样量为10-20μL，优选为15-20μL，进一步优选为20μL。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的高效液相色谱检测时的流动相为水、甲醇和乙腈的混合溶液；
优选地，所述混合溶液中水、甲醇和乙腈的体积比为(20-35)：(5-20)：(3-12)，优选为(25-30)：(10-18)：(5-10)，进一步优选为29：13：8。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的高效液相色谱检测时的流动相的流速为0.9-1.1mL/min，优选为1mL/min；
优选地，所述高效液相色谱检测时的洗脱方式为等浓度洗脱。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的高效液相色谱检测时的检测波长为200-250nm，优选为210-230nm，进一步优选为228nm；
优选地，所述的高效液相色谱检测时的柱温为25-35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：将红豆杉枝叶用甲醇浸泡，甲醇与红豆杉枝叶的体积质量比为(5-12)：1，超声80-160min，0.45μm的滤膜过滤，得到供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：用体积比为(150-300)：1的甲醇和醋酸混合液配制10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ对照品，配制的浓度为0.05-0.5mg/mL，0.45μm的滤膜过滤，得到对照品溶液；
(3)检测方法：用高效液相色谱对步骤(1)得到的供试品和步骤(2)得到的对照品进行检测，采用色谱柱为ShimpackC18分析柱，规格为250mm×4.60mm，5.0μm；
其中，检测条件为进样量为10-20μL，采用流动相为水、甲醇和乙腈的混合溶液，水、甲醇和乙腈的体积比为(20-35)：(5-20)：(3-12)，流动相的流速为0.9-1.1mL/min，检测波长为200-250nm，柱温为25-35℃。
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