CN109856253A - 一种peg修饰蛋白多关键参数同时检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及PEG修饰蛋白多关键参数同时检测的方法，本发明基于蛋白在紫外下的UV吸收值和在示差下的RI吸收值均与蛋白浓度呈线性关系；PEG在紫外下无吸收，而其RI吸收值同样与其浓度呈线性关系；PEG修饰后蛋白的PEG部分与蛋白部分互不干扰各自在UV或RI中的吸收值的原理,依据上述原理，本方法可同时进行了包括纯度、蛋白浓度、PEG结合数和游离PEG的四项关键指标的检测。本发明方法适用于不同的蛋白类型及不同PEG修饰剂类型的PEG修饰蛋白，本方法高效便捷、准确度高、操作简单，尤其针对聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶进行了检测方法的优化及验证，使得该方法在重复性、精密度等方面都满足了药品级检测要求。

Description

一种PEG修饰蛋白多关键参数同时检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种PEG修饰蛋白药物多关键参数同时检测的检测 方法。

背景技术

聚乙二醇(polyethylene glycols，PEG)是一种毒性极低的线性大分子聚合物，具有水溶 性和免疫惰性。当和目标蛋白结合后，可降低蛋白质被免疫系统的识别而达到降低免疫原性； 同时这种屏蔽作用还可以使蛋白水解酶不容易识别到被修饰的蛋白质，这就有助于目标蛋白 在体内作用时间更长；另外药物进行PEG修饰后，还具有溶解度增加、毒性显著降低、血药 浓度波动小等优势。自1977年Abuchowski等人首次应用PEG修饰药物蛋白以来，PEG修饰 技术发展迅速，目前为止很多PEG修饰的蛋白药物已经成功上市，而处于临床研究阶段的修 饰药物种类越来越多。

与未修饰的蛋白质相比，PEG化蛋白质具有更为复杂的结构和质量属性，其质量控制无 法简单的照搬未修饰蛋白质的质量标准，必须结合品种自身独特的结构、理化性质及生物学 特性，开发适用的质控方法和标准。除了纯度、蛋白浓度、分子量和生物活性等与未修饰蛋 白相类似的质量属性外，还应重点关注与PEG有关的质控项目，如PEG结合数、游离PEG 和修饰位点等。

目前常用来检测蛋白质纯度的方法有非还原SDS-PEGA法和HPLC法；常用来检测蛋白 质含量的方法有紫外可见分光光度法、BCA法、Lowry法、考马斯亮蓝法以及液相色谱法等。

PEG化蛋白质中会有游离PEG残留，可能来源于投料过量或是修饰后蛋白质的脱落，特 别是后者可以反映修饰蛋白质的稳定性，因此是质控的重要项目。常用的游离PEG分析方法， 如电位法、比色法、光干涉法和碘染色法等，但均会受到与蛋白质共价结合的PEG干扰，测 定结果误差较大。

PEG结合数是指修饰后每个蛋白分子上偶联的PEG的数目，常来衡量PEG化蛋白质的 PEG修饰程度，修饰程度的不同会影响修饰后蛋白的活性和产品的均一性，对最终产品的质 量产生影响，也是质控的重要项目。目前已有多种测定方法，如三硝基苯磺酸(TNBS)法、 荧光胺法、质谱法、液相-示差/蒸发光散射检测器联用法等。其中，前两种方法属于化学和荧 光发光法，操作简单，但容易受到干扰。而质谱法所用仪器较为特殊和昂贵，且不能通用， 只能用于分子量小于200KD的样品检测。

针对PEG修饰蛋白药物的纯度、蛋白浓度、PEG结合数和游离PEG的质控项目，目前均有多种分析方法，但每个检测方法只能完成一个项目的分析检测，同时完成这四个质控项 目，操作复杂，工作量大。

发明内容

本发明提供了一种方法可以同时对PEG修饰蛋白药物进行4项重要的质控参数进行检测， 包括纯度、蛋白浓度、PEG结合数和游离PEG。

蛋白在紫外下的UV吸收值和在示差下的RI吸收值均与蛋白浓度呈线性关系；PEG在紫 外下无吸收，而其RI吸收值同样与其浓度呈线性关系；PEG修饰后蛋白的PEG部分与蛋白 部分互不干扰各自在UV或RI中的吸收值。本发明的检测方法正是基于上述原理，完成以下 检测：

建立三条标准曲线：将蛋白浓度已经标定确定的原蛋白标准品稀释，根据其浓度与相对 应的紫外吸收值峰面积进行线性拟合，建立标准曲线UV_原蛋白-C_原蛋白(标曲①)，根据其浓度 与相对应的示差吸收值峰面积进行线性拟合，建立标准曲线RI_原蛋白-C_原蛋白(标曲②)；将PEG 标准品溶液稀释，根据其浓度与相对应的示差吸收值峰面积进行线性拟合，建立标准曲线 RI_PEG-C_PEG(标曲③)。

(1)纯度：体积排阻色谱柱根据表观分子量大小对供试品的纯度进行分析，采集紫外检 测器下的出峰，积分分析纯度。

(2)蛋白浓度：将供试品溶液在紫外检测器下的峰面积代入标曲①，计算得到供试品中 修饰蛋白的浓度。

(3)游离PEG：将供试品溶液在示差检测器下PEG的峰面积UV_修饰蛋白代入标曲③，计算得到供试品中游离PEG浓度C_原蛋白。

(4)PEG结合数：由于供试品修饰蛋白中PEG部分在紫外下无吸收峰，因此修饰蛋白的紫外峰面积完全由原蛋白部分贡献，故由上述(2)中计算得到的修饰蛋白浓度即为修饰蛋 白中原蛋白所占有的含量C_原蛋白；修饰蛋白中原蛋白和PEG部分均在示差检测器中有吸收值， 修饰蛋白的示差峰面积由原蛋白和PEG共同贡献(即A_修饰蛋白＝A_原蛋白+A_PEG)，利用已求出的C _原蛋白代入标曲②计算得A_原蛋白，继而得到A_PEG，代入标曲③计算得到修饰蛋白中PEG所占有的含量C_PEG，

其中，C_原蛋白和C_PEG分别为修饰蛋白中原蛋白部分和PEG部分的含量(质量浓度)，M_原蛋白和M_PEG分别为原蛋白部分和PEG部分的分子量。

作为优选，本发明检测方法结合体积排阻色谱法(SEC)或者反相色谱法(RP)分离方 法进行检测，更优选体积排阻色谱法。

更优选的，采用体积排阻色谱法时，其中流动相含5％(v/v)异丙醇的20mM磷酸盐缓 冲液，pH6.5。

更优选的，采用体积排阻色谱法时，其中流动相流速为0.6ml/min；

更优选的，采用体积排阻色谱法时，其中色谱柱柱温35℃。

更优选的，采用体积排阻色谱法时，其中紫外检测器的检测波长为280nm。

更优选的，PEG修饰蛋白是聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶。

本发明方法适用于不同的蛋白类型及不同PEG修饰剂类型的PEG修饰蛋白，本发明方法 可以同时完成纯度、蛋白浓度、PEG结合数和游离PEG的检测，高效便捷、准确度高、操作 简单。

附图说明

图1实施例1不同浓度的Kb在紫外下的色谱图

图2实施例1标曲UV_原蛋白-C_原蛋白

图3实施例1不同浓度的Kb在示差下的色谱图

图4实施例1标曲RI_原蛋白-C_原蛋白

图5实施例1不同浓度的PEG在示差下的色谱图

图6实施例1标曲RI_PEG-C_PEG

图7实施例1供试品206在紫外下的色谱图

图8实施例1供试品206在示差下的色谱图

图9实施例2标曲UV_原蛋白-C_原蛋白

图10实施例2标曲RI_原蛋白-C_原蛋白

图11实施例2标曲RI_PEG-C_PEG

图12实施例3标曲1～3，其中图12-1表示实施例3线性重复考察第一次进样标曲、图12-2 表示实施例3线性重复考察第二次进样标曲、图12-3表示实施例3线性重复考察第三次进样 标曲

图13实施例3空白溶液稳定性考察色谱图及放大图

图14实施例4不同浓度的PEG在示差下的色谱图

图15实施例4不同浓度的PEG在示差下的标曲

图16实施例4定量限图谱

具体实施方式

比较例1：荧光胺法检测检测PEG随机修饰的胰激肽原酶(以下简称Kb)的PEG结合数 实验步骤：

1相关溶液配制

1.1 0.3％荧光胺丙酮溶液配制

称取6mg荧光胺溶解于20ml丙酮中，避光保存。

1.2反应缓冲液

取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液5.3ml，0.2mol/L磷酸氢二钠94.7ml，用水定容至1L，调节 pH至8.0，过滤后备用。

2BCA法测定蛋白含量

2.1工作液的配制

根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂(50:1)配制成BCA工 作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混均后就会消失)。BCA工作液室温24小时内稳 定。

2.2标准品的稀释

取BCA标准品用PBS稀释至终浓度为0.5mg/ml。

2.3BCA测定法

将标准品按0μL、2μL、4μL、6μL、8μL、12μL、16μL、20μL加到96孔板的蛋白标准 品孔中，加PBS 20μL、18μL、16μL、14μL、12μL、8μL、4μL、0μL。将样品作适当稀释(最 好多做几个梯度，入作2倍、4倍、8倍稀释)，加20μL到96孔板的样品孔中。由于移液器 在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2 后。各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置20分钟。用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线 计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。

2.4从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。

3氨基修饰度测定

3.1未修饰蛋白标准储备液的配制

根据BCA法测得的蛋白浓度，用反应缓冲液将未修饰蛋白稀释至100μg/ml，为未修饰 蛋白标准储备液。

3.2修饰蛋白标准储备液的配制

根据BCA法测得的蛋白浓度，用反应缓冲液将修饰蛋白稀释至100μg/ml，为修饰蛋白标 准储备液。

3.3未修饰蛋白标准曲线测定

移取未修饰蛋白标准储备液(100μg/ml)20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl至4ml 离心管中，分别用磷酸缓冲液定容至1.5ml，积分未修饰蛋白标准梯度溶液；分别加入0.5ml0.3％ 荧光胺丙酮溶液，在震荡混合器上剧烈震荡混合，室温放置8分钟后，测定荧光值(激发波 长为380nm，发射波长为475nm),得到荧光值与蛋白浓度的标准曲线。

3.4供试品标准曲线测定

移取修饰后蛋白标准储备液(100μg/ml)20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl至4ml 离心管中，同3.3步骤进行测定。

3.5计算公式

PEG结合数＝[1-(供试品溶液标准曲线斜率/未修饰蛋白标准曲线斜率)]×修饰位点数

3.6实验结果

比较例2：PEG释放+SDS-PAGE电泳法检测PEG定点修饰的门冬酰胺酶的PEG结合数实验步骤：

以下以酶解进行样品处理、SDS-PAGE电泳后碘染、Quantity One软件定量为例说明PEG 释放+SDS-PAGE电泳法检测PEG修饰蛋白PEG结合数完整的操作过程：

1酶解.

1.1胰酶溶液的配制

准确称取胰酶粉末2.5g，加入100mlPBS溶解，混匀，避免出现泡沫，损坏蛋白，过滤除 菌，即可用，4℃放置。

1.2样品溶液的制备

取已知蛋白含量的供试品溶液500μl，高温放置15min后，加入40μL的胰酶溶液，于37℃ 水浴酶解20h，备用。

2.SDS-PAGE电泳后碘染

2.1配制pH8.8的Tris-HCl缓冲液

9.08g Tris溶解在40ml纯化水中，用4mol/L盐酸调节pH值8.8，再用纯化水加至50ml，

4℃保存。

2.2配制pH6.8的Tris-HCl缓冲液

6.06g Tris溶解在40ml纯化水中，用4mol/L盐酸调节pH值6.8，再用纯化水加至50ml，4℃保存。

2.3 10％十二烷基硫酸钠(SDS)

10g SDS，用纯化水溶解并定容至100ml，室温保存。

2.4 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液

在900ml纯化水中溶解15.1g Tris和94g甘氨酸(电泳级)(pH8.0)，然后加入50ml10％ SDS(电泳级)或5g SDS，用纯化水补至1000ml。

2.5 5×非还原的上样缓冲液

量取1M Tris-HCL 1.25ml(称取1M Tris，量取200ml的双蒸水溶解，用HCl调节pH＝6.8， 备用)；称取BPB 25mg和量取甘油2.5ml置于10ml的塑料离心管中；加去离子水溶解后定容 至5ml；将定容好的溶液分装每份500μL，于室温保存。

2.6配制SDS-PAGE胶的比例如下

2.6.1 12％SDS-PAGE分离胶的配制

H₂O(1.6ml)，30％丙烯酰胺(2.0ml)，1.5M Tris-HCl(pH8.0)(1.3ml)，10％SDS(0.05ml)， 10％过硫酸铵(0.05ml)TEMED(0.002ml)

2.6.2 12％SDS-PAGE浓缩胶的配制

H₂O(1.4ml)，30％丙烯酰胺(0.33ml)，1.5M Tris-HCl(pH6.8)(0.25ml)，10％SDS(0.2ml)，10％过硫酸铵(0.2ml)TEMED(0.002ml)

2.6.3配制

按每块胶板需要5ml量的分离胶配制，加入胶板模具中，再加入异丙醇填满容器，将分 离胶压平整，约需要放置30～60分钟(室温不同，聚合时间不同，需要达到分离胶凝固)； 然后，将上层的异丙醇倒掉，每块胶板加入浓缩胶2ml的量，加满后立即插入梳齿，放置一 段时间(室温不同，聚合时间不同，需要达到浓缩胶凝固)，即可使用。

2.7Y-PALD-40K PEG溶液的配制

精密称取10mg Y-PALD-40K粉末，加水定溶至4ml，制成每lml含Y-PALC-40K PEG2.5mg的溶液，即为聚乙二醇贮备液，混匀，放置。

2.8标准梯度溶液的配制

分别取5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL的Y-PALD-40K PEG溶液(2.5mg/ml) 加入纯化水中配制成终体积为100μL的梯度溶液，混匀，即得标准梯度溶液。

2.9样品的制备和上样

分别取上述标准梯度溶液和供试品溶液100μL，加入5×非还原的上样缓冲液25μL，混匀， 离心，上样量均为8μL。加样时间要尽量短，避免样品扩散及边缘效应。

2.10电泳过程

按照顺序依次上样，加样完毕，盖好垂直电泳仪的盖子，链接电泳仪电源，打开电泳仪 电源开关后初始电压调至80V，时间约30～40min；当进入分离胶的时候将电压调至120V～150 V，时间约1.5～2.0h；当溴酚蓝迁移至胶底时，停止跑样，将蛋白胶拿出，按照下述方法进行 碘染色法进行显色。

2.11 10％高氯酸溶液的配制

用量筒量取100ml的高氯酸慢慢加入到900ml水中，混匀，即得。

2.12碘染液配制

准确称取BaCl₂粉末17.5g、KI粉末6g、I₂粉末3.9g溶于500ml的双蒸水中，避光保存。 2.13碘染色

电泳结束后，撬开玻璃板，将胶片做好标记后放在染色盒内，先用10％高氯酸溶液固定 10min，用水洗3遍后，再用碘染液覆盖胶片染色，1min左右就能显色，再立即用水脱色3～4 遍后，即可拍照。

3.Quantity One软件定量

3.1数据处理

将照片导出相机于电脑中，使用Quantity One 4.4.0软件进行定量功能处理。

3.2一些参数

如在一定范围内电泳电压、电流的调整、标准梯度溶液的制备、上样量的调整等均对实 验的结果无明显的影响。酶解条件如上述胰酶在pH值7.5～8.5，温度为37℃，酶解效力最强， 这些特定酶的最佳酶解条件也是本领域技术人员公知的常识。另外SDS-PAGE电泳所采用的 胶组分、含量、及其配置方法等也均为常规技术手段，可以根据待检样品分子量确定胶的组 分及含量等。

4.实验结果

样品名称/批次	ZHB202(20160803)	ZHB202(20170501)
			PEG结合数	2.13	2.2

实施例1：检测PEG随机修饰的胰激肽原酶的多关键参数

PEG随机修饰的胰激肽原酶，每个酶分子上结合了约9个PEG，采用的PEG修饰剂为M-PEG-10k(购自北京键凯科技有限公司)。

实验步骤：

1.相关溶液的配制

1.1流动相的配制

20mM pH6.5磷酸缓冲液+5％异丙醇(pb6.5+5％IPA),称取1.64gNaH₂PO₄和0.75gNa₂HPO₄，溶解并调pH为6.5后定容至1L，得到20mM pb6.5，量取950ml加入50ml异丙 醇，混匀并超声脱气10min，待用。

1.2PEG标准品溶液的配制

精密称取2mgPEG标准品(M-PEG-10k)粉末，用去离子水溶解并定容至1ml，得到2mg/ml 的PEG标准品溶液。

1.3原蛋白标准品溶液的配制

本公司制备的原蛋白胰激肽原酶(以下简称Kb)(购自常州千红生化制药股份有限公司， 批号：20170614)，其蛋白浓度经BCA法检测标定为25.4mg/ml，经PBS稀释后得到1mg/ml 原蛋白标准品溶液。

2.仪器及参数

2.1UPLC(含紫外和示差检测器)

品牌：Waters，型号：H-Class；

2.2色谱柱

品牌：Waters，型号：xBridge BEH SEC 450，3.5μm，450A，7.8×300mm；

2.3色谱条件

3.建立标准曲线

3.1Kb标准品的标准曲线

将1mg/mlKb标准品溶液用PBS准确稀释至0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、 0.8mg/ml、1.0mg/ml，按照上述色谱条件进样检测，根据其浓度与相对应的紫外吸收值峰面 积进行线性拟合，建立标准曲线UV_原蛋白-C_原蛋白(标曲①)，根据其浓度与相对应的示差吸收 值峰面积进行线性拟合，建立标准曲线RI_原蛋白-C_原蛋白(标曲②)。

3.2PEG标准品的标准曲线

将2mg/ml的PEG标准品溶液用去离子水稀释至0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml，按照上述色谱条件进样检测，根据其浓度与相对 应的示差吸收值峰面积进行线性拟合，建立标准曲线RI_PEG-C_PEG(标曲③)。

4.供试品检测

以本公司制备的随机修饰胰激肽原酶(简称ZHB206，制备方法详见我司专利CN201610688896.6，药用激肽原酶的PEG修饰物及其制备方法和应用，本次供试品批号20170518)作为供试品，按照上述色谱条件进样检测。

5.实验结果及计算

5.1标曲的拟合

标曲①：UV_原蛋白-C_原蛋白，见图1、2、表1。

表1不同浓度的Kb在紫外下的色谱分离相关参数

标曲②：RI_原蛋白-C_原蛋白，见图3、4、表2。

表2不同浓度的Kb在示差下的色谱分离相关参数

标曲③：RI_PEG-C_PEG，见图5、6、表3。

表3不同浓度的PEG在示差下的色谱分离相关参数

5.2供试品ZHB206的检测结果

见图7、8、表4、5：

表4供试品ZHB206在紫外下的色谱分离相关参数

保留时间/min	面积	％面积	USP拖尾因子	USP理论塔板数
					12.827	320400	100	1.29	2446

表5供试品ZHB206在示差下的色谱分离相关参数

保留时间/min	面积	％面积	USP拖尾因子	USP理论塔板数
					12.854	172260	99.11	1.25	2664
16.929	1549	0.89	1.13	17254

5.3根据检测结果和上述计算公式，对供试品的纯度、蛋白浓度、游离PEG和PEG结合数计 算结果如下：

表6多关键参数检测结果

检测项目	检测结果
		纯度/％	100
蛋白浓度/mg/ml	0.32
		游离PEG/mg/ml	0.0138
PEG结合数	9.28

本发明方法所检测得到的PEG随机修饰的胰激肽原酶PEG结合数为9.28个，与比较例 1中采用荧光胺检测得的9.2个相符合，故表明采用该方法可准确、快捷的检测出修饰后蛋白 的PEG结合数。

5.4对该方法检测PEG结合数的精密度进行考察，不同操作人员于不同时间，照上述方法检 测，结果如下：

表7PEG结合数精密度考察

检测项目

检测结果1

检测结果2

检测结果3

Mean

SD

RSD

PEG结合数

9.28

9.41

9.42

9.37±0.09

0.0781

0.83

实施例2：检测PEG定点修饰的门冬酰胺酶的多关键参数

PEG定点修饰的门冬酰胺酶，其原蛋白为ASP，每个酶分子上结合了约2个PEG，采用的PEG修饰剂为M-PEG-40k(购自北京键凯科技有限公司)。

实验步骤：

1.相关溶液的配制

1.1流动相的配制

20mM pH6.5磷酸缓冲液+10％异丙醇(pb6.5+5％IPA),称取1.64gNaH₂PO₄和0.75gNa₂HPO₄，溶解并调pH为6.5后定容至1L，得到20mM pb6.5，量取900ml加入100ml异丙 醇，混匀并超声脱气10min，待用。

1.2PEG标准品溶液的配制

精密称取2mgPEG标准品(M-PEG-40k)粉末，用去离子水溶解并定容至1ml，得到2mg/ml 的PEG标准品溶液。

1.3原蛋白标准品溶液的配制

将门冬酰胺酶(以下简称ASP)标准品(购自常州千红生化制药股份有限公司，批号： 20120170118)用去离子水溶解，其蛋白浓度经BCA法检测标定为1mg/ml。

2.仪器及参数

2.1UPLC(含紫外和示差检测器)

品牌：Waters，型号：H-Class；

2.2色谱柱

品牌：Waters，型号：xBridge BEH SEC 450，3.5μm，450A，7.8×300mm；

2.3色谱条件

3.建立标准曲线

3.1ASP标准品的标准曲线

将1mg/mlASP标准品溶液用去离子水准确稀释至0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、 0.8mg/ml、1.0mg/ml，按照上述色谱条件进样检测，根据其浓度与相对应的紫外吸收值峰面 积进行线性拟合，建立标准曲线UV_原蛋白-C_原蛋白(标曲①)，根据其浓度与相对应的示差吸收 值峰面积进行线性拟合，建立标准曲线RI_原蛋白-C_原蛋白(标曲②)。

3.2PEG标准品的标准曲线

将2mg/ml的PEG标准品溶液用去离子水稀释至0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml，按照上述色谱条件进样检测，根据其浓度与相对 应的示差吸收值峰面积进行线性拟合，建立标准曲线RI_PEG-C_PEG(标曲③)。

4.供试品检测

以本公司中试生产的定点修饰ASP(以下简称ZHB202，具体制备方法参见本公司专利 CN201410837456.3，聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶及其制备方法与应用)作为供试品，本 次供试品批号为20160803，分别用PBS适当稀释后，按照上述色谱条件进样检测。

5.实验结果及计算

5.1标曲的拟合

标曲①：UV_原蛋白-C_原蛋白，见表8、图9。

表8不同浓度的ASP在紫外下的色谱分离相关参数

标曲②：RI_原蛋白-C_原蛋白，见表9、图10。

表9不同浓度的ASP在示差下的色谱分离相关参数

标曲③：RI_PEG-C_PEG，见表10、图11。

表10不同浓度的PEG在示差下的色谱分离相关参数

5.2供试品ZHB202的检测结果

紫外：

表11供试品ZHB202在紫外下的色谱分离相关参数

供试品	保留时间/min	面积	％面积	USP拖尾因子	USP理论塔板数
						ZHB202	12.209	154550	97.22	1.85	5343

示差：

表12供试品ZHB202在示差下的色谱分离相关参数

供试品	保留时间/min	面积	％面积	USP拖尾因子	USP理论塔板数
						ZHB202	12.24	74997	100	1.23	5747

5.3根据检测结果和上述计算公式，对供试品的纯度、蛋白浓度、游离PEG和PEG结合数计 算结果如下：

表13多关键参数检测结果

检测项目	检测结果
		纯度/％	97.22
蛋白浓度/mg/ml	1.03
		游离PEG/mg/ml	0
PEG结合数	2.32

实施例3：检测PEG随机修饰的胰激肽原酶的纯度的方法验证

1精密度

重复性：平行配制5份供试品溶液，分别进针照上述色谱条件进行分析；

中间精密度：另一人于另一人平行配制6份供试品溶液，重新配制流动相，照上述色谱 条件进行分析并采集色谱图，结果如下：

表14精密度考察

2线性及LOD

以1mg/ml浓度记为100％，一共设置6个浓度水平，每个浓度平行进样3次，色谱峰采 集原始数据如下：

表15线性考察-1

表16线性考察-2

备注：40％浓度水平在配制过程中操作有误导致结果不可用，故在此处删除。

三次线性曲线及方程如下见图12，其线性相关系数均大于0.999。

LOD值通过如下公式进行计算：LOD＝3.3σ/S×100％，σ＝响应值的标准方差，S＝线性 方程的斜率，计算如下：

表17LOD的计算

因此，LOD＝3.3×1605÷635189×100％＝0.01％，说明该方法灵敏度较高。

3溶液稳定性

3.1样品溶液的稳定性考察

表18样品溶液稳定性考察

说明样品溶液室温放置5天仍非常稳定，由于样品配制后进行液相分析的时间一般不会 超过5天，故此后的时间未再继续进行考察。

3.2空白溶液的稳定性考察

见图13，空白虽在0-4天内在主峰出峰位置无干扰，空白溶液的稳定性也较好。

实施例4：检测修饰蛋白游离PEG含量的方法验证过程

本方法可以用于检测游离PEG，对检测方法的线性、准确定和定量限进行考察。

实验条件与实施例1一致。

1.线性

取上述配制的2mg/mlPEG标准品溶液，用去离子水稀释至0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2 mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml，依照实施例1方法分别进样，采集色谱图，考察0.05～1.0mg/ml浓度范围内的线性关系。结果如图14、15、表19。

表19不同浓度的PEG在示差下的色谱分离相关结果参数

根据采集得到的峰面积对浓度水平进行线性拟合，R²≥0.9990，表明本方法线性关系良好。 2.准确度

取一定量的ZHB206样品，添加一定浓度的PEG标准品溶液，制备得到低、中、高三个不同浓度的样品，每个浓度平行配制3份样品，同样照实施例1方法分别进样，采集色谱图，以计算得到的回收率RSD来考察准确度。

表20准确度考察

平均回收率为101.83％，回收率的RSD为1.92％，表明方法的准确度较好。

3.定量限(LOQ)

将PEG标准品溶液稀释不同的浓度后进样，以信噪比为10:1时响应浓度或注入仪器的量 确定为定量限。见图16、表21。

表21LOD的色谱分离相关结果参数

保留时间	面积	％面积	S/N	USP拖尾	USP理论塔板数
						16.94	3677	100	15.43601	1.1	17015

当PEG标准品溶液稀释至0.05mg/ml，进样量为5μg时，S/N为15.43，即为定量限，可以有效对PEG残留进行检出。

Claims (8)

1.一种PEG修饰蛋白多关键参数同时高效液相检测方法，同时检测PEG修饰蛋白的纯度、蛋白浓度、PEG结合数和游离PEG，所述方法采用紫外检测和示差检测联用。

2.权利要求1所述的PEG修饰蛋白多关键参数检测方法，其特征在于包含以下步骤：

首先，分别对PEG修饰蛋白的原蛋白及其所用PEG的标准品进行紫外和/或示差检测，并建立标准曲线：

将蛋白浓度已经标定确定的原蛋白标准品稀释，根据其浓度C_原蛋白与相对应的紫外吸收值峰面积UV_原蛋白进行线性拟合，建立标准曲线①：UV_原蛋白-C_原蛋白

将蛋白浓度已经标定确定的原蛋白标准品稀释，根据其浓度C_原蛋白与相对应的示差吸收值峰面积RI_原蛋白进行线性拟合，建立标准曲线②：RI_原蛋白-C_原蛋白；

将PEG标准品溶液稀释，根据其浓度C_PEG与相对应的示差吸收值峰面积RI_PEG进行线性拟合，建立标准曲线③：RI_PEG-C_PEG；

其次，对供试品同时以紫外、示差检测器检测，并计算得到以下参数：

1)纯度测算：体积排阻色谱柱根据表观分子量大小对供试品的纯度进行分析，采集紫外检测器下的出峰，积分计算纯度；

2)蛋白浓度测算：将供试品溶液在紫外检测器下的峰面积UV_修饰蛋白代入标准曲线①，计算得到供试品中的蛋白浓度C_原蛋白；

3)游离PEG测算：将供试品溶液在示差检测器下游离PEG的峰面积RI_游离PEG代入标准曲线③，计算得到供试品中游离PEG浓度C_游离PEG；

4)PEG结合数测算：将上述2)中计算得到含量C_原蛋白代入标准曲线②，计算得原蛋白的示差吸收值峰面积RI_原蛋白；RI_PEG＝RI_修饰蛋白-RI_原蛋白，代入标准曲线③计算得到修饰蛋白中PEG所占有的含量C_PEG，

其中，C_原蛋白和C_PEG分别为修饰蛋白中原蛋白部分和PEG部分的质量浓度，M_原蛋白和M_PEG分别为原蛋白部分和PEG部分的分子量。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱或者反相色谱进行分离检测。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中流动相含5％(V/V)异丙醇的20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中流动相流速为0.6ml/min。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中色谱柱柱温35℃。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中紫外检测器波长为280nm。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，PEG修饰蛋白是聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶。