CN112630314B - 一种l-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体的分离方法 - Google Patents
一种l-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体的分离方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种L‑丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体的分离方法，所述分离方法包括在碱性条件下，使用GITC溶液对L‑丙氨酸异丙酯盐酸盐及其异构体进行衍生化，衍生化后的L‑丙氨酸异丙酯盐酸盐及其异构体采用HPLC色谱法进行分离和检测。该分离方法能够有效的分离L丙氨酸异丙酯盐酸盐和其对映异构体D‑丙氨酸异丙酯盐酸盐，并能够准确的测定其对映异构体的含量。本方法采用特定的反相方法和等度洗脱方式，简单且易于操作，峰型较好，分离度合格，方法学验证显示本方法专属性强，灵敏度高，准确度以及线性均比较良好。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测分析领域，更具体地，涉及一种L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体的分离方法。
背景技术
L-丙氨酸异丙酯盐酸盐是一种重要的医药中间体，也是合成替诺福韦艾拉酚胺等原料药的一种重要起始原料，其结构中具有一个手性中心。当以L-丙氨酸异丙酯盐酸盐为起始原料合成替诺福韦艾拉酚胺等原料药时，其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐可能也会参与反应，生成原料药相应的异构体杂质，例如D-丙氨酸异丙酯盐酸盐则是替诺福韦艾拉酚胺手性杂质的来源之一。因此，对物料杂质的研究有助于药物的合成工艺优化和质量控制，研究L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐的分离检测方法，可为评价L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的质量提供较好的参考，也为优化L-丙氨酸异丙酯盐酸盐合成工艺提供技术依据，对确定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中D-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映异构体所引起的不良反应具有重大意义。
经查阅文献可知，目前关于L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐的分离方法研究报道非常少。如陈楠等人(陈楠,等.高效液相色谱法分离检测L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的对映异构体杂质[J].中南药学,2020,(06):997-997)公开了采用高效液相色谱法分离检测L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的对映异构体杂质，该方法以邻苯二甲醛/N-乙酰-L-半胱氨酸(OPA/NAC)对L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其异构体进行手性衍生化，生成具有紫外吸收的一对非对映异构体衍生物(波长为333nm)，经5-氟苯基色谱柱分离，采用0.1％三氟乙酸水溶液-甲醇的流动相体系进行梯度洗脱。然而，该方法对于色谱柱的要求苛刻，对柱前衍生前的衍生反应时间也限制严格，检测成本偏高；且衍生化反应产物的稳定性时间较短，仅为2.5h，极有可能会影响实验结果的准确性；这些无疑都不利应用于L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映异构体的拆分。
专利CN110849980A公开了一种检测L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其对映异构体的检测方法，该方法中的色谱柱填充剂为冠醚手性柱(硅胶表面涂敷有手性冠醚)，且需要使用强酸性流动相，例如pH值为1.0～2.0的高氯酸水溶液，对色谱柱的损害较大，而且检测过程对温度的要求过于严苛。
本发明为解决L-丙氨酸异丙酯盐酸盐异构体与其对映异构体难分离问题，提供了一种便捷、高效、准确的分离方法。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的缺陷和不足，提供一种L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体的分离方法，该方法在碱性条件下采用GITC溶液对L-丙氨酸异丙酯盐酸盐进行柱前衍生化，并结合特定的HPLC检测条件，从而实现L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐的分离与测定，并使该方法在系统适用性、专属性、线性和范围等方面完全符合中国药典方法验证的指导原则，可用于以L-丙氨酸异丙酯盐酸盐为起始原料或中间体制得的原料药或药品的质量控制。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体的分离方法，所述分离方法包括在碱性溶液的存在下，使用乙酰葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)溶液对L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其异构体进行衍生化，衍生化后的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其异构体采用HPLC色谱法得到分离和检测。
优选地，所述碱性溶液为三乙胺溶液。
优选地，所述三乙胺溶液中包括三乙胺和乙腈溶液。
优选地，所述GITC溶液的制备方法为：取GITC约78mg，置于20ml容量瓶中，加乙腈稀释至刻度即得。
优选地，所述HPLC色谱法中的色谱柱为键合硅胶色谱柱，流动相为体积比为50：50的水(A)和甲醇(B)。
优选地，所述HPLC色谱法还包括以下检测条件：所述键合硅胶色谱柱为YMC-PackODS-AQ，色谱柱规格为150*4.6mm*3μm，柱温为25℃，检测波长为246nm，流速为1.0ml/min，进样量为10μl。
优选地，所述分离方法包括以下步骤：
(1)配制溶液：分别配制空白溶液、供试品溶液、D-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品溶液、系统适用性溶液；所述供试品溶液中包括L-丙氨酸异丙酯盐酸盐样品和乙腈溶液；所述系统适用性溶液包括D-丙氨酸异丙酯盐酸盐和L-丙氨酸异丙酯盐酸盐；
(2)HPLC测定：分别将配制的溶液注入色谱仪中，记录色谱图。
优选地，所述供试品溶液的制备方法为：取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐约150mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈适量，超声使溶解，待冷却至室温后，加乙腈稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5ml置2ml自动进样瓶中，依次精密加入0.5ml三乙胺溶液和GITC溶液各0.5ml，涡旋混合均匀，室温放置1h，作为供试品溶液。
优选地，所述系统适用性溶液的制备方法为：分别称取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐和其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐各适量，加乙腈溶解并稀释成每1ml中约含D-丙氨酸异丙酯盐酸盐和L-丙氨酸异丙酯盐酸盐0.3mg的混合溶液；精密量取0.5ml置2ml自动进样瓶中，依次精密加入0.5ml三乙胺溶液和GITC溶液各0.5ml，涡旋混合均匀，室温放置1h，作为系统适用性溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)采用本发明的分离方法，可有效分离L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其对映异构体，分离度可达3.0以上。
(2)碱性条件下，采用GITC为衍生剂与L-丙氨酸异丙酯盐酸盐发生衍生化反应，得到的衍生化产物在24小时内稳定性良好。
(3)本发明采用反相高效液相色谱方法分离L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与D-丙氨酸异丙酯盐酸盐，采用普通的键合硅胶色谱柱、等度洗脱即可，操作简单且对色谱柱的要求不高，成本较低，且得到的色谱峰峰型较好，分离度可高达3.0以上。方法学验证显示本方法专属性强，线性良好，适用于准确、快速的分离检测L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的对映异构体杂质。
附图说明
图1是实施例1中空白溶液的HPLC检测结果图。
图2是实施例1中系统适用性溶液的HPLC检测结果图。
图3是实施例1中供试品溶液的HPLC检测结果图。
图4是实施例1中对照品溶液的HPLC检测结果图。
图5是实施例1中D-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品的线性关系图。
具体实施方式
为了更清楚、完整的描述本发明的技术方案，以下通过具体实施例进一步详细说明本发明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明，可以在本发明权利限定的范围内进行各种改变。
实施例1
一种L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体的分离方法，包括以下步骤：
(1)溶液的配制
GITC溶液：称取GITC约78mg，置于20ml容量瓶中，加乙腈溶解并定量稀释至刻度，摇匀即得；
三乙胺溶液：量取三乙胺溶液1ml，置于100ml量瓶中，用乙腈定量稀释至刻度，作为三乙胺溶液A，精密量取2ml三乙胺溶液A置于100ml量瓶中，乙腈定容至刻度，摇匀，作为三乙胺溶液B；
空白溶液：取乙腈0.5ml置2ml自动进样瓶中，依次精密加入0.5ml三乙胺溶液A和GITC溶液各0.5ml，涡旋混合均匀，室温放置1h，作为空白溶液；
D-丙氨酸异丙酯对照品溶液：取D-丙氨酸异丙酯对照品7.5mg，精密称定，置100ml量瓶中，加乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀后取2ml置50ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取0.5ml，置2ml自动进样瓶中，依次精密加入三乙胺溶液B和GITC溶液各0.5ml，涡旋混合均匀，室温放置1h，作为对照品溶液；
供试品溶液：取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐约150mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈适量，超声使溶解，待冷却至室温后，加乙腈稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5ml置2ml自动进样瓶中，依次精密加入0.5ml三乙胺溶液A和GITC溶液各0.5ml，涡旋混合均匀，室温放置1h，作为供试品溶液；
系统适用性溶液：分别称取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐和其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐各适量，加乙腈溶解并稀释成每1ml中约含D-丙氨酸异丙酯盐酸盐和L-丙氨酸异丙酯盐酸盐0.3mg的混合溶液；精密量取0.5ml置2ml自动进样瓶中，依次精密加入0.5ml三乙胺溶液A和GITC溶液各0.5ml，涡旋混合均匀，室温放置1h，作为系统适用性溶液；
(2)HPLC检测：
分别将空白溶液、系统适用性溶液和测试溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱条件如表1。
表1
| 色谱柱 | 键合硅胶色谱柱YMC-Pack ODS-AQ |
| 色谱柱规格 | 150*4.6mm*3μm |
| 柱温 | 25℃ |
| 波长 | 246nm |
| 流速 | 1.0ml/min |
| 进样量 | 10μl |
| 流动相 | 水(A)-甲醇(B)；A：B＝50：50 |
| 运行时间 | 45min |
检测结果及分析：
(1)本发明所述分离方法的专属性及检测结果分析
分别将空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液和对照品溶液的色谱检测结果如图1～4，从图中可以看出，空白溶剂不干扰L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐的检测，表明本发明的分离方法具有优异的专属性。
附图2中从左到右分别为L-丙氨酸异丙酯盐酸盐以及其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐，其分离度达到3.0以上，远大于1.5，能够达到基线分离，说明本发明的分离方法完全能够将L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐分离。
(2)本发明所述分离方法的线性和范围
空白溶剂：乙腈
线性溶液：取对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品适量，分别配制成一系列浓度的溶液，依照实施例1中的色谱方法测定，D-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品线性和范围测定结果如表2。
表2
D-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品线性关系图如附图5。
结论：D-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品在0.09μg/ml～0.6μg/ml浓度范围内线性关系良好。线性回归系数R2＝0.9982，符合方案要求(R2≥0.99)。
(3)本发明所述分离方法的回收率试验
实验步骤：精密称取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐适量，置于量瓶中，分别加入其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐适量，乙腈溶解并稀释至刻度，配制成相对浓度分别为50％、100％、150％的溶液，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐适量，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为空白样品溶液、另精密量取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐适量，用乙腈溶解并稀释成合适浓度的溶液，作为对照品溶液。精密量取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，依照实施例1中的色谱方法检测，记录发色谱图及峰面积，计算回收率。结果如表3。
表3
结论：各浓度下L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐的回收率均符合药典规定，本方法准确度良好。
(4)衍生化产物稳定性分析
室温条件下，将供试品溶液和对照品溶液放置24小时，并在每1小时的时间间隔点进行检测，结果显示各溶液主峰RSD均小于2.0％，且供试品溶液和对照品溶液中均为增加干扰其检测的杂质，说明所得衍生化产物在24小时内的稳定性良好。
以上实施例使用具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些不偏离本发明主旨的修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，这些不偏离本发明主旨基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括在碱性溶液下，使用乙酰葡萄糖异硫氰酸酯溶液对L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其异构体进行衍生化，衍生化后的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其异构体采用HPLC色谱法进行分离和检测，所述HPLC色谱法中的色谱柱为键合硅胶色谱柱，所述键合硅胶色谱柱为YMC-PackODS-AQ，流动相A为水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B体积比为50：50。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述碱性溶液为三乙胺溶液。
3.如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述三乙胺溶液中包括三乙胺和乙腈溶液。
4.如权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述三乙胺溶液的制备方法为：取三乙胺溶液1~2ml，置于100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度即得。
5.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述乙酰葡萄糖异硫氰酸酯溶液的制备方法为：取乙酰葡萄糖异硫氰酸酯约78mg，置于20ml容量瓶中，加乙腈稀释至刻度即得。
6.如权利要求5所述的分离方法，其特征在于，所述HPLC色谱法还包括以下检测条件：所述键合硅胶色谱柱为YMC-Pack ODS-AQ，色谱柱规格为150*4.6mm*3μm，柱温为25℃，检测波长为246nm，流速为1.0ml/min，进样量为10μl。
7.如权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括以下步骤：
（1）配制溶液：分别配制空白溶液、供试品溶液、D-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品溶液、系统适用性溶液；所述供试品溶液中包括L-丙氨酸异丙酯盐酸盐样品和乙腈溶液；所述系统适用性溶液包括D-丙氨酸异丙酯盐酸盐和L-丙氨酸异丙酯盐酸盐；
（2）HPLC测定：分别将配制的溶液注入色谱仪中，记录色谱图。
8.如权利要求7所述的分离方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐约150mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈适量，超声使溶解，待冷却至室温后，加乙腈稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5ml置2ml自动进样瓶中，依次精密加入0.5ml三乙胺溶液和乙酰葡萄糖异硫氰酸酯溶液各0.5ml，涡旋混合均匀，室温放置1h，作为供试品溶液。
9.如权利要求7所述的分离方法，其特征在于，所述系统适用性溶液的制备方法为：分别称取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐和其对映异构体D-丙氨酸异丙酯盐酸盐各适量，加乙腈溶解并稀释成每1ml中约含D-丙氨酸异丙酯盐酸盐和L-丙氨酸异丙酯盐酸盐0.3mg的混合溶液；精密量取0.5ml置2ml自动进样瓶中，依次精密加入0.5ml三乙胺溶液和乙酰葡萄糖异硫氰酸酯溶液各0.5ml，涡旋混合均匀，室温放置1h，作为系统适用性溶液。
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