CN112305141B - 一种人参皂苷虚拟数据库的构建方法及人参皂苷的鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人参皂苷虚拟数据库的构建方法，及一种利用所述的人参皂苷虚拟数据库鉴定人参皂苷的方法。采用基于本申请构建的人参皂苷虚拟数据库的鉴定人参皂苷的方法，可以获得更全面的皂苷成分鉴定结果，发现更多微量皂苷，为进一步研究人参属中药的药效物质基础提供依据。

Description

一种人参皂苷虚拟数据库的构建方法及人参皂苷的鉴定方法
技术领域
本发明涉及中药成分鉴定技术领域，具体涉及一种人参皂苷虚拟数据库的构建方法及人参皂苷的鉴定方法。
背景技术
人参属植物多为补益类中药。其中人参(Panax ginseng)被誉为保健养生第一品，含有丰富的初级和次级代谢产物。其主要活性成分是人参皂苷，该类成分具有防治心血管疾病，增强免疫力，安神，抗癌，以及抗疲劳等功效。
然而，由于现有分析技术的局限，难以对人参属中药中的皂苷成分进行全面、准确的检测与鉴定，因此亟需一种分析方法，以对人参属中药中的皂苷成分进行更全面并且准确的鉴定。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种人参皂苷虚拟数据库的构建方法，及一种利用所述的人参皂苷虚拟数据库鉴定人参皂苷的方法，以获得更全面的皂苷成分鉴定结果，发现更多微量皂苷，为进一步研究人参属中药的药效物质基础提供依据。具体技术方案如下：
本申请第一方面提供了一种人参皂苷虚拟数据库的构建方法，包括：
(1)根据人参皂苷的已知结构特征，拆解苷元分子式、糖基分子式和非糖取代基的元素组成；
(2)利用分子设计规则预测可能的分子结构；
(3)构建人参皂苷虚拟数据库，其中包括所述可能的分子结构。
在本申请第一方面的一些实施方式中，苷元分子式选自如下27种中的任一种：
Figure BDA0002738385640000011
Figure BDA0002738385640000021
所述分子结构中不含糖基，或含有选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸中的至少一种糖基；
所述分子结构中不含非糖取代基，或含有选自CH2、CO、C2H4、C2H2O、C3H2O3、C8H14O、C10H18O2、C11H20O2、C17H24O3、C19H32O2、C3H2O、C4H4O、C5H6O、C6H8O、C7H10O、C8H12O、C9H14O、C10H16O、C5H4O、C6H6O、C7H8O、C8H10O、C9H12O、C10H14O中的任一种非糖取代基。
在本申请第一方面的一些实施方式中，所述分子设计规则为：1)设定的化合物中只包含C、H、O三种元素；2)苷元上糖基总数目为0-6个；3)非糖取代基最多只含有一种，总数目为0-2个。
本申请第二方面提供了一种利用所述的人参皂苷虚拟数据库鉴定人参皂苷的方法，包括：
通过质量亏损过滤获取包括目标质荷比的皂苷成分，并构建母离子列表，以人参皂苷虚拟数据库中皂苷分子式的[M–H]–和[M–H+HCOOH]–两种加合形式，计算每个皂苷分子对应的理论质荷比；利用质量亏损过滤技术，以质量亏损±10mDa的变异范围生成人参皂苷分子筛，对人参属中药样品负离子模式全扫描数据进行过滤筛选，获取所述母离子列表；
高分辨质谱分析，在高分辨质谱上建立包含所述母离子列表的数据依赖采集方法，获得分析样品人参属中药中的皂苷成分的质谱图，进行皂苷分子的结构鉴定。
所述目标质荷比是根据人参属植物植化分离文献总结的“人参皂苷自建数据库”中已知皂苷化合物对应的[M–H]–和[M–H+HCOOH]–两种加合形式的质荷比。人参皂苷自建数据库包括499种已知皂苷成分(含苷元)。
在本申请第二方面的一些实施方式中，高分辨质谱包括：
通过四级杆-静电场轨道阱质谱，获得各皂苷成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比；
四级杆-静电场轨道阱质谱的质谱条件包括：
采用电喷雾离子源，以负离子检测作为检测模式，质谱参数为：
喷雾电压值：-3～-4kV，毛细管温度：300-400℃，辅助气加热温度：200-300℃，标准化碰撞能量：25/30/35V，鞘气：30-40L/h，辅助气：5-20L/h，吹扫气：0～5L/h，其中鞘气、辅助气和吹扫气均为氮气；
采用全扫描/数据依赖二级扫描模式，参数设置如下：全扫描模式的扫描范围m/z250-1500，分辨率为70,000；数据依赖二级扫描模式的扫描分辨率为17,500；动态排除时间为8.0s，分离宽度为6.0Da；
基于各皂苷成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比，确定待测样品中的皂苷成分。
在本申请第二方面的一些实施方式中，在所述高分辨质谱分析之前进行反相色谱分离，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数5-85％A相，15-95％B相，梯度洗脱；柱温：25-35℃；流速：0.2-0.4mL/min；进样量V1：2-5μL。
在本申请第二方面的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：0-2分钟，15-20％B相；2-12分钟，20-30％B相；12-21分钟，30-31％B相；21-25分钟，31-35％B相；25-32分钟，35-40％B相；32-34分钟，40-95％B相；34-36分钟，95％B相。
在本申请第二方面的一些实施方式中，制备5-20mg/mL的待测样品溶液，溶剂为体积分数为60-80％的甲醇水溶液。
在本申请第二方面的一些实施方式中，将获得的待测样品中皂苷成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比，与已知皂苷成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比进行比对，确定待测样品的皂苷成分。
在本申请第二方面的一些实施方式中，所述已知皂苷成分包括56个人参皂苷：
Figure BDA0002738385640000041
Figure BDA0002738385640000051
Figure BDA0002738385640000061
在本申请第二方面的一些实施方式中，所述已知皂苷成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比是按照以下过程获得的：
制备浓度为0.01-1mg/mL的所述已知皂苷成分的标准品溶液，溶剂为乙腈；
通过超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱质谱，获得所述皂苷成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比；
其中，超高效液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数5-85％A相，15-95％B相，梯度洗脱；柱温：25-35℃；流速：0.2-0.4mL/min；进样量V1：2-5μL；
四级杆-静电场轨道阱质谱的质谱条件包括：
采用电喷雾离子源，以负离子检测作为检测模式，质谱参数为：
喷雾电压值：-3～-4kV，毛细管温度：300-400℃，辅助气加热温度：200-300℃，标准化碰撞能量：25/30/35V，鞘气：30-40L/h，辅助气：5-20L/h，吹扫气：0～5L/h，其中鞘气、辅助气和吹扫气均为氮气；
采用全扫描/数据依赖二级扫描模式，参数设置如下：全扫描模式的扫描范围m/z250-1500，分辨率为70,000；数据依赖二级扫描模式的扫描分辨率为17,500；动态排除时间为8.0s，分离宽度为6.0Da。
发明人于研发时，共筛选过多种不同填料的色谱柱，不同比例的有机相，不同浓度的水相添加剂，以及不同的柱温，综合评价了选择性、分离度、重现性等因素，获得了以上优选方案。
本领域技术人员可以根据本申请的方法分离的化合物的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比等信息，与商业数据库、已发表的文章中已公开的皂苷成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比等信息进行比对，或者通过将已知的皂苷标准品采用与待测样品溶液相同的方法进行检测，获得的皂苷标准品的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比等信息，与分离的化合物的信息进行比对，以确定待测样品溶液中的皂苷成分，此为本领域常用的技术手段，本领域技术人员可根据实际需要选择比对的方式，本申请在此不做限制。
本发明提供的一种人参皂苷虚拟数据库的构建方法，及一种利用所述的人参皂苷虚拟数据库鉴定人参皂苷的方法，可以获得更全面的皂苷成分鉴定结果，发现更多微量皂苷，为进一步研究人参属中药的药效物质基础提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1为60个标准品的化学结构式；
图2为人参皂苷虚拟数据库构建示意图；
图3为PPT型人参皂苷裂解示意图；
图4为PPD型人参皂苷裂解示意图；
图5为OA型人参皂苷裂解示意图；
图6为PPT型人参皂苷的离子提取色谱图、MS1和MS2质谱图；
图7为丙二酸酰化人参皂苷的离子提取色谱图、MS1和MS2质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.仪器与试剂
1.1仪器
UltiMate 3000超高效液相系统(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)；Q-Orbitrap MS高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)；Eppendorf高速离心机(Eppendorf,Germany)；SB-4200DTS/P超声波提取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，浙江，中国)；AX205十万分之一天平(Mettler Toledo,Switzerland)；BP121S万分之一天平(Mettler Toledo,Switzerland)；Vortex-2旋涡混匀仪(上海泸析实业有限公司，上海，中国)。
1.2试剂
乙腈、甲醇(Fisher,Fair lawn,NJ,USA)，甲酸(ACS,Wilmington,USA)，醋酸铵(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)均为LC-MS级；去离子水经Milli-Q系统(Millipore,Bedford,MA,USA)纯化。人参花样品购自黑龙江省牡丹市，研磨粉碎后作为待测样品。56个人参皂苷与4个对应的苷元标准品，购自上海诗丹德生物技术有限公司或成都德斯特生物技术有限公司(化合物名称、分子式、精确分子量、亚型对应如表1所示，各标准品结构式如图1所示)。
表1 56个人参皂苷(1–56)与4个对应的苷元(57–60)标准品信息
Figure BDA0002738385640000081
Figure BDA0002738385640000091
Figure BDA0002738385640000101
如无特殊说明，本发明中所述的标准品的已知人参皂苷均以上述的命名和亚型分类及对应关系为准。
以下实施例中所涉及的试剂与药材如无特殊说明均可来源于市售或按照本领域公知方法取得。
实施例1构建人参皂苷虚拟数据库
通过对已知的499种人参皂苷结构特征总结，拆解出27种苷元、6种糖基和24种非糖取代基，其中，苷元分子式见表2，非糖取代基见表3，糖基分别为葡萄糖(Glc，C6H10O5)、半乳糖(Gal，C6H10O5)、鼠李糖(Rha，C6H10O4)、木糖(Xyl，C5H8O4)、阿拉伯糖(Ara，C5H8O4)、葡萄糖醛酸(GlurA，C6H8O6)。
表2 27种苷元分子式
Figure BDA0002738385640000102
Figure BDA0002738385640000111
表3 24种非糖取代基
Figure BDA0002738385640000112
制定分子设计规则：设定的化合物(1)只包含C、H、O三种元素；(2)苷元上糖基为六种糖基中的0-6种，总数目为0-6个；(3)非糖取代基为24种非糖取代基中的0或1种，总数目为0-2个；(4)苷元为27种中的任一种，然后运用C语言程序，在糖基总数和非糖取代基总数限制下，通过逐步递增的方式进行组合，获得皂苷分子式，构建数据库。数据库运行输出结果为13536个人参皂苷分子式。最终，预测了13536个人参皂苷分子式，构建出“人参皂苷虚拟数据库”，构建示意图如图2所示。经验证，其中包括已知的499种人参皂苷。对人参皂苷虚拟数据库按分子量大小进行排序，用于人参属中药中皂苷成分的表征与鉴定。
在数据库建立过程中，所述非糖取代基的分子式并不是取代基的元素组成，而是加上取代基后增加的元素组成，因此少一个氢。以非糖取代基中的甲基为例，在计算分子式时，实际增加的元素组成是CH2。
实施例2获取母离子列表
在实施例1构建得到的人参皂苷虚拟数据库中，以人参皂苷分子式的[M–H]–和[M–H+HCOOH]–两种加合形式，计算每个分子对应的理论质荷比(m/z)；利用质量亏损过滤(MDF)技术，整数部分与小数部分双重过滤，以质量亏损±10mDa的范围生成人参皂苷分子筛，通过MDF的筛选方法获取母离子列表PIL-2(1859个目标质量数)。
质量亏损过滤技术，是一种通过设置质荷比整数部分以及小数部分(即质量亏损，单位是mDa)一定变异范围，来实现高分辨数据中目标质荷比成分筛选的数据处理技术。
添加甲酸(HCOOH)加合形式的理论质荷比，以增加对潜在目标皂苷化合物的覆盖度。在负离子模式下，中性与酸性人参皂苷的加合离子存在明显差异，中性皂苷易生成溶剂加合离子(如甲酸加合，+46Da)。
自建数据库是根据人参属植物植化分离文献总结的人参皂苷数据库，包含已知的499种皂苷成分的名称、分子式、理论分子量、化学结构式等信息。
自建数据库所包含皂苷的分子式去重复，共获得169种不同的分子量。通过[M–H]–和[M–H+HCOOH]–计算所对应的理论质荷比，构成基于自建数据库的母离子列表PIL-1(169个目标质量数)。
通过设置母离子列表，能够提高质谱对待测样品中目标质量数成分的二级质谱的获取性能，减少重复采集或非目标质量数成分二级数据的采集，提高命中率。
实施例3质谱分析
1.标准品制备
分别精密称取表1中的60个标准品1mg至1.5mL EP管中，分别加入1mL乙腈涡旋溶解后得到1mg/mL的各标准品母液；选择质量数不同的标准品母液等体积混合，将60个标准品分组最后得到9个混标溶液，浓度分别为0.06mg/mL、0.17mg/mL、0.17mg/mL、0.11mg/mL、0.14mg/mL、0.067mg/mL、0.17mg/mL、0.33mg/mL，用作标准品溶液。
2.待测样品溶液制备
精密称取人参花50mg，加70％的甲醇水溶液(v/v)5mL，浸润，超声提取60min，于14000rpm离心10min，取上清液作为待测样品溶液。
3.质谱条件
四极杆-静电场轨道阱质谱(Q-Orbitrap MS)检测条件如下：使用Thermo FisherQ Exactive Q-Orbitrap MS进行数据采集，采用ESI离子源，在负离子模式下，采用FullMS/dd-MS2/PIL/IIPO(If idle-pick other)扫描方法，母离子列表通过在Inclusion里设置过滤得到的皂苷对应的分子式及选择加合离子来实现，即实施例2中得到的基于人参皂苷虚拟数据库的母离子列表PIL-2(1859个目标质量数)或基于自建数据库的母离子列表PIL-1(169个目标质量数)；二级设置中开启的“If idle-pick others”功能，可以同时记录部分非目标化合物的MS2信息；喷雾电压值为-3.5kV，毛细管温度为350℃，辅助气温度为250℃，标准化碰撞能量为25/30/35V，鞘气为35L/h，辅助气为10L/h，吹扫气为0L/h；其中鞘气、辅助气和吹扫气均为氮气。Full MS扫描范围m/z 250-1500，分辨率为70,000；MS2扫描分辨率为17,500；动态排除时间为8.0s，分离宽度为6.0Da。
4.标准品鉴定
采用上述质谱条件对标准品溶液进行检测，得到60个标准品的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比等信息，用于对待测样品溶液检测结果进行对比和验证。
5.待测样品鉴定
通过上述方法获得人参花中化合物对应的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比等信息，采用与标准品的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比等信息比对，与自建数据库的信息比对，与文献报道鉴定内容比对等方法，对采集到的数据进行分析和分类，对人参花中皂苷成分进行系统鉴定。
实施例4待测样品溶液中皂苷成分的分离和鉴定
1.色谱条件
固定相：CSH C18(2.1×100mm,1.7μm)色谱柱；
流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；
梯度洗脱：0-2分钟，15-20％B；2-12分钟，20-30％B；12-21分钟，30-31％B；21-25分钟，31-35％B；25-32分钟，35-40％B；32-34分钟，40-95％B；34-36分钟，95％B；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样量：3μL。
2.待测样品溶液中皂苷成分的分离和鉴定
按照实施例3的方法制备人参花的待测样品溶液，按照上述色谱条件和实施例3的质谱条件进行检测，获得人参花中化合物对应的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比等信息。
本申请中，发明人发现通过构建“人参皂苷虚拟数据库”，结合质量亏损过滤(MDF)获取母离子列表(PIL)，建立包含PIL的Full MS/dd-MS2/PIL/IIPO新方法，能够对人参属中药中皂苷成分进行更为系统全面的表征和鉴定，鉴定未知皂苷的能力得到增强。不限于理论，发明人认为，基于“人参皂苷虚拟数据库”采集的数据实现更广泛覆盖和更灵敏检测新颖未知皂苷成分；结合MDF获取PIL的新方法，进一步提高对新颖未知成分的覆盖程度，使鉴定过程更高效，鉴定结果更全面、可靠。
以下为根据已获得的化合物相关信息，采用比对的方法，对皂苷成分分类鉴定的举例：
中性人参皂苷的鉴定标准：以[M-H+HCOOH]-为分子离子峰。主要包括原人参三醇型皂苷(PPT型)、原人参二醇型皂苷(PPD型)、奥克梯隆型人参皂苷(Octillol型，OT)三大类：
PPT型人参皂苷的鉴定标准：特征苷元碎片常见为m/z 475.38，或者同时出现m/z475.38与m/z 391.29。
以化合物#29(C51H84O21)为例(#29表示按保留时间排序，第29个化合物，下同)介绍PPT型人参皂苷的裂解行为，其二级质谱图如图3的A图所示，[M–H]–母离子裂解产生碎片m/z 945.5419([M–H–Mal]–)和脱去糖的碎片m/z 783.4846([M–H–Mal–Glc]–)、m/z 637.4327([M–H–Mal–Glc–Rha]–)，及苷元离子m/z 475.3784([PPT–H]–)，表明其为含有一个丙二酸酰基、2个葡萄糖和一个鼠李糖的PPT型皂苷；与标准品比对保留时间和二级碎片等信息后，最终将化合物#29鉴定为丙二酰人参茎叶皂苷Re1(malonyl-floralginsenoside Re1，标准品19)。
根据对化合物#29的鉴定结果，参照PPT型人参皂苷裂解规律对未知化合物#51(C51H84O22)进行鉴定，其二级质谱图如图3的B图所示，它的[M–H]–母离子裂解产生丙二酸酰化类型的诊断离子m/z 1003.5410([M–H–CO2]–)、m/z 961.5396([M–H–Mal]–)，和脱去糖的碎片m/z 799.4838([M–H–Mal–Glc]–)、m/z 637.4323([M–H–Mal-Glc–Glc]–)，及苷元离子m/z 475.3784([PPT–H]–)，表明其为含有一个丙二酸酰基、3个葡萄糖的PPT型皂苷。根据化合物碎裂结果，最终将未知化合物#51鉴定为苷元为原人参三醇单丙二酰三葡萄糖苷(PPT-Mal.-3Glc)。
以化合物#19(C47H80O17)为例介绍PPT型人参皂苷的鉴定，其提取离子色谱图(EIC)如图6的A图所示，一级质谱图(MS1)如图6的B图所示，二级质谱图(MS2)如图6的C图所示。在质谱图MS1中，可看到化合物#19的[M–H+HCOOH]–(m/z 961.5389)离子，结合MS2数据，准分子离子[M–H]–(m/z 915.5311)，同时伴随着一系列皂苷的诊断离子[M–H–Glc]–(m/z753.4788)、[M–H–Glc–Rha]–(m/z 607.4254)和[M–H–Glc–Rha–Xyl]–(m/z 475.3781)，得出化合物#19含有1个葡萄糖基、1个鼠李糖基以及木糖基(或阿拉伯糖基)，通过低质量端诊断离子m/z 475.3781，表明化合物#19为PPT型皂苷；将化合物与自建数据库对比，根据化合物色谱图和质谱图信息，将未知化合物#19鉴定为苷元为原人参三醇含有葡萄糖、鼠李糖与木糖三糖苷(PPT-Glc-Rha-Xyl)。
为描述方便，本申请中对未知人参皂苷鉴定时，均用木糖代替所有中性人参皂苷丢失132Da而鉴定的五碳糖。
PPD型人参皂苷的鉴定标准：特征苷元碎片常见为m/z 459.38，或者同时出现m/z459.38与m/z 375.29；
以化合物#74(C57H94O26)为例介绍PPD型人参皂苷的裂解行为，其二级质谱图如图4的A图所示，[M–H]–母离子裂解产生碎片m/z 1107.5948([M–H–Mal]–)和脱去糖的碎片m/z945.5438([M–H–Mal–Glc]–)、m/z 621.4370([M–H–Mal–3Glc]–)，及苷元离子m/z 459.3848([PPD–H]–)，表明其为含有一个丙二酸酰基、4个葡萄糖的PPD型皂苷；与标准品比对保留时间和二级碎片等信息后，最终将化合物#74鉴定为丙二酰人参皂苷Rb1(malonyl-ginsenoside Rb1，标准品35)。
根据对化合物#74的鉴定结果，参照PPD型人参皂苷裂解规律对未知化合物#140(C50H82O20)进行鉴定，其二级质谱图如图4的B图所示，根据高分辨数据推断其分子式为C50H82O20(m/z 1001.5352)。它的[M–H]–母离子裂解产生丙二酸酰化类型的诊断离子m/z915.5343([M–H–Mal]–)和脱去糖的碎片m/z753.4798([M–H–Mal–Glc]–)、m/z 621.4352([M–H–Mal-Glc–Xyl]–)，及苷元离子m/z 459.3852([PPD–H]–)，表明其为含有1个丙二酸酰基、2个葡萄糖和1个木糖的PPD型皂苷；根据化合物碎裂结果，最终将未知化合物#140鉴定为苷元为原人参二醇单丙二酰双葡萄糖与木糖三糖苷(PPD-Mal.-2Glc-Xyl)。
酸性人参皂苷的鉴定标准：以[M-H]-为分子离子峰。主要包括丙二酸酰化人参皂苷和齐墩果酸型人参皂苷(OA型)两大类：
OA型人参皂苷的鉴定标准：特征苷元碎片常见为m/z 455.35；
以化合物#80(C48H76O19)为例介绍OA型人参皂苷的裂解行为，其二级质谱图如图5的A图所示，根据高分辨数据推断其分子式为C48H76O19(m/z955.4912)。它的准分子母离子m/z 955.4912([M–H]–)裂解产生脱去糖的碎片m/z 793.4387([M–H–Glc]–)和丢失两个葡萄糖后在3位葡萄糖醛酸上交叉断裂产生的碎片m/z 569.3852([M–H–2Glc–CO2–H2O]–)，及苷元离子m/z 455.3535([OA–H]–)，表明其为含有2个葡萄糖和一个葡萄糖醛酸的OA型皂苷；与标准品比对保留时间和二级碎片等信息后，最终将化合物#80鉴定为人参皂苷Ro(ginsenoside Ro，标准品43)。
根据对化合物#80的鉴定结果，参照OA型人参皂苷裂解规律对未知化合物#161(C42H68O13)进行鉴定，其二级质谱图如图5的B图所示，它的准分子母离子m/z 779.4626([M–H]–)裂解产生脱去糖的碎片m/z 617.4075([M–H–Glc]–)及苷元离子m/z 455.3525([OA–H]–)，表明其为含有2个葡萄糖的OA型皂苷；根据化合物碎裂结果，最终将未知化合物#161鉴定为苷元为齐墩果酸双葡萄糖苷(OA-2Glc)。
丙二酸酰化人参皂苷的鉴定标准：特征中性丢失常见为44.01Da、86.00Da(丙二酰基)、104.06Da；再结合PPT或PPD型人参皂苷的鉴定标准进行鉴定；
以化合物#72(C45H74O16)为例介绍丙二酸酰化人参皂苷的鉴定，其提取离子色谱图(EIC)如图7的A图所示，一级质谱图(MS1)如图7的B图所示，二级质谱图(MS2)如图7的C图所示。在质谱图MS1中，可看到化合物#72的准分子离子[M–H]–(m/z 869.4925)离子，以及丙二酸酰化类型的诊断离子[M–H–CO2]–(m/z 825.5021)，结合MS2数据，丙二酸酰化类型的诊断离子[M–H–malonyl]–(m/z 783.4905)，同时伴随着一系列皂苷的诊断离子[M–H–malonyl–Rha]–(m/z 637.4374)以及[M–H–malonyl–Rha–Glc]–(m/z 475.3779)，得出化合物#72含有1个丙二酰基、1个鼠李糖基以及1个葡萄糖基，通过低质量端诊断离子m/z 475.3779，表明化合物#72为PPT型皂苷；将化合物与自建数据库对比，根据化合物色谱图和质谱图信息，将未知化合物#72鉴定为苷元为原人参三醇单丙二酰鼠李糖葡萄糖苷(PPT-Mal.-Rha-Glc)。
3.母离子列表PIL-1和PIL-2对皂苷成分鉴定结果的差异
基于自建数据库的母离子列表PIL-1(169个目标质量数)，基于人参皂苷虚拟数据库的母离子列表PIL-2(1859个目标质量数)，比较PIL-1和PIL-2对人参花中皂苷成分鉴定结果的差异。同时分析了基于两种不同母离子列表最终的鉴定结果，两种方法对于已知皂苷成分的表征和鉴定能力相当，但对于未知皂苷成分的鉴定能力存在差异。与基于PIL-1的方法相比，基于PIL-2的方法能够新采集到17个皂苷成分的二级质谱图，其中9个皂苷的结构获得鉴定，另外8个因为母离子强度低，采集到的二级谱图缺少诊断离子而无法进行结构解析。通过检索自建数据库，发现上述9个皂苷的其中3个含有未知质量数，均为新的皂苷分子。而且，这3个化合物虽然通过两种方法均采集到二级质谱图，但基于PIL-2采集到的二级质谱图质量更佳，碎片丰富易于结构解析。这些表明相对于基于PIL-1的方法，基于PIL-2的方法对于未知目标皂苷成分的鉴定能力具有明显的优势。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种利用人参皂苷虚拟数据库鉴定人参皂苷的方法，包括：
通过质量亏损过滤获取包括目标质荷比的皂苷成分，并构建母离子列表，以人参皂苷虚拟数据库中皂苷分子式的[M–H]–和[M–H+HCOOH]–两种加合形式，计算每个皂苷分子对应的理论质荷比；利用质量亏损过滤技术，以质量亏损±10mDa的变异范围生成人参皂苷分子筛，对人参属中药样品负离子模式全扫描数据进行过滤筛选，获取所述母离子列表；
高分辨质谱分析，在高分辨质谱上建立包含所述母离子列表的数据依赖采集方法，获得分析样品人参属中药中的皂苷成分的质谱图，进行皂苷分子的结构鉴定；
其中，所述人参皂苷虚拟数据库的构建方法，包括：
(1)根据人参皂苷的已知结构特征，拆解苷元分子式、糖基分子式和非糖取代基的元素组成；
(2)利用分子设计规则预测可能的分子结构；
(3)构建人参皂苷虚拟数据库，其中包括所述可能的分子结构。
2.根据权利要求1所述的鉴定人参皂苷的方法，其中，所述苷元分子式选自如下27种中的任一种：
Figure FDA0003769292600000011
Figure FDA0003769292600000021
所述分子结构中不含糖基，或含有选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸中的至少一种糖基；
所述分子结构中不含非糖取代基，或含有选自CH2、CO、C2H4、C2H2O、C3H2O3、C8H14O、C10H18O2、C11H20O2、C17H24O3、C19H32O2、C3H2O、C4H4O、C5H6O、C6H8O、C7H10O、C8H12O、C9H14O、C10H16O、C5H4O、C6H6O、C7H8O、C8H10O、C9H12O、C10H14O中的任一种非糖取代基。
3.根据权利要求1所述的鉴定人参皂苷的方法，其中，所述分子设计规则为：1)设定的化合物中只包含C、H、O三种元素；2)苷元上糖基总数目为0-6个；3)非糖取代基最多只含有一种，总数目为0-2个。
4.根据权利要求1所述的鉴定人参皂苷的方法，其中，所述高分辨质谱包括：
通过四级杆-静电场轨道阱质谱，获得各皂苷成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比；
四级杆-静电场轨道阱质谱的质谱条件包括：
采用电喷雾离子源，以负离子检测作为检测模式，质谱参数为：
喷雾电压值：-3～-4kV，毛细管温度：300-400℃，辅助气加热温度：200-300℃，标准化碰撞能量：25/30/35V，鞘气：30-40L/h，辅助气：5-20L/h，吹扫气：0～5L/h，其中鞘气、辅助气和吹扫气均为氮气；
采用全扫描/数据依赖二级扫描模式，参数设置如下：全扫描模式的扫描范围m/z 250-1500，分辨率为70,000；数据依赖二级扫描模式的扫描分辨率为17,500；动态排除时间为8.0s，分离宽度为6.0Da；
基于各皂苷成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比，确定待测样品中的皂苷成分。
5.根据权利要求1所述的鉴定人参皂苷的方法，其中，在所述高分辨质谱分析之前进行反相色谱分离，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数5-85％A相，15-95％B相，梯度洗脱；柱温：25-35℃；流速：0.2-0.4mL/min；进样量V1：2-5μL。
6.根据权利要求5所述的鉴定人参皂苷的方法，其中，所述梯度洗脱具体为：0-2分钟，15-20％B相；2-12分钟，20-30％B相；12-21分钟，30-31％B相；21-25分钟，31-35％B相；25-32分钟，35-40％B相；32-34分钟，40-95％B相；34-36分钟，95％B相。
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