CN106008407A - 一种快速筛选植物中痕量紫杉醇类活性物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种快速筛选植物中紫杉醇类活性物质的方法，利用填充有不同表面的未活化的碳纤维和活性炭纤维的微型柱对红豆杉萃取物进行预分离，采用不同的流动相洗脱，得到不同极性的紫杉醇类活性物质，经在线离子化过程，实现以巴卡亭III、10‑脱乙酰基巴卡亭III、紫杉醇、7–木糖基‑10脱乙酰基紫杉醇、7–木糖基‑紫杉醇、三尖杉宁碱及7‑表‑10‑脱乙酰基紫杉醇为代表的紫杉醇类活性物质的筛选，整个筛选过程只需5min且筛选的检出限达到25ng/g的水平，所述方法减少分析的物质用量、降低背景干扰，提高检测灵敏度，且具有筛选成分不同的多种类型天然物样品的高通用性。

Description

一种快速筛选植物中痕量紫杉醇类活性物质的方法

技术领域

本发明涉及天然产物提取技术领域，具体涉及一种快速筛选植物中痕量紫杉醇类活性物质的方法。

背景技术

紫杉醇是从红豆杉属植物中分离出来的一种具有抗癌作用的二萜类化合物，因其独特的抗癌机理及其显著疗效而受重视；紫杉醇同类物质由于具有一定的药用作用并含有紫杉醇的基本骨架能够通过有效方法转化成紫杉醇，而越来越受到关注。

目前，分离检测植物中紫杉醇类物质常用方法的具体过程为：采用乙醇进行萃取，经水和二氯甲烷溶剂震荡分层，之后蒸干二氯甲烷层，加入正己烷和甲醇震荡，甲醇层浓缩后进入检测器检测；或萃取后经固相柱净化，用大量溶剂洗脱，浓缩后进入高效液相分离检测器检测。这些方法不能在短时间内分离难以实现高通量筛选痕量紫杉醇类活性物质。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种快速、高效筛选植物中紫杉醇类活性物质的方法，使所述方法能够实现短时间内同时分析极性差异较大的各种紫杉醇类活性物质。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种快速筛选植物中痕量紫杉醇类活性物质的方法，包括如下步骤：

(1)将植物样品经有机溶剂超声萃取，得到植物萃取液；

(2)将所述步骤(1)得到的植物萃取液先后经过未活化的碳纤维材料和活性炭纤维，得到吸附有植物紫杉醇类活性物质的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料；

(3)采用第一流动相洗脱所述步骤(2)得到吸附有植物紫杉醇类活性物质的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料，得到第一组分洗脱液，将所述第一组分洗脱液在线进行离子化，筛选得到第一紫杉醇前体物，所述第一紫杉醇前体物包括巴卡亭III和10-脱乙酰基巴卡亭III；

所述第一流动相包括体积终浓度为0.05～0.2％的甲酸溶液与体积终浓度为8～12％的甲醇溶液；

(4)采用第二流动相洗脱所述步骤(3)得到活性炭纤维材料，得到第二组分洗脱液，对所述第二组分洗脱液进行离子化，得到第二紫杉醇前体物，所述第二紫杉醇前体物包括紫杉醇、7-木糖基-10脱乙酰基紫杉醇、7-木糖基-紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-10-脱乙酰基紫杉醇；

所述第二流动相包括体积终浓度为0.05～0.2％的甲酸溶液与体积浓度为55～70％的甲醇终溶液。

优选的，所述步骤(1)中有机溶剂为甲醇；

所述甲醇的体积浓度为99.9％。

优选的，所述步骤(1)中超声萃取的温度为18～25℃，所述超声萃取的时间15min/次，萃取3次，每次间隔时间为5～10min。

优选的，所述步骤(1)中超声萃取后还包括：将所述萃取得到的物料经过滤膜过滤；

所述滤膜的孔径为0.22μm、0.45μm或0.6μm。

优选的，所述滤膜的孔径为0.45μm。

优选的，所述步骤(3)中第一流动相的流速为1.5～3.5mL/h；

所述步骤(4)中第二流动相的流速为1.5～3.5mL/h。

优选的，所述步骤(3)中第一流动相的流速为2.5mL/h；

所述步骤(4)中第二流动相的流速为2.5mL/h。

优选的，所述步骤(3)中第一流动相的流速为2.5mL/h。

优选的，所述第一流动相包括体积终浓度为0.01％的甲酸溶液与体积终浓度为10％的甲醇溶液。

优选的，第二流动相包括体积终浓度为0.01％的甲酸溶液与体积浓度为60％的甲醇终溶液。

本发明提供了一种快速筛选植物中痕量紫杉醇类活性物质的方法，以未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料依次对紫杉醇类活性物质进行吸附，未活化的碳纤维材料通过π-π作用力、范德华力和疏水相互作用力等非共价作用力与色素、脂类等干扰物结合，去除杂质；活性炭纤维材料，表面粗糙，具有许多含氧的官能团，增强了碳纤维的亲水性，活性炭纤维材料可以与极性较强的紫杉醇类物质结合，同时极性最强的紫杉醇前体物与两种炭纤维的作用力均很弱，被第一流动相快速洗脱，经过电喷雾离子源离子化，进入三重四级杆质谱分析检测。组分分离与串联质谱离子化过程结合从各种植物中筛选多种紫杉醇类物质，能有效提高目标物离子化效率，并减少同时分析的物质降低背景干扰，提高检测灵敏度，整个筛选时间只需5min，且筛选的检出限达到25ng/g的水平；且本发明提供的筛选方法快速，操作简便，对于不同种类植物样品通用性好，消耗原料和有机溶剂量少且更经济环保。

附图说明

图1为本发明实施例中筛选装置的结构示意图；

图2为本发明实施例1-3中对红豆杉的紫杉醇类物质分离检测全扫描模式总离子色谱图；

图3为本发明实施例1-3中对红豆杉的紫杉醇类物质分离检测MRM模式总离子色谱图；

图4为本发明实施例1-3中对红豆杉的紫杉醇类物质分离检测7种目标物质MRM色谱图；

图5为本发明实施例1-3中对红豆杉的紫杉醇类物质分离检测7种目标物质MRM质谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种快速筛选植物中痕量紫杉醇类活性物质的方法，包括如下步骤：

(1)将植物样品经有机溶剂超声萃取，得到植物萃取液；

(2)将所述步骤(1)得到的植物萃取液分别经过未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料，得到吸附有植物紫杉醇类活性物质的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料；

(3)采用第一流动相洗脱所述步骤(2)得到吸附有植物紫杉醇类活性物质的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料，得到第一组分洗脱液和经第一组分洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料，将所述第一组分洗脱液在线进行离子化，筛选得到第一紫杉醇前体物，所述第一紫杉醇前体物包括巴卡亭III和10-脱乙酰基巴卡亭III；

所述第一流动相由体积终浓度为0.05～0.2％的甲酸溶液与体积终浓度为8～12％的甲醇溶液组成；

(4)采用第二流动相洗脱所述步骤(3)得到第一次洗脱后的活性炭纤维材料，得到第二组分洗脱液，对所述第二组分洗脱液进行离子化，得到第二紫杉醇前体物，所述第二紫杉醇前体物包括紫杉醇、7-木糖基-10脱乙酰基紫杉醇、7-木糖基-紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-10-脱乙酰基紫杉醇；

所述第二流动相由体积终浓度0.05～0.2％的甲酸溶液与体积浓度为55～70％的甲醇终溶液组成。

本发明提供了一种快速筛选植物中痕量紫杉醇类活性物质的方法，利用未活化的碳纤维材料和活化的炭纤维材料进行分离，减少分析的物质降低背景干扰，提高检测灵敏度，整个筛选过程只需5min且筛选的检出限达到25ng/g的水平。

本发明将植物样品经有机溶剂超声萃取，得到植物萃取液。

在本发明中，所述植物样品的种类优选为乔木、草本植物及食用菌类。在本发明中采用红豆杉、牵牛和平菇为分析样品，所述植物样品的部位优选为针叶。本发明对所述红豆杉的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的红豆杉的来源即可。所述植物样品无需前处理过程。

在本发明中，所述超声萃取的温度优选为室温，更优选为20℃；所述超声萃取的时间优选为10～20min，更优选为15min。

本发明中，所述超声萃取的间隔时间优选为5～10min，更优选为7min。

本发明对所述超声萃取的频率没有特殊限制，采用本领域技术人员常规超声萃取频率即可。

在本发明中，所述超声萃取所用的有机溶剂优选为甲醇、氯仿、乙腈，所述有机溶剂的体积浓度优选>99.9％。所述甲醇的体积浓度优选为大于98％，更优选为甲醇浓度99.9％。

在本发明中，所述植物样品与萃取溶剂的质量体积比优选为1g：5mL～1g：15mL，更优选为1g：10mL。

在本发明中，所述超声萃取后优选还包括：将所述萃取得到的物料经过滤膜过滤。所述滤膜的孔径优选为0.22、0.45或0.6μm，更优选为0.45μm。

得到植物萃取液，本发明使所述植物萃取液先后经过未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料，得到吸附有植物紫杉醇类活性物质的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料。

附图1为本发明植物萃取液筛选所用装置的结构示意图，1、第一流动相试剂瓶；2、第二流动相试剂瓶；3、第三流动相试剂瓶；4、泵1；5、泵2；6、泵3；7、控制器；8、进样阀；9、阀1；10、阀2；11、填充有未活化的碳纤维材料微型柱；12、阀3；13、填充有活性炭纤维的微型柱；14、阀4；15、废液筒；16、质谱仪；

附图1展示了A、B、C、D 4种不同进样状态的情况：

A状态为第一流动相对填充有未活化的碳纤维材料微型柱和填充有活性炭纤维的微型柱润洗的过程，第一流动相进入装置内，在控制器7的作用下，设置一定流速，其中将阀1和阀4断开，阀2和阀3闭合，使第一流动相先后通过填充有未活化的碳纤维材料的微型柱11和填充有活性炭纤维的微型柱13，用废液筒15收集排出的废液，达到润洗未活化的碳纤维材料的微型柱11和填充有活性炭纤维的微型柱13的目的；

B状态为紫杉醇前体物I的洗脱过程，植物萃取液样品均由进样阀8手动进样进入装置内，在控制器7的作用下，设置一定流速，其中将阀1和阀4断开，阀2和阀3闭合，使第一流动相先后通过填充有未活化的碳纤维材料的微型柱11和填充有活性炭纤维的微型柱13，得到的第一组分洗脱液在线进行离子化得到紫杉醇前体物I质谱图，填充有未活化的碳纤维材料的微型柱11结合弱极性杂质，填充有活性炭纤维的微型柱13结合上第二紫杉醇前体物；

C状态为第二紫杉醇前体物的洗脱过程，第二流动相在控制器7的作用下到达进样阀8，设置一定流速，其中将阀2和阀4断开，阀1和阀3闭合，使第二流动相仅通过填充有活性炭纤维的微型柱13，使结合在填充有活性炭纤维的微型柱13的第二紫杉醇前体物洗脱下来，得到的第二组分洗脱液在线进行离子化得到第二紫杉醇前体物质谱图；

D状态为弱极性杂质的洗脱过程，第三流动相在进样阀8的作用下进入装置中，在控制器7设置一定流速，将阀2和阀4闭合，阀1和阀3断开，使第三流动相仅通过填充有未活化的碳纤维材料的微型柱11，使结合在填充有未活化的碳纤维材料的微型柱11上的弱极性杂质洗脱下来，得到的第三组分洗脱液在线进行离子化得到弱极性杂质质谱图。

在本发明中，所述未活化的碳纤维材料和活性炭纤维的表面是不同的。所述未活化的碳纤维材料表面未经过修饰，所述活性炭纤维的表面为是经表面修饰氧元素。本发明中对所述未活化的碳纤维材料和活性炭纤维的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维的来源即可。在本发明实施例中，所述未活化的碳纤维材料和活性炭纤维是商业化产品。

所述未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料优选作为填充材料填充到微型柱中，将植物萃取液依次通过填充有未活化的碳纤维材料的微型填充柱和填充有活性炭纤维材料的微型填充柱。所述微型柱的长度优选为5cm，所述微型柱的内经优选为0.75mm。

在本发明中，所述填充碳纤维材料的填充度优选为6000～8000根，更优选为7000根；所述填充活性炭纤维材料的填充度优选为3000～4000根，更优选为3500根)。

得到吸附有植物紫杉醇类活性物质的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料后，本发明用第一流动相先后对所述未活化的碳纤维材料和进行第一次洗脱，得到第一组分洗脱液和经第一次洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料。

在本发明中，所述第一流动相优选采用注射泵导入。所述的注射泵为多通道单独调控的低压注射泵，在低压下实现高效分析。

在本发明中，所述第一流动相优选包括体积终浓度为0.1％的甲酸溶液和体积终浓度为10％的甲醇溶液。

在本发明中，所述第一流动相的流速优选为1.5～3.5mL/h，更优选为2.5mL/h。

在本发明中，所述第一次洗脱时间优选为0.5～1.5min，更优选为1min。

得到第一组分洗脱液后，本发明优选将所述第一组分洗脱液导入串联质谱中，完成离子化过程，得到紫杉醇前体物I。

在本发明中，所述离子化过程的条件优选满足如下条件：

离子源条件：ESI离子源正离子MRM模式检测，毛细管电压优选为3500～4500V，更优选为4000V，干燥气流速优选为8～14L/min，更优选为11L/min，喷雾器电压优选为10～25psi；更优选为15psi，干燥气温度优选为250～320℃，更优选为300℃；

质谱检测条件：各目标物母离子及相应子离子如表所示，Fragmentor为毛细管出口电压(单位：V)，CE为碰撞能(单位：eV)，Delta为扫描频率

表1 目标物质离子化条件及MRM模式检测参数

本发明中，所述紫杉醇前体物I主要成分包括巴卡亭III和10-脱乙酰基巴卡亭III。所述巴卡亭III和10-脱乙酰基巴卡亭III为强极性紫杉醇前体物。

得到经第一次洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料后，本发明用第二流动相对经第一次洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料进行第二次洗脱，得到第二组分洗脱液和第二次洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料。

在本发明中，所述第二流动相优选采用注射泵导入。所述的注射泵为多通道单独调控的低压注射泵，在低压下实现高效分析。

在本发明中，所述第二流动相优选包括体积浓度0.1％的甲酸溶液和体积浓度为55～60％的甲醇溶液。

在本发明中，所述第二流动相的流速优选为1.5～3.5mL/h，更优选为2.5mL/h。

得到第二组分洗脱液，本发明将所述第二组分洗脱液作为离子化试剂进入串联质谱完成离子化过程，得到紫杉醇系列物Ⅱ。在本发明中，所述紫杉醇系列物Ⅱ的主要成分包括紫杉醇、7–木糖基-10脱乙酰基紫杉醇、7–木糖基-紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-10-脱乙酰基紫杉醇。所述的紫杉醇、7–木糖基-10脱乙酰基紫杉醇、7–木糖基-紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-10-脱乙酰基紫杉醇为中等极性的紫杉醇提取物。

在本发明中，所述未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料与串联质谱联用优选在常压下实现在线联用，操作环境安全。

得到第二次洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料，本发明优选还包括：将第三流动相通过第二次洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料，去除结合在未活化的碳纤维材料上的弱极性杂质，同时冲洗、平衡纤维材料，以便下次循环筛选时使用。

在本发明中，所述第三流动相优选包括体积浓度为0.05～0.2％甲醇溶液，更优选为0.1％的甲醇溶液。所述第三流动相的洗脱时间优选为2～3min，更优选为2min。

在本发明中，所述第三流动相的流速为4.0～5.5mL/h，更优选为5.0mL/h。

下面结合实施例对本发明提供的一种快速筛选植物中紫杉醇类活性物质的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

称取红豆杉针叶样品0.25g，经甲醇超声萃取，萃取液过0.45μm滤膜后，直接由微量注射器注入到进样器内，搬动进样器阀门，完成进样；断开阀门1和阀门2，调节注射泵控制器令泵1推动第一流动相，流速为2.5mL/h，样品在第一流动相的带动下进入到由未活化的碳纤维微型柱和活化的炭纤维微型柱，红豆杉针叶甲醇萃取液中不同极性的组分与两个微型柱的作用机理不同，分别被选择性地保留在不同的微型柱上；(3)第一流动相洗脱后，得到第一组分洗脱液，并在线进入串联质谱完成离子化过程，实现强极性紫杉醇前体物的筛选；(4)关闭阀门1、断开阀门2并调节注射泵令泵2推动第二流动相洗脱活化的炭纤维微型柱，流速为2.5mL/h进行洗脱得到第二组分洗脱液，将得到的第二组分洗脱液作为离子化试剂进入串联质谱完成离子化过程，实现中等极性紫杉醇活性物质的筛选；(5)断开阀门1、关闭阀门2并调节注射泵令泵3推动第三流动相，流速调节至5.0mL/h，调节MS/MS检测器状态为waste，进行去除弱极性脂质色素等杂质，并完成冲洗、平衡微型柱过程，以便下次循环筛选时使用。

实施例2

称取平菇样品0.25g，经甲醇超声萃取，萃取液过0.22μm滤膜后，直接由微量注射器注入到进样器内，搬动进样器阀门，完成进样；断开阀门1和阀门2，调节注射泵控制器令泵1推动第一流动相，流速为1.5mL/h，样品在第一流动相的带动下进入到由未活化的碳纤维微型柱和活化的炭纤维微型柱，平菇甲醇萃取液中不同极性的组分与两个微型柱的作用机理不同，分别被选择性地保留在不同的微型柱上；(3)第一组分洗脱液在线进入串联质谱完成离子化过程，实现强极性紫杉醇前体物的筛选；(4)关闭阀门1、断开阀门2并调节注射泵令泵2推动第二流动相洗脱活化的炭纤维微型柱，流速为3.5mL/h进行洗脱，得到第二组分洗脱液，将得到的第二组分洗脱液作为离子化试剂进入串联质谱完成离子化过程，实现中等极性紫杉醇活性物质的筛选；(5)断开阀门1、关闭阀门2并调节注射泵令泵3推动第三流动相，流速调节至4.0mL/h，调节MS/MS检测器状态为waste，进行去除弱极性脂质色素等杂质，并完成冲洗、平衡微型柱过程，以便下次循环筛选时使用。

实施例3

称取牵牛样品0.25g，经甲醇超声萃取，萃取液过0.65μm滤膜后，直接由微量注射器注入到进样器内，搬动进样器阀门，完成进样；断开阀门1和阀门2，调节注射泵控制器令泵1推动第一流动相，流速为3.5mL/h，样品在第一流动相的带动下进入到由未活化的碳纤维微型柱和活化的炭纤维微型柱，牵牛甲醇萃取液中不同极性的组分与两个微型柱的作用机理不同，分别被选择性地保留在不同的微型柱上；(3)第一流动相第一组分洗脱液并在线进入串联质谱完成离子化过程，实现强极性紫杉醇前体物的筛选；(4)关闭阀门1、断开阀门2并调节注射泵令泵2推动第二流动相洗脱活化的炭纤维微型柱，流速为1.5mL/h进行洗脱得到第二组分洗脱液，将得到的第二组分洗脱液作为离子化试剂进入串联质谱完成离子化过程，实现中等极性紫杉醇活性物质的筛选；(5)断开阀门1、关闭阀门2并调节注射泵令泵3推动第三流动相，流速调节至5.5mL/h，调节MS/MS检测器状态为waste，进行去除弱极性脂质色素等杂质，并完成冲洗、平衡微型柱过程，以便下次循环筛选时使用。

将实施例1-3分离得到的强极性紫杉醇前体物经检测，其活性物质种类为巴卡亭III和10-脱乙酰基巴卡亭III，将实施例1-3分离得到的中极性紫杉醇系列物经检测，其活性物质种类为紫杉醇、7–木糖基-10脱乙酰基紫杉醇、7–木糖基-紫杉醇、三尖杉宁碱及7-表-10-脱乙酰基紫杉醇5种。为了验证该结果是否准确，采用全扫描模式对方案的整个过程进行检测，其中流动相3洗脱，得到的洗脱液结果如图2所示，5-8min所检出的物质为弱极性脂质色素等杂质，筛选结果如图3至图5所示，7种紫杉醇类物质均能被很好的检出，检出限达到25ng/g的水平。

由以上实施例可知，本发明提供的一种快速筛选植物中紫杉醇类活性物质的方法，利用不同表面的未活化的纤维微型柱和活化炭纤维微型柱对红豆杉萃取物进行分离，采用不同的流动相洗脱，得到不同极性的紫杉醇类活性物质，经在线离子化过程，实现巴卡亭III、10-脱乙酰基巴卡亭III、紫杉醇、7–木糖基-10脱乙酰基紫杉醇、7–木糖基-紫杉醇、三尖杉宁碱及7-表-10-脱乙酰基紫杉醇7类不同紫杉醇活性物质的筛选，整个筛选时间只需5min且筛选的检出限达到能25ng/g的水平，所述方法减少分析的物质降低背景干扰，提高检测灵敏度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速筛选植物中痕量紫杉醇类活性物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将植物样品经有机溶剂超声萃取，得到植物萃取液；

(2)将所述步骤(1)得到的植物萃取液先后经过未活化的碳纤维材料和活性炭纤维，得到吸附有植物紫杉醇类活性物质的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料；

(3)采用第一流动相洗脱所述步骤(2)得到吸附有植物紫杉醇类活性物质的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料，得到第一组分洗脱液，将所述第一组分洗脱液在线进行离子化，筛选得到第一紫杉醇前体物，所述第一紫杉醇前体物包括巴卡亭III和10-脱乙酰基巴卡亭III；

所述第一流动相包括体积终浓度为0.05～0.2％的甲酸溶液与体积终浓度为8～12％的甲醇溶液；

(4)采用第二流动相洗脱所述步骤(3)得到活性炭纤维材料，得到第二组分洗脱液，对所述第二组分洗脱液进行离子化，得到第二紫杉醇前体物，所述第二紫杉醇前体物包括紫杉醇、7-木糖基-10脱乙酰基紫杉醇、7-木糖基-紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-10-脱乙酰基紫杉醇；

所述第二流动相包括体积终浓度为0.05～0.2％的甲酸溶液与体积浓度为55～70％的甲醇终溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中有机溶剂为甲醇；

所述甲醇的体积浓度为99.9％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中超声萃取的温度为18～25℃，所述超声萃取的时间15min/次，萃取3次，每次间隔时间为5～10min。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中超声萃取后还包括：将所述萃取得到的物料经过滤膜过滤；

所述滤膜的孔径为0.22μm、0.45μm或0.6μm。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.45μm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中第一流动相的流速为1.5～3.5mL/h；

所述步骤(4)中第二流动相的流速为1.5～3.5mL/h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中第一流动相的流速为2.5mL/h。

8.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中第二流动相的流速为2.5mL/h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一流动相包括体积终浓度为0.01％的甲酸溶液与体积终浓度为10％的甲醇溶液。

10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，第二流动相包括体积终浓度为0.01％的甲酸溶液与体积浓度为60％的甲醇终溶液。