JP6702962B2 - 改変ｆｇｆ−２１ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

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Description

この開示は、ペプチドによって任意に置換される内部欠失を含む、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、および疾患および障害の治療または予防に対するその使用に関する。
線維芽細胞成長因子は、発育中のおよび成人の組織で広く発現されるポリペプチドであり（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ，３：２３９−２４３，１９９１）、複数の生理機能に重大な役割を果たす。（ＭｃＫｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：１３５−１７６，１９９８；Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｗ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５７５−６０６（１９８９）。文献によれば、ＦＧＦファミリーは少なくとも２２のメンバーからなる。（Ｒｅｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．３１３：１３９−１５７（２００３））。
線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）は文献に記載されている（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１４９２：２０３−２０６（２０００）、国際公開第０１／３６６４０号、および国際公開第０１／１８１７２号、ならびに米国特許公開第２００４０２５９７８０号、それらの各々がその全体において参照により本明細書に援用される）。他のＦＧＦと異なり、ＦＧＦ−２１は増殖および腫瘍化の影響がないと報告されている（Ｏｒｎｉｔｚ ａｎｄ Ｉｔｏｈ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００１，２（３）：ｒｅｖｉｅｗｓ３００５．１-３００５．１２）。
特定のＦＧＦ−２１ポリペプチドおよびその使用は、米国特許出願公開第２００１００１２６２８号、米国特許第６，７１６，６２６号、米国特許出願公開第２００４／０２５９７８０号、国際公開第０３／０１１２１３号、Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００５ Ｊｕｎ；１１５（６）：１６２７−３５、国際公開第０３／０５９２７０号、米国特許出願公開第２００５／０１７６６３１号、国際公開第２００５／０９１９４４号、国際公開第２００７／０２９３４３０号、米国特許出願公開第２００７／０２９３４３０号、国際公開第２００８／１２１５６３号、米国特許第４，９０４，５８４号、国際公開第９９／６７２９１号、国際公開第９９／０３８８７号、国際公開第００／２６３５４号、および米国特許第５，２１８，０９２号に記載され、それらの各々がその全体において参照により本明細書に援用される。
ヒトＦＧＦ−２１は、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質分解を経る、凝集塊をｉｎ ｖｉｔｒｏで形成する、脱アミドを経る傾向を有すると報告されており（Ｇｉｍｅｎｏ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２０１４ Ｊｕｎ；２５（６）：３０３−１１、米国特許第８，３６１，９６３号、Ｈｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（１１）：ｅ４９３４５、米国特許出願公開第号２００７／０２９３４３０号、国際公開第２００６／００６５５８２号）、ＦＧＦ−２１を含む医薬品組成物の保存期間を制限する可能性がある。ポリペプチド製剤の凝集塊および脱アミド化された形態は免疫原性を増加し得る場合がある（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，” Ａｕｇｕｓｔ ２０１４；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａｍ （ｅｄ．），“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｆｏｃｕｓ Ｇｒｏｕｐ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１１）を参照されたい）。
国際公開第２００８／１２１５６３号、および米国特許出願公開号２００８／０２５５０４５号として公開された先の研究は、所定位置でポリ（エチレングリコール）に連結された天然にコードされていないアミノ酸を含むように改変された特定のヒトＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の増加、および／または、保持された生物活性を呈したことを示した。しかしながら、例証されたヒトＦＧＦ−２１ポリペプチドは、本明細書に記載される配列欠失、または置換を含まなかった。
線維症は、臓器または組織における過剰な線維性結合組織の形成である。線維組織の過剰な堆積は、臓器または組織の機能の損傷をもたらす可能性のある病理学的条件と関係する。冒された臓器として、肺（肺（ｌｕｎｇ）線維症または肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）線維症）、肝臓（肝（ｌｉｖｅｒ）線維症または肝（ｈｅｐａｔｉｃ）線維症）、腎臓（腎（ｋｉｄｎｅｙ）線維症または腎（ｒｅｎａｌ）線維症）および心臓（心臓線維症）を含む場合がある。また、線維症は、関節、皮膚、腸、骨髄、およびその他を含む他の組織および臓器を冒す場合がある。例示的な線維症の病態または疾患として、制限されないが、肝臓を冒す非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；腎臓を冒す、糖尿病性腎疾患および糖尿病腎症；ならびに、心臓を冒す代謝性心不全が挙げられる。例えば、ＮＡＳＨは、アルコールをほとんどまたは全く摂取しない人々の肝臓における脂肪、炎症および傷害を特徴とし、肝硬変をもたらす可能性がある。ＮＡＳＨは、血液脂質レベルの上昇、糖尿病または糖尿病前症を有することの多い、太り過ぎまたは肥満の中年の人々において診断される傾向がある。
本発明の実施形態は、とりわけＦＧＦ−２１ポリペプチドの活性および生産、ならびに治療半減期の改善等の、改善された生物学的または薬理学的な特性を有するＦＧＦ−２１ポリペプチドの生産、ならびに障害を治療または予防する方法に関連する問題に取り組む。
配列番号１〜７から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドであって、
（ｉ）２個〜１９個のアミノ酸（５個〜１９個のアミノ酸等）の内部欠失であって、上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１６〜１３４に対応する領域内あり、
上記内部欠失が、０個〜１２個のアミノ酸の長さを有する置換ペプチドによって置換される；ならびに
（ｉｉ）９以下の追加のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入、
を含む上記アミノ酸配列を除く、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが本明細書において提供される。
また、本明細書に記載されるいずれかの改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物が本明細書において提供される。
配列番号１〜７から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドであって、
（ｉ）２個〜１９個のアミノ酸（５個〜１９個のアミノ酸等）の内部欠失であって、
上記内部欠失が、配列番号１のアミノ酸１１６〜１３４に対応する領域内にあり、
上記内部欠失が、０個〜１２個のアミノ酸の長さを有する置換ペプチドによって置換される；ならびに
（ｉｉ）９個以下の追加のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入；ならびに
（ｉｉｉ）融合パートナー、
を含む上記アミノ酸配列を除く、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが本明細書において提供される。
また、グルコースおよび脂質のホメオスタシス、グルコース取込み、ＧＬＵＴ １発現、および／またはグルコース、トリグリセリド、インシュリンもしくはグルカゴンの血清濃度の少なくとも１つを調節する方法であって、それを必要とする患者において、治療的有効量の本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを上記患者に投与することを含む方法、が本明細書において提供される。
また、インスリン感受性を増加させる、アディポネクチンのレベルを増加させる、血糖のレベルを低下させる、グルカゴンのレベルを低下させる、トリグリセリドのレベルを低下させる、フルクトサミンのレベルを低下させる、低密度コレステロールのレベルを低下させる、またはＣ反応性蛋白質のレベルを低下させる方法であって、それを必要とする患者において、または該患者の血液試料、血清もしくは別の試料において、治療的有効量の本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを上記患者に投与することを含む方法、が本明細書において提供される。
また、治療必要とする患者において、肥満、糖尿病、膵炎、インスリン抵抗性、高インスリン血症、グルコース不耐症、高血糖、メタボリックシンドローム、耐糖能障害、グルコースクリアランス不全（ｉｎａｄｅｑｕａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）、高血糖、Ａ型インスリン抵抗性、、Ｃ型インスリン抵抗性（ＡＫＡ ＨＡＩＲ−ＡＮ症候群）、ラブソン−メンデンホール症候群、ドナヒュー症候群もしくはレプレコーニズム、アンドロゲン過剰症、男性型多毛症もしくは黒色表皮肥厚症、およびプラーダー−ヴィリ症候群から選択される病態または傷害を治療する方法であって、治療的有効量の本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを患者に投与することを含む方法、が本明細書において提供される。
また、治療を必要とする患者において、１型糖尿病、２型糖尿病または肥満を治療する方法であって、治療的有効量の本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを上記患者に投与することを含む方法、が本明細書において提供される。
また、有効量の本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、線維症に関連する疾患を治療する方法が本明細書において提供される。
また、有効量の本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、線維症に関連する疾患を治療する方法が本明細書において提供される。
また、治療を必要とする患者において、肝線維症または肝硬変を治療する方法であって、治療的有効量の本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを患者に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
また、治療を必要とする患者において、ＮＡＳＨを治療または予防する方法であって、
治療的有効量の本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを患者に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
また、ＮＡＳＨおよび／または肝線維症を治療する方法であって、本明細書に記載される有効量の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
また、治療的有効量の本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを患者に投与することを含み、任意に上記患者がＮＡＳＨを発症するリスクがあるか、またはＮＡＳＨと診断されている、それを必要とする患者において肝臓の脂肪画分を減少させる方法が、本明細書において提供される。
また、アディポネクチンレベル（血漿総アディポネクチン、および／または高分子量アディポネクチン等）を増加させる方法であって、それを必要とする患者において、治療的有効量の本明細書に記述される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを患者に投与することを含み、
任意に上記患者がＮＡＳＨを発症するリスクがあるか、またはＮＡＳＨと診断されている、方法が本明細書において提供される。
また、治療を必要とする患者において心不全または心臓線維症を治療する方法であって、治療的有効量の本明細書に記述される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを患者に投与することを含む方法、が本明細書において提供される。
また、治療を必要とする患者において、腎臓または腎線維症を治療する方法であって、治療的有効量の本明細書に記述される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを患者に投与することを含む方法、が本明細書において提供される。
また、治療を必要とする患者において、肺線維症を治療する方法であって、治療的有効量の本明細書に記述される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを患者に投与することを含む方法、が本明細書において提供される。
治療を必要とする患者において、線維症に関連する疾患を治療する方法であって、上記患者に有効量の１以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを投与することを含み、上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、配列番号１〜配列番号７、および配列番号２０１から選択されるアミノ酸配列を有するヒトＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を持ち、上記線維症に関連する疾患が、ＮＡＳＨ、肝線維症、糖尿病性腎疾患、慢性腎疾患、腎線維症、肺線維症、心臓線維症、心不全、および代謝性心不全から選択される、線維症に関連する疾患を治療する方法が本明細書において提供される。
例示的な改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド配列。指定の座標は、配列番号１の野生型ＦＧＦ−２１ポリペプチドに関する。全ポリペプチドは各々、Ｎ末端配列ＭＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹに続いて１０８位の指定のアミノ酸、それに続いて「アミノ酸１０９〜１４９」と標識される領域の指定の配列、それに続いてＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭ、それに続いて「アミノ酸１６９〜１８１」と標識される領域の指定の配列を含む。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの全アミノ酸配列も、下記実施例４において示される。
ＰＥＧ化化合物１およびＰＥＧ化化合物２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦＧＦ−２１活性に関する例示的な用量反応曲線（細胞に基づく分析において細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）１／２のＦＧＦ２１依存性リン酸化によって測定される）。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの熱安定性の評価のために行なわれた示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）の代表的な結果。この実施例において、ＰＥＧ化化合物２はＰＥＧ化化合物１よりもおよそ８℃高い遷移中点（「Ｔｍ」）温度を有することが示された。熱可逆性は９５％超（図示せず）であった。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの熱安定性の評価のために行なわれた、熱走査蛍光（ＴＳＦ）の代表的な結果。この図では、化合物１０は化合物１（Ｅ．コリにおける発現のためにＮ末端メチオニンが含まれる点を除いて、野生型のＦＧＦ−２１配列を有する）よりもおよそ８℃高い遷移中点（「Ｔｍ」）温度を有することが示された。
左パネル：ＰＥＧ化化合物１およびＰＥＧ化化合物２に対する２５℃における経時的なの脱アミドの測定（電荷不均一性によって示される）。ＰＥＧ化化合物２は、大幅に遅延した脱アミドを示す、減少した電荷不均一性生成（ｃｈａｒｇｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を示した。右パネル：各々ｐＨ７．０および７．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でショ糖／ヒスチジンバッファー中でのＰＥＧ化化合物１およびＰＥＧ化化合物２に対する４０度での経時的な凝集体生成の測定（サイズ排除クロマトグラフィーによって測定される）。ＰＥＧ化化合物２は減少した凝集体生成を示した。これらの結果は、ともに、より高い貯蔵安定性、およびＰＥＧ化化合物１と比べてＰＥＧ化化合物２についてより高濃度に製剤化される可能性を予測する。
ショ糖／ヒスチジンバッファー中ｐＨ６．５（上パネル）、ショ糖／ヒスチジンバッファー中ｐＨ７．０（中央パネル）、およびショ糖／ＴＲＩＳバッファー中ｐＨ８．３（下パネル）での改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対する経時的な高分子量（ＨＭＷ）凝集体生成の測定。ＨＭＷ凝集体生成は、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０でｐＨ８．３よりも明らかであった。少数の化合物については、ＨＭＷ凝集体生成は化合物１に類似、またはそれよりも高かったが、大多数のＦＧＦ−２１変異体は、ＰＥＧ化化合物１と比較して減少したＨＭＷ凝集体生成を示した。
ショ糖／ヒスチジンバッファー中ｐＨ６．５（上パネル）、ショ糖／ヒスチジンバッファー中ｐＨ７．０（中央パネル）、およびショ糖／ＴＲＩＳバッファー中ｐＨ８．３（下パネル）での改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの脱アミド傾向の測定（経時的な酸性変異体の形成によって示される）。ＰＥＧ化化合物１と比較して、示される化合物は、いずれも減少した電荷酸性変異体生成を呈し、脱アミドの減少示した。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対する可溶性の測定。所与のポリペプチド濃度の高分子量凝集塊の比較的より低い形成は、より高濃度に製剤化される能力を結果としてもたらす、より大きな可溶性を示す。試験した化合物の高分子量（ＨＭＷ）種のタンパク質濃度対パーセントフラクションに関する観察は、ｐＨ７．２のＰＢＳバッファー中のプラグフロー濾過アッセイによって決定される。これらの観察の各々に対して適合された線の線形化された勾配を、タンパク質凝集傾向の推定として使用した。
７日間のタンパク質と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインキュベーションに続くＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答を有するドナーのパーセンテージ。調節タンパク質は、既知のＴ細胞活性化特性を有するＥ．コリに発現されるタンパク質である。化合物１（Ｅ．コリ中での発現のためにＮ末端メチオニンを含むという点を除いて、野生型ＦＧＦ−２１配列を有する）に対する非ＰＥＧ化改変ＦＧＦ−２１の比較。「ＣｏｎＡ」は、既知の免疫原性タンパク質であるコンカナバリンＡに対する略語である。
ｏｂ／ｏｂマウスに対する０．０５ｍｇ／ｋｇの単回Ｓ．Ｃ．投与の後のＰＥＧ化化合物１およびＰＥＧ化化合物２の薬物動態学の分析。改変ＦＧＦ−２１化合物のレベルを、総ポリペプチドおよびＣ末端インタクト（活性）として測定した。ＰＥＧ化化合物２は、ＰＥＧ化化合物１よりＣ末端インタクト形態に対してはるかに大きな合計ＡＵＣを示し、ＰＥＧ化化合物２の大幅に減少されたｉｎ ｖｉｖｏタンパク質分解を示した。結果を、上パネルにおいてグラフで示し、薬物動態学のパラメーターを左下パネル（ＰＥＧ化化合物１）および右下パネル（ＰＥＧ化化合物２）において表にする。
カニクイザルへの投与の後のＰＥＧ化化合物１およびＰＥＧ化化合物２の薬物動態学分析。改変ＦＧＦ−２１化合物のレベルを、（Ａ）合計および（Ｂ）Ｃ末端インタクト（活性）ポリペプチドの両方として測定した。ＰＥＧ化化合物２は、ＰＥＧ化化合物１よりＣ末端インタクト形態に対してはるかに大きな合計ＡＵＣを示し、ＰＥＧ化化合物２の大幅に減少されたｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解を示した。
ｏｂ／ｏｂマウスにおける反復投薬研究の２１日目における糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）対ビヒクルの変化。
ｏｂ／ｏｂマウスにおける反復投薬研究の２１日間の体重。
ｏｂ／ｏｂマウスにおける反復投薬研究の２１日間の体重のパーセント変化。
ｏｂ／ｏｂマウスにおける２１日間の反復投薬研究の間の血漿インスリン濃度。
ｏｂ／ｏｂマウスにおける２１日間の反復投薬研究の間の血漿ブドウ糖濃度。
ビヒクル治療対照とのパーセンテージ差として表わされたｏｂ／ｏｂマウスにおける、２１日間の反復投薬研究の間のＡＵＣ血漿ブドウ糖濃度の変化。
ｏｂ／ｏｂマウスにおける２１日間の反復投薬研究の間の血漿トリグリセリド濃度。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における体重変化。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における総摂食量。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における体重。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における肝臓重量。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における肝臓対体重比。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における全血グルコース。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における血漿ＡＬＴ。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における血漿トリグリセリド。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における血漿総コレステロール。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における肝臓トリグリセリド。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における肝臓コレステロール。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究におけるＨＥ染色肝臓切片の代表的な顕微鏡写真。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究におけるＮＡＦＬＤ活性スコア。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における脂肪症スコア。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における小葉内炎症スコア。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における肝細胞風船様腫大スコア。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究におけるシリウスレッド染色肝臓切片の代表的な顕微鏡写真。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における線維症面積。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究におけるＦ４／８０免疫染色肝臓切片の代表的な顕微鏡写真。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における炎症面積。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究におけるオイルレッド染色肝臓切片の代表的な顕微鏡写真。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における脂肪沈着面積。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における相対的遺伝子発現。（Ａ）アルファ−ＳＭＡ（Ｂ）ＴＩＭＰ−１、（Ｃ）Ｉ型コラーゲン、および（Ｄ）ＴＧＦ−βに関する発現の結果。
Ｆｃドメイン、ＰＫＥアドネクチンまたはヒト血清アルブミンポリペプチドへ融合された例示的な改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド配列。「融合配置」は、Ｎ末端からＣ末端への融合蛋白質の一般的な配置を説明し、限定されないが、対応するポリペプチド配列を例証することが意図される。ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）：配列番号３２１のアミノ酸配列有する改変ヒト血清アルブミン；ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ；ｄｅｓ Ｌｅｕ−５８５）：配列番号３２２のアミノ酸配列を有する改変ヒト血清アルブミン；ＰＫＥ（１）：配列番号３１９のアミノ酸配列を有するＰＫＥアドネクチン；ＰＫＥ（２）：配列番号３２０のアミノ酸配列を有するＰＫＥアドネクチン：３２０。Ｌに続く番号はリンカーを示す；ＦＧＦ−２１（Ｃｍｐｄ．２）は、内部欠失および置換ペプチドを含むＦＧＦ−２１配列（具体的には、Ｃｍｐｄ．２）を示し、ＦＧＦ−２１（Ｃｍｐｄ．１）は上記欠失および置換ペプチドを欠くＦＧＦ−２１配列（具体的には、Ｃｍｐｄ．１）を示す。ＦＧＦ−２１（Ｃｍｐｄ．１）およびＦＧＦ−２１（Ｃｍｐｄ．２）は、化合物１および化合物２に含まれるＮ末端メチオニンを含んでもよく、またはそれを欠いてもよい。Ｆｃポリペプチド配列の変異型は、挿入句的な方法、例えばＦｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１）で特定される。ＦＧＦ−２１−１ａａ（Ｃｍｐｄ．２）およびＦＧＦ−２１−３ａａ（Ｃｍｐｄ．２）の表記は、そのＣ末端からアミノ酸（それぞれ、１個または３個）の列挙された数の欠失によって改変された化合物２の配列を指す。
アドネクチン融合パートナーに融合された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対する可溶性の測定。所与のポリペプチド濃度における高分子量凝集塊の比較的より低い形成は、より高濃度に製剤化される能力を結果として生じ得る、より大きな可溶性を示す。試験した化合物の高分子量（ＨＭＷ）種のタンパク質濃度対パーセントフラクションについての観察は、ｐＨ７．２のＰＢＳバッファー中でのプラグフロー濾過アッセイによって特定される。これらの観察の各々に対して適合された線の直線化された勾配を、タンパク質凝集傾向の推定として使用した。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の体重。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物（「ＰＥＧ−Ｃｍｐｄ」）１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の肝臓重量。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。肝臓重量は、９週〜１５週に亘って治療されたマウスについて有意に減少した（ｐ＜０．００１）。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の肝臓対体重比。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。肝臓対体重比は、９週〜１２週または９週〜１５週に亘って治療されたマウスについて有意に減少した。（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の右腎重量。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の左腎重量。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の全血グルコース。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。全血グルコースは、９週〜１５週に亘って治療されたマウスについて有意に減少した（ｐ＜０．０５）。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の血漿ＡＬＴ。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。血漿ＡＬＴは、９週〜１５週に亘って治療されたマウスについて有意に減少した（ｐ＜０．０１）。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の血漿トリグリセリド。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の血漿総コレステロール。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の肝臓トリグリセリド。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。肝臓トリグリセリドは、９週〜１２週または９週〜１５週に亘って治療されたマウスについて有意に減少した（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の肝臓コレステロール。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。肝臓コレステロールは、９週〜１２週または９週〜１５週に亘って治療されたマウスについて有意に減少した（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）。
９週〜１２週の間ビヒクル（Ａ〜Ｂ）またはＰＥＧ化合物１（Ｃ〜Ｄ）により、９週〜１５週の間ビヒクル（Ｅ〜Ｆ）またはＰＥＧ化合物１（Ｇ〜Ｈ）により治療されたマウスのＨＥ染色肝臓切片の代表的な顕微鏡写真。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群のＮＡＦＬＤ活性スコア。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。ＮＡＦＬＤ活性スコアは、９週〜１２週または９週〜１５週に亘って治療されたマウスについて有意に減少した（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）。
９週〜１２週の間ビヒクル（Ａ〜Ｂ）またはＰＥＧ化合物１（Ｃ〜Ｄ）で、９週〜１５週の間ビヒクル（Ｅ〜Ｆ）またはＰＥＧ化合物１（Ｇ〜Ｈ）で治療されたマウスのシリウスレッド染色肝臓切片の代表的な顕微鏡写真。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の肝線維症面積の要約。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。線維症面積は、ＰＥＧ化合物１で９週〜１５週の間治療されたマウスについて有意に減少した（ｐ＜０．０５）。
９週〜１２週の間ビヒクル（Ａ〜Ｂ）またはＰＥＧ化合物１（Ｃ〜Ｄ）で、９週〜１５週の間ビヒクル（Ｅ〜Ｆ）またはＰＥＧ化合物１（Ｇ〜Ｈ）で治療されたマウスのＦ４／８０免疫染色された肝臓の代表的な顕微鏡写真。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の炎症面積の要約。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。
９週〜１２週の間ビヒクル（Ａ〜Ｂ）またはＰＥＧ化合物１（Ｃ〜Ｄ）で、９週〜１５週の間ビヒクル（Ｅ〜Ｆ）またはＰＥＧ化合物１（Ｇ〜Ｈ）で治療されたマウスのオイルレッド染色肝臓切片の代表的な顕微鏡写真。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における治療群の脂肪沈着面積の要約。Ａ．９週〜１２週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。Ｂ．９週〜１５週の間ビヒクルまたはＰＥＧ化合物１で治療されたマウスの比較。脂肪沈着面積は、９週〜１２週または９週〜１５週に亘って治療されたマウスについて有意に減少した（いずれもｐ＜０．００１）。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における血清総アディポネクチン測定。５週〜９週または７週〜９週の間治療されたマウス由来のターミナル血漿試料（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ ｓａｍｐｌｅ）において、血清総アディポネクチンは、ビヒクルで治療されたマウスと比較して、３．０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物１で治療されたマウスにおいて有意に増加した（ｐ＜０．００１、ダネットのＴ検定）
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における血清総アディポネクチン測定。１２週または１５週のマウスに由来する最終血漿試料において、血清総アディポネクチンは、ビヒクルで治療されたマウスと比較して、３．０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物１で治療されたマウスで有意に増加した（ｐ＜０．０５、ダネットのＴ検定）。
３つのＦＧＦ２１変異体に対する濃度反応曲線：５ｈ Ｅｌｋ１ルシフェラーゼ分析において、Ｎ−末端Ｈｉｓタグ付き化合物１（Ｈｉｓ−Ｃｍｐｄ１）、ＰＥＧ化合物１（ＰＥＧ−Ｃｍｐｄ１）、およびＰＥＧ化合物２（ＰＥＧ−Ｃｍｐｄ２）。値は１つの実験当たり３つまたは４つの複製で６つの独立した実験に由来する。Ｚ’値は、０．６〜０．９の間で変化し、許容可能な分析品質（Ｚ’＞０．５）を示した。
細胞に基づくＥｌｋ１ルシフェラーゼ分析において測定されたＦＧＦ−２１変異体の効能。測定点はそれぞれ個々の複製を示し、バーは平均値を表わす。値は、モル中の測定されたＥＣ５０値の常用対数として表される。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける体重のパーセント変化に対するＰＥＧ化合物２の単独の急性投薬の影響。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ビヒクル（２５０ｍＭショ糖／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３）または、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、もしくは１．０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物２のいずれかで、ｎ＝１０／群で治療した。ＳＣ投薬後ベースライン（０）、２４時間、４８時間、７２時間および１４４時間のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける体重のパーセント変化を特定した。値はいずれも、平均±ＳＥＭ ＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ビヒクル（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後のダネットの検定）。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血漿総アディポネクチンに対するＰＥＧ化合物２の単回の急性投薬の影響。ＳＣ投薬後ベースライン（０）時間、２４時間、４８時間、７２時間および１４４時間の血漿総アディポネクチン濃度を特定した。絶食していないＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ビヒクル（２５０ｍＭショ糖／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３）または、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、もしくは１．０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物２のいずれかで、ｎ＝１０／群で治療した。値はいずれも、平均±ＳＥＭ ＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ビヒクル（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後のダネットの検定）。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血漿総アディポネクチンにおけるパーセント変化に対するＰＥＧ化合物２の単回の急性投薬の影響。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ビヒクル（２５０ｍＭショ糖／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３）または、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、もしくは１．０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物２のいずれかで、ｎ＝１０／群で治療した。ＳＣ投薬後ベースライン２４時間、４８時間、７２時間および１４４時間の血漿総アディポネクチン濃度を特定し、ベースラインに対するパーセント変化を特定した。値はいずれも、平均±ＳＥＭ ＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ビヒクル（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後のダネットの検定）。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血漿総アディポネクチンに対するＦＧＦ−２１変異体の影響。ＰＥＧ化合物２およびＰＥＧ化合物２０の治療は両方とも、０．３ｍｐｋおよび１ｍｐｋの用量の両方で投与後６日の総血漿アディポネクチンの有意な増加をもたらした（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血漿総アディポネクチンに対するＦＧＦ−２１変異体の影響。５４．３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のＰＥＧ化合物２、化合物１０５および化合物１１２は、３日目および６日目のビヒクル治療対照での総アディポネクチンのパーセント変化と比較して、総アディポネクチンにおけるパーセント変化を有意に増加した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血漿総アディポネクチンに対するＦＧＦ−２１変異体の影響。１８．１ｎｍｏｌ／ｋｇおよび５４．３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量の化合物１８２が、３日目および６日目の血漿総アディポネクチンにおけるパーセント変化を有意に増加した（ビヒクル対照で観察されたパーセント変化と比較して）。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血漿総アディポネクチンに対するＦＧＦ−２１変異体の影響。両方の化合物１７１および化合物１８１は、ビヒクルで治療された対照と比較して、用量依存的な様式で投薬後３日目および６日目の血漿総アディポネクチンのベースラインからのパーセント変化を有意に増加した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血漿総アディポネクチンに対するＦＧＦ−２１変異体の影響。血漿総アディポネクチン（ビヒクルと比較してる）のベースラインからのパーセント変化は、１８．１ｎｍｏｌ／ｋｇおよび５４．３ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物１７０によって３および６日目に有意に増加した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血漿総アディポネクチンに対するＦＧＦ−２１変異体の影響。３日目および６日目のビヒクルで治療された対照と比較して、用量１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物１は、血漿総アディポネクチンのベースラインからのパーセント変化を有意に増加した。
タンパク尿（尿ＡＣＲ）に対するＰＥＧ化合物２の影響。＃Ｐ＜０．０５、疾患（ｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂ、ビヒクル、ｎ＝９〜１０）対正常（ｄｂ／ｍ 非肥満（ｌｅａｎ）、ｎ＝１０〜１２）。＊Ｐ＜０．０５、ＰＥＧ化合物２（ｎ＝１３〜１４）対ビヒクル。個々の時間点における各ペアに対するダネットのポストホック検定によるＡＮＯＶＡ。データは平均±ＳＥＭとして表される。
心臓のヒドロキシプロリン（ＨＰ）含有量は、イソプロテレノールおよびＰＥＧ化合物２による治療の３週目において示される。測定点はそれぞれ、個々のマウスのタンパク質に対して標準化された全心臓ＨＰ含有量を表す。＊：Ｐ＜０．０５、対シャム（ｓｈａｍ）＋ビヒクル、＊＊：Ｐ＜０．０５、対Ｉｓｏ＋ビヒクル（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニの検定）。
Ｓｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨマウス研究における血清総アディポネクチン（図７０Ａ）、血清高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチン（図７０Ｂ）、および総アディポネクチンに対するＨＭＷアディポネクチンの比（図７０Ｃ）に対するＦＧＦ−２１変異体の影響。値は全て、平均±ＳＥＭである。
ＮＡＳＨ動物モデルにおける肝臓重量（図７１Ａ）、および体重（ＢＷ）に対する肝臓重量の比（図７１Ｂ）。
ＮＡＳＨ動物モデルにおけるＦＧＦ−２１変異体の影響。ＰＥＧ化化合物１（「ＰＥＧ−Ｃｍｐｄ１」）、ＰＥＧ化化合物２（「ＰＥＧ−Ｃｍｐｄ２」）または化合物１７０（「Ｃｍｐｄ１７０」）による治療の後、体重（図７２Ａ）、肝臓重量（図７２Ｂ）、肝臓対体重比（図７２Ｃ）、肝臓トリグリセリド（図７２Ｄ）、血漿ＡＬＴ（図７２Ｅ）、肝臓コレステロール（図７２Ｆ）および血漿トリグリセリド（図７２Ｇ）について動物を評価した。ビヒクルで治療された対照との統計的有意差は示された通りである。ｎ．ｓ：統計的有意差は検出されなかった（すなわち、Ｐ≧０．０５）。
発明の詳細な説明
定義
本明細書および添付の請求項で使用されるように、単数形成である「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明白に示さない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「ＦＧＦ−２１」「ＦＧＦ−２１ポリペプチド」または「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」に対する参照は、１以上のそのようなタンパク質の参照であり、また当業者に既知のその等価物等も含む。
別段の規定がない限り、本明細書に使用される全の技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術の当業者に通常に理解されるのと同じ意味を有する。
正常血糖：
本開示において正常血糖（ｎｏｒｍｏｇｌｙｃｅｍｉａ）または正常血糖（ｅｕｇｌｙｃｅｍｉａ）の用語は、正常な血糖濃度をする状態を指す。ヒトにおける例示的な正常血糖濃度は、絶食中の成人において７０ｍｇ／ｄｌ〜９９ｍｇ／ｄｌ、また食後の成人において７０ｍｇ／ｄｌ〜１４０ｍｇ／ｄｌである。持続的な正常血糖は、例えば本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドによる進行中の治療の間、幅広い期間、例えば少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１か月間、またはそれより長い、正常血糖の維持を指す。
「半減期延長部分」（また本明細書では「ＨＬＥＭ」と呼ばれる）の用語は、任意に天然にコードされていないアミノ酸を介して、直接的にまたはリンカーを介して、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに共有結合で連結された（「複合化された」または「融合された」）薬学的に許容可能な部分、ドメインまたは分子であって、改変ＦＧＦ−２１ポリぺプチドのタンパク質分解または他の活性を減少させる化学的修飾をｉｎ ｖｉｖｏで予防または緩和し、限定されないが、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは野生型ＦＧＦ−２１ポリペプチドの非複合化形態等のコンパレータ（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）と比べて、半減期を増加させ、および／または改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの吸収速度を改善する、毒性を減少させる、可溶性を改善する、タンパク質凝集を減少させる、生物活性をおよび／または標的選択性増加させる、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの製造性を増加させるおよび／または免疫原性を減少させることを含む、他の薬物動態学的もしくは生物物理学的な特性を改善し、もしくは変更する、薬学的に許容可能な部分、ドメインまたは分子を指す。「半減期延長部分」の用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくは個別のＰＥＧ、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）等の水溶性ポリマー、脂質、分岐鎖もしくは直鎖のアシル基、分岐鎖もしくは直鎖のＣ８〜Ｃ３０アシル基、分岐鎖もしくは直鎖のアルキル基、および分岐鎖もしくはＣ８〜Ｃ３０アルキル基等の非タンパク質の半減期延長部分；ならびに血清アルブミン、トランスフェリン、アドネクチン（例えば、アルブミン結合アドネクチンまたは薬物動態伸長（ＰＫＥ）アドネクチン）等のタンパク質の半減期延長部分、Ｆｃドメイン、ならびにＸＴＥＮおよびＰＡＳポリペプチド等の非構造性ポリペプチド（例えば、アミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａ、および／またはＳｅｒで構成される立体配配置的に乱れたポリペプチド配列）、ならびに先のもののうちのいずれかのフラグメント等を含む。ＦＧＦ−２１またはＦＧＦファミリーの結晶構造およびＦＧＦ受容体とのその相互作用の検査は、どの所定のアミノ酸残基が溶媒に完全にまたは部分的にアクセス可能な側鎖を有するかを示すことができる。これらの位置で天然にコードされていないアミノ酸の側鎖は、タンパク質表面から離れて溶媒へと外に伸びてもよく、したがって、例えば水溶性ポリマーに連結され得る。
本明細書で使用される「アルブミン結合部分」の用語は、アルブミンを結合することができる任意の化学基、すなわち、アルブミン結合親和性、例えばアルブミン結合ＰＫＥアドネクチンを有する化学基を指す。
「アルブミン結合能」は当該技術分野において既知のいくつかの方法によって決定され得る。或る１つの方法では、測定される化合物は、放射性同位体、例えば１２５Ｉまたは３Ｈで識別され、固定化アルブミンと共にインキュベートされる（Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１２，７２５−７３１（１９９５））。スタンダードと比較したその化合物の結合を計算する。別の方法では、関連する化合物は、放射性同位体で標識され、例えばＳＰＡビーズ（シンチレーション近接アッセイビーズ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ カタログ番号ＲＰＮＱ０００１）上に固定化されたアルブミンに対するその結束は、測定される化合物の希釈系列によって競合される。競合に対するＥＣ５０値は、化合物の親和性の尺度である。第３の方法では、化合物の受容体親和性または効能は、種々アルブミン濃度で測定され、アルブミン濃度の関数としての化合物の相対親和度または効能におけるシフトは、アルブミンに対するその親和性を反映する。
「熱安定性」の用語は、ポリペプチドが加熱された時、展開される（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）ことに抵抗する能力を指す。一般には、分子の熱安定性が高いほど、ポリペプチドが展開されるのに必要とされる温度が高くなる。ポリペプチドの熱安定性を決定する例示的な方法は、本明細書の実施例６に記載される示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）および熱の走査蛍光法である。熱安定性は、例えば、高められた熱安定性を有するポリペプチドを同定するため、コンパレータ化合物に関して決定されてもよい。
「凝集」の用語は、他の分子（同じポリペプチドの他の分子等）と非共有結合で連結された複合体を形成して高分子量の複合体を形成するポリペプチドの傾向を指す。凝集塊の形成を測定する例示的な方法として、本明細書の実施例７に記載される分析型サイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。凝集の相対量は、例えば、凝集を減少したポリペプチドを同定するためにコンパレータ化合物に関して決定されてもよい。
「脱アミド化」用語は、ポリペプチド内のアミノ酸残基の自発的に脱アミド反応を経て、アミノ酸の化学構造を変更し、潜在的にポリペプチドの機能に影響する傾向を指す。脱アミド化を測定する例示的な方法として、本明細書の実施例７に記載される想像された毛状の等電点電気泳動法（ｉｃＩＥＦ）が挙げられる。脱アミド化の相対量は、例えば、脱アミド化を減少させたポリペプチドを同定するためにコンパレータ化合物に関して決定されてもよい。
「ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質分解」の用語は、生体系に導入された場合（例えば、生体に注入された時）、上記生体に生じるプロテアーゼに起因し得る、ポリペプチドの切断を指す。タンパク質分解は、ポリペプチドの生物活性または半減期に影響する可能性がある。例えば、野生型ＦＧＦ−２１はＣ末端での切断を経て、トランケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）不活性なポリペプチドをもたらす場合がある。ｉｎ ｖｉｖｏでＦＧＦ−２１のタンパク質分解を測定する典型的な方法は、本明細書の実施例１０に記載されるメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）に基づく基電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）である。ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解の相対量は、例えば、減少したｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解を伴うポリペプチドを同定するため、コンパレータ化合物に関して決定されてもよい。
「溶解度」の用語は、別の物質に溶解し得る物質の量、例えば水性溶液に溶解し得る未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドの量を指す。未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドの溶解度を測定する典型的な方法は、本明細書の実施例８に記載されるプラグフロー溶解度試験である。相対的な溶解度は、例えば、増加させた溶解度を有するポリペプチドを同定するため、コンパレータ化合物に関して決定されてもよい。
「生物活性」の用語は、分子が生物系、経路、分子、または、限定されないが、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、菌類、植物、動物およびヒトを含む、生体に関する相互作用の任意の物理学的または生化学的な特性に影響する能力を指す。例えば、未改変または改変されたＦＧＦ−２１の文脈では、生物活性は、本明細書に記載されるＦＧＦ−２１によって行なわれた機能のいずれかを含む。分子が野生型ＦＧＦ−２１（配列番号１の野生型ＦＧＦ−２１ポリペプチド等）の少なくとも１つの生物活性を持つかどうか判断する例示的な方法として、実施例５に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイ、または実施例１７に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイが挙げられ得る。生物活性の相対レベルは、例えば、生物活性をしている、または意図される治療適用途に十分高い生物活性をしている、例えば、コンパレータのＥＣ５０より５倍未満、１０倍、２０倍未満、５０倍未満で、または１００倍未満高いＥＣ５０を有している、ポリペプチドを同定するため、コンパレータ化合物に関して決定されてもよい。
本明細書に記載されるコンパレータ化合物は、本明細書に記載される改変等の改変を欠く別の配列であってもよい。例えば、コンパレータ化合物は、内部欠失のない、置換ペプチドのない、または融合パートナーのない、同じ改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド配列であってもよい。例示的なコンパレータ化合物として、限定されないが、配列番号１の野生型ＦＧＦ−２１ポリペプチド、配列番号２０１の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別のコンパレータ化合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、コンパレータ化合物は、リンカー、ポリマー、生物学的活性分子、ペプチド、ポリペプチド、または本明細書に記載される半減期延長部分（例えばＰＥＧ）に連結されてもよい、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、コンパレータ化合物は、リンカー、ポリマー、生物学的活性分子、ペプチド、ポリペプチドまたは本明細書に記載される半減期延長部分（例えばＰＥＧ）に連結されなくてもよい、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、コンパレータ化合物は追加のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含んでもよい。いくつかの実施形態では、比較はポリペプチドのＰＥＧ化または非ＰＥＧ化の形態によって行われてもよく、前者の場合、比較は、天然にコードされていないアミノ酸を含むまたは含まないポリペプチドを用いて行われてもよい。いくつかの実施形態では、コンパレータ化合物は、任意にペプチドによって置換される内部欠失（例えば、コンパレータが比較されている化合物中の同じ内部欠失および置換ペプチド）を含み得るが、融合パートナーを含まない。
「Ｆｃ」、「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」の用語は、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントを指す。Ｆｃは、自然界で見出されたＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む天然のＦｃ領域であってもよく、または少なくとも１つのアミノ酸のおかげで天然のＦｃ領域のそれと異なるアミノ酸配列を含む異なるＦｃ領域であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、天然のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然のＦｃ領域、または親ポリペプチドのＦｃ領域において約１個〜約２０個、約１個〜約１０個、または約１個〜約５個のアミノ酸の置換、欠失または挿入を有する。本明細書においてＦｃ領域は、天然のＦｃ領域、および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を持つ場合がある。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域、および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約９０％の配列同一性を有してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域、および／または、親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約９５％の配列同一性を有してもよい。Ｆｃ領域の例示的なアミノ酸配列として、配列番号３０２、および配列番号３２３〜配列番号３３５が挙げられる。Ｆｃ領域の例示的なドメインまたはフラグメントとして、配列番号３０３〜配列番号３０９のポリペプチドが挙げられる。
本明細書で使用されるように、「機能性Ｆｃ領域」は、ＦｃＲｎを結合する能力を保持するＦｃドメインまたはそのフラグメントを指す。
「対応する」の用語は、参照配列に対する比較によって同定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列内の位置（「に対応する位置」または「対応する位置」）、または領域（「に対応する領域」または「対応する領域」）を指す。参照配列は、配列番号１の野生型のＦＧＦ−２１ポリペプチド等の野生型または未改変の配列であってもよい。対応する位置または領域は、参照配列を有する配列の整列によって同定されてもよい。例えば、配列中の「配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置」は、その配列が配列番号１と整列される場合に配列番号１のアミノ酸１０８と同じアラインメントカラムにある配列の位置を指す。アラインメントでは、アミノ酸またはヌクレオチドは参照配列の対応する位置においてアミノ酸またはヌクレオチドと一致してもよく、または一致しなくてもよい。対応する領域の欠失を参照する場合、アラインメントは、削除された領域が、該削除された領域の一部と潜在的に整列し得る置換ペプチドによって置き換えられている限り、削除された領域内の各位置に対応するアラインメントカラムにギャップを含んでもよい。したがって、置換ペプチドによって置き換えられた欠失については、整列を行なう場合、そのアラインメントが削除された領域の全体にわたってギャップを含むように、該置換ペプチドを配列から省略してもよい。代替的には、対応する領域を同定する場合、置換ペプチドは、存在する場合、無視されてもよい。
対応する位置または対応する領域の同定に使用されるアラインメントは、Ｂｌａｓｔ等の従来のアラインメントアルゴリズムを使用して得られてもよい（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｏｃｔ ５；２１５（３）：４０３−１０），Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８１ Ｍａｒ ２５；１４７（１）：１９５−７）、またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ （Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９７０ Ｍａｒ；４８（３）：４４３−５３）。最高得点のグローバルアラインメント（ｈｉｇｈｅｓｔ−ｓｃｏｒｉｎｇ ｇｌｏｂａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（すなわち、両方の配列にすべての残基を含んでいるが、アラインメントがギャップにおいて開始および／または終了し得るアラインメント）を得るため、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用してもよい。Ｂｌａｓｔ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈを利用してもしなくても、最高得点のアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス、１１のギャップ開始ペナルティおよび１のギャップ伸長ペナルティ、ならびに（ペアワイズアラインメントに使用する場合）３ワードサイズの使用等の「デフォルト」パラメーターを使用して同定されてもよい。
「領域」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列の隣接する部分を指す。領域は、配列内の領域の開始および終了の位置を指定するポリペプチドまたはポリヌクレオチド内の２つの位置によって同定されてもよい。別段の指定がない限り、領域は参照配列内の領域を規定する位置を含み、すなわち、所与の開始および終了の位置を含む。例えば、配列番号１の領域１１９〜１３０は、配列番号１のアミノ酸１１９から開始し、アミノ酸１３０で終了する部分を指し、アミノ酸１１９および１３０を含み、それは配列ＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰ（配列番号７３）を有する。
「欠失」の用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドからの１以上の（または指定された数の）隣接するアミノ酸またはヌクレオチドの除去を指す。「内部欠失」は、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、またはポリヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端を含まない欠失を指す。
欠失または内部欠失は、参照配列に関する欠失の開始および終了の位置を指定することにより同定することができる。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに関して、内部欠失に対する参照は、一般に、配列番号１の野生型ＦＧＦ−２１ポリペプチドの位置に対応する領域、例えば配列番号１のアミノ酸の位置１１９〜１３０（すなわち、ＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰ（配列番号７３））の欠失等の参照ＦＧＦ−２１ポリペプチドに関する領域の欠失を明示する。
「置換ペプチド」は、内部欠失またはポリペプチド内の他の欠失に代えて挿入されるアミノ酸を指す。置換ペプチドの長さは、内部欠失の長さと異なってもよい。例示的な置換ペプチドは、１以上のグリシン、セリンおよびヒスチジンの残基を含んでもよく、いくつかの例では、リジンおよびプロリン等の追加のアミノ酸残基を含んでもよい。しかしながら、置換ペプチドはこれらの特定のアミノ酸を含んでいる配列に制限されず、むしろ任意の天然アミノ酸または天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよいことが理解される。置換ペプチドは、任意の長さ、例えば単一のアミノ酸（すなわち、１個のアミノ酸の長さを有する）、２個以上、または３個以上のアミノ酸であってもよい。ゼロのアミノ酸の長さを有する置換ペプチドは、置換ペプチドが存在しないことを示す。いくつかの実施形態では、置換ポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個アミノ酸の長さを有していてもよい。いくつかの実施形態では、置換ポリペプチドは、１個〜１０個、１個〜７個、１個〜５個、または１個〜３個のアミノ酸の長さを有していてもよい。いくつかの実施形態では、置換ポリペプチドは、２個〜７個、２個〜５個または２個〜３個のアミノ酸の長さを有していてもよい。いくつかの実施形態では、置換ポリペプチドは、３個のアミノ酸の長さを有していてもよい。例示的な置換ペプチドとして、Ｇ、ＧＧ、ＳＧ、ＧＳＧ、ＧＧＨ、ＳＧＧ、ＧＳＧＨ（配列番号３４３）、ＨＳＧ、ＨＨＳＧ（配列番号３４４）、ＨＧＳＨ（配列番号３４５）、ＧＳＧＰ（配列番号３４６）、ＨＧＧ、ＨＳＧＧ（配列番号３４７）およびＨＧＳＧ（配列番号３４８）の配列が挙げられる。追加の例示的な置換ペプチドとして、Ｋ、ＤＫＳ、ＨＫＳ、Ｄ、Ｑ、ＫＤＳおよびＫＤＳＱ（配列番号３４９）の配列が挙げられる。
「融合パートナー」は、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに融合されたペプチドまたはポリペプチドを指す。融合パートナーは、Ｎ末端および／またはＣ末端上の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに融合されてもよい。例示的な融合パートナーとして、限定されないが、アルブミン、トランスフェリン、アドネクチン（例えばアルブミン結合、または薬物動態延長（ＰＫＥ）アドネクチン）、Ｆｃドメイン、ＸＴＥＮおよびＰＡＳポリペプチド等の非構造性ポリペプチド（例えば、アミノ酸 Ｐｒｏ、Ａｌａ、および／またはＳｅｒで構成される構造的に無秩序なポリペプチド配列）、または先のもののうちのいずれかのフラグメント。融合パートナーは、限定されないが、精製、製造性、半減期延長、増強された生物物理学の特性（例えば溶解度または安定性）、減少された免疫原性、または毒性等を含む任意の目的のため改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに融合されてもよい。
「連結ペプチド」は、他のペプチドまたはポリペプチドにそのＮ末端およびＣ末端の両方を融合させるアミノ酸配列を指す。連結ペプチドは、融合タンパク質中に存在してもよく、例えば、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドおよび融合パートナーにその末端を（いずれかの順序で）融合させる。例示的な連結ペプチドは、０個のアミノ酸（すなわち、連結ペプチドが存在しない）から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個または１００個のアミノ酸、またはそれ以上を含んでもよい。いくつかの実施形態では、連結ペプチドは、１個〜４０個、１個〜３０個、１個〜２０個、１個〜１０個、１個〜５個、２個〜４０個、２個〜３０個、２個〜２０個、２個〜１０個、５個〜４０個、５個〜３０個、５個〜２０個、または５個〜１０個のアミノ酸を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、連結ペプチドは５個〜２０個のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、連結ペプチドは１０個〜２０個のアミノ酸を含んでもよい。本明細書に記載される特定の例示的な連結ペプチドは、セリン残基およびグリシン残基に富む場合があるが、連結ペプチドがそのような配列に制限されないことが理解される。例示的な連結ペプチドは、以下の配列を含む：ＧＡＧＧＧＧＳＧ（配列番号７４）、ＥＰＫＳＳＤ（配列番号７５）、Ｄ、ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＬＡ（配列番号７６）、ＥＬＱＬＥＥＳＡＡＥＡＱＤＧＥＬＤ（配列番号７７）、ＧＱＰＤＥＰＧＧ（配列番号７８）、ＧＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号７９）、ＥＬＱＬＥＥＳＡＡＥＡＱＥＧＥＬＥ（配列番号８０）、ＧＳＧＳＧ（配列番号８１）、ＧＳＧＣ（配列番号８２）、ＡＧＧＧＧＳＧ（配列番号：８３）、ＧＳＧ（配列番号８４）、ＱＰＤＥＰＧＧ（配列番号８５）、ＧＳＧＳＧ（配列番号８６）、ＴＶＡＡＰ（配列番号８７）、ＫＡＧＧＧＧＳＧ（配列番号：８８）、ＫＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号８９）、ＫＱＰＤＥＰＧＧ（配列番号９０）、ＫＥＬＱＬＥＥＳＡＡＥＡＱＤＧＥＬＤ（配列番号９１）、ＫＴＶＡＡＰ（配列番号９２）、ＫＡＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号９３）、ＫＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号９４）、ＫＱＰＤＥＰＧＧＳＧ（配列番号９５）、ＫＥＬＱＬＥＥＳＡＡＥＡＱＤＧＥＬＤＧ（配列番号９６）、ＫＴＶＡＡＰＳＧＡＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号９７）、ＡＧＧＧＧＳＧ（配列番号９８）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号９９）、ＱＰＤＥＰＧＧＳＧ（配列番号１００）、ＴＶＡＡＰＳＧ（配列番号３０１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号３５０）、ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰ（配列番号３５１）、ＥＬＱＬＥＥＳＡＡＥＡＱＥＧＥＬＥ（配列番号３５２）、ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号３５３）、ＧＳ（配列番号３５４）、ＧＧＧＧ（配列番号３５５）、ＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤ（配列番号３５６）、ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号３５７）、ＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨＧ（配列番号３５８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３５９）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３６０）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号３６１）、ＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰ（配列番号３６２）、ＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰ（配列番号３６３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３６４）、ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号３６５）、ＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰ（配列番号３６６）、ＰＳＰＥＰ（配列番号３６７）、ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号３６８）、ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号３６９）、ＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰ（配列番号３７０）、ＰＳＰＥＰＧＧＧＳＰＴＰＥＰ（配列番号３７１）、ＰＳＰＥＰＥＥＥＤＰＴＰＥＰ（配列番号３７２）、ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＥＥＥＤＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号３７３）、ＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＥＥＥＤＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰ（配列番号３７４）、ＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＧＧＧＧＳＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰ（配列番号３７５）、ＰＳＰＥＰＴＰＥＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＳＰＥＰＴＰＥＰ（配列番号３７６）、ＧＥＴＧＳ（配列番号３７７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７８）、ＧＥＴＧＳＳＧＥＧＴ（配列番号３７９）、ＧＥＴＧＳＳＧＥＧＴＧＳＴＧＳ（配列番号３８０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３８１）、ＧＥＴＧＳＳＧＥＧＴＧＳＴＧＳＧＡＧＥＳ（配列番号３８２）、およびＧＥＴＧＳＳＧＥＧＴＧＳＴＧＳＧＡＧＥＳＧＴＧＥＳＧＥＧＧＳ（配列番号３８３）、すなわち、配列番号７４〜配列番号１００、配列番号３０１、および３配列番号５０〜配列番号３８３。
「線維症に関連する疾患」の用語は、それにおいて線維症が生じることが観察された、またはそれにおいて線維症が、疾患の病因、進行もしくは症状と関連するかもしくは寄与することが知られているもしくはそのように考えられている、またはそれにおいて線維症がその疾患が進行するとともに生じることが知られているもしくはそのように考えられている、疾患、障害、もしくは病態を含む。線維症は、臓器または組織（膵臓、肺、心臓、腎臓、肝臓、眼、神経系、骨髄、リンパ節、心内膜心筋または後腹膜）を冒す場合がある。例示的な線維症に関連する疾患として、限定されないが、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変前期、肝硬変、びまん性実質性肺疾患、嚢胞性線維症、肺（ｌｕｎｇ）線維症もしくは肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）線維症、進行性塊状線維症、特発性肺線維症、インジェクション（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）線維症、腎（ｋｉｄｎｅｙ）線維症もしくは腎（ｒｅｎａｌ）線維症、慢性腎疾患、糖尿病性腎疾患、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、骨髄線維症、心不全、代謝性心不全、心臓線維症、白内障線維症、白内障、眼の瘢痕化、膵線維症、皮膚線維症、腸管線維症、腸狭窄、心内膜心筋線維症、心房線維症、縦隔洞線維症、クローン病、後腹膜線維症、ケロイド、腎原性全身性線維症、強皮症、全身性硬化症、関節線維症、ペローニー症候群、デュピュイトラン拘縮、糖尿病性ニューロパチー、癒着性関節包炎、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝、ウイルス性肝炎、胆道疾患、原発性ヘモクロマトーシス、薬剤関連の肝硬変、特発性肝硬変、ウィルソン病、およびα１−抗トリプシン欠乏症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、ヒト線維性肺疾患、黄斑変性、網膜の網膜症、硝子体の網膜症、心筋線維症、グレーブズ眼症、薬物誘発性麦角中毒、心血管疾患、アテローム性動脈硬化／再狭窄、肥厚性瘢痕、原発性または特発性の骨髄線維症、ならびに炎症性腸疾患（コラーゲン性大腸炎を含むが、これに限定されない）が挙げられる。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は、肝線維症、腎（ｋｉｄｎｅｙ）線維症もしくは腎（ｒｅｎａｌ）線維症、肺（ｌｕｎｇ）線維症もしくは肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）線維症、および心臓（ｈｅａｒｔ）線維症もしくは心臓（ｃａｒｄｉａｃ）線維症を含んでもよい。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は肝線維症であってもよい。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患はＮＡＳＨであってもよい。
「医学的複雑型肥満」の文言（時には「病的肥満」とも呼ばれる）は、一般に肥満に関するまたは肥満によって引き起こされる健康問題（ｈｅａｌｔｈ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）も有する肥満個体の亜集団の病態を指す。肥満は、肥満指数（メートル単位の高さの２乗で割ったキログラム単位の体重）によって決定されてもよく、３０ｍ／ｋｇ２以上の肥満指数は肥満を指す。医学的複雑型肥満に存在する例示的な健康問題として、２型糖尿病、高血圧症、閉塞性睡眠時無呼吸、冠動脈疾患、および他の心血管疾患（冠動脈疾患、卒中、および鬱血性心不全を含む）のおよび脂質異常症の１または複数が挙げられる。存在し得る更なる健康問題として、非アルコール性の脂肪変性疾患（脂肪症、脂肪性肝炎または肝硬変等）、呼吸疾患、閉塞性睡眠時無呼吸、肥満低換気症候群、喘息、拘束性肺疾患、癌、骨関節炎、胆石症、胃食道逆流疾患、婦人科の異常、不妊、月経以上、静脈うっ血、皮膚の問題、間擦疹、蜂巣炎、手術または妊娠中の合併症のリスクの増加、尿失禁、および特発性の頭蓋内圧亢進が挙げられる。医学的複雑型肥満もプラーダー−ヴィリ症候群に関連する場合がある。
「本質的に精製された」の用語は、その天然起源の環境、すなわち、生来の細胞、または組み換え生成された未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドの場合では宿主細胞において見出されるタンパク質に通常付随するか、または相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まない、未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを指す。細胞形質成分を実質的に含まない、未改変か改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満（乾重量による）の混在タンパク質を有するタンパク質の製剤を含む。未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドまたはその変異体が宿主細胞によって組み換え生成される場合、タンパク質は、細胞の乾重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％または約１％以下で存在し得る。未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドまたはその変異体が宿主細胞によって組み換え生成される場合、タンパク質は、細胞の乾重量の約５ｇ／ｌ、約４ｇ／ｌ、約３ｇ／ｌ、約２ｇ／ｌ、約１ｇ／ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌまたは約１ｍｇ／Ｌ以下で培地中に存在する。したがって、本開示の方法によって生産される「実質的に精製された」未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣおよびキャピラリー電気泳動法等の適切な方法によって決定される、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、特に、少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、より具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の清浄レベル、少なくとも約９９％以上の純度レベルを有してもよい。
「組み換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入、例えば直接取り込み、形質導入、ｆ−交配に使用される方法、または当該術分野で知られている組み換え宿主細胞を作製する他の方法にかかわらず、外因性のポリヌクレオチドを含む細胞を指す。
外因性のポリヌクレオチドは、統合されていないベクター、例えばプラスミドとして維持されてもよく、または代替的には、宿主ゲノムへと統合され手もよい。
本明細書で使用される「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」または「培地（ｍｅｄｉａ）」の用語は、細菌の宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物寄主細胞、真核生物の宿主細胞、哺乳動物の宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物の宿主細胞、Ｅ．コリまたはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の宿主細胞と、細胞含有物とを含む、任意の宿主細胞を支持し得るまたは含み得る、任意の培養の培地、溶液、固体、半固形または固定支持体を含む。
したがって、上記用語は、宿主細胞が育てられた培地、例えば増殖段階の前に、またはその段階の後のいずれかに未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドが分泌されている培地を包含してもよい。また、上記用語は未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドが、細胞内で生産され、宿主細胞が未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを放出するために溶解されるか、または破壊される場合等に、宿主細胞溶解物を含むバッファーまたは試薬を包含してもよい。
「抗糖尿病剤」の用語は、本明細書に記載される病態、疾患、または合併症のいずれかを含む、任意のグルコース代謝障害の重症度、またはその任意の合併症を治療、予防、あるいは低減するのに有用な任意の薬物を意味する。抗糖尿病剤は、インシュリン、（チアゾリジンジオン）、スルホニルウレア誘導体、安息香酸誘導体、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤等を含む。本発明の抗糖尿病組成物は、ベースラインから少なくとも１０％、または少なくとも５０％の変化だけＨｂＡ１ｌｃレベルを低減し得る。抗糖尿病剤は、限定されないが、インスリンの分泌または活性をさらに増強する、小分子インシュリン強化剤、タウリン、アルファリポ酸、桑の実抽出物、クロム、グルタミン、エニコステンマ リットラーレ ブルーメ（Ｅｎｉｃｏｓｔｅｍｍａ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ Ｂｌｕｍｅ）、スコパリア ドゥルシス（Ｓｃｏｐａｒｉａ ｄｕｌｃｉｓ）、タラゴンの抽出物、アンドログラフィス パニクラータ（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）イソマルト、トレハロースまたはＤ−マンノース等を含むインシュリン強化剤を含む。
本明細書で使用される「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」、「改変線維芽細胞成長因子２１」または「改変ＦＧＦ−２１」およびハイフンが付いていない形式は、同義的に使用され、野生型ＦＧＦ−２１（例えば配列番号１および配列番号５の野生型ヒトＦＧＦ−２１：１）と異なるそれらのポリペプチドおよびタンパク質を含んでいるものとし、また典型的には、ＦＧＦ−２１類縁体、ＦＧＦ−２１アイソフォーム、ＦＧＦ−２１ミメティック、ＦＧＦ−２１フラグメント、ハイブリッドＦＧＦ−２１タンパク質、融合蛋白質、オリゴマーおよびマルチマー、相同染色体、グリコシル化パターン変異体、変異体、スプライス変異体、およびそれらの突然変異蛋白質と同様に、その生物活性にかかわらず、線維芽細胞成長因子２１の少なくとも１つの生物活性を有する。「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」および「改変ＦＧＦ−２１」の用語は、１または複数のアミノ酸置換、付加または欠失を含むＦＧＦ−２１ポリペプチドを包含する。例えば、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、図１に示され、またその他は本明細書に記載される内部欠失を含む、内部欠失を含む。
また、「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」の用語は、多型（例えば、天然起源のＦＧＦ−２１配列変異体）を包含する。例えば、ＦＧＦ−２１の「Ｐ−型」は、１７４位（配列番号１の成熟ポリペプチド中の１４６位）でプロリン（Ｐ）を含まないのに対し、「Ｌ型」は、１７４位（配列番号５の成熟ポリペプチド中の１４６位）でロイシン（Ｌ）を含む。例示的なＰ−型ＦＧＦ−２１ポリペプチド配列は配列番号１〜配列番号４に含まれる野に対し、Ｌ型ＦＧＦ−２１ポリペプチド配列は配列番号５〜配列番号７に含まれる。
天然起源のＦＧＦ−２１における多様なアミノ酸位置における置換が記載されている。置換は、限定されないが、溶解度または安定性を調節する、アゴニスト活性を増加させる、ｉｎ ｖｉｖｏでまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで半減期を増加させる、プロテアーゼ抵抗性を増加させる、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する、免疫原性または毒性を減少する、精製または製造性を促進する等のものを含み、「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」または「改変ＦＧＦ−２１」の用語によって包含される。いくつかの場合には、別のＦＧＦ−２１ポリペプチドに関して改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの他の生物学の形質に影響を与えるように、天然にコードされていないアミノ酸置換（複数の場合がある）が、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド内の他の付加、置換または欠失と結合してもよい（例えば、配列番号１の野生型のＦＧＦ−２１ポリペプチド、配列番号２０１の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、または上記付加、置換もしくは欠失を有しない同じＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変または改変されたＦＧＦ−２１未改変または改変されたポリペプチド等の別のＦＧＦ−２１ポリペプチド）。いくつかの場合には、他の付加、置換または欠失が、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの安定性（限定されないが、タンパク質分解に対する抵抗を含む）を増加させるか、またはその受容体に対する改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの親和性を増加させてもよい。いくつかの場合には、他の付加、置換または欠失が、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの薬学的安定性を増加させてもよい。いくつかの場合には、他の付加、置換または欠失が、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの溶解度（限定されないが、Ｅ．コリまたは他の宿主細胞において発現される場合を含む）を増加させてもよい。いくつかの実施形態では、付加、置換または欠失は、Ｅ．コリまたは他の組み換え宿主細胞における発現の後にポリペプチド溶解度を増加させてもよい。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸の組み込みのための別の部位に加えて、Ｅ．コリまたは他の組み換え宿主細胞における発現の後にポリペプチドの溶解度の増加をもたらす、天然にコードされた、または非天然のアミノ酸による置換のための部位が選択される。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体、結合タンパク質、または関連するリガンドに対する親和性を調節する、またはＦＧＦ−２１受容体に結合した後のシグナル伝達を調節する、循環半減期を調節する、放出またはバイオアベイラビリティーを調節する、精製を促進する、特定の投与経路を改善するもしくは変更する、別の付加、置換または欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、その受容体に対する改変ＦＧＦ−２１の親和性を増加させる付加、置換または欠失を含む。同様に、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、化学的または酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（限定されないが、ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓを含む）、または他の親和性に基づく配列（限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴ等を含む）、または検出、精製、組織もしくは細胞膜を通る輸送、プロドラッグリリースもしくは活性化、改変ＦＧＦ−２１サイズリダクションまたはポリペプチドの他の形質を改善する（限定されないが、ＧＳＴ等を含む）、連結された分子（限定されないが、ビオチンむ）を含むことができる。
リーダー配列を欠くＦＧＦ−２１の配列については、本明細書の配列番号１、配列番号２、および配列番号５を参照されたい。リーダー配列を有するＦＧＦ−２１の配列については、本明細書の配列番号３、配列番号４、配列番号６、および配列番号７を参照されたい。いくつかの実施形態では、本開示のＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１〜配列番号７、または任意の他の配列のＦＧＦ−２１ポリペプチドと実質上同一である。ＦＧＦ−２１の多数の多型が同定されている。ロイシンまたはプロリンは、米国特許公開第２００１００１２６２８号、および米国特許第６，７１６，６２６号において、同じ位置で記載された。１つのアミノ酸（ロイシン）によって異なる、Ｎ末端リーダーまたはシグナル配列は、米国特許第６，７１６，６２６号、および米国特許公開第２００４０２５９７８０号に示される。ＦＧＦ−２１ポリペプチド変異体または突然変異体として、限定されないが、それらの全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，７１６，６２６号；米国特許公開第２００５／０１７６６３１号、米国特許公開第２００５／００３７４５７号、米国特許公開第２００４／０１８５４９４号、米国特許公開第２００４／０２５９７８０号、米国特許公開第２００２／０１６４７１３号、および米国特許公開第２００１／００１２６２８；国際公開第０１／３６６４０号、国際公開第０３／０１１２１３号、国際公開第０３／０５９２７０号、国際公開第０４／１１０４７２号、国際公開第０５／０６１７１２号、国際公開第０５／０７２７６９号、国際公開第０５／０９１９４４号、国際公開第０５／１１３６０６号、国際公開第０６／０２８５９５号、国際公開第０６／０２８７１４号、国際公開第０６／０５０２４７号、国際公開第０６／０６５５８２号、国際公開第０６／０７８４６３号、国際公開第０１／０１８１７２号、国際公開第０９／１４９１７１号、国際公開第１０／０４２７４７号、国際公開第１２／０６６０７５号、国際公開第１１／１５４３４９号、国際公開第１３／０５２３１１号、国際公開第１３／１８８１８１に開示されるものが挙げられる。
また、「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」の用語は、天然起源のＦＧＦ−２１およびそのポリペプチド融合のアゴニスト、ミメティックおよびアンタゴニストの変異体と同様に、天然起源のＦＧＦ−２１の生物学的に活性なフラグメント、生物学的に活性な変異体および立体異性体を含む。アミノ末端、カルボキシル末端または両方で追加のアミノ酸を含む融合は、「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」の用語によって包含される。例示的な融合として、制限されないが、例えばメチオニンがリーダーもしくはシグナルペプチド、またはその部分（メチオニンは、例えばＥ．コリにおいて、組み換え発現に起因してＦＧＦ−２１のＮ末端に連結される）を欠くＦＧＦ−２１の成熟形態の組み換え発現に起因してＦＧＦ−２１のＮ末端に連結されるメチオニル基ＦＧＦ−２１、精製のための融合（限定されないが、ポリ−ヒスチジンまたは親和性エピトープを含む）、ＰＫＥアドネクチン等の血清アルブミン結合ペプチド、および血清アルブミン等の血清蛋白質との融合、およびによる融合、およびＦＧＦ−２１と、限定されないが、血清アルブミン、Ｆｃドメイン、免疫グロブリン定常領域、非構造性ポリペプチドおよびアドネクチン、ならびにそれらのフラグメントを含む１または複数の他の分子（「融合パートナー」）とを含む融合蛋白質が挙げられる。標準的な生化学の方法によって、またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現することにより、任意のかかるフラグメントをタンパク質から作製することができる。
別段の指示がない限り、一般に、本明細書に使用される「ＦＧＦ−２１ポリペプチド」、「線維芽細胞成長因子２１」用語は、未改変（すなわち、野生型）ＦＧＦ−２１および改変ＦＧＦ−２１のポリペプチドの両方を包含する。
「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」の用語は、ＰＥＧ等のポリマーに複合化されたポリペプチドを含み、任意にシステイン、リジンまたは他の残基の１または複数の追加の誘導体化（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚａｔｉｏｎｓ）を含んでもよい。さらに、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドはリンカーまたはポリマーを含んでもよく、ここで、リンカーかポリマーが複合体化されるアミノ酸は、本開示による非天然アミノ酸であってもよく、またはリジンまたはシステインへのカップリング等の当該技術分野で知られている技術を利用して天然にコードされたアミノ酸に複合化されてもよい。
また、「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」用語は、限定されないが、任意のアミノ酸位置でグリコシル化されたポリペプチド、ポリペプチドのＮ連結もしくはＯ連結グリコシル化形態を含む。また、単一のヌクレオチド変化を含む変異体は、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの生物学的に活発な変異体と見なされる。さらに、スプライス変異体も含まれる。また、「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」の用語は、例えば、特定の欠失または他の修飾を含むが、生物活性を維持するポリペプチド類縁体と同様に、化学的手段によって連結された、または融合蛋白質として発現された、ＦＧＦ−２１ポリペプチドのヘテロダイマー、ホモダイマー、ヘテロマルチマー、または任意の１または複数の未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは任意の他のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リンカー、リガンドもしくは任意の種類の他の生物学的活性分子のホモマルチマーを含む。
本明細書に記載される未改変または改変されたＦＧＦ−２１におけるアミノ酸位置への言及はいずれも、別段の明示がない限り（すなわち、その比較が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または他のＦＧＦ−２１配列に基づくことが述べられる場合）、配列番号１中の対応する位置に基づく。例えば、配列番号１の７７位のアミノ酸はアルギニンであり、対応するアルギニンは配列番号２の８７位に位置する。当業者は、配列番号１における位置に対応するアミノ酸位置を、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７等の任意の他のＦＧＦ−２１分子において容易に同定できることを十分に理解する。当業者は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または他のＦＧＦ−２１配列中の対応する位置のアミノ酸位置を、ＦＧＦ−２１融合体、変異体、フラグメント等の任意の他のＦＧＦ−２１分子において容易に同定できることを十分に理解する。例えば、ＢＬＡＳＴ等の配列アラインメントプログラムを使用して、配列番号１、２、３、４、５、６、７または他のＦＧＦ−２１配列中の位置に対応するタンパク質中の特定の位置を整列させて同定することができる。配列番号１、２、３、４、５、６、７または他のＦＧＦ−２１配列に関して、本明細書に記載されるアミノ酸の置換、欠失または付加は、本明細書に記載され、当該技術分野において知られている、ＦＧＦ−２１融合体、変異体、フラグメント等における対応する位置での置換、欠失または付加も指すことが意図され、本開示によって明確に包含される。
「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」または「改変ＦＧＦ−２１」の用語は、１または複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含むＦＧＦ−２１ポリペプチドを包含する。例えば、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、任意に１または複数の非天然アミノ酸の修飾と併せて１または複数の天然アミノ酸を有する修正で構成されてもよい。例示的なＦＧＦ−２１ポリペプチドにおける多様なアミノ酸位置での置換、挿入または欠失（本明細書におよびその他に記載されるものを含む）は、限定されないが、薬学的安定性を調節する置換、限定されないが、アゴニスト活性を増加させる、ポリペプチドの溶解度を増加させる、プロテアーゼ感受性を減少させる、脱アミド化を減少させる、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する、免疫原性もしくは毒性（ｔｏｘｉｔｙ）を減少させる、または精製もしくは製造性を促進する等のＦＧＦ−２１ポリペプチドの生物活性に１または複数の調節する、置換が挙げられ、「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」用語によって包含される。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの生物活性を調節する、追加の挿入、置換または欠失を更に含む。例えば、付加、置換または欠失は、改変ＦＧＦ−２１の１または複数の特性または活性を調節してもよい。例えば、付加、置換または欠失は、ＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体に対する親和性を調節してもよく、循環半減期を調節してもよく、治療的半減期を調節してもよく、ポリペプチドの安定性を調節してもよく、プロテアーゼによる切断を調節してもよく、用量を調節してもよく、放出もしくはバイオアベイラビリティーを調節してもよく、精製を促進してもよく、脱アミド化を減少してもよく、保存期間を改善してもよく、または特定の投与経路を改善もしくは変更してもよい。同様に、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（限定されないが、ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓを含む）、または他の親和性に基づく配列（限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴ等）、または検出（限定されないが、ＧＦＰを含む）、精製もしくはポリペプチドの他の形質を改善する連結された分子（限定されないが、ビオチンを含む）を含んでもよい。
また、「改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド」の用語は、Ｆｃドメイン等の融合パートナーを介して形成される、または限定されないが、天然にコードされていないアミノ酸側鎖によって、同じか異なる天然にコードされていないアミノ酸側鎖もしくは天然にコードされたアミノ酸側鎖のいずれかに直接連結された、またはリンカーによって間接的に連結されたものに連結される、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマーおよびヘテロマルチマーを包含する。例示的リンカーとして、限定されないが、小さな有機化合物、ポリ（エチレングリコール）もしくはポリデキストラン等の様々な長さの水溶性ポリマー、または様々な長さのポリペプチドが挙げられる。
「天然にコードされていないアミノ酸」は、２０の共通するアミノ酸、またはピロリジンもしくはセレノシステインのうちの１つまたはでないアミノ酸を指す。「天然にコードされていないアミノ酸」の用語と同義的に使用され得る他の用語は、「非天然アミノ酸」、「非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）アミノ酸」、「非天然起原のアミノ酸」、ならびにそれらの様々にハイフンで結ばれた、およびハイフンで結ばれていない変形である。また、「天然にコードされていないアミノ酸」の用語は、限定されないが、天然にコードされたアミノ酸の修飾（例えば翻訳後修飾）によって生じるアミノ酸（限定されないが、２０の共通のアミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインを含む）を含むものの、それら自身は天然に翻訳複合体によって成長しているポリペプチド鎖へと組み込まれない。かかる天然にコードされていないアミノ酸の例として、限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニンおよびＯ−ホスホチロシンが挙げられる
「アミノ末端修飾基」は、ポリペプチドのアミノ末端に付けることができるあらゆる分子を指す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」は、ポリペプチドのカルボキシ末端へ付けることができるあらゆる分子を指す。末端修飾基は、限定されないが、様々な水溶性ポリマー、ペプチドまたはタンパク質、血清アルブミン、Ｆｃドメイン、免疫グロブリン定常領域、非構造性ポリペプチド、アドネクチン、もしくはそのフラグメント、またはペプチドの血清（ｉｎ ｖｉｖｏでの）半減期を増加させる他の部分等を含む。
「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学的反応性基」および「化学的反応性部分」の用語は、当該技術において使用され、本明細書において、分子の別個の定義可能な部分またはユニットを指す。上記用語は、化学の技術分野において、いくぶん同意語であり、ある機能または活性を実行し、他の分子と反応性である分子の部分を示すため本明細書において使用される。
「結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」または「リンカー」の用語は、化学反応の結果として通常形成され、典型的には共有結合である基または結合を指すため本明細書で使用される。加水分解的に安定した連結は、その連結が水中で実質的に安定であり、限定されないが、長期間、おそらくは無期限であったとしても生理学的条件の下で、有用なｐＨ値において水と反応しないことを意味する。加水分解的に不安定または分解性の連結は、その連結が、水または例えば血液を含む水溶液において分解性であることを意味する。酵素的に不安定または分解性の連結は、１または複数の酵素によって連結を分解できることを意味する。当該技術において理解されるように、ＰＥＧおよび関連するポリマーは、ポリマー分子の末端官能基のポリマー骨格中、またはポリマー骨格間のリンカー基に分解性の連結を含む場合がある。例えば、ＰＥＧカルボン酸、または生物学的活性物質上でアルコール性基によって活性化されたＰＥＧカルボン酸の反応によって形成されたエステル結合は、一般に生理学的条件の下で加水分解されて薬剤を放出する。他の加水分解的に分解性の連結として、限定されないが、炭酸結合；アミンとアルデヒドとの反応に起因するイミン結合；アルコールをリン酸基と反応させることにより形成されるリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール結合；ギ酸エステルとアルコールとの反応生成物であるオルトエステル結合；限定されないが、ＰＥＧ等のポリマーの末端、およびペプチドのカルボキシル基にける、アミン基によって組織されたペプチド結合；ならびに限定されないが、ポリマーの末端、およびオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基において、ホスホラミダイト基によって形成されたオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。
「生物学的活性分子」、「生物学的活性部分」または「生物学的活性物質」の用語は、本明細書で使用場合、生物系、経路、分子または生体に関する相互作用の任意の物理学的または生化学的な特性に影響を及ぼし得る、任意の物質を意味する。特に、本明細書で使用されるように、生物学的活性分子は、限定されないが、ヒトまたは他の動物における疾患の診断、治癒、緩和、治療もしくは予防、またはそうでなければヒトもしくは動物の肉体的もしくは精神的な健康を増すことを意図する任意の物質を含む。生物学的活性分子の例として、制限されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、炭水化物、無機原子もしくは分子、色素、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、トキソイド、毒素、多糖、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびウイルス、細菌、昆虫、動物、または他の細胞もしくは細胞型、リポソーム、微粒子およびミセルから得られた、もしくはそれに由来するそれらの部分が挙げられる。
「置換基」用語は、「非干渉置換基」に限定されない。「非干渉置換基」は安定した化合物をもたらす基である。好適な非干渉置換基またはラジカルとして、限定されないが、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アラルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルカリール、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７〜Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、式中、ｍはアリール１〜８のアリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環ラジカル、ニトロアルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、Ｃ２〜Ｃ１０アルキルチオアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、−ＯＨ−ＳＯ２、＝Ｓ、−ＣＯＯＨ−ＮＲ２、カルボニル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）ＣＦ３−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−Ｓ（Ｃ１〜Ｃ１０アリール基）、（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０アリール）、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、式中、各ｍは１〜８である、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、それらの塩等が挙げられる。本明細書で使用されるＲはそれぞれ、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキル、アリールもしくは置換アリール、アラルキル、またはアルカリールである。
本明細書で使用されるように、「水溶性ポリマー」の用語は、水性溶媒に可溶の任意のポリマーを指す。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドへの水溶性ポリマー連結は、結果的に、限定されないが、血清（ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期の増加もしくは調節、または未改変形態と比較した治療的半減期の増加もしくは調節、免疫原性もしくは毒性の調節、凝集および多量体形成等の物理的な集合特性の調節、受容体結合の変更、１または複数の結合パートナーへの結合の変更、受容体の二量体化または多量体化の変更を含む変化を生じ得る。水溶性ポリマーは、それ自体、生物学的活性を有してよく、または有しなくてもよく、また限定されないが、１もしくは複数の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド、または１もしくは複数の生物学的活性分子を含む、他の物質へと改変ＦＧＦ−２１を付着するためのリンカーとして利用されてもよい。好適なポリマーとして、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、それらのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体（本明細書に参照より援用される米国特許第５，２５２，７１４号に記載される）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、個別のＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化多価アルコール、ヘパリン、ヘパリンフラグメント、多糖、オリゴ糖、グリカン、セルロース、ならびに限定されないが、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む、セルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキルエングリコールおよびその誘導体、ポリアルキルエングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド等、またはそれらの混合物が挙げられる。かかる水溶性ポリマーの例として、限定されないが、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられる。
本明細書で使用されるように、「ポリアルキルエングリコール」（ＰＥＧ）または「ポリ（アルケングリコール）」の用語は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの誘導体を指す。「ポリアルキルエングリコール」の用語は、直鎖および分岐鎖のポリマー、ならびに０．１ ｋＤａ〜１００ ｋＤａの平均分子量の両方を包含する。他の例示的な実施形態は、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（２００１）等の商業上の供給者のカタログに列挙される。
本明細書で使用されるように、「調節された血清半減期」または「調節されたｉｎ ｖｉｖｏ半減期」の用語および同様の用語は、その改変形態等のコンパレータに対する改変ＦＧＦ−２１の循環半減期の肯定的または否定的な変化を指す。血清半減期は、改変ＦＧＦ−２１の投与後の様々な時点で血液サンプルを採取して、各試料中のその分子の濃度を決定することにより測定することができる。時間と血清濃度との相関は、血清半減期の計算を可能とする。血清（ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期の増加は、望ましくは、少なくとも約２倍であってもよいが、より小さな増加が有用な場合、例えば、満足な投薬レジメンまたは、毒作用の回避を可能とする場合がある。いくつかの実施形態では、上記増加は、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍であってもよい。
本明細書で使用される「調節された治療的半減期」の用語は、その非改変形態または野生型ＦＧＦ−２１等のコンパレータに対する、治療的有効量の本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの血清中もしくはｉｎ ｖｉｖｏ半減期における肯定的もしくは否定的な変化を意味する。治療的半減期は、薬物動態および／または投与の後の様々な時点での分子の薬力学的特性を測定することにより、測定される。増加した治療的半減期は、望ましくは、特定の有益な投薬レジメン、特定の有益な全薬用量を可能とするか、または望ましくない結果を回避する。いくつかの実施形態では、治療的半減期の増加は、増加した効能、その標的への改変分子の増加もしくは減少した結合、プロテアーゼ等の酵素による分子の増加もしくは減少した破壊、または非改変分子の作用のパラメーターもしくは作用機構における増加もしくは減少、または分子の受容体媒介クリアランスの増加もしくは減少に起因する。
「単離された」用語は、核酸もしくはタンパク質に適用される場合、核酸もしくはタンパク質が、それが自然の状態に関連する細胞成分の少なくともいくつかを含まないこと、または核酸もしくはタンパク質がそのｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成の濃度より高いレベルに濃縮されていることを示す。それは均質な状態であってもよい。単離された物質は、乾燥もしくは半乾燥の状態、または限定されないが水性溶液を含む溶液のいずれかにあってもよい。追加の薬学的に許容可能な担体および／または添加剤を含む医薬品組成物の成分であってもよい。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技術を使用して決定される。製剤中に存在する主要な種であるタンパク質が、実質的に精製される。特に、単離された遺伝子は、遺伝子の横に位置する、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。「精製された」の用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて実質的に１本のバンドを生じることを示す。特に、それは核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％以上純粋であることを意味し得る。
「核酸」の用語は、一本鎖または二本鎖の形態のいれかのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチド、およびそれらのポリマーを指す。具体的に限定されに限り、上記用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然起源のヌクレオチドに類似する方式で代謝される、天然なヌクレオチドの既知の類縁体を含む核酸を包含する。また、別段の具体的な限定がない限り、上記用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で使用されるＤＮＡの類縁体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデート等）を含むオリゴヌクレオチド類縁体を指す。別段の指示がない限り、特定の核酸配列もまた、明示的に示される配列と同様に、その保存的改変変異体も（限定されないが、同義性コドン置換を含む）および相補的配列を非明示的に包含する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」の用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すため本明細書において互換的に使用される。すなわち、ポリペプチドに関する記載は、ペプチドの記載およびタンパク質の記載に等しく当てはまり、またその逆も同様である。上記用語は、１または複数のアミノ酸残基が天然にコードされていないアミノ酸である、アミノ酸ポリマーと同様に、天然起源のアミノ酸ポリマーに当てはまる。本明細書で使用されるように、用語は全長タンパク質含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含すし、アミノ酸残基は共有結合のペプチド結合によって連結される。
「保存的改変変異体」は、保存的置換を含むアミノ酸配列を指す。例示的な保存的に改変変異体として核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する、単一のアミノ酸またはポリペプチド配列もしくはコードされたポリペプチドポリペプチド配列中の数パーセントのアミノ酸、例えば任意に、化学的に類似のアミノ酸（複数の場合がある）を含むアミノ酸（複数の場合がある）の置換を含んでもよく、含まなくてもよい、最大１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸、最大０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、もしくは３．５％のポリペプチド配列もしくはコードされたポリペプチド配列中のアミノ酸、を変更、付加、または削除する、置換、欠失または挿入が挙げられる。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に知られている。かかる保存的に改変された変異体は、加えて、開示された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの多型性変異体、異種間ホモログ、および対立遺伝子排除しない。
機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表が、当業者に知られている。
以下の８つの群は、各々、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照されたい）。
「同一の」またはパーセント「同一性」の用語は、２以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、同じである２以上の配列またはサブシーケンスを指す。比較ウインドウ、または以下の配列比較アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、または手動の整列および目視検査によって測定される指定の領域に対して最大の一致について比較、整列した場合、アミノ酸残基またはヌクレオチドの割合が同じであれば、配列は「実質的に同一」（すなわち、指定された領域について、約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％同一性）である。同一性は、少なくとも約５０のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さの領域もしくは比較ウインドウに亘って、または７５個〜１００個のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域に亘って存在してもよく、または明示されない場合、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全配列を横切って存在してもよい。本明細書で使用される「比較ウインドウ」は、配列が、２つの配列が最適に整列された後に、同数の隣接する位置の参照配列と比較される、２０〜６００、通常約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される、隣接する位置の数のうちのいずれか１つのセグメントに対する参照を含む。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適し得るアルゴリズムの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，に記載される、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム、例えばそれらの各出版物に記載されるデフォルトパラメーターによって実行され得る、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８１ Ｍａｒ ２５；１４７（１）：１９５−７）、または Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ （Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９７０ Ｍａｒ；４８（３）：４４３−５３）のアルゴリズムである。
本明細書に使用される「被験体」の用語は動物を指し、いくつかの実施形態では、哺乳動物、他の実施形態では、治療、観察または実験の対象であるヒトを指す。動物は、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜（例えば、雌牛、ヒツジ、ブタ、ウマ等）、または実験動物（例えばラット、マウス、モルモット等）であってもよい。
本明細書で使用される「有効量」の用語は、治療されている疾患、病態または障害の１または複数の症状をある程度まで軽減し得る、投与されている化合物（例えば、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド）のその量を指す。本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む組成物を、予防、増強および／または治療の処置に対して投与することができる。
「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「増強する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」の用語は、効能または所望の結果の持続のいずれかにおける増加または延長することを意味する。したがって、治療薬の効果の増強に関して、「増強」の用語は、効能または持続のいずれか、体に対する他の治療薬の効果の増加または延長する能力を指す。
本明細書で使用される「改変」の用語は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造、同時翻訳修飾、またはポリペプチドの翻訳後修飾に対する変更等の所与のポリペプチドに対して行なわれた任意の変更を指す。
「（改変）」の形式の用語は、述べられるポリペプチドが任意に修飾され、すなわち、検討されているポリペプチドが改変されてもよく、または未改変であってもよいことを意味する。
「翻訳後修飾された」の用語は、ポリペプチド鎖に組み込まれた後、かかるアミノ酸に生じる天然または非天然のアミノ酸の任意の修飾を指す。上記用語は、例であるにすぎず、同時翻訳ｉｎ ｖｉｖｏ修飾、（無細胞翻訳系等における）同時翻訳ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾、翻訳後ｉｎ ｖｉｖｏ修飾、および翻訳後ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾を包含する
予防用途では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む組成物は、特定の疾患、障害または病態に感受性であるか、そうでなければそのリスクがある患者に投与される。かかる量は、「予防的有効量」であると定義される。
治療用途では、改変非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物は、疾患、障害または病態の症状を治癒するか、または少なくとも部分的に抑制するか、または緩和する緩和するのに十分な量で、疾患、条件または障害をすでに患っている患者に投与される。かかる量は、「治療的有効量」であると定義され、疾患、障害または病態の重症度および課程、先の治療、患者の健康状態および医薬品に対する反応、ならびに治療する医師の判断に依存し得る。日常の実験によってかかる治療的有効量を決定することは、当業者によく知られているとされる。（例えば、容量漸増臨床試験）。
「治療する」の用語は、予防的および／または治療的な処置を指すため使用される。
本明細書に提示される天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、自然界で通常見つかる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられた１または複数の原子を有する放射性同位体で標識された化合物を含んでいてもよい。
限定されないが、偏左右異性体、鏡像異性体およびそれら混合を含む全ての異性体は、本明細書に記載される組成物の一部とされる。追加のまたは更なる実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、後に所望の治療効果を含む所望の効果を生じるように使用される代謝産物を生成する必要のある生物への投与によって代謝される。更なるまたは追加の実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドの活性代謝産物がある。
Ｉ．概要
内部欠失を含み、任意に少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１分子が、本開示において提供される。例示的な、内部欠失を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの実施形態は、限定されないが、内部欠失のないＦＧＦ−２１ポリペプチドに匹敵する生物学的活性のレベル保持しながら、増加した熱安定性、改善された溶解度、減少された脱アミノ化、改善された製造性、改善された全長生物学的に活性な形態のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を含む少なくとも１つの有利な特性を示すことが実証される。
削除された領域を含むおよび任意にペプチドで置換された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおいて、脱アミド化が軽減され、保存期間および純度が改善された（図１を参照されたい）。例示的な改変配列は、分子の貯蔵中に生じる可能性のある脱アミド化事象を軽減することが示された。脱アミド化の軽減に加えて、この修飾はまた、野生型のＦＧＦ−２１またはこの欠失を欠くＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して、熱安定性および／または溶解したタンパク質の溶解度を増加させ、更にタンパク質凝集傾向を最小化した。減少した脱アミド化、増加した熱安定性、増加した溶解度、および／または、減少された凝集は、より高い濃度での製剤化と同様に、より長い保存期間および、より高い純度等の優れた製剤化特性を示す。さらに、脱アミド化傾向の軽減は、大きな範囲の製剤化の選択を可能とし、さもなければ、脱アミド化を減少させるために製剤化条件を選択する必要があり、他の望ましくない製剤化の性質をもたらす可能性がある。さらに、５個〜１９個の隣接するアミノ酸の内部欠失、および１つの置換ペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、ＦＧＦ−２１の生物学的機能を保持し得る、また減少した脱アミド化、増加した熱安定性、増加した溶解度、および減少した凝集の少なくとも１つを有することは予測不能であり、予想できない。
更なる例示的な修飾は、タンパク質からの１０個のＣ末端アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｖｏタンパク質分解クリッピングを軽減する。この修飾は、完全な活性分子の血液半減期を延長し、全体的な用量の減少、およびさほど頻繁でない投薬をもたらす。他の修飾もまた利用され得るが、タンパク質分解クリッピングを軽減する例示的な修飾は、点突然変異、Ｇ１７０Ｅである。
いくつかの実施形態では、上記開示は、配列番号１〜配列番号７から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む改変ＦＧＦ２１ポリペプチドであって、上記アミノ酸配列が以下を含む場合を除く、ポリペプチドを提供する：
（ｉ）２個〜１９個（５個〜１９個のアミノ酸等）のアミノ酸の内部欠失であって、ここで、上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１６〜１３４に対応する領域内にあり、上記内部欠失は、０個〜１２個のアミノ酸の長さを有する置換ペプチドにより置き換えられる；
および（ｉｉ）９個以下の追加のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸を含み得るアミノ酸配列有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸７２、７７、８６、８７、９１、１０８、１１０、１２６、１３１か、１４６に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸７７、９１、１０８または１３１に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸７２に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸７７に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸８６に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸８７に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸９１に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１１０に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１２６に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１３１に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１４６に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸がフェニルアラニン誘導体である。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、パラ置換、オルト置換、またはメタ置換されたフェニルアラニン誘導体であってもよい。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンである。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置で組み込まれた、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンである。
いくつかの実施形態では、上記開示は、配列番号１〜配列番号７から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む改変ＦＧＦ２１のポリペプチドであって、上記アミノ酸配列が以下を含む場合を除く、ポリペプチドを提供する：
（ｉ）２個〜１９個（５個〜１９個のアミノ酸等）のアミノ酸の内部欠失であって、ここで、上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１６〜１３４に対応する領域内にあり、上記内部欠失は、０個〜１２個のアミノ酸の長さを有する置換ペプチドにより置き換えられる；
（ｉｉ）９個以下の追加のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入；
（ｉｉｉ）パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン等のパラ置換、オルト置換、またはメタ置換されたフェニルアラニン誘導体を含み得る、配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置の天然にコードされていないアミノ酸。
いくつかの実施形態では、上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１７０に対応する位置のグリシンに対してグルタミン酸の置換を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１９〜１３０に対応する領域を含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリマー、水溶性ポリマー、または約３０ｋＤａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）等のポリ（エチレングリコール）に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは、配列Ｇ、ＧＧ、ＳＧ、ＧＳＧ、ＧＧＨまたはＳＧＧを有する。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは配列ＧＳＧを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個、またはより少数の追加のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、８個またはより少数の追加のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、７個またはより少数の追加のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、６個またはより少数の追加のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、５個またはより少数の追加のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、４個またはより少数の追加のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、３個またはより少数の追加のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、２個またはより少数の追加のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１個の追加のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸Ｇ１７０に対応するアミノ酸の置換または欠失を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１７０に対応する位置でグリシンに対してグルタミン酸の置換を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、追加のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、４個〜１９個、４個〜１８個、４個〜１７個、４個〜１６個、４個〜１５個、４個〜１４個、４個〜１３個、４個〜１２個、４個〜１１個、４個〜１０個、４個〜９個、４個〜８個、４個〜７個、または４個〜６個のアミノ酸の内部欠失を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は４個〜１４個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は４個〜１２個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は４個〜１０個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は４個〜８個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は４個〜６個のアミノ酸であってもよい。
いくつかの実施形態では、上記内部欠失は５個〜１９個、５個〜１８個、５個〜１７個、５個〜１６個、５個〜１５個、５個〜１４個、５個〜１３個、５個〜１２個、５個〜１１個、５個〜１０個、５個〜９個、５個〜８個、５個〜７個、または５個〜６個のアミノであってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は５個〜１４個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は５個〜１２個のアミノ酸であってもよい。
いくつかの実施形態では、上記内部欠失は、は６個〜１９個、６個〜１８個、６個〜１７個、６個〜１６個、６個〜１５個、６個〜１４個、６個〜１３個、６個〜１２個、６個〜１１個、６個〜１０個、６個〜９個、６個〜８個、または６個〜７個のアミノであってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は６個〜１４個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は６個〜１２個のアミノ酸であってもよい。
いくつかの実施形態では、上記内部欠失は、は７個〜１９個、７個〜１８個、７個〜１７個、７個〜１６個、７個〜１５個、７個〜１４個、７個〜１３個、７個〜１２個、７個〜１１個、７個〜１０個、７個〜９個、または７個〜８個のアミノであってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は７個〜１４個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は７個〜１２個のアミノ酸であってもよい。
いくつかの実施形態では、上記内部欠失は８個〜１９個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は８個〜１４個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、上記内部欠失は８個〜１２個のアミノ酸であってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１２個のアミノ酸の内部欠失を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１３個のアミノ酸の内部欠失を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２１に対応する位置を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、内部欠失を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよく、ここで、
ｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１６からアミノ酸１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１７からアミノ酸１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｉｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１８からアミノ酸１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｉｖ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１９からアミノ酸１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｖ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２０からアミノ酸１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；または
ｖｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２１からアミノ酸１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、内部欠失を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよく、ここで、
ｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２２からアミノ酸１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２３からアミノ酸１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｉｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２４からアミノ酸１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｉｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２５からアミノ酸１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｖ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２６からアミノ酸１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｖｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２７からアミノ酸１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｖｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２８からアミノ酸１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；
ｖｉｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２９からアミノ酸１３３もしくは１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる；または
ｉｘ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１３０からアミノ酸１３４に対応する領域に含まれるか、もしくはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、内部欠失を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよく、ここで、
ｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１６からアミノ酸１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１７からアミノ酸１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｉｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１８からアミノ酸１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｉｖ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１９からアミノ酸１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｖ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２０からアミノ酸１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｖｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２１からアミノ酸１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｖｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２２からアミノ酸１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｖｉｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２３からアミノ酸１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｉｘ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２４からアミノ酸１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｘ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２５からアミノ酸１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｘｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２６からアミノ酸１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｘｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２７からアミノ酸１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｘｉｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２８からアミノ酸１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｘｉｖ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１２９からアミノ酸１３０、１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｘｖ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１３０からアミノ酸１３１、１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｘｖｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１３１からアミノ酸１３２、１３３、もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；
ｘｖｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１３２からアミノ酸１３３もしくは１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる；または
ｘｖｉｉｉ）上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１３３からアミノ酸１３４に対応する領域に含まれる、もしくはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、内部欠失を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよく、ここで、前記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１９〜１３０に対応する領域内にある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、内部欠失を含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよく、ここで、前記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１９〜１３０を含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１〜配列番号７から選択されるアミノ酸配列有するポリペプチドを含む改変ＦＧＦ２１のポリペプチドであって、上記アミノ酸配列が以下を含むことを除くポリペプチドを提供する。
（ｉ）配列番号１のアミノ酸１１９〜１３０に対応する領域の内部欠失であって、
上記内部欠失は、０個〜１２個のアミノ酸の長さを有する置換ペプチドによって置き換えられる；
（ｉｉ）９個またはより少数の追加のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入；ならびに
（ｉｉｉ）パラ置換、オルト置換、またはメタ置換されたフェニルアラニン誘導体（パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン等）を含み得る、配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置における天然にコードされていないアミノ酸。
上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１７０に対応する位置でグリシンに対するグルタミン酸の置換を含んでもよい。
上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリマー、水溶性ポリマー、または約３０ ｋＤａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）等のポリ（エチレングリコール）に連結されてもよい。
いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは配列Ｇ、ＧＧ、ＳＧ、ＧＳＧ、ＧＧＨまたはＳＧＧを有する。
いくつかの実施形態では、前記置換ペプチドは配列ＧＳＧを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、置換ポリペプチドを含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは、２個〜８個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは、２個〜５個のアミノ酸の長さを有している。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは、３個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは、セリン残基、ヒスチジン残基、および／またはグリシン残基を含む。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは、セリン残基、および／またはグリシン残基を含む。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは、配列Ｇ、ＧＧ、ＳＧ、ＧＳＧ、ＧＧＨまたはＳＧＧを有する。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは配列ＧＳＧを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１１９〜１３０に対応する領域内の内部欠失、および配列ＧＳＧを有する置換ペプチドを含み得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１〜配列番号７から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む改変ＦＧＦ２１のポリペプチドであって、上記アミノ酸配列が以下を含むことを除く、ポリペプチドを提供する：
（ｉ）２個〜１９個のアミノ酸（５個〜１９個のアミノ酸等）の内部欠失であって、
上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１６〜１３４に対応する領域に含まれ、
上記内部欠失は、配列Ｇ、ＧＧ、ＳＧ、ＧＳＧ、ＧＧＨまたはＳＧＧを有有する置換ペプチドと置き換えられる；
（ｉｉ）９個またはより少数の追加のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置における、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン等のパラ置換、オルト置換、またはメタ置換されたフェニルアラニン誘導体を含み得る天然にコードされていないアミノ酸。上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１７０に対応する位置でグリシンに対するグルタミン酸の置換を含んでもよい。上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１９〜１３０に対応する領域を含んでもよく、またはそれからなってもよい。上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリマー、水溶性ポリマー、または約３０ｋＤａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）等のポリ（エチレングリコール）に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、上記置換ペプチドは配列ＧＳＧを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１１９〜１３０に対応する領域を含む内部欠失を含み得るアミノ酸配列、配列ＧＳＧを有する置換ペプチド、配列番号１のアミノ酸１７０に対応する位置でのグリシンに対するグルタミン酸の置換、および任意に、配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置でのパラ置換、オルト置換、またはメタ置換されたフェニルアラニン誘導体（パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン等）を含み得る天然にコードされていないアミノ酸を有するポリペプチドを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを有する、またはそれを有しない配列番号２０２のポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを有する、またはそれを有しない配列番号２０２のポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを有する、またはそれを有しない配列番号２０２のポリペプチドに対して少なくとも９７％の同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを有する、またはそれを有しない配列番号２０２のポリペプチドに対して少なくとも９８％の同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを有する、またはそれを有しない配列番号２０２のポリペプチドに対して少なくとも９９％の同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを有する、またはそれを有しない配列番号２０２のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、配列番号２０２のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを有しない配列番号２０２のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを含む、またはそれを含まない配列番号１０２のポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを含む、またはそれを含まない配列番号１０２のポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有してもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを含む、またはそれを含まない配列番号１０２のポリペプチドに対して少なくとも９７％の同一性を有してもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを含む、またはそれを含まない配列番号１０２のポリペプチドに対して少なくとも９８％の同一性を有してもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを含む、またはそれを含まない配列番号１０２のポリペプチドに対して少なくとも９９％の同一性を有してもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを含む、またはそれを含まない配列番号１０２のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は配列番号１０２のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを含まない配列番号１０２のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、融合パートナーを更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、上記アミノ酸配列と融合パートナーの間に０個〜５０個のアミノ酸の長さを有する連結ペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、連結ペプチドは配列番号７４〜配列番号１００、配列番号３０１、および配列番号３５０〜配列番号３８３からアミノ酸配列を選択してもよい。いくつかの実施形態では、連結ペプチドはアミノ酸配列ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６０）を有してもよい。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、上記アミノ酸配列を連結する連結ペプチドと、上記融合パートナーとを更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、連結ペプチドは、０個〜１００個、２個〜８０個、２個〜６０個、２個〜５０個、２個〜４０個、２個〜３０個、２個〜２０個、２個〜１０個、２個〜８個、２個〜６個、または２個〜４個のアミノ酸の長さを有していてもよい。いくつかの実施形態では、連結ペプチドは、配列番号７４〜配列番号１００、配列番号３０１、および配列番号３５０〜３８３から選択されたアミノ酸配列に含んでもよく、またはそれからなってもよい。
いくつかの実施形態では、連結ペプチドはアミノ酸配列ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６０）を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
いくつかの実施形態では、融合パートナーは、血清アルブミン、Ｆｃドメイン、免疫グロブリン定常領域、非構造性ポリペプチド、およびアドネクチン、ならびにそれらのフラグメントから選択される。いくつかの実施形態では、融合パートナーは免疫グロブリン定常領域または改変免疫グロブリン定常領域を含む。いくつかの実施形態では、融合パートナーは非構造性ポリペプチドを含んでもよく、該非構造性ポリペプチドはＸＴＥＮまたはＰＡＳのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＳポリペプチドは配列番号３１０〜配列番号３１６から選択されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列を有してもよい。
いくつかの実施形態では、融合パートナーはＦｃドメインまたはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３０３〜配列番号３０９から選択されるポリペプチド等の配列番号３０２および配列番号３２３〜配列番号３３５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有してもよい。いくつかの実施形態では、融合パートナーは、配列番号．３０２および配列番号３２３〜配列番号３３５から選択されるアミノ酸配列を有するＦｃドメインまたはＦｃフラグメントを含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３０２および配列番号３２３〜配列番号３３５から選択されたアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは配列番号３０２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３０２に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３０２のアミノ酸配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４７５〜配列番号４８７から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは配列番号４７５に少なくとも９０％同一のポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは配列番号４７５に少なくとも９５％同一のポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは配列番号４７５に少なくとも９６％同一のポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは配列番号４７５に少なくとも９７％同一のポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは配列番号４７５に少なくとも９８％同一のポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは配列番号４７５に少なくとも９９％同一のポリペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは配列番号４７５のポリペプチドを含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、融合パートナーはアドネクチンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、融合パートナーはアルブミン結合アドネクチン、またはＰＫＥアドネクチンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＫＥアドネクチンは、配列番号３２０に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＫＥアドネクチンは、配列番号３２０に対して少なくとも９０％同一のポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＫＥアドネクチンは、配列番号３２０のポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４０１〜配列番号４２３から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４０１〜配列番号４２３から選択されたポリペプチドに対して少なくとも９５％同一のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４０１〜配列番号４２３から選択されたポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい：
いくつかの実施形態では、ＰＫＥアドネクチンは、配列番号３１９に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＫＥアドネクチンは、配列番号３１９に対して少なくとも９０％同一のポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＫＥアドネクチンは、配列番号３１９のポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４５２〜配列番号４７４から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４５２〜配列番号４７４から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９５％同一のポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４５２〜配列番号４７４から選択されるポリペプチドを含んでもよく、またはそれからなってもよい。
いくつかの実施形態では、融合パートナーは、血清アルブミンまたはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、融合パートナーはヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、融合パートナーは配列番号３２１または配列番号３２２に対して少なくとも９０％同一のポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、融合パートナーは、配列番号３２１または配列番号３２２のポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４２４〜配列番号４３２、配列番号４３４〜配列番号４３７、配列番号４４０〜配列番号４４３、および配列番号４４６〜配列番号４５１から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４２４〜配列番号４３２、配列番号４３４〜配列番号４３７、配列番号４４０〜配列番号４４３、および配列番号４４６〜配列番号４５１から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９５％同一のポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４２４〜配列番号４３２、配列番号４３４〜配列番号４３７、配列番号４４０〜配列番号４４３、および配列番号４４６〜配列番号４５１から選択されるポリペプチドを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１〜配列番号７から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む改変ＦＧＦ２１のポリペプチドであって、
上記アミノ酸配列が、
（ｉ）２個〜１９個のアミノ酸（５個〜１９個のアミノ酸等）の内部欠失であって、上記内部欠失が配列番号１のアミノ酸１１６〜１３４に対応する領域内にあり、上記内部欠失が０個〜１２個のアミノ酸の長さを有する置換ペプチドによって置換される内部欠失、ならびに
（ｉｉ）９個以下の追加のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入、
を含むことを除き、上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが融合パートナーを更に含む、改変ＦＧＦ２１ポリペプチドを提供する。上記融合パートナーは、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントを含んでもよい。前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１７０に対応する位置のグリシンに対するグルタミン酸の置換を含んでもよい。上記内部欠失は、配列番号１のアミノ酸１１９〜１３０に対応する領域を含んでもよく、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、前記置換ペプチドは、配列Ｇ、ＧＧ、ＳＧ、ＧＳＧ、ＧＧＨまたはＳＧＧを有する。いくつかの実施形態では、前記置換ペプチドは配列ＧＳＧを有する。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、前記アミノ酸配列および融合パートナーの間の連結ペプチドを含む。そこでは、前記連結ペプチドはアミノ酸配列ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：３６０）を含むか、それからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、リンカー、ポリマー、生物学的活性分子、ペプチド、ポリペプチドまたは半減期延長部分に連結されてもよい天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよいアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、半減期延長部分に連結されてもよい天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよいアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記半減期延長部分は水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、上記半減期延長部分は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、非構造性ポリペプチド、アドネクチン、血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、Ｆｃドメイン、免疫グロブリン定常領域、先のもののうちのいずれかのフラグメント、脂質、分岐鎖または直鎖のアシル基、分岐鎖または直鎖のＣ８〜Ｃ３０アシル基、分岐鎖または直鎖のアルキル基、および分岐鎖または直鎖のＣ８−Ｃ３０アルキル基から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＸＴＥＮまたはＰＡＳのポリペプチドから選択される非構造性ポリペプチドに連結されてもよい天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよいアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記半減期延長部分は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはモノメトキシのＰＥＧ（ｍＰＥＧ）ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、上記半減期延長部分は、分岐鎖もしくはマルチアームのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、または他の分岐鎖もしくはマルチアームの水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、上記半減期延長部分は、約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはモノメトキシのＰＥＧ（ｍＰＥＧ）の部分を含む。いくつかの実施形態は、上記半減期延長部分は、
ｉ）約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ；
ｉｉ）約１ｋＤａ〜５０ｋＤａ；
ｉｉｉ）約１０ｋＤａ〜４０ｋＤａ；
ｉｖ）約２０ｋＤａ〜３０ｋＤａ；
ｖ）約０．０５０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ；
または
ｖｉ）約１００ｋＤａ、９５ｋＤａ、９０ｋＤａ、８５ｋＤａ、８０ｋＤａ、７５ｋＤａ、７０ｋＤａ、６５ｋＤａ、６０ｋＤａ、５５ｋＤａ、５０ｋＤａ、４５ｋＤａ、４０ｋＤａ、３５ｋＤａ、３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ、１０ｋＤａ、９ｋＤａ、８ｋＤａ、７ｋＤａ、６ｋＤａ、５ｋＤａ、４ｋＤａ、３ｋＤａ、２ｋＤａ、１ｋＤａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａまたは１００Ｄの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）かモノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）の部分を含む。
いくつかの実施形態では、上記半減期延長部分は、約３０ｋＤａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）を含む。いくつかの実施形態では、上記半減期延長部分は、非ポリ（エチレングリコール）水溶性ポリマーまたはオリゴ糖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される上記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル部分を含み、リンカー、ポリマー、生物学的活性分子またはアミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドもしくはセミカルバジドの部分を含む、半減期延長部分に連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、アミド結合によってリンカー、ポリマー、生物学的活性分子または半減期延長部分に連結される、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジドの部分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、アジド部分によってリンカー、ポリマー、生物学的活性分子または半減期延長部分に連結されるアルキン部分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、リンカー、ポリマー、生物学的活性分子またはアルキン部分を含む半減期延長部分に連結されるアジド部分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、アミド結合によってリンカー、ポリマー、生物学的活性分子または半減期延長部分に連結されるアジドまたはアルキンの部分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、オキシム結合によってリンカー、ポリマー、生物学的活性分子または半減期延長部分に連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、オキシム結合によってリンカー、ポリマー、生物学的活性分子または半減期延長する部分に連結され、ここで、上記オキシム結合は、カルボニル基とアミノオキシ基の反応に起因する構造を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、オキシム結合によりリンカー、ポリマー、生物学的活性分子、または半減期延長部分に連結され、ここで、上記オキシム結合は構造がある、上記天然にコードされていないアミノ酸に含まれるカルボニル基と、上記リンカー、ポリマー、生物学的活性分子、または半減期延長部分に含まれるアミノオキシ基との反応に起因する構造を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ヒトＦＧＦ−２１ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を持つ。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、上記内部欠失のないＦＧＦ−２１ポリペプチド、または配列番号１、または配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＦＧＦ−２１ポリペプチドと比較して、または上記内部欠失および置換ペプチドのない同じ改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと比較して、熱安定性の増加、凝集の減少、ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解の減少、脱アミド化の減少、および溶解度の増加の少なくとも１つを持つ。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、上記内部欠失のないＰＥＧ化ＦＧＦ−２１ポリペプチド、上記内部欠失のない非ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１ポリペプチド、配列番号１のアミノ酸配列を含むＦＧＦ−２１ポリペプチド、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む非ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１ポリペプチド、ＰＥＧ化された配列番号２０１と比較して、または上記内部欠失および置換ペプチドのない同じ改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと比較して、熱安定性の増加、凝集の減少、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質分解の減少、脱アミド化の減少、および溶解度の増加の少なくとも１つを持つ。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、上記内部欠失のないＰＥＧ化ＦＧＦ−２１ポリペプチドと比較されてもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、上記内部欠失のない非ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１ポリペプチドと比較されてもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、ＦＧＦ−２１ポリペプチドと比較されてもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号２０１と比較されてもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＰＥＧ化された配列番号２０１と比較されてもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、上記内部欠失および置換ペプチドのない同じ改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと比較されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１もしくは配列番号２０１のアミノ酸配列を含む未改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、または上記内部欠失を含まないＦＧＦ−２１ポリペプチドと比較して、２℃〜１２℃、２℃〜１０℃、２℃〜８℃、４℃〜８℃、４℃〜１０℃、４℃〜１２℃、または６℃〜８℃の遷移中点（融解温度、Ｔｍ）の増加を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号２０２、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、または配列番号２２３のポリペプチドに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号２０２、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、または配列番号２２３のポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号２０２、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、または配列番号２２３のポリペプチドに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１０２または配列番号２０２のポリペプチドに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１０２または配列番号２０２のポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１０２または配列番号２０２のポリペプチドに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号２０２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号２０２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよく、ここで、配列番号２０２中のｐＡＦはポリ（エチレングリコール）に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）は約３０ｋＤａの平均分子量を有してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン（Ｅ．コリ等のいくつかの系において発現された後に存在し得る）を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、例えば哺乳動物細胞に基づく発現系において、例えばＮ末端メチオニンを含むシグナルペプチドを除去する処理の結果、Ｎ末端メチオニンのないポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、本明細書に開示される配列またはその変異体のいずれかを含むが、Ｎ末端メチオニンが省略されている、例えば、Ｎ末端メチオニンが省略されるか、または不在である、配列番号１０１〜配列番号１３２、配列番号２０１〜配列番号２０２、配列番号２０５〜配列番号２０６、配列番号２１０〜配列番号２１２、配列番号２１９〜配列番号２２３のいずれか１つ、または本明細書に記載されるその変異体、改変された、もしくは融合の形態のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、本明細書に開示される配列またはその変異体のいずれか、例えば、Ｎ末端メチオニンが付加されるか、または存在する、配列番号４０１〜配列番号４８７のいずれか１つ、または本明細書に記載されるそれらの変異体、改変形態、または融合形態のいずれか１つを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンのない配列番号２０２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号２０２のアミノ酸配列（任意にＮ末端メチオニンの無い）を有するポリペプチドを含んでもよく、ここで、配列番２０２号中のｐＡＦは、約３０ｋＤａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）に連結される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１０２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを含まない配列番号１０２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンおよびＦｃドメインまたはそのフラグメントを含まない配列番号１０２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１０２のアミノ酸配列およびＦｃドメインまたはそのフラグメントを有するポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４７５を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯまたはＨＥＫ等の哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．コリ等の細菌である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等である。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される宿主細胞を培養すること、および上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを単離することを含む、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを生産する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを生産する方法を提供する。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸はセレクタコドンによってコードされる。いくつかの実施形態では、上記方法は、本明細書に記載される宿主細胞を培養すること、ここで、上記宿主細胞は、上記セレクタコドンを認識して上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドへ上記天然にコードされていないアミノ酸を導入する直交ｔＲＮＡを含み、および上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを単離することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２０２のアミノ酸配列を有し、配列番号２０２中のｐＡＦがポリ（エチレングリコール）に連結されてもよい、ポリペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）は、約３０ｋＤａの平均分子量を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントに融合された、Ｎ末端メチオニンを有しない配列番号１２０のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４７５を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤と、少なくとも１つの他の活性剤とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの他の活性剤は、糖尿病治療薬、コレステロール調節剤、抗炎症剤、抗肥満剤、血圧降下薬、または線維症治療剤（ａｎｔｉ−ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｇｅｎｔ）である。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの他の活性剤は、ＧＬＰ−１アゴニストまたはインスリンである。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの他の活性剤は、超即効型インスリン、即効型インスリン、レギュラーインスリン、中間型インスリン、または持続型インスリン、ヒューマログ、リスプロ、ノボログ、アピドラ、ヒューミュリン、アスパルト、ヒトインスリン、ＮＰＨ、レンテ、ウルトラレンテ、ランタス、グラルギン、レベミル、デテミール（Ｄｅｔｅｍｉｒｍ）；エキセナチド（バイエッタ／ビデュリオン）、リラグルチド（ビクトーザ）、リキシセナチド（リクスミア）、アルビグルチド（タンゼウム）、エキセナチド長時間作用型放出（ＬＡＲ）、タスポグルチド、アルビグルチド、ＬＹ２１８９２６５（デュラグルチド）；オルリスタット（ゼニカル）、膵臓リパーゼ阻害剤、ナルトレキソン、フェンテルミン、トピラマート（キューシミア）、ロルカセリン（ベルヴィック）、ナルトレキソンおよびブプロピオン（コントラヴィーン）、リモナバン（アコンピア）、カンナビノイド受容体アンタゴニスト、シブトラミン（メリディア）、ロルカセリン、リモナバン、プラムリンチド、フェンテルミン、トピラマート、ブプロピオンまたはグルコマンナンである。
いくつかの実施形態では、本開示は、それらを必要とする患者において、グルコースおよび脂質ホメオスタシス、グルコース取込み、ＧＬＵＴ １発現、および／またはグルコース、トリグリセリド、インスリンもしくはグルカゴンの血清濃度の少なくとも１つを調節する方法であって、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量、または本明細書に開示される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、インスリン感受性を増加する、アディポネクチンレベルを増加する、血糖レベルを減少する、グルカゴンレベルを減少する、トリグリセリドレベルを減少する、フルクトサミンレベルを減少する、低密度コレステロールレベルを減少する、またはＣ反応性タンパク質レベルを減少する方法であって、それを必要とする患者において、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量、または本明細書に開示される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、肥満、糖尿病、膵炎、インスリン抵抗性、高インスリン血症、グルコース不耐症、高血糖、メタボリックシンドローム、耐糖能障害、不十分なグルコースクリアランス、高血糖、およびプラーダー−ヴィリ症候群から選択される病状または障害を治療する方法であって、それを必要とする患者において、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量、または本明細書に開示される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ａ型インスリン抵抗性、Ｃ型インスリン抵抗性（ＡＫＡ ＨＡＩＲ−ＡＮ症候群）、ラブソン−メンデンホール症候群、ドナヒュー症候群もしくはレプレコーニズム、アンドロゲン過剰症、男性型多毛症または黒色表皮肥厚症から選択されるインスリンに関係する病状または障害を治療する方法であって、それを必要とする患者において、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量、または本明細書に開示される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療を必要とする患者において、１型糖尿病または２型糖尿病を治療する方法であって、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量、または本明細書に開示される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療を必要とする患者において、肥満を治療する方法であって、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量、または本明細書に開示される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、線維症に関連する疾患を治療する方法であって、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量、または本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は、膵臓、肺、心臓、腎臓、肝臓、眼、神経系、骨髄、リンパ節、心内膜心筋、および／または後腹膜等の臓器または組織を冒す場合がある。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は肝線維症または肝硬変前期であってもよい。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、びまん性の実質性肺疾患、嚢胞性線維症、肺線維症、進行性塊状線維症、特発性肺線維症、注射線維症、腎線維症、慢性腎疾患、糖尿病性腎疾患、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、骨髄線維症、心不全、代謝性心不全、心臓線維症、白内障線維症、白内障、眼の瘢痕化、膵線維症、皮膚線維症、腸管線維症、腸狭窄、心内膜心筋線維症、心房線維症、縦隔洞線維症、クローン病、後腹膜線維症、ケロイド、腎原性全身性線維症、強皮症、全身性硬化症、関節線維症、ペローニー症候群、デュピュイトラン拘縮、糖尿病性ニューロパチー、癒着性関節包炎、アルコール性肝疾患、脂肪肝、ウイルス性肝炎、胆道疾患、原発性ヘモクロマトーシス、薬物性肝硬変、特発性肝硬変、ウィルソン病、およびα１−抗トリプシン欠乏症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、ヒト線維性肺疾患、肝線維症、黄斑変性、網膜の網膜症、硝子体の網膜症、心筋線維症、グレーブズ眼症、薬物誘発性麦角中毒、心血管疾患、アテローム性動脈硬化／再狭窄、肥厚性瘢痕、原発性または特発性の骨髄線維症および炎症性腸疾患（コラーゲン性大腸炎を含むが、これに限定されない）から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は、肺疾患、肺癌、薬物療法、化学療法または放射線療法の１または複数に起因する。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は、老化、心臓発作、卒中、心筋損傷、または左室機能不全の１または複数に起因する。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は、腎線維症、糸球体腎炎、慢性腎疾患、慢性腎不全、および全身性狼瘡、癌、物理的な障害、毒素、代謝性疾患、免疫疾患または糖尿病腎症に関連する腎炎から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は、外傷、脊髄損傷、感染、手術、虚血傷害、心臓発作、熱傷、環境汚染物曝露、肺炎、結核または急性呼吸窮迫症候群の１つ以上に起因する。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は、肺線維症、間質性肺疾患、ヒト線維性肺疾患、特発性肺線維症、肝線維症、心臓線維症、心筋線維症、黄斑変性、網膜の網膜症、硝子体の網膜症、グレーブズ眼症、薬物誘発性麦角中毒、心血管疾患、アテローム性動脈硬化／再狭窄、ケロイドおよび肥厚性瘢痕、原発性または特発性の骨髄線維症、炎症性腸疾患、コラーゲン性大腸炎、眼の瘢痕化、ならびに白内障線維症から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患はＮＡＳＨ、肝線維症および肝硬変から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患はＮＡＳＨであってもよい。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は、糖尿病性腎疾患、慢性腎疾患および腎線維症から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は、代謝性心不全および心臓線維症から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、線維症に関連する疾患は肺線維症であってもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療を必要とする患者において、肝線維症または肝硬変を治療する方法であって、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量、または本明細書に記載される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療または予防を必要とする患者において、ＮＡＳＨを治療または予防する方法であって、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量、または本明細書に記載される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、肝臓の脂肪画分の減少を必要とする患者において、肝臓の脂肪画分を減少する方法であって、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量、または本明細書に記載される組成物を上記患者に投与することを含み、ここで、任意に上記患者がＮＡＳＨを発症するリスクがあるか、またはＮＡＳＨと診断されている、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、それらを必要とする患者において、肝硬度を減少する、体脂肪率を減少する、体重を減少する、肝重量体重比を減少する、肝臓脂質含有量を減少する、肝線維症面積を減少する、空腹時血中グルコースレベル、絶食時トリグリセリドを減少する、ＬＤＬコレステロールを減少する、ＡｐｏＢを減少する、ＡｐｏＣを減少する、および／またはＨＤＬコレステロールを増加する方法であって、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量、または本明細書に記載される組成物を上記患者に投与することを含み、ここで、任意に上記患者がＮＡＳＨを発症するリスクがあるか、またはＮＡＳＨと診断されている、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ポネクチンレベルの増加を必要とする患者において、アディポネクチンレベルを増加する方法であって、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量、または本明細書に記載される組成物を上記患者に投与することを含み、ここで、任意に上記患者がＮＡＳＨを発症するリスクがあるか、またはＮＡＳＨと診断されている、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療を必要とする患者において、１または複数のＮＡＳＨに関連する症状を治療する方法であって、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量または本明細書に記載される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。
治療または予防を必要とする患者において、ＮＡＳＨを治療または予防する方法であって、配列番号２０２に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量を上記患者に投与することを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号２０２に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。また、治療または予防を必要とする患者において、ＮＡＳＨを治療または予防する方法であって、配列番号２０２を含み、そのｐＡＦ残基がポリ（エチレングリコール）部分に連結される、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量を上記患者に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、上記ポリ（エチレングリコール）は、約０．１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、もしくは約２０ｋＤａ〜４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、上記ポリ（エチレングリコール）は、約３０ｋＤａの分子量を有する。
治療または予防を必要とする患者において、ＮＡＳＨを治療または予防する方法であって、配列番号１０２に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量を上記患者に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１０２に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。また、治療または予防を必要とする患者においてＮＡＳＨを治療または予防する方法であって、（ａ）Ｎ末端Ｍｅｔを有しない配列番号１０２、または（ｂ）配列番号１０２を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量を上記患者に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。
治療または予防を必要とする患者においてＮＡＳＨを治療または予防する方法であって、配列番号４７５に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量を上記患者に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号４７５に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。治療または予防を必要とする患者において、ＮＡＳＨを治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に配列番号４７５を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量を投与することを含む、方法が本明細書において提供される。
いくつかの実施形態では、患者は、肝生検によって任意に決定される、ＮＡＳＨ ＣＲＮ線維症のステージ１〜ステージ３を示してもよい。いくつかの実施形態では、治療に先立って、患者は、少なくとも約６０の脂肪症インデックスを示してもよい。いくつかの実施形態では、治療に先立って、患者は、磁気共鳴画像によって任意に決定される、少なくとも１０％の肝臓脂肪画分のパーセンテージを示してもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療を必要とする患者において心不全または心臓線維症を治療する方法であって、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量、または本明細書に記載される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療を必要とする患者において腎臓または腎線維症を治療する方法であって、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量、または本明細書に記載される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療必要とする患者において肺線維症を治療する方法であって、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量、または本明細書に記載される組成物を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療を必要とする患者において線維症に関連する疾患を治療する方法であって、１または複数の天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量を上記患者に投与することを含み、上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、配列番号１〜配列番号７および配列番号２０１から選択されるアミノ酸配列を有するヒトＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して少なくとも９０％または９５％の同一性を持ち、上記線維症に関連する疾患が、ＮＡＳＨ、肝線維症、糖尿病性腎疾患、慢性腎疾患、腎線維症、肺線維症、心臓線維症、心不全、および代謝性心不全から選択される、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１〜配列番号７、および配列番号２０１から選択されるアミノ酸配列を有するヒトＦＧＦ−２１ポリペプチドに対して少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を持つ。
いくつかの実施形態では、本開示は、線維症に関連する疾患を治療する方法であって、任意に、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有してもよいポリ（エチレングリコール）を含んでもよいポリマーまたは水溶性のポリマーに連結された、配列番号２０１の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含み、ここで、上記線維症に関連する疾患が、ＮＡＳＨ、肝線維症、糖尿病性腎疾患、慢性腎疾患および代謝性心不全から選択されてもよい、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸７２、７７、８６、８７、９１、１０８、１１０、１２６、１３１、または１４６に対応する位置にあってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１中のアミノ酸１０８に対応する位置にあってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１中のアミノ酸７７、９１、または１３１に対応する位置にあってもよい。
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、フェニルアラニンの類縁体または誘導体を含んでもよい。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含み、配列番号１中のアミノ酸１０８に対応する位置にあってもよい。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはモノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）部分に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、
ｉ）約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ；
ｉｉ）約１ｋＤａ〜５０ｋＤａ；
ｉｉｉ）約１０ｋＤａ〜４０ｋＤａ；
ｉｖ）約２０ｋＤａ〜３０ｋＤａ；
ｖ）約０．０５０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ；または
ｖｉ）約１００ｋＤａ、９５ｋＤａ、９０ｋＤａ、８５ｋＤａ、８０ｋＤａ、７５ｋＤａ、７０ｋＤａ、６５ｋＤａ、６０ｋＤａ、５５ｋＤａ、５０ｋＤａ、４５ｋＤａ、４０ｋＤａ、３５ｋＤａ、３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ、１０ｋＤａ、９ｋＤａ、８ｋＤａ、７ｋＤａ、６ｋＤａ、５ｋＤａ、４ｋＤａ、３ｋＤａ、２ｋＤａ、１ｋＤａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、または１００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）またはモノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）部分に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、約３０ｋＤａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）に連結されてもよい。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、オキシム結合によってリンカー、ポリマー、生物学的活性分子または半減期延長部分に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、オキシム結合は、カルボニル基およびアミノオキシ基の反応に起因する構造を有する。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、配列番号１の、または別のＦＧＦ−２１ポリペプチドのアミノ酸配列を有する野生型ヒトＦＧＦ−２１ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を持っていてもよい。
いくつかの実施形態では、上記方法は、上記患者への少なくとも１つの他の活性剤の投与を更に含んでもよく、上記追加の活性剤は、上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと同じ組成物に含まれていてもよく、または別々に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの他の活性剤は、抗線維症剤、Ｎ−カドヘリンアンタゴニスト、抗Ｎカドヘリン抗体、小分子Ｎ−カドヘリンアンタゴニスト、拮抗性Ｎ−カドヘリンフラグメント、抗炎症剤、レニン−アンギオテンシン系（ＲＡＳ）系を抑制する肝保護剤、プロバイオティクスおよび多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、抗線維症剤は、ニンテダニブ、ピルフェニドン、ＬＰＡ１アンタゴニスト、ＬＰＡ１受容体アンタゴニスト、ＧＬＰ１類縁体、トラロキヌマブ（ＩＬ−１３、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ビスモデギブ（ヘッジホッグアンタゴニスト、Ｒｏｃｈｅ）、ＰＲＭ−１５１、ＳＡＲ−１５６５９７（二重特異性Ｍａｂ ＩＬ−４およびＩＬ−１３、Ｓａｎｏｆｉ）、シムツズマブ（抗リシルオキシダーゼ様２（抗ＬＯＸＬ２）抗体、Ｇｉｌｅａｄ）、ＣＫＤ−９４２、ＰＴＬ−２０２（ＰＤＥ ｉｎｈ．／ペントキシフェリン／ＮＡＣ経口制御放出Ｐａｃｉｆｉｃ Ｔｈｅｒ．）、オミパリシブ（経口 ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、ＧＳＫ）、ＩＷ−００１（経口ゾル ウシＶ型コラーゲン ｍｏｄ．、ＩｍｍｕｎｅＷｏｒｋｓ）、ＳＴＸ−１００（インテグリン アルファＶ／ベータ−６ ａｎｔ（Ｓｔｒｏｍｅｄｉｘ／Ｂｉｏｇｅｎ））、アクティミューン（ＩＦＮガンマ）、ＰＣ−ＳＯＤ（ミジスマーゼ；吸入された、ＬＴＴ Ｂｉｏ−Ｐｈａｒｍａ／ＣＫＤ Ｐｈａｒｍ）レブリキズマブ（抗ＩＬ−１３ ＳＣ ヒト化ｍＡｂ、Ｒｏｃｈｅ）、ＡＱＸ−１１２５（ＳＨＩＰ１活性化因子、Ａｑｕｉｎｏｘ）およびＣＣ−５３９（ＪＮＫ阻害剤、Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＦＧ−３０１９（ＦｉｂｒｏＧｅｎ）、およびＳＡＲ−１００８４２（Ｓａｎｏｆｉ）から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、肝保護剤は、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）またはオベチコール酸（ＯＣＡまたはＩＮＴ−７４７、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）であってもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される線維症に関連する疾患を治療する方法における使用に適した改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、上記組成物は、少なくとも１つの他の活性剤を更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの他の活性剤は、抗線維症剤、ピルフェニドン、Ｎ−カドヘリンアンタゴニスト、抗Ｎカドヘリン抗体、小分子Ｎ−カドヘリンアンタゴニスト、拮抗性Ｎ−カドヘリンフラグメント、抗炎症剤、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、オベチコール酸（ＯＣＡまたはＩＮＴ−７４７、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）等のレニン‐アンギオテンシン系（ＲＡＳ）系を抑制する肝保護剤、プロバイオティクスおよび多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）から選択されてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む組成物の有効量を、治療を必要とする患者に、投与することを含む医学的複雑型肥満を治療する方法、を提供する。いくつかの実施形態では、医学的複雑型肥満はプラーダー−ヴィリ症候群と関連し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、または本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物を、経口的に、局所的に、または注射によって投与してもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは組成物は、皮下注射、ＩＶ注射、腹腔内注射、筋肉内注射によって投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは組成物は、１日当たり約１回、または１日約１回より少ない頻度で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは組成物は、１週間に約２回、または１週に約２回よりも少ない頻度で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは組成物は、１週間に約１回、または１週に約２回よりも少ない頻度で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは組成物は、２週間に約１回、または１週に約２回よりも少ない頻度で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは組成物は、３週間に約１回、または１週に約２回よりも少ない頻度で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは組成物は、１ヶ月に約１回、または１ヶ月に約１回よりも少ない頻度で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは組成物は、４週間に約１回の頻度で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは組成物は、１日に約１回の頻度で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたは組成物は、１週間に約１回の頻度で投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１用量当たり約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、１用量当たり約０．１ｍｇ〜約２００ｍｇの間で、１用量当たり約０．２ｍｇ〜約１００ｍｇの間で、１用量当たり約０．５ｍｇ〜約８０ｍｇの間で、１用量当たり約１ｍｇ〜約６０ｍｇ、１用量当たり約５ｍｇ〜約４０ｍｇ、１用量当たり約１０ｍｇ〜約３０ｍｇ、１用量当たり約１０ｍｇ〜約２０ｍｇ、１用量当たり約０．２ｍｇ〜約１ｍｇ、１用量当たり約１ｍｇ〜約２ｍｇ、１用量当たり約２ｍｇ〜約４ｍｇ、１用量当たり約４ｍｇ〜約６ｍｇ、１用量当たり約６ｍｇ〜約１０ｍｇ、１用量当たり約１０ｍｇ〜約２０ｍｇ、１用量当たり約２０ｍｇ〜約４０ｍｇ、１用量当たり約４０ｍｇ〜約６０ｍｇ、１用量当たり約６０ｍｇ〜約８０ｍｇ、１用量当たり約８０ｍｇ〜約１００ｍｇ、１用量当たり約１００ｍｇ〜約１２０ｍｇ、１用量当たり約１２０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、１用量当たり約１４０ｍｇ〜約１６０ｍｇ、１用量当たり約１６０ｍｇ〜約１８０ｍｇ、１用量当たり約１８０ｍｇ〜約２００ｍｇ、または１用量当たり約２００ｍｇ〜約２４０ｍｇの量で投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１用量当たり約０．２ｍｇ、約０．６ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約４０ｍｇ、約６０ｍｇ、約８０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１８０ｍｇ、および約２００ｍｇから選択される量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１用量当たり約０．２ｍｇ、約０．６ｍｇ、約２ｍｇ、約６ｍｇ、約２０ｍｇ、約４０ｍｇ、および約６０ｍｇから選択される量で投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、または改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物は、少なくとも１つの他の活性剤と同時投与、または別々に投与（同時にまたは連続して）されてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの他の活性剤は、抗糖尿病剤、抗肥満剤、コレステロール調節剤、抗炎症剤および血圧降下剤から選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの他の活性剤は、スタチン、ＧＬＰ−１アゴニストおよびインスリンから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの他の活性剤は、アミリン、アミリン類縁体、ミグリトール、アカルボース、ボグリボース、メトホルミン、ビグアニド等のアルファ−グルコシダーゼ阻害剤、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン等のグリタゾン、エキセナチド、リラグルチド、タスポグルチドまたはリキシセナチド、グリコ尿酸、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤、超即効型インスリン、即効型インスリン、レギュラーインスリン、中間型インスリンまたは持続型インスリン、ヒューマログ、リスプロ、ノボログ、アピドラ、ヒューミュリン、アスパルト、ヒトインスリン、ＮＰＨ、レンテ、ウルトラレンテ、ランタス、グラルギン、レベミル、デテミール、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、バイトリン、アドビコール、ベシル酸カデュエット、シムコール、オルリスタット（ゼニカル）、膵臓リパーゼ阻害剤、ナルトレキソン、フェンテルミンおよびトピラマート（キューシミア）、ロルカセリン（ベルヴィック）、ナルトレキソン、ブプロピオン（コントラヴィーン）、リモナバン（アコンピア）、カンナビノイド受容体拮抗薬、シブトラミン（メリディア）、ロルカセリン、リモナバン、エキセナチド、プラムリンチド、フェンテルミン、トピラマート、精神安定剤、ブプロピオン、グルコマンナン、グアーガム、デキセドリン、ジゴキシン、食欲抑制薬、抗肥満薬、エキセナチド（バイエッタ／ビデュリオン）、リラグルチド（ビクトーザ）、リキシセナチド（リクスミア）、アルビグルチド（タンゼウム）、エキセナチド長時間作用型放出（ＬＡＲ）、タスポグルチド、アルビグルチド、ＬＹ２１８９２６５（デュラグルチド）等の分泌促進物質から選択される。
有利には、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１化合物は、より少ない用量を要求する、より長い循環半減期を可能とすること、かかる治療を必要とする被験体に対する利便性、および被験体の投薬要件の遵守の可能性の両方を増すことによって効能を高め得る。
メタボリックシンドロームは、少なくとも以下のうち３つの徴候を示す患者において典型的に診断される：腹部脂肪−大半の男性において４０インチ以上のウエスト；高血糖−絶食後１デシリットル当たり少なくとも１１０ミリグラム（ｍｇ／ｄＬ）；高トリグリセリド−血流中少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ；低ＨＤＬ−４０ｍｇ／ｄＬ未満；および１３０／８５以上の血圧。
主題の方法は、それを必要とする患者において、ＩＩ型糖尿病および／または肥満を治療するか、またはその発症を遅らせるのに有効な場合がある。上記患者は、糖尿病前症と診察されていてもよく、またはＩＩ型糖尿病の家族歴；以前にＩＩ型糖尿病と診察された１人または複数の親または兄弟；脂質異常症；少なくとも２００ｍｇ／ｄＬの総血液トリグリセリドレベル；３５ｍｇ／ｄＬ未満の血液高密度リポ蛋白質レベル；肥満；２５ｋｇ／ｍ２超の肥満指数；妊娠性糖尿病の既往症；以前に、９ｌｂｓ．超の出生時体重の乳児を産んだ；高血圧症；少なくとも１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧；少なくとも９０ｍｍＨｇの拡張期血圧；以前の測定で少なくとも９９ｍｇ／ｄＬの空腹時血中グルコース；血管疾患；多嚢胞性卵巣症候群；または黒色表皮肥厚症等のＩＩ型糖尿病の発症の１または複数の危険因子を示してもよい。
患者は、空腹時血中グルコースレベル１００ｍｇ／ｄＬ〜１２５ｍｇ／ｄｌ；７５グラムのグルコース溶液、または最大７５グラムまでの体重の１キログラム当たりの１．７５グラムのグルコースのグルコース溶液を摂取した後の２時間後、１４０ｍｇ／ｄＬおよび１９９ｍｇ／ｄＬの血糖値、；および／または５．７パーセント〜６．４パーセントの糖化ヘモグロビン等の１または複数の糖尿病前症を示してもよい。
患者は、１２５ｍｇ／ｄｌ超の空腹時血中グルコースレベル；７５グラムのグルコース溶液、または７５グラムの最大用量までの体重の１キログラム当たりの１．７５グラムのグルコースのグルコース溶液を摂取した２時間後の少なくとも２００ｍｇ／ｄＬの血糖値；および／または少なくとも６．５パーセントの糖化ヘモグロビン等の１または複数の糖尿病の症状を示してもよい。
患者はＩＩ型糖尿病と診断されていてもよい。
患者は、からなる群から選択された少なくとも化合物を用いる治療に治療抵抗性であってもよい。ＧＬＰ−１、エキセナチド−ｌ、エキセンディン、エキセンディン類縁体、エキセンディンアゴニスト、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、エキセナチドＬＡＲ、ＤＰＰ−４阻害剤、ＧＬＰ−１受容体アゴニストおよび別のＧＬＰ−１アゴニスト；または、かかる化合物は患者への投与に対して禁忌であってもよい。
上記方法は、上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに加えて抗糖尿剤または抗肥満剤を上記患者に投与することを更に含んでもよい。上記抗糖尿病剤または抗肥満剤は、１または複数のアミリン、アミリンアゴニスト、スルホニルウレア、カルシトニン、グルカゴン、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、ＧＰＬ−１受容体アゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤、アミリン類縁体、ビグアニド、ドーパミンＤ２−受容体アゴニスト、メグリチニド、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、抗脂質異常症胆汁酸金属イオン封鎖剤、エキセンディン、エキセンディン類縁体、エキセンディンアゴニスト、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、インクレチンペプチド、インスリン、ＳＧＬＴ２阻害剤、グルコース再吸収阻害剤、フェノフィブラート、フィブラート、抗グレリン抗体または抗体フラグメント、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）−１（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ−１（ＩＩＩｃ）、抗体もしくは抗体フラグメント、および／または、ＦＧＦＲ−４（ＩＩＩｃ）、抗ＣＤ３８抗体もしくは抗体フラグメント、抗ＭＩＣ−１抗体、またはＭＩＣ−１結合フラグメント、メトホルミンまたは先のもののうちのいずれかの組み合わせを含んでもよい。
典型的な実施形態では、上記抗糖尿病剤は、メトホルミン、インスリングラルギン、ランタス（Ｓａｎｏｆｉ）、ジャヌビア等のシタグリプチン、ノボログおよびノボラピッド（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）等のインスリンアスパルト、ヒューマログ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）等のインスリンスリプロ、ビクトーザ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）等のリラグルチド、レベミル（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）等のインスリンデテミール、ジャヌメット（Ｍｅｒｃｋ）等のメトホルミンと併用するシタグリプチン、ノボミックス３０（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）等の比率３０／７０の可溶性インスリンアスパルトおよびプロタミン結晶化インスリンアスパルト、またはアクトス（Ｔａｋｅｄａ）等のピオグリタゾンであってもよい。
上記方法は、減量をもたらすのに有効な可能性がある。
本発明の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと共に組み合わせて使用される抗糖尿病剤として、限定されないが、インスリン分泌促進物質、もしくはインスリン抵抗性改善薬、ＭＧＡＴ２阻害剤または他の抗糖尿病剤が挙げられる。これらの薬剤として、限定されないが、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰ４）阻害剤（例えばシタグリプチン、サキサグリプチン、アログリプチン、ビルダグリプチン等）、ビグアニド（例えばメトホルミン、フェンホルミン等）、スルホニルウレア、（例えばグリブライド、グリメピリド、グリピジド等）、グルコシダーゼ阻害薬（例えばアカルボース、ミグリトール等）、チアゾリジンジオン（例えばロシグリタゾン、ピオグリタゾン等）等のＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト（例えばムラグリタザル、テサグリタザル、アレグリタザル等）、グルコキナーゼ活性化体（Ｆｙｆｅ，Ｍ．Ｃ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ，３４（８）：６４１−６５３（２００９）に記載され、参照により本明細書に援用される）、ＧＰＲ４０受容体調節剤、ＧＰＲ１１９受容体調節剤（ＭＢＸ−２９５２、ＰＳＮ８２１、ＡＰＤ５９７等）、ＳＧＬＴ２阻害剤（ダパグリフロジン、カナグリフロジン、レモグリフロジン（ｒｅｍａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）等）、プラムリンチド等のアミリン類縁体、および／またはインスリンが挙げられる。また、本発明の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、任意に、糖尿病の合併症を治療するための薬剤と組み合わせて採用されてもよい。これらの薬剤は、ＰＫＣ阻害剤、および／またはＡＧＥ阻害剤を含む。
また、本発明の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、任意に、ジエチルプロピオン、フェンジメトラジン、フェンテルミン、オルリスタット、シブトラミン、ロルカセリン、プラムリンチド、トピラマート、ＭＣＨＲ１受容体拮抗薬、オキシントモジュリン、ナルトレキソン、アミリンペプチド、ＮＰＹ Ｙ５受容体調節剤、ＮＰＹ Ｙ２受容体調節剤、ＮＰＹ Ｙ４受容体調節剤、セチリスタット、５ＨＴ２ｃ受容体調節剤等の１または複数の食欲減退薬剤と組み合わせて採用されてもよい。また、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを、エキセナチド、リラグルチド、ＧＰＲ−１（１−３６）アミド、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｈａｂｅｎｅｒに対する米国特許第５，６１４，４９２号に開示され、その本開示は参照によって本明細書に援用される）等のグルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）のアゴニストと組み合わせて採用してもよく、注射、鼻腔内、または経皮的もしくはバッカルのデバイスによって投与されてもよい。
また、本発明の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、任意に、１または複数の、ＤＧＡＴ阻害剤等の他の種類の治療剤、スタチン（ＨＭＧ ＣｏＡリダクターゼの阻害剤）等のＬＤＬ低下薬、またはコレステロール吸収の阻害剤、およびＰＣＳＫ９の調節剤、ＣＥＴＰ阻害剤等のＨＤＬを増加させる薬物と組み合わせて採用されてもよい。
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されてもよい。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、リンカーにより水溶性ポリマーに連結されるか、または水溶性ポリマーに結合される。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は二官能性ポリマーである。いくつかの実施形態では、二官能性ポリマーは第２のポリペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドはアンフォールドされた、または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性ポリマーに連結された少なくとも２つの天然にコードされていないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、１または複数の天然にコードされていないアミノ酸は、改変ＦＧＦ−２１中の以下の１または複数の位置に組み込まれる：１位の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端に）（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７中の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１または複数の天然にコードされていないアミノ酸は、改変ＦＧＦ−２１の中の以下の１または複数の位置に組み込まれる：１０、５２、１１７、１２６、１３１、１６２、８７、７７、８３、７２、６９、７９、９１、９６、１０８および１１０（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１または複数の天然にコードされていないアミノ酸は、改変ＦＧＦ−２１中の以下の１または複数の位置に組み込まれる：１０、５２、７７、１１７、１２６、１３１、１６２（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１または複数の天然にコードされていないアミノ酸は、改変ＦＧＦ−２１の中の以下の１または複数の位置に組み込まれる：
８７、７７、８３、７２（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１または複数の天然にコードされていないアミノ酸は、改変ＦＧＦ−２１の中の以下の１または複数の位置に組み込まれる：６９、７９、９１、９６、１０８、および１１０（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１または複数の非天然アミノ酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、または他の非改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１配列のリーダー配列、またはシグナル配列に組み込まれる。いくつかの実施形態では、リーダー配列は配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４から選ばれてもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１分泌コンストラクトは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４から選択されるリーダー配列と共にｐＶＫ７ａｒａ（Ｎｄｅ／Ｅｃｏ）へとクローンニングされる。
いくつかの実施形態では、これらの位置の１または複数における天然起源でないアミノ酸は、限定されないが以下を含む位置の水溶性ポリマーに連結される：１位の前（すなわちＮ末端に）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２（すなわち、カルボキシル末端に）（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、配列番号３４〜配列番号３６の１位の前（すなわちＮ末端）からＣ末端の１または複数の位置の天然起源でないアミノ酸が水溶性ポリマーに連結される。いくつかの実施形態では、これらの位置の１または複数における天然起源でないアミノ酸は、限定されないが以下を含む位置の水溶性ポリマーに連結される：１０、５２、１１７、１２６、１３１、１６２、８７、７７、８３、７２、６９、７９、９１、９６、１０８、および１１０（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、これらの位置の１または複数における天然起源でないアミノ酸は、限定されないが以下を含む位置の水溶性ポリマーに連結される：１０、５２、７７、１１７、１２６、１３１、１６２（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、これらの位置の１または複数における天然起源でないアミノ酸は、限定されないが以下を含む位置の水溶性ポリマーに連結される：８７、７７、８３、７２（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、これらの位置の１または複数における天然起源でないアミノ酸は、限定されないが以下を含む位置の水溶性ポリマーに連結される：６９、７９、９１、９６、１０８、および１１０（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４のリーダー配列またはシグナル配列の中の１または複数の天然起源でないアミノ酸、または他の改変ＦＧＦ−２１配列が水溶性ポリマーに連結される。いくつかの実施形態では、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７のリーダー配列またはシグナル配列の中の１または複数の天然起源でないアミノ酸、または他の改変ＦＧＦ−２１配列が水溶性ポリマーに連結される。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体に対する改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの親和性、またはタンパク質、ポリペプチド、小分子もしくは核酸を含むがこれらに限定されない、結合パートナーを調節する、少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の安定性と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの安定性を増加させる少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の免疫原性と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの免疫原性を減少させる、少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の血清半減期または循環時間と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの血清半減期または循環時間を増加させる、少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の脱アミド化と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの脱アミド化を減少させる、少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の水溶解度と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの水溶解度を増加させる、少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、宿主細胞の中で生産された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの溶解度を増加させる少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の溶解度と比較された時、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の水溶解度と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の発現または合成と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、宿主細胞における改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現を増加させる、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成を増加させる、少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。この置換を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドはアゴニスト活性を保持してもよく、宿主細胞中の発現レベルを保持または改善する。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１のプロテアーゼ抵抗性と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのプロテアーゼ抵抗性を増加させるか、またはプロテアーゼ切断（Ｃ末端アミノ酸等の切断）を減少する、少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。米国特許第６，７１６，６２６号は、プロテアーゼ切断を変更するように置換され得る候補部位として、限定されないがプロリンの２つの残基内の一塩基部位が挙げられることを示した。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１ポリペプチドとの相互作用による受容体の活性と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、改変ＦＧＦ−２１受容体のシグナル伝達活性を調節する、少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１ポリペプチドの結束と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、受容体等の別の分子へのその結束を調節する、少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの置換、付加または欠失のない対応するＦＧＦ−２１の適合性と比較した場合、または配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、または別の未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド等のコンパレータ化合物と比較した場合、薬学的防腐剤（例えばｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール）と改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの適合性を増加させる、少なくとも１つの置換、付加または欠失を含む。この適合性の増加は、保存中、タンパク質の生理化学的な特性および生物活性を維持する、保存されている医薬製剤の調製を可能にする。その全体が参照により本明細書に記載される、国際公開第２００５／０９１９４４号は、増強された薬学的安定性を有するＦＧＦ−２１変異タンパク質の以下の例について考察する：以下の１つに対する荷電、および／または極性であるが非荷電のアミノ酸による置換：国際公開第２００５／０９１９４４号の配列番号１のグリシン４２、グルタミン５４、アルギニン７７、アラニン８１、ロイシン８６、フェニルアラニン８８、リジン１２２、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、プロリン１３０、アルギニン１３１、ロイシン１３９、アラニン１４５、ロイシン１４６、イソロイシン１５２、アラニン１５４、グルタミン１５６、グリシン１６１、セリン１６３、グリシン１７０、またはセリン１７２。本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリペプチド中の対応する位置でこれらの置換の少なくとも１つを含んでいてもよく、および／または１もしくは複数の他の置換、付加または欠失を含んでもよい。いくつかの実施形態では、１または複数の非天然アミノ酸は、以下の１または複数の位置で置換される：グリシン４２、グルタミン５４、アルギニン７７、アラニン８１、ロイシン８６、フェニルアラニン８８、リジン１２２、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、プロリン１３０、アルギニン１３１、ロイシン１３９、アラニン１４５、プロリン／ロイシン１４６、イソロイシン１５２、アラニン１５４、グルタミン１５６、グリシン１６１、セリン１６３、グリシン１７０、セリン１７２（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１または複数の非天然アミノ酸は、以下の１または複数の位置で置換される：グルタメート９１、アルギニン１３１、グルタミン１０８、アルギニン７７、アルギニン７２、ヒスチジン８７、ロイシン８６、アルギニン１２６、グルタメート１１０、チロシン８３、プロリン１４６、アルギニン１３５、アルギニン９６、アルギニン３６、（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）。
国際公開第０５／０９１９４４号は、増強された薬学的安定性を有するＦＧＦ−２１の更なる変異タンパク質を記載する。かかる変異タンパク質は、ＦＧＦ−２１において下記の２以上に対してシステインの置換を含む（国際公開第０５／０９１９４４号の配列番号１を参照されたい）：アルギニン１９、チロシン２０、ロイシン２１、チロシン２２、トレオニン２３、アスパルテート２４、アスパルテート２５、アラニン２６、グルタミン２７、グルタミン２８、アラニン３１、ロイシン３３、イソロイシン３５、ロイシン３７、バリン４１、グリシン４２、グリシン４３、グルタメート５０、グルタミン５４、ロイシン５８、バリン６２、ロイシン６６、グリシン６７、リジン６９、アルギニン７２、フェニルアラニン７３、グルタミン７６、アルギニン７７、アスパルテート７９、グリシン８０、アラニン８１、ロイシン８２、グリシン８４、セリン８５、プロリン９０、アラニン９２、セリン９４、フェニルアラニン９５、ロイシン１００、アスパルテート１０２、チロシン１０４、チロシン１０７、セリン１０９、グルタメート１１０、プロリン１１５、ヒスチジン１１７、ロイシン１１８、プロリン１１９、アスパラギン１２１、リジン１２２、セリン１２３、プロリン１２４、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、アスパルテート１２７、アラニン１２９、プロリン１３０、グリシン１３２、アラニン１３４、アルギニン１３５、ロイシン１３７、プロリン１３８、またはロイシン１３９。本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリペプチド中の対応する位置でこれらの置換の少なくとも１つを含んでいてもよい、および／または１もしくは複数の他の置換、付加もしくは欠失を含んでもよい。
国際公開第０５／０９１９４４号は、Ｃｙｓ７５−Ｃｙｓ９３における天然起源のものに加えて、操作されたジスルフィド結合（システインにより置換されたアミノ酸）を有するＦＧＦ−２１の具体的な変異タンパク質を更に記載し、それらは以下の通りである：Ｇｌｎ７６Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１０９Ｃｙｓ、Ｃｙｓ７５−Ｓｅｒ８５Ｃｙｓ、Ｃｙｓ７５−Ａｌａ９２Ｃｙｓ、Ｐｈｅ７３Ｃｙｓ−Ｃｙｓ９３、Ｓｅｒ１２３Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１２５Ｃｙｓ、Ａｓｐ１０２Ｃｙｓ−Ｔｙｒ１０４Ｃｙｓ、Ａｓｐｌ２７Ｃｙｓ−Ｇｌｙｌ３２Ｃｙｓ、Ｓｅｒ９４Ｃｙｓ−Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ｐｒｏ１１５Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ、Ａｓｎ１２１Ｃｙｓ−Ａｓｐ１２７Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１００Ｃｙｓ−Ａｓｐ１０２Ｃｙｓ、Ｐｈｅ９５Ｃｙｓ−Ｔｙｒ１０７Ｃｙｓ、Ａｒｇ１９ＣｙｓＰｒｏ１３８Ｃｙｓ、Ｔｙｒ２０Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ２２Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３７Ｃｙｓ、Ａｒｇ７７Ｃｙｓ−Ａｓｐ７９Ｃｙｓ、Ｐｒｏ９０Ｃｙｓ−Ａｌａ９２Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５０Ｃｙｓ−Ｌｙｓ６９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ２３Ｃｙｓ−Ａｓｐ２５Ｃｙｓ、Ａｌａ３１Ｃｙｓ−Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ、Ｔｈｒ２３Ｃｙｓ−Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ、Ｖａｌ４１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ８２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ５８Ｃｙｓ−Ｖａｌ６２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５４Ｃｙｓ−Ｌｅｕ６６Ｃｙｓ、Ｉｌｅ３５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ６７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ６７Ｃｙｓ−Ａｒｇ７２Ｃｙｓ、Ｉｌｅ３５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ８４Ｃｙｓ、Ａｒｇ７２Ｃｙｓ−Ｇｌｙ８４Ｃｙｓ、またはＡｒｇ７７Ｃｙｓ−Ａｌａ８１Ｃｙｓここで、ナンバリングは国際公開第０５／０９１９４４号の配列番号１に基づく。操作されたジスルフィド結合を有する更なる変異タンパク質は、Ｔｙｒ２２Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３９Ｃｙｓ；Ａｓｐ２４Ｃｙｓ−Ａｒｇ１３５Ｃｙｓ；Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１３２Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１３０Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ−Ａｌａ１２９Ｃｙｓ；Ｌｅｕ８２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１１９Ｃｙｓ；Ｇｌｙ８０Ｃｙｓ−Ａｌａ１２９Ｃｙｓ；Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ；Ｇｌｙ４２Ｃｙｓ−Ａｒｇ１２６Ｃｙｓ；Ｇｌｙ４２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ；Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ；Ｇｌｎ２７Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１２３Ｃｙｓ；Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ；またはＡｓｐ２５Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓであり、ナンバリングは国際公開第０５／０９１９４４号の配列番号１に基づく。操作されたジスルフィド結合を含む更なる変異タンパク質は、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ；Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ；Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ；Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ／Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓであり、ナンバリングは国際公開第０５／０９１９４４号の配列番号１に基づく。本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、該ポリペプチド中の対応する位置（複数の場合がある）でこれらの置換の１または複数を含んでもよく、および／または１または複数の他の置換、付加または欠失を含んでもよい。
国際公開第０５／０９１９４４号は、ＰＥＧ化されたＦＧＦ−２１の更なる変異タンパク質を記載する。これらの変異タンパク質は、以下の置換のうち１鬱を有した：Ｄ２５Ｃ、Ｄ３８Ｃ、Ｌ５８Ｃ、Ｋ５９Ｃ、Ｐ６０Ｃ、Ｋ６９Ｃ、Ｄ７９Ｃ、Ｈ８７Ｃ、Ｅ９１Ｃ、Ｅ１０１Ｃ、Ｄ１０２Ｃ、Ｌ１１４Ｃ、Ｌ１１６Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｐ１３０Ｃ、Ｐ１３３Ｃ、Ｐ１４０Ｃ。国際公開第０５／０９１９４４号は、以下の位置のシステイン置換を記載する：１９、２１、２６、２８、２９、３０、３６、３９、４２、５０、５６、６１、６４、６５、６８、７０、７１、７７、８１、８５、８６、９０、９２、９４、９８、１０７、１０８、１１２、１１３、１２３、および１２４。国際公開第０５／０９１９４４号は、以下の位置のシステイン置換を示す：２４、２７、３７、４０、４４、４６、４９、５７、８８、８９、１０６、１１０、１１１、１１５、１２０、および１３９．また、国際公開第０５／０９１９４４号は、以下の位置のシステイン置換を記載する：１８、４５、４７、４８、７８、８３、９９、１０３、１２５、１２８、１３１、１３２および１３８。また、国際公開第０５／０９１９４４号は、以下の位置のシステイン置換を記載する：２５、３８、５８、５９、６０、６９、７９、８７、９１、１０１、１０２、１１４、１１６、１２２、１２６、１３０、１３３および１４０。
本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリペプチド中の対応する位置での１もしくは複数の前述の置換を含んでもよく、および／または１もしくは複数の他の置換、付加または欠失を含んでもよい。また、本明細書に記載される方法における使用に適した改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物が本明細書において提供される。
本開示の特定の実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、翻訳後修飾はｉｎ ｖｉｔｒｏでなされる。特定の実施形態では、翻訳後修飾は、真核細胞または非真核細胞においてｉｎ ｖｉｖｏでなされる。
特定の実施形態では、タンパク質は、１つの宿主細胞によってｉｎ ｖｉｖｏでなされる、少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、ここで、翻訳後修飾は、通常別の宿主細胞型によってなされない。特定の実施形態では、タンパク質は、真核細胞によってｉｎ ｖｉｖｏでなされる少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、ここで、翻訳後修飾は、通常非真核細胞によってなされない。翻訳後修飾の例として、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸塩付加、リン酸化、糖脂質リンケージ修飾等が挙げられる。特定の実施形態では、本開示のタンパク質またはポリペプチドは、分泌または局在化の配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合等を含むことができる。
また、本開示は、ＰＥＧ誘導体の水溶性で加水分解的に安定した誘導体、および１または複数のアセチレンまたはアジドの部分を有する関連する親水性ポリマーを提供する。アセチレン部分を含むＰＥＧポリマー誘導体は、セレクタコドンに応じてタンパク質へと選択的に導入されたアジド部分とのカップリングに対して高度に選択的である。同様に、アジド部分を含むＰＥＧポリマー誘導体は、セレクタコドンに応じてタンパク質へ選択的に導入されたアセチレン部分とのカップリングに高度に選択的である。
より具体的には、アジド部分として、制限されないが、アルキルアジド、アリールアジド、およびこれらのアジドの誘導体が挙げられる。アセチレン特異的な反応性が維持される限り、アルキルおよびアリールのアジド誘導体は、他の置換基を含んでもよい。アセチレン部分は、アルキルおよびアリールのアセチレン、ならびに各々の誘導体を含む。アジド特異的反応性が維持される限り、アルキルおよびアリールのアセチレンの誘導体は、他の置換基を含んでもよい。
本開示は、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性ラベル；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチド、またはポリペプチド類縁体；抗体または抗体フラグメント；金属キレート化剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖；水溶性デンドリマー；シクロデキストリン；抑制性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規な官能基；共有結合的にまたは非共有結合的に他の分子と相互作用する基；フォトケージされた部分；化学線励起部分；光異性化部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチン類縁体；重原子を組み込む部分；化学的開裂基；光開裂基；伸長された側鎖；炭素連結糖；酸化還元活性のある薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；アイソトープ標識化部分；生物物理学的プローブ；りん光性基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性物質；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノトランスミッター；放射性ヌクレオチド；ラジオトランスミッター（ｒａｄｉｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）；中性子捕捉剤；または上記のものの任意の組み合わせ、または他の望ましい化合物もしくは物質を含むが、これらに限定されない、他の物質を含む様々な官能基、置換基または部分を有する物質の抱合体を提供する。また、本開示は、アジドを有する物質の抱合体を含む。または対応するアセチレンまたはアジドの部分を有するＰＥＧポリマー誘導体を有するアセチレン部分を含む。例えば、アジド部分を含むＰＥＧポリマーを、アセチレン官能性を持つ非遺伝学的にコードされたアミノ酸を含むタンパク質中の位置で生物学的活性分子にカップリングすることができる。ＰＥＧおよび生物学的活性分子が連結されるリンケージとして、限定されないが、ヒュスゲン［３＋２］付加環化生成物が挙げられる。
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸はカルボニル基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は以下の構造を有する：
Figure 0006702962
 式中、ｎは０〜１０であり、Ｒ１は、アルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリールであり、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリールおよび置換アリールであり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である。
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸はアミノオキシ基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸はヒドラジド基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸はヒドラジン基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸残基はセミカルバジド基を含む。
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸残基はアジド基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は以下の構造を有する：
Figure 0006702962
 式中、ｎは０〜１０であり、Ｒ１は、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、または存在せず、ＸはＯ、Ｎ、Ｓまたは存在せず、ｍは０〜１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である。
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸はアルキン基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造を有する：
Figure 0006702962
 式中、ｎは０〜１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、ＸはＯ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず、ｍは０−１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストであってもよい。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。
また、本開示は、配列番号８〜配列番号１４へのストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸を提供する。また、本開示は、配列番号８〜配列番号１４へのストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸を提供し、ここで、ポリヌクレオチドは少なくとも１つのセレクタコドンを含む。また、本開示は、配列番号１〜配列番号７等に示されるポリペプチド、または本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される単離されたポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｅｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、少なくとも１つのセレクタコドン、例えば、上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに含まれる天然にコードされていないアミノ酸をコードするセレクタコドンを含む。
いくつかの実施形態では、セレクタコドンは、アンバーコドン、オーカーコードン、オパールコードン、特有のコドン、希少なコドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンからなる群から選択される。
また、本開示は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを水溶性ポリマーに連結させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含む単離された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと、天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含む水溶性ポリマーとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、他の場合には２０個の通常のアミノ酸のいずれにも反応しない、水溶性ポリマーに対して反応性である。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、他の場合には２０個の通常のアミノ酸のいずれにも反応しない、リンカー、ポリマーまたは生物学的活性分子に対して反応性である。
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、カルボニル含有アミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを、リンカー、ポリ（エチレングリコール）分子等のポリマー、またはアミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドもしくはセミカルバジド基を含む生物学的活性分子と反応させることによって作製される。
いくつかの実施形態では、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基は、アミド結合によってポリ（エチレングリコール）分子に連結される。
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、カルボニル基を含むポリ（エチレングリコール）分子を、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基を含む、天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドと反応させることにより作製される。
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アルキン含有アミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを、アジド部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることにより作製される。いくつかの実施形態では、アジドまたはアルキン基はアミド結合によってポリ（エチレングリコール）分子に連結される。
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アジド含有アミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを、アルキン部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることにより作られる。いくつかの実施形態では、アジドまたはアルキン基は、アミド結合によってポリ（エチレングリコール）分子に連結される。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに連結された水溶性ポリマーは、ポリアルキルエングリコール部分を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基は、カルボニル部分を含み、水溶性ポリマーはアミノオキシ、ヒドラジド、ヒドラジンまたはセミカルバジド部分を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基は、アルキン部分を含み、水溶性ポリマーはアジド部分を含む。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基は、アジド部分を含み、水溶性ポリマーはアルキン部分を含む。
また、本開示は、セレクタコドンを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、直交ＲＮＡ合成酵素、および／または改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドへ天然にコードされていないアミノ酸を置換するための直交ｔＲＮＡを含む。
また、本開示は、天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを作る方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの発現を可能とする条件下で改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、直交ＲＮＡ合成酵素、および／または直交ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（複数）を含む細胞を培養すること、ならびに上記細胞および／または培養培地から改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを精製することを含む。
改変ＦＧＦ−２１のコーディング領域につながれた異種起源のシグナル配列と同様に、改変ＦＧＦ−２１コーディング領域へつながれたＦＧＦ−２１リーダー配列またはシグナル配列も本開示の範囲に含まれる。選択された異種起源のリーダー配列またはシグナル配列は、宿主細胞によって、認識され、例えば、分泌のための宿主細胞分泌系によって処理され、またおそらくはシグナルペプチダーゼによって開裂されなくてはならない。本開示のリーダー配列は下記から選択されてもよい：配列番号３および配列番号６に由来する３つのロイシンリーダー（アミノ酸１位〜２８位）、配列番号４および配列番号７由来の２つのロイシンリーダー（アミノ酸１位〜２７位）、配列番号２に由来するＨｉｓタグ（アミノ酸１位〜１０位）、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４。本開示の改変ＦＧＦ−２１によって病状または障害を治療する方法は、シグナルペプチドまたはリーダーペプチドを含む、またはそれを含まない改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドによって治療することを示唆することを意味する。
また、本開示は、脂肪細胞におけるグルコース取込みの増加を引き起こす方法を提供し、該方法は、グルコース取込みの増加を誘導するのに有効な量で改変ＦＧＦ−２１を上記細胞に投与することを含む。上記グルコース取込みの増加は、より速くより効率的なグルコース利用によるエネルギー消費の増加を引き起こし得る。
ＩＩ．一般的な組み換え核酸および開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドとの使用に対する方法
本開示の多数の実施形態において、目的の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードする核酸は、組み換え法を使用して、単離し、クローニングし、しばしば変更されてもよい。
かかる実施形態は、限定されないが、タンパク質発現のため、または変異体、誘導体、発現カセットもしくは改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに由来する他の配列の作製に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコード化する配列は、異種起源のプロモータに制御可能に連結される。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド（ｐｏｌｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド配列中のＤＮＡコドン使用頻度は、当該技術分野においてよく知られている技術を使用して、Ｅ．コリまたは哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ）の発現のために最適化されてもよい。
リーダー配列のないＰ型のＦＧＦ−２１をコードする例示的なｃＤＮＡは、配列番号８として示される。このポリペプチドは、配列番号１として示される。
リーダー配列のないＨｉｓタグ付けされたＰ型ＦＧＦ−２１をコードする例示的なｃＤＮＡは、配列番号９として示される。このポリペプチドは、配列番号２として示される。
３つのロイシンを共に含むリーダー配列を有するＰ型のＦＧＦ−２１をコードする例示的なｃＤＮＡは、配列番号１０として示される。このポリペプチドは、配列番号３として示される。
２つのロイシンを共に含むリーダー配列を有するＰ型のＦＧＦ−２１をコードする例示的なｃＤＮＡは、配列番号１１として示される。このポリペプチドは、配列番号４として示される。
リーダー配列のないＦＧＦ−２１のＬ型をコードする例示的なｃＤＮＡは、配列番号１２として示される。このポリペプチドは、配列番号５として示される。
３つのロイシンを共に含むリーダー配列を有するＬ型のＦＧＦ−２１をコードする例示的なｃＤＮＡは、配列番号１３として示される。このポリペプチドは、配列番号６として示される。
２つのロイシンを共に含むリーダー配列を有するＬ型のＦＧＦ−２１をコードする例示的なｃＤＮＡは、配列番号１４として示される。このポリペプチドは、配列番号７として示される。
本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、限定されないが、配列番号１〜配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成された後、適切なアミノ酸残基（複数の場合がある）の導入（すなわち、組み込みまたは置換）または削除（すなわち、欠失または置換）を果たすように、ヌクレオチド配列を変更してもよい。ヌクレオチド配列は、従来の方法に従って部位特異的変異誘発によって都合よく修飾されてもよい。代替的には、ヌクレオチド配列は、限定されないが、オリゴヌクレオチドが所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される、オリゴヌクレオチド合成装置を使用することを含む化学合成によって、好ましくは、組み換えのポリペプチドが産生される宿主細胞において好まれるコドンを選択することによって、作製されてもよい。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応によって合成され組み立てられてもよい。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｂａｒａｎｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９−１９３（１９９１）；米国特許第６，５２１，４２７号を参照されたい。
また、本開示は、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対によって非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏでの組み込みに対する真核生物の宿主細胞、非真核生物の宿主細胞および生物に関する。宿主細胞は、本開示のポリヌクレオチドまたは限定されないが、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであってもよい、本開示のベクターを含む、本開示のポリヌクレオチドを含むコンストラクトにより遺伝子操作される（限定されないが、形質転換、形質移入、またはトランスフェクトされる）。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡ合成酵素および誘導体化されるタンパク質に対するコーディング領域は、所望の宿主細胞において機能的な遺伝子発現調節エレメントに制御可能に連結される。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチドまたは共役ポリヌクレオチドの形態であってもよい。ベクター、標準的な方法によって細胞および／または、微生物に導入されてもよい。
セレクタコドン
本開示のセレクタコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝コドンフレームワークを拡大する。例えば、セレクタコドンは、限定されないが、アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコードンまたはオパールコードン（ＵＧＡ）を含む特有の３塩基コドン、停止コドン等のナンセンスコドン、非天然コドン、４塩基以上のコドン、希少コドン等を含むが、これらに限定されない。所望の遺伝子またはポリヌクレオチドへ導入され得るセレクタコドンの数は広範囲に亘り、限定されないが、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの少なくとも一部をコードする単一のポリヌクレオチド中の１または複数の、２以上、３以上、４、５、６、７、８、９、１０以上を含むことが、当業者に容易に明らかである。
或る一つの実施形態では、上記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで１または複数の非天然（すなわち、天然にコードされていない）アミノ酸の組み込みに対する停止コドンであるセレクタコドンの使用を含む。例えば、限定されないがＵＡＧを含む停止コドンを認識し、所望の非天然アミノ酸を用いてＯ−ＲＳによってアミノアシル化される、Ｏ−ｔＲＮＡが生産される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然起源宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって認識されない。従来の部位特異的変異誘発は、限定されないが、目的のポリペプチド中の目的の部位でＴＡＧを含む停止コドンを導入するために使用され得る。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８），５’−３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１６：７９１−８０２を参照されたい。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、および目的のポリペプチドをコード化する核酸が、ｉｎ ｖｉｖｏで組み合わせられる場合、所定位置で非天然アミノ酸を含むポリペプチドを与えるために、非天然アミノ酸はＵＡＧコドンに応じて組み込まれる。
非天然アミノ酸の組み込みは、真核生物の宿主細胞の著しい摂動を伴わずにｉｎ ｖｉｖｏで行われ得る。例えば、ＵＡＧコドンに対する抑制効率は、限定されないが、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ、および真核生物の遊離因子（限定されないが、ｅＲＦを含む）（停止コドンに結合して、リボソームから成長しているペプチドの放出を開始する）を含むＯ−ｔＲＮＡの間の競合に依存することから、限定されないが、Ｏ−ｔＲＮＡ、および／またはサプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを増加させることによって、抑制効率を調節することができる
また、非天然アミノ酸は、希少コドンによりコードされ得る。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成反応におけるアルギニン濃度が減少される場合、希少なアルギニンコドン（ＡＧＧ）はアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に能率的であると証明された。例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）を参照されたい。この場合、合成ｔＲＮＡは、エシェリキア・コリにおいて少数の種として存在する天然起源ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。いくつかの生物は、全てのトリプレットコドンを使用しない。ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）中の割り当てられていないコドンＡＧＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳抽出物におけるアミノ酸挿入に利用された。例えば、Ｋｏｗａｌ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）を参照されたい。本開示の構成要素は、ｉｎ ｖｉｖｏでこれらの希少コドンを使用するために生成され得る。
また、セレクタコドンは、限定されないが、４塩基、５塩基、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドンを含む、拡張コドンを含む。４塩基コドンの例として、制限されないが、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例として、制限されないが、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本開示の特徴はフレームシフト抑制に基づく拡張コドンを使用することを含む。４塩基以上のコドンは、限定されないが、同じタンパク質に１または複数の非天然アミノ酸を挿入することができる。例えば、限定されないが、アンチコドンループ有する、例えば少なくとも８ｎｔ〜１０ｎｔのアンチコドンループを有する、特殊なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを含む、変異されたＯ−ｔＲＮＡの存在下では、４塩基以上のコドンは単一のアミノ酸と解釈される。他の実施形態では、アンチコドンループは、限定されないが、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基以上のコドンを解読することができる。２５６個の可能性のある４塩基コドンが存在することから、４塩基以上のコドンを使用して、同じ細胞において多数の非天然アミノ酸がコードされ得る。
或る一つの実施形態では、希少コドンに基づく拡張コドンまたはナンセンスコドンは、本開示において使用可能であり、それらは他の望ましくない部位でのミスセンスリードスルーおよびフレームシフト抑制を減少させることが可能である。
また、所与の系について、セレクタコドンは、天然３塩基コドンの１つを含んでもよく、内因性の系は天然塩基コドンを使用しない（ほとんど使用しない）。例えば、これは、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠く系、および／または、３塩基コドンが希少コドンである系を含む。
セレクタコドンは任意に非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は既存の遺伝アルファベットを更に拡大する。余分な１つの塩基対は、６４〜１２５のトリプレットコドンの数を増加させる。第３の塩基対の特性として、安定して選択的な塩基対合、ポリメラーゼによる高忠実度でのＤＮＡへの効率的な酵素による組み込み、および初期の非天然塩基対の合成後の効率的で継続的なプライマー伸長が挙げられる。方法および組成物に適している可能性がある非天然塩基対の説明として、例えばＨｉｒａｏ，ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２が挙げられる。また、Ｗｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０を参照されたい。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド等の目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者に知られ、本明細書に記載される、例えば非天然アミノ酸の組み込みのための１つ以上のセレクタコドンを含む方法を使用して、突然変異を誘発し得る。例えば、目的のタンパク質に対する核酸は、１または複数のセレクタコドンを含めるため突然変異誘発され、１または複数の非天然アミノ酸の組み込みを提供する。本開示は、限定されないが、突然変異体、例えば、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む任意のタンパク質バージョンを含む、任意のかかる変異体を含む。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド等の目的のタンパク質をコードする核酸分子は、ポリペプチドの任意の望ましい位置でシステインを導入するために容易に変異され得る。システインは、目的のタンパク質に反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質、または多様な他の分子を導入するために広く使用される。
ＩＩＩ．天然にコードされていないアミノ酸
非常に多様な天然にコードされていないアミノ酸が、本開示における使用に適している。任意の数の天然にコードされていないアミノ酸を、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドへ導入することができる。一般に、導入された天然にコードされていないアミノ酸は、２０個の通常の、遺伝学的にコードされたアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）に対して実質上、化学的に不活性である。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、安定した抱合体を形成するため、２０個の通常のアミノ酸（限定されないが、アジド基、ケトン基、アルデヒド基およびアミノオキシ基を含む）に見られない官能基と、効率的で選択的に反応する側鎖官能基を含む。例えば、アジド官能基を含有する天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリマー（限定されないが、ポリ（エチレングリコールを含む）、または代替的には、ヒュスゲン［３＋２］付加環化生成物を形成するためのアジドとアルキンの官能基の選択的反応に対して生じる安定な抱合体を形成するためのアルキン部分を含む第２のポリペプチドと反応させることができる。
アルファ−アミノ酸の総括的な構造は、以下の通り説明される（式Ｉ）：
Figure 0006702962
天然にコードされていないアミノ酸は典型的に上記のリストされた定式がある任意の構造である。ここで、Ｒ基は、２０個の天然アミノ酸の中で使用されるもの以外の任意の置換基であり、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドで使用するに適している可能性がある。本開示の天然にコードされていないアミノ酸は、典型的には側鎖の構造においてのみ天然アミノ酸と異なることから、天然にコードされていないアミノ酸は、限定されないが、天然起源ポリペプチドにおいて形成されるのと同じ方法で、天然にコードされたまたは天然にコードされていない、他のアミノ酸とアミド結合を形成する。しかしながら、天然にコードされていないアミノ酸は、それらと天然アミノ酸との相違を示す側鎖基を有する。例えば、Ｒは、任意にアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、ホウ酸塩、ボロン酸エステル、リン酸、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環式、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基等、またはその任意の組み合わせを含む。
例示的な天然にコードされていないアミノ酸は、本開示における使用に適している可能性があり、限定されないが、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジドおよびアルキンの反応性基を有するものを含む、水溶性ポリマーとの反応に有用である。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は糖部分を含む。
そのようなアミノ酸の例はＮ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニルｌ−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギンおよびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンを含んでいる。
本明細書において提供される天然にコードされていないアミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ドイツ国ダルムシュタットのＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ課）、またはＰｅｐｔｅｃｈ（米国マサチューセッツ州バーリントン）から商業的に入手可能である。商業的に入手できないものは、本明細書に提示されるように、または当業者に知られている標準的な方法を使用して、任意に合成される。有機合成技術については、例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ ａｎｄ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ，（１９８２，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。また、参照により本明細書に援用される、米国特許第７，０４５，３３７号および第７，０８３，９７０号を参照されたい。新規の側鎖を含む非天然アミノ酸に加えて、本開示における使用に適し得る非天然アミノ酸もまた、限定されないが式ＩおよびＩＩの構造によって説明される、改変された骨格構造を含んでもよい。
Figure 0006702962
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 式中、Ｚは典型的にはＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’、またはＳ−Ｒ’を含み、
ＸおよびＹ、同じまたは異なってもよく、典型的にはＳまたはＯを含み、ＲおよびＲ’は、同じまたは異なってもよく、典型的には、式Ｉを有する非天然アミノ酸について上に記載されるＲ基に対する置換基と同じ一覧、また同世に水素から選択される。例えば、本開示の非天然アミノ酸は、式ＩＩおよび式ＩＩＩによって説明されるアミノまたはカルボキシル基における置換を含んでもよい。この種の非天然アミノ酸として、限定されないが、通常の２０個の天然アミノ酸に対応する側鎖または非天然側鎖を有する、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、α−炭素での置換は、制限されないが、Ｄ−グルタメート、Ｄアラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等のＬ、Ｄまたはα−α−二置換アミノ酸が挙げられる。他の構造の代替案として、３員、４員、６員、７員、８員および９員からなる環状プロリン類縁体と同様にプロリン類縁体等の環状アミノ酸、β−アラニンおよびγ−アミノ酪酸等の置換βおよびγ置換アミノ酸が挙げられる。
多くの非天然アミノ酸がチロシン、グルタミン、フェニルアラニン等の天然アミノ酸に基づき、本開示で使用するに適している。チロシン類縁体として、限定されないが、パラ置換チロシン、オルト置換チロシンおよびメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンとして、限定されないが、ケト基（限定されないが、アセチル基を含む）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６〜Ｃ２０直鎖または分岐鎖炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基等が挙げられる。さらに、複合的に置換されたアリール環も意図される。本開示で使用するに適し得るグルタミン類縁体はとして、限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。本開示で使用するに適し得るフェニルアラニン類縁体の例として、限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニンおよびメタ置換フェニルアラニンが挙げられる。ここで、置換基は、限定されないが、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリール基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（限定されないが、アセチル基を含む）、ベンゾイル、アルキニル基等を含む。本開示における使用に適し得る非天然アミノ酸の具体例として、限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル基）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン−Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−フォスフォセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、およびｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニン等が挙げられる。
或る一つの実施形態では、非天然アミノ酸（ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン等）を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの組成物が提供される。また、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンを含む様々な組成物、限定されないが、タンパク質および／または細胞が提供される。１つの態様では、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンの非天然アミノ酸を含む組成物は、直交ｔＲＮＡを更に含む。非天然アミノ酸は、限定されないが、アミノアシル結合によって共有結合により直交ｔＲＮＡに結合され、共有結合的に直交ｔＲＮＡの末端のリボース糖の３’ＯＨまたは２’ＯＨに結合される等を含んで、直交ｔＲＮＡに（限定されないが、共有結合的に）結合され得る。
本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、その全体が参照によって本明細書に援用される米国特許第８，０１２，９３１号に記載される天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよい。
非天然アミノ酸の構造および合成：カルボニル、カルボニル様、マスキングされたカルボニル、保護カルボニル基、およびヒドロキシルアミン基
いくつかの実施形態では、本開示は、オキシム結合によって水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結された改変ＦＧＦ−２１を提供する。多くの種類の天然にコードされていないアミノ酸は、オキシム結合の形成に適している。これらは、限定されないがカルボニル、ジカルボニル、カルボニル様、マスキングされたカルボニル、保護カルボニル、またはヒドロキシルアミン基を含む天然にコードされていないアミノ酸を含む。かかるアミノ酸、それらの構造および合成は、米国特許第８，０１２，９３１号に記載され、その全体が参照によって本明細書に援用される。
ＩＶ．非天然アミノ酸の構造及び合成：ヒドロキシルアミンを含むアミノ酸
米国仮特許出願番号第６０／６３８，４１８号は、その全体において参照により援用される。米国仮特許出願第６０／６３８，４１８号のＶ項（「非天然アミノ酸」と題される）、Ｂ部（「非天然アミノ酸の構造および合成：ヒドロキシルアミン含有アミノ酸」と題される）、において提供される開示は、かかる開示が完全に本明細書に示される場合と同じ程度まで、本明細書に記載される、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチドおよび改変非天然アミノ酸ポリペプチドを作製する、精製する、特性評価する、および使用する方法、組成物、技術に完全に適用される。また、「非天然アミノ酸およびポリペプチドを含む組成物、それらを含む方法、およびそれらの使用」と題される米国特許出願公開第２００６／０１９４２５６号、第２００６／０２１７５３２号、および第２００６／０２１７２８９号、ならびに国際公開第２００６／０６９２４６号は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
非天然アミノ酸の化学合成
本開示における使用に適する多数の非天然アミノ酸は、例えばＳｉｇｍａ（米国）またはＡｌｄｒｉｃｈ（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から商業的に入手可能である。商業的に入手できないものは、本明細書において提示されるように、または様々な出版物で提示されるように、または当業者に知られている標準的な方法を使用して、任意に合成される。有機合成技術については、Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ ａｎｄ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ，（１９８２，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。非天然アミノ酸の合成を記載する追加の出版物として、例えば、「非天然アミノ酸のＩｎ ｖｉｖｏ組み込み」と題される国際公開第２００２／０８５９２３号；Ｍａｔｓｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８， ４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．＆Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．＆Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ （Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ５３， １１６７−１１７０； Ａｚｏｕｌａｙ， Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ， Ｍ． ＆ Ｆｒａｐｐｉｅｒ， Ｆ． （１９９１） Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２６， ２０１−５； Ｋｏｓｋｉｎｅｎ， Ａ．Ｍ．Ｐ． ＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｈ． （１９８９） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．＆Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：１２３９−１２４６；Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ− ａｎｄ Ｄ−ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｌ−ａｌｐｈａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４３：４２９７−４３０８；およびＳｕｂａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７を参照されたい。
また、参照により本明細書に援用される、「タンパク質アレイ」と題される、米国特許出願公開第２００４／０１９８６３７号を参照されたい。
Ａ．カルボニル反応性基
カルボニル反応性基を有するアミノ酸は、特に、求核付加またはアルドール縮合の反応によって分子（限定されないが、ＰＥＧまたは他の水溶性分子を含む）を連結する様々な反応を可能とする。
ｐ−アセチル−−（＋／−）フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、本明細書に援用される、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載される。他のカルボニル含むアミノ酸は、同様に、当業者によって調製され得る。
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、反応性のカルボニル官能基を生成するために化学的に修飾されてもよい。例えば、共役結合反応に有用なアルデヒド官能性は隣接するアミノ基および水酸基を有する官能性から生成され得る。生物学的活性分子がポリペプチドである場合、例えば、Ｎ末端セリンまたはトレオニン（通常、存在してもよく、または化学的または酵素的な消化によって露出されてもよい）は、過ヨウ素酸塩を使用する穏やかな酸化的開裂条件下で、アルデヒド官能性を生成するために使用され得る。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２−２６８（１９９２）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．＆Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）、Ｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４−７２３０（１９９４）を参照されたい。しかしながら、当該技術分野で知られている方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端のアミノ酸に制限される。
本開示では、隣接する水酸基およびアミノ基を持つ天然にコードされていないアミノ酸は、「マスクされた」アルデヒド官能性として、ポリペプチドに組み込まれ得る。例えば、５つのヒドロキシリジンが、イプシロンアミンに隣接している水酸基を持つ。アルデヒドを生成するための反応条件は、典型的にはポリペプチド内の他の部位での酸化を回避するため、穏やかな条件下でのモル過剰量のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加を含む。酸化反応のｐＨは、典型的には約７．０である。典型的な反応は、約１．５のモル過剰量のナトリウム・メタ過ヨウ素酸塩のポリペプチドの緩衝液への添加の後、暗やみの中で約１０分間インキュベーションを含む。例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第６，４２３，６８５号を参照されたい。
カルボニル官能性は、水溶液中の穏やかな条件下でヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミンまたはセミカルバジドを含有する試薬と選択的に反応させて、生理学的条件の下で安定な、対応するヒドラゾン、オキシムまたはセミカルバゾンのリンケージをそれぞれ形成することができる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５−４８１（１９５９）；Ｓｈａｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照されたい。
さらに、カルボニル基の特有の反応性は、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的修飾を可能とする。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．＆Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）； Ｍａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）を参照されたい。
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジドの反応性基
ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド等の求核性基を含有する天然にコードされていないアミノ酸は、抱合体を形成するために様々な求電子性基との反応を可能とする（限定されないが、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー）。
ヒドラジド、ヒドラジン、およびセミカルバジドを含有するアミノ酸は、商業的な供給元から入手可能である。例えば、Ｌ−グルタメート−γ−ヒドラジドは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミズーリ州セントルイス）から入手可能である。商業的に入手できない他のアミノ酸は、当業者によって調製され得る。例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第６，２８１，２１１号を参照されたい。
ヒドラジド、ヒドラジンまたはセミカルバジドの官能性を持つ天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、同様の化学反応性を有するアルデヒドまたは他の官能基を含む様々な分子と効率的に選択的に反応させることができる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｔａｍ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照されたい。ヒドラジド、ヒドラジンおよびセミカルバジド官能基の特有の反応性は、それらをアルデヒド、ケトンおよび他の求電子性基に対して、２０個の通常のアミノ酸（限定されないが、セリンもしくはトレオニンの水酸基、またはリジンおよびＮ末端のアミノ基を含む）に存在する求核性基と比較して、著しくより反応的にする。
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ基を含有する天然にコードされていないアミノ酸は、（ヒドロキシルアミンとも呼ばれる）抱合体を形成するために様々な求電子性基との反応を可能とする（限定されないがＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーを含む）。ヒドラジン、ヒドラジドおよびセミカルバジドのように、アミノオキシ基の増強された求核性は、同様の化学反応性を有するアルデヒドまたは他の官能基を含む様々な分子と、効率的および選択的に反応することを可能とする。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｔａｍ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）；Ｈ．Ｈａｎｇ ａｎｄ Ｃ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７−７３６（２００１）を参照されたい。しかしながら、ヒドラジン基との反応の結果は対応するヒドラゾンであるのに対し、オキシムは、一般的には、ケトン等のカルボニル含有基とのアミノオキシ基の反応から生じる。
アミノオキシ含有アミノ酸は、容易に利用可能なアミノ酸前駆物質（ホモセリン、セリンおよびトレオニン）から調製され得る。例えば、Ｍ．Ｃａｒｒａｓｃｏ ａｎｄ Ｒ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：８８５３−８８５８（２００３）を参照されたい。Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸等の特定のアミノオキシ含有アミノ酸は、天然の供給源から単離された（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｇ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０： １６３５−１６４１（１９９７）。他のアミノオキシ含有アミノ酸は、当業者によって調製され得る。
Ｄ．アジド及びアルキンの反応性基
アジドおよびアルキンの官能基の特有の反応性は、それらをポリペプチドおよび他の生体分子の選択的な修飾に非常に役立つものとする。有機アジド、特に脂肪族アジド（ａｌｐｈａｔｉｃ ａｚｉｄｅ）およびアルキンは、通常の反応性の化学条件に対して安定している。特に、アジドおよびアルキンの両方の官能基は、天然起源ポリペプチドで見つかった２０個の通常のアミノ酸の側鎖（すなわち、Ｒ基）に対して不活性である。しかしながら、隣接させた場合、アジド基およびアルキン基の「ばね上げる（ｓｐｒｉｎｇ−ｌｏａｄｅｄ）」性質が明らかにされ、それらはヒュスゲン［３＋２］付加環化反応によって選択的および効率的に反応して対応するトリアゾールを生成する。例えば、Ｃｈｉｎ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−７（２００３）；Ｗａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，３１９２−３１９３（２００３）、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）を参照されたい。
ヒュスゲン付加環化反応が、求核置換ではなく、選択的な付加環化反応を含むため
（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，ｉｎ ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｖｏｌ．４，（ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，１９９１），ｐ．１０６９−１１０９；Ｈｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．ｉｎ １，３−ＤＩＰＯＬＡＲ ＣＹＣＬＯＡＤＤＩＴＩＯＮ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，（ｅｄ． Ｐａｄｗａ，Ａ．，１９８４），ｐ．１−１７６を参照されたい）アジドおよびアルキン含む側鎖を持つ天然にコードされていないアミノ酸の組み込みは、結果として生じたポリペプチドが天然にコードされていないアミノ酸の位置で選択的に改変されることを可能とする。アジドまたはアルキンを含有する改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが関与する付加環化反応は、触媒量のＣｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）にｉｎ ｓｉｔｕで還元するための還元剤の存在下において、Ｃｕ（ＩＩ）（限定されないが、触媒量のＣｕＳＯ４の形態）の添加によって水性条件下にて室温で行なわれてもよい。例えば、Ｗａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５， ３１９２−３１９３（２００３）；Ｔｏｒｎｏｅ，Ｃ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４（２００２）；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９（２００２）を参照されたい。例示的な還元剤として、限定されないが、アスコビル酸塩、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋および電圧の印加が挙げられる。
アジドとアルキンとの間のヒュスゲン［３＋２］付加環化反応が望ましいいくつかの場合には、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アルキン部分を含む天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよく、アミノ酸に付着される水溶性ポリマーはアジド部分を含んでもよい。また、代替的には逆反応（すなわち、アミノ酸上のアジド部分、および水溶性ポリマー上に存在するアルキン部分による）を行うことができる。
アリールエステルを含み、アミド結合を生成するためにアリール基を含むホスフィン部分で適切に官能化された水溶性ポリマーと、アジド官能基を選択的に反応させることができる。
アリールホスフィン基は、ｉｎ ｓｉｔｕでアジドを還元して、生じたアミンは、その後、近接するエステル結合と効率的に反応して対応するアミドを生成する。例えば、Ｅ．Ｓａｘｏｎ ａｎｄ Ｃ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，２００７−２０１０（２０００）を参照されたい。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（限定されないが、２−アミノ−６−アジド−１−ヘキサン酸を含む）、またはアリール基含有アジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）のいずれかとなり得る。
アジド官能基を、チオエステルを含有する水溶性ポリマーと選択的に反応させて、アリールホスフィン部分で適切に官能化して、アミド結合を生成することができる。アリールホスフィン基は、ｉｎ ｓｉｔｕでアジドを還元し、その後、生じたアミンはチオエステル結合ト効率的に反応して対応するアミドを生成する。
アルキン含有アミノ酸は、商業的に入手可能である。例えば、プロパギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（マサチューセッツ州バーリントン）から商業的に入手可能である。代替的には、アルキン含有アミノ酸は、標準的な方法によって調製され得る。例えば、ｐ−プロパギルオキシフェニルアラニンを、例えば、Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１７８２−１１７８３（２００３）に記載されるように合成することができ、４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンを、Ｋａｙｓｅｒ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３（７）：２４７５−２４８４（１９９７）に記載されるように合成することができる。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者によって調製され得る。
アジド含むアミノ酸は、商業上の供給元から入手可能である。例えば、４−アジドフェニルアラニンは、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（イリノイ州ウッドデール）から得ることができる。商業的に入手できないアジド含有アミノ酸については、アジド基は、限定されないが、好適な脱離基（限定されないが、ハロゲン化物、メシレート、トシラートを含む）の転置を介する、または好適な保護ラクトンの開口に介することを含む、当業者に知られている標準的な方法を使用して、比較的容易に調製することができる。例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
［３＋２］付加環化によって本開示のタンパク質に付加され得る分子は、アジドまたはアルキニルの誘導体と共に実質的に任意の分子を含む。分子として、限定されないが、色素、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（限定されないが、ポリエチレングリコールを含むポリマーを含む）、光架橋剤、細胞毒性化合物、アフィニティー標識、ビオチン誘導体、樹脂剤、ビーズ、第２のタンパク質またはポリペプチド（またはそれ以上）、ポリヌクレオチド（複数の場合がある）、（限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を含む）、金属キレート化剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物等が挙げられる。これらの分子は、限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニンを含むアルキニル基、または限定されないがｐ−プロパギルオキシフェニルアラニンを含むアジド基を有する非天然アミノ酸にそれぞれ付加され得る。
Ｅ．アミノチオール反応性基
ベータ置換アミノチオール官能基の特有の反応性は、それらをポリペプチドおよびチアゾリジンの形成によってアルデヒド基を含む他の生体分子の選択的な修飾に非常に有用なものとする。例えば、Ｊ．Ｓｈａｏ ａｎｄ Ｊ．Ｔａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７（１４）３８９３−３８９９を参照されたい。いくつかの実施形態では、ベータ置換アミノチオールアミノ酸を改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込んだ後、アルデヒド官能性を含む水溶性ポリマーと反応させる。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマー、薬物抱合体、または他のペイロードを、チアゾリジンの形成によってベータ置換アミノチオールアミノ酸を含む、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドにカップリングすることができる。
Ｆ．更なる反応性基
本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込むことができる、更なる反応性基および天然にコードされていないアミノ酸は、いずれも参照によってそれらの全体が本明細書に援用される以下の特許出願に記載されている：米国特許出願公開第２００６／０１９４２５６号、米国特許出願公開第２００６／０２１７５３２号、米国特許出願公開第２００６／０２１７２８９号、米国仮特許出願第６０／７５５，３３８号、米国仮特許出願第６０／７５５，７１１号、米国仮特許出願第６０／７５５，０１８号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４９３９７号、国際公開第２００６／０６９２４６号、米国仮特許出願第６０／７４３，０４１号、米国仮特許出願第６０／７４３，０４０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号、米国仮特許出願第６０／８８２，８１９号、米国仮特許出願第６０／８８２，５００号、および米国仮特許出願第６０／８７０，５９４号。
非天然アミノ酸の細胞取り込み
細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、限定されないが、タンパク質中への組み込みのため非天然アミノ酸を設計するおよび選択する場合、典型的に考慮される１つの問題である。例えば、α−アミノ酸の高い電荷密度は、これらの化合物が恐らく細胞浸透性ではないことを示唆する。天然アミノ酸は、タンパク質に基づく輸送系の集合によって真核細胞へ取り込まれる。もしあれば、どの非天然アミノ酸が細胞によって取り込まれるかを評価する、迅速なスクリーニングを行うことができる。例えば、参照により本明細書に援用される、「タンパク質アッセイ」と題される米国特許出願公開第２００４／０１９８６３７号の毒性アッセイ、およびＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．＆Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ９６：４７８０−４７８５を参照されたい。取り込みは様々なアッセイで容易に分析されるが、細胞の取り込み経路に対して適用可能な非天然アミノ酸を設計するための代案は、ｉｎ ｖｉｖｏでアミノ酸を作るための生合成経路を提供することである。
非天然アミノ酸の生合成
多くの生合成経路が、既にアミノ酸と他の化合物の生産用の細胞に存在する。特定の非天然アミノ酸に対する生合成の方法は、限定されないが細胞を含む自然界において存在しない場合があるものの、本開示はかかる方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸に対する生合成経路は、新しい酵素を加えるまたは既存の宿主細胞経路を修飾することにより、宿主細胞において任意に生成される。追加の新しい酵素は、天然起源の酵素または人為的に発展された酵素であってもよい。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニン（「非天然アミノ酸のＩｎ ｖｉｖｏ取り込み」と題される国際公開第２００２／０８５９２３号の実施例において提示される）の生合成は、他の生物からの既知の酵素の組み合わせの添加に依存する。これらの酵素に対する遺伝子は、遺伝子を含むプラスミドによる細胞の形質転換により、真核細胞へと導入され得る。遺伝子は、細胞において発現した場合、所望の化合物を合成するための酵素経路を提供する。任意に加えられる酵素のタイプの例は、以下の実施例に提示される。追加の酵素配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋで見出される。また、人為的に発展された酵素も、同じ方法で細胞へ任意に加えられる。このように、細胞機構および細胞の供給源は、非天然アミノ酸を産生するように操作される。
生合成経路における使用、または既存の経路の発展のための新規な酵素の産生に対して、様々な方法が利用可能である。例えば、限定されないが、Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．によって開発された再帰組み換え法（ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍのワールドワイドウェブで入手可能）は、新規の酵素および経路を開発するために任意に使用される。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４），Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０（４）：３８９−３９１、およびＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１：１０７４７−１０７５を参照されたい。同様に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒによって開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ（商標）（ｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍのワールドワイドウェブで入手可能）は、任意に、限定されないが、細胞においてＯ−メチル−Ｌ−チロシンを作製する経路の設計する、代謝経路の操作に使用される。この技術は、新たな遺伝子の組み合わせを使用して、限定されないが、ゲノム機能解析によって同定されたもの、ならびに分子進化および設計を含む、宿主生物中の既存の経路を再構築する。また、Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍのワールドワイドウェブで利用可能）は、限定されないが、新たな経路を作ることを含む、遺伝子および遺伝子経路のライブラリの迅速なスクリーニングのための技術を提供する。
典型的には、本開示の操作された生合成経路で生産された非天然アミノ酸は、効率的なタンパク質の生合成に十分な濃度、限定されないが他、のアミノ酸の濃度に影響する、または細胞の供給源を消耗する程度ではない、生来の細胞量で生産される。このようにｉｎ ｖｉｖｏで産生された典型的な濃度は、約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。一旦、細胞が特定の経路に対して望ましい酵素を産生するために使用される遺伝子を含むプラスミドによって形質転換され、また、非天然アミノ酸が生成されると、任意に、リボソーム蛋白質合成および細胞増殖の両方に対する非天然アミノ酸の産生を更に最適化するためｉｎ ｖｉｖｏ選択が使用される。
Ｖ．天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの ｉｎ ｖｉｖｏ生成
天然起源系においてコードされないアミノ酸を付加または置換するため、改変ｔＲＮＡおよび転移ＲＮＡ合成酵素を使用して、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで生成することができる。かかる方法は、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，０１２，９３１号に記載される。
天然起源系においてコードされていないアミノ酸を使用するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ合成酵素を生成する方法は、参照により本明細書に援用される、米国特許第７，０４５，３３７号、および米国特許第７，０８３，９７０号に記載される。これらの方法は、翻訳系に対して内因性の合成酵素およびｔＲＮＡから独立して機能する（したがって、時に「直交」と呼ばれる）、翻訳機構を生じることを含む。典型的には、翻訳系は、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。典型的には、Ｏ−ＲＳは、翻訳系において少なくとも１つの天然起源でないアミノ酸により優先的にＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは、上記系での他のｔＲＮＡによって認識されない少なくとも１つのセレクタコドンを認識する。翻訳系は、このようにその系で生産されたタンパク質に天然にコードされていないアミノ酸を、コードされたセレクタコドンに応じて挿入し、それによって、コードされたポリペプチド中の位置にアミノ酸を「置換」する。
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの使用は、天然にコードされていないアミノ酸をコードする特定のコドンの選択を含む。任意のコドンも使用することができるが、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが発現される細胞では希少か、または使用されないコドンを選択することが一般的に望ましい。例えば、例示的なコドンは、停止コドン（アンバー、オーカーおよびオパール）、４塩基以上のコドン、および希少なまたは使用されない他の天然の３塩基コドン等のナンセンスコドンを含む。
特定のセレクタコドン（複数の場合がある）は、当該技術分野において知られている突然変異生成方法（限定されないが、部位突然変異、カセット変異導入、制限選択的変異導入等を含む）を使用して、改変ＦＧＦ−２１ポリヌクレオチドコーディング配列中の適切な位置へ導入され得る。
ＶＩ．改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中の天然にコードされていないアミノ酸の位置
本開示は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中への１または複数の天然にコードされていないアミノ酸の組み込みを意図する。１または複数の天然にコードされていないアミノ酸は、ポリペプチドの活性を妨げない特定の位置で組み込まれてもよい。これは、限定されないが、疎水性アミノ酸と疎水性アミノ酸、大きなアミノ酸に対してアミノ酸、親水性アミノ酸に対して親水性アミノ酸の置換、および／または活性に必要でない位置での天然起源でないアミノ酸の挿入を含む、「保存的」置換を作ることにより達成され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ポリペプチドの構造を妨げないタンパク質の領域に位置される１または複数の天然起源でないアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中のアミノ酸配列は、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよい。なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１由来のアミノ酸１〜１８１に対応する位置、または１位の前（すなわちＮ末端）、もしくはその１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）または配列番号２〜配列番号７、もしくは本開示の別の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中の対応するアミノ酸を含む、アミノ酸配列中の任意の位置で組み込まれてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１０、３６、５２、１１７、１２６、１３１、１３５、１４６、１６２、８７、７７、８３、７２、６９、７９、９１、９６、１０８または、１１０に対応する位置にあってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸７２、７７、８６、８７、９１、１０８、１１０、１２６、１３１または、１４６に対応する位置にあってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然起源でないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置にあってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸はフェニルアラニン誘導体であってもよい。いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置は、フェニルアラニン誘導体であってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸はパラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンであってもよい。いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置は、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンであってもよい。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の９１位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の１３１位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の１０８位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の７７位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の７２位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の８７位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の８６位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の１２６位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の１１０位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の８３位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の１４６位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の１３５位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の９６位にある。或る一つの実施形態では、天然起源でないアミノ酸は、ＦＧＦ−２１（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）中の３６位にある。
別の実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置で天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよく、また、配列番号１由来のアミノ酸１〜１８１のうちの任意の他の１つに対応する位置、もしくは１位の前（すなわちＮ末端）、もしくはその１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）において少なくとも１つの他の天然にコードされていないアミノ酸、または配列番号２〜配列番号７もしくは本開示の別の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中の対応するアミノ酸を含んでもよい。別の実施形態では、少なくとも１つの他の天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１０、３６、５２、１１７、１２６、１３１、１３５、１４６、１６２、８７、７７、８３、７２、６９、７９、９１、９６、１０８または、１１０に対応する位置にあってもよい。別の実施形態では、少なくとも１つの他の天然にコードされていないアミノ酸は配列番号１のアミノ酸９１または１３１に対応する位置にあってもよい。
別の実施形態では、９１に天然起源でないアミノ酸が存在し、また次の１または複数の位置、すなわち配列番号１由来のアミノ酸１〜１８１のうち任意の他の１つに対応する位置、もしくは１位の前（すなわちＮ末端）、もしくはその１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）に１または複数の他の天然起源でないアミノ酸、または配列番号２〜配列番号７もしくは本開示の別の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中の対応するアミノ酸が存在する。別の実施形態では、９１に天然起源でないアミノ酸が存在し、また次の１または複数の位置、すなわち１３１、１０８、７７、７２、８７、８６、１２６、１１０、８３、１４６、１３５、９６および３６に１または複数の他の天然起源でないアミノ酸（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７に対応するアミノ酸）が存在する。
別の実施形態では、１３１に天然起源でないアミノ酸が存在し、また、次の１または複数の位置、すなわち配列番号１由来のアミノ酸１〜１８１のうち任意の他の１つに対応する位置、もしくは１位の前（すなわちＮ末端）、もしくはその１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）に他の１つの天然起源でないアミノ酸、または配列番号２〜配列番号７もしくは本開示の別の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中の対応するアミノ酸が存在する。別の実施形態では、１３１に天然起源でないアミノ酸が存在し、また、次の１または複数の位置、すなわち１３１、１０８、７７、７２、８７、８６、１２６、１１０、８３、１４６、１３５、９６および３６に他の１つ天然起源でないアミノ酸（配列番号１に対応するアミノ酸位置、または配列番号２〜配列番号７に対応するアミノ酸）が存在する。
別の実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中のアミノ酸配列は、配列番号１の残基１０８に対応する位置で天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよく、また配列番号１の以下のアミノ酸の少なくとも２つに対応する位置、すなわち配列番号１由来のアミノ酸１〜１８１のうちの任意の他の１つに対応する位置、もしくは１位の前（すなわちＮ末端）、もしくはその１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）に少なくとも２つの他の天然にコードされていないアミノ酸、または配列番号２〜配列番号７もしくは本開示の別の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中の対応するアミノ酸を含んでもよい。別の実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１０８に対応する位置で天然にコードされていないアミノ酸を含んでもよく、また配列番号１の次のアミノ酸の少なくとも２つに対応する位置、すなわち配列番号１の１０、３６、５２、１１７、１２６、１３１、１３５、１４６、１６２、８７、７７、８３、７２、６９、７９、９１、９６、１０８または１１０で少なくとも２つの任意の他の天然起源でないアミノ酸を含んでもよい。
別の実施形態では、７７位の天然起源でないアミノ酸、および以下の位置の１または複数にもう１つの天然起源でないアミノ酸が存在する：配列番号１のアミノ酸１〜１８１の任意の他の１つに対応する位置、もしくは１位の前（すなわちＮ末端）、もしくはその１８２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）、または配列番号２〜配列番号７もしくは本開示の別の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド中の対応するアミノ酸。別の実施形態では、７７位の天然起源でないアミノ酸が存在し、また次の１または複数の位置、すなわち１３１、１０８、７７、７２、８７、８６、１２６、１１０、８３、１４６、１３５、９６および３６にもう１つの天然起源でないアミノ酸（配列番号１または配列番号２〜配列番号７の対応するアミノ酸）が存在する。
ＶＩＩ．非真核生物及び真核生物における発現
Ｉ．発現系、培養及び単離
未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞および細菌を含むいくつもの好適な発現系において発現されてもよい。例示的な発現系の説明を下に提示する。
酵母：本明細書で使用される「酵母」の用語は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードする遺伝子を発現することができる様々な酵母のいずれかを含む。
本開示による使用について特に関心があるものは、限定されないが、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．ギリエルモンディ（Ｐ．ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ジアスタチカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ドウグラシ（Ｓ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｓ．ノルベンシス（Ｓ．ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、Ｓ．オビフォルミス（Ｓ．ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．マルトーサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、およびＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を含む、ピキア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンセヌラ属、トルロプシス属およびカンジダ属、に含まれる種である。参照により援用される、国際公開第２００５／０９１９４４号は、酵母におけるＦＧＦ−２１の発現を記載する。
バキュロウィルス感染昆虫細胞：「昆虫宿主」または「昆虫宿主細胞」の用語は、組み換えベクター、または他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用され得る、または使用された昆虫を指す。上記用語は、トランスフェクトされたオリジナルの昆虫宿主細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶然または故意の突然変異により、オリジナルの親に対して、形態学、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ総補体において、必ずしも完全に同一ではなくてもよい。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在等の関連する特性を特徴とするのに親と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれている。
Ｅ．コリ、シュードモナス種および他の原核生物：
「細菌宿主」または「細菌宿主細胞」の用語は、組み換えベクター、または他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用され得る、または使用された細菌（ｂａｃｔｅｒｉａｌ）を指す。上記用語は、トランスフェクトされたオリジナルの細菌宿主細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶然または故意の突然変異により、オリジナルの親に対して、形態学、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ総補体において、必ずしも完全に同一ではなくてもよい。未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在等の関連する特性を特徴とするのに親と十分に類似する親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれる。
発現のための細菌宿主の選択において、好適な宿主は、とりわけ、良好な封入体形成能力、低いタンパク質分解活性、および全体的なロバスト性を有すると示されたものを含んでもよい。工業的／薬学的な発酵は、一般に、Ｋ株（例えばＷ３１１０）由来の細菌、またはＢ株（例えばＢＬ２１）由来細菌を使用する。好適なＥ．コリの他の例として、限定されないが、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂ、またはそれらの誘導体の株が挙げられる。本開示の方法の別の実施形態では、Ｅ．コリ宿主は、限定されないが、ＯＭＰ−およびＬＯＮ−を含む、プロテアーゼマイナス株である。宿主細胞株は、限定されないが、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）を含む、シュードモナス属の１種であってもよい。ＭＢ１０１株と示されるシュードモナス・フルオレッセンスは、組み換え体生成に有用であると知られており、治療用タンパク質産生プロセスに利用可能である。
組み換え宿主細胞株が確立されると（すなわち、発現コンストラクトが宿主細胞へと導入され、適切な発現コンストラクトを含む宿主細胞が単離される）、組み換え宿主細胞株は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの産生に適した条件下で培養される。
組み換え宿主細胞は、細胞の採取（改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが細胞内で蓄積する場合）、またはバッチもしくは連続的なフォーマットのいずれかでの培養上清の採取のいずれかを伴って、バッチまたは連続的なフォーマットにおいて培養されてもよい。
細菌宿主細胞中で生産された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、可溶性が不十分であってもよく、または不溶性であってもよい（封入体の形態）。本開示の或る一つの実施形態では、アミノ酸置換は、組み換え生成されるタンパク質の溶解度を増加させる目的で選択される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドにおいて容易に行われ得る。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、例えば尿素または塩酸グアニジンにより、可溶化されてもよい。
可溶性改変ＦＧＦ−２１タンパク質の場合、ＦＧＦ−２１は、細胞膜周辺腔または培養培地中へ分泌されてもよい。例えば、改変ＦＧＦ−２１は、配列番号３９〜配列番号４４に列挙されたものを含む、８個の異なるリーダー配列を含む、プラスミドをコードするコンストラクトを使用し、これらをＷ３１１０−Ｂ２細胞に形質転換して、その後、０．０１％のアラビノースによって発現が誘導される、ＯＤが約０．８に達するまで３７℃で細胞を成長させて、Ｗ３１１０−Ｂ２細胞の細胞膜周辺腔へ分泌される。５時間後、ペリプラズム性放出試料は培養物から調製され得る。さらに、可溶性改変ＦＧＦ−２１は、宿主細胞の細胞質中にあってもよい。精製工程を行なう前に、可溶性改変ＦＧＦ−２１を濃縮することが望ましい場合がある。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが融合タンパク質として生産される場合、融合配列が除去されてもよい。融合配列の除去は、酵素的または化学的な切断によってなされてもよい。融合配列の酵素的除去は、当業者に知られている方法を使用してなされてもよい。融合配列の除去のための酵素の選択は、融合のアイデンティティーによって決定されてもよく、反応条件は、当業者に明らかであろう酵素の選択によって明示されてもよい。化学的切断は、限定されないが、臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼおよび他の試薬を含む、当業者に知られている試薬を使用してなされてもよい。開裂された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、当業者に知られている方法によって、開裂された融合配列が取り除かれてもよい。
一般に、発現されたポリペプチドを変性させて還元した後、好ましい構造へとポリペプチドをリフォールドすることが望ましい場合がある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、および／またはシャペロニンは、目的の翻訳産物に付加され得る。タンパク質は、限定されないが、酸化型グルタチオンおよびＬ−アルギニンを含む酸化還元バッファー中でリフォールドされ得る。リフォールディング試薬は、流れるか、または他の場合には移動して１または複数のポリペプチドもしくは他の発現産物に接触することができ、逆もまた同じである。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの原核生物による産生の場合には、このように産生された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドはミスフォールドされて、生物活性を欠くか、または減少した生物活性を有する場合がある。タンパク質の生物活性は「リフォールディング」により回復され得る。一般に、ミスフォールドされた未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドは、（改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドもまた不溶性である場合）可溶化により、例えば、１または複数のカオトロピック剤（例えば、尿素、および／またはグアニジン）を使用してポリペプチド鎖をアンフォールドし、還元することにより、ならびにジスルフィド結合を還元することができる還元剤（例えばジチオトレイトール、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノール、２−ＭＥ）により、リフォールドされる。中程度の濃度のカオトロープ、その後、ジスルフィド結合の改良を可能とする酸化剤が添加される（例えば酸素、シスチンまたはシスタミン）。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、参照により本明細書に援用される、米国特許第４，５１１，５０２号、第４，５１１，５０３号、および第４，５１２，９２２号に記載されるもの等の当該技術分野において知られている標準的な方法を使用してリフォールドされてもよい。また、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ヘテロダイマーまたはヘテロマルチマーを形成するために他のタンパク質と共にフォールディング（ｃｏｆｏｌｄｅｄ）されてもよい。
リフォールディングの後、改変ＦＧＦ−２１は更に精製されてもよい。改変ＦＧＦ−２１の精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等またはその任意の組み合わせを含む、当業者に知られている様々な技術を使用してなされてもよい。また、追加の精製は、精製されたタンパク質の乾燥または沈降の工程を含んでもよい。
精製後、改変ＦＧＦ−２１を、異なるバッファーへと交換してもよく、および／または限定されないが、ダイアフィルトレーションおよび透析を含む、当該技術分野において知られている様々な方法いずれかによって濃縮されてもよい。単一の精製されたタンパク質として提供される改変ＦＧＦ−２１を、凝集および沈降に供してもよい。
精製された改変ＦＧＦ−２１は、少なくとも９０％純粋（逆相高速液体クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣまたはナトリウムドデシル硫酸塩−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される）、または少なくとも９５％純粋、または少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％以上純粋であってもよい。改変ＦＧＦ−２１の純度の正確な数値にかかわらず、改変ＦＧＦ−２１は、医薬製品としての使用、またはＰＥＧ等の水溶性ポリマーとの接合等の更なる処理に対して十分に純粋である。
特定の改変ＦＧＦ−２１分子は、他の有効成分またはタンパク質（添加剤、担体および安定化剤以外、および血清アルブミン等）の不在下で、治療薬として使用されてもよくまたは、それらは別のタンパク質またはポリマーと複合体化されてもよい。
本開示のいくつかの実施形態では、各精製工程の後の改変ＦＧＦ−２１の収率は、各精製工程の出発材料中の未改変または改変されたＦＧＦ−２１の少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％であってもよい。
ＶＩＩＩ．代替系における発現
本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、無細胞の（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ）翻訳系を使用して発現されてもよい。翻訳系は、細胞性または無細胞性であってもよく、また、原核生物または真核生物であってもよい。細胞の翻訳系は、限定されないが、所望の核酸配列がｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡが翻訳され得る、透過処理された細胞または細胞培養物等の全細胞製剤を含む。無細胞翻訳系は商業的に入手可能であり、様々な種類および系がよく知られている。無細胞系の例として、限定されないが、エシェリキア・コリ溶解物等の原核生物の溶解物、およびコムギ麦芽抽出物、昆虫細胞溶解物、ウサギ網状赤血球抽出液、ウサギ卵母細胞溶解物およびヒト細胞溶解物等の真核生物の溶解物が挙げられる。ミクロソーム膜を含むイヌ膵臓抽出物等の膜性抽出物が利用可能であり、分泌蛋白質を翻訳するのに有用である。
ＩＸ．改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドにカップリングされた巨大分子ポリマー
本明細書に記載される非天然アミノ酸ポリペプチドへの様々な修飾は、本明細書に記載される組成物、方法、技術および戦略を使用して達成され得る。これらの修飾は、限定されないが、ポリペプチドの非天然アミノ酸構成要素に対して、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞毒性化合物；薬物；アフィニティー標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチド、またはポリペプチド類縁体；抗体または抗体フラグメント；金属キレート化剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド；水溶性のデンドリマー；シクロデキストリン；抑制性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア（金属含有部分）；放射性部分；新規な官能基；共有結合的にまたは非共有結合的に他の分子と相互作用する基；フォトケージされた部分；化学線励起部分；光異性化部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチン類縁体；重原子を組み込む部分；化学的開裂基；光開裂基；伸長された側鎖；炭素連結糖；酸化還元活性のある薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；アイソトープ標識化部分；生物物理学的プローブ；りん光性基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性物質；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノトランスミッター；放射性ヌクレオチド；ラジオトランスミッター；中性子捕捉剤；または上の任意の組み合わせ、または他の任意の望ましい化合物もしくは物質を含む、更なる官能性の組み込みを含む。実例として、また本明細書に記載される組成物、方法、技術および戦略の非限定的な例として、以下の記載は、それに対して記載される組成物、方法、技術および戦略を、限定されないが、上に列挙されたものを含む他の官能性を加えることに対して（必要ならば、またそのために当業者が本明細書の開示により作製可能であった、適切な修飾により）適用可能であるという理解により、巨大分子のポリマーを非天然アミノ酸ポリペプチドに付加することに注目する。
多様な巨大分子のポリマーおよび他の分子を、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの生物学的特性を調節するためにおよび／または改変ＦＧＦ−２１分子に新しい生物学的特性を提供するために、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに連結することができる。これらの巨大分子のポリマーは、天然にコードされたアミノ酸によって、天然にコードされていないアミノ酸、または天然もしくは非天然アミノ酸の任意の官能性の置換基、または天然もしくは非天然アミノ酸に付加された任意の置換基または官能基によって改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに連結され得る。ポリマーの分子量は、限定されないが、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上を含む、幅広い範囲であってもよい。ポリマーの分子量は、限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａを含む、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであってもよい。１，０００ｄａ、９００ｄａ、８００ｄａ、７００ｄａ、６００ｄａ、５００ｄａ、４００ｄａ、３００ｄａ、２００ｄａおよび１００ｄａ。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。
選択されるポリマーは、それが付着されるタンパク質が、生理学的環境等の水性環境において沈殿しないように、水溶性であってもよい。ポリマーは分岐鎖であってもよく、または直鎖であってもよい。最終生成物の調製剤の治療的使用に対して、ポリマーは薬学的に許容可能であってもよい。
ポリマーの例は、限定されないが、ポリアルキルエーテルおよびそのアルコキシキャップ類縁体（例えばポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレン）グリコール、およびそのメトキシまたはエトキシキャップ類縁体、特にポリオキシエチレン）グリコールであって、後者はポリエチレングリコールまたはＰＥＧとしても知られる）；個別のＰＥＧ（ｄＰＥＧ）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエーテル；ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリンおよびポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド、およびポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、およびその誘導体）；ポリヒドロキシアルキルアクリレート；ポリシアル酸およびその類縁体；親水性ペプチド配列；デキストランおよびデキストラン誘導体、例えばカルボキシメチルデキストラン、硫酸デキストラン、アミノデキストランを含む、多糖およびそれらの誘導体；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース；キチンおよびその誘導体、例えばキトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン；ヒアルロン酸およびその誘導体；デンプン；アルギン酸塩；コンドロイチン硫酸；アルブミン；プルランおよびカルボキシメチルプルラン；ポリアミノ酸およびその誘導体、例えばポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパラギン酸エステル）；以下の無水マレイン酸共重合体：スチレン無水マレイン酸共重合体、ジビニルエチルエーテル無水マレイン酸共重合体；ポリビニルアルコール；その共重合体；その三量体；それらの混合物；ならびに先のものの誘導体。
本明細書に使用され、またＰＥＧ：改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド抱合体を意図する場合、「治療的有効量」の用語は、患者に所望の利益を与える量を指す。上記量は、ある個体から別の個体で変化してもよく、患者の全体的な健康状態および治療される病状の根本的な原因を含む、多くの因子に依存し得る。治療に使用される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの量は、許容可能な変化率をもたらし、有益なレベルの所望の応答を維持する。
水溶性ポリマーは、限定されないが、直鎖、フォーク状、または分岐鎖を含む任意の構造形態であってもよい。典型的には、水溶性ポリマーは（ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ））等のポリ（アルキレングリコール）であるが、他の水溶性ポリマーも使用することができる。例として、ＰＥＧは、この開示の特定の実施形態を説明するために使用される。
「ＰＥＧ」の用語は、サイズまたはＰＥＧの末端の修飾に関わらず、任意のポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
式中、ｎは２〜１０，０００であり、ＸはＨまたは末端修飾であり、限定されないが、Ｃ１〜４アルキル、保護基、または末端官能基を含む、
によって改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに連結されるものとして表され得る。
いくつかの場合には、本開示のポリペプチドで使用されるＰＥＧは、ヒドロキシまたはメトキシにより１つの末端上で終了し、すなわち、ＸはＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。代替的には、ＰＥＧは、反応性基で終了してもよく、それにより二官能性ポリマーを形成する。典型的な反応性基は、２０個の通常のアミノ酸に対して不活性であるが、天然にコードされていないアミノ酸中に存在する相補的官能基と特異的に反応する官能基（限定されないが、アジド基、アルキン基を含む）と同様に、２０個の通常のアミノ酸に見られる官能基と反応するように一般に使用されるそれらの反応性基（限定されないが、マレイミド基、活性化炭酸塩（限定されないが、ｐ−ニトロフェニルエステルを含む）、活性化エステル（限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびｐ−ニトロフェニルエステルを含む）、ならびにアルデヒドを含む）を含んでもよい。上記式中Ｙにより表される、ＰＥＧのもう１つの末端は、天然起源または天然にコードされていないアミノ酸によって改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに直接的または間接的に付着され得ることに留意されたい。例えば、Ｙは、ポリペプチドのアミン基（限定されないが、リジンのイプシロンアミンまたはＮ末端を含む）に対するアミド、カルバメートまたは尿素リンケージであってもよい。
代替的には、Ｙはチオール基（限定されないが、システインのチオール基を含む）へのマレイミドリンケージであってもよい。代替的には、Ｙは２０個の通常のアミノ酸によって一般にアクセス可能でない残基へのリンケージであってもよい。例えば、ヒュスゲン［３＋２］付加環化生成物を形成するため、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド上のアルキン基とＰＥＧ上のアジド基を反応させることができる。代替的には、同様の生成物を形成するために天然にコードされていないアミノ酸中に存在するアジド基と、ＰＥＧの上のアルキン基を反応させることができる。いくつかの実施形態では、強い求核分子（限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドを含む）を天然にコードされていないアミノ酸中存在するアルデヒド基またはケトン基と反応させて、いくつかの場合には、更に適切な還元剤を用いた処理によって還元することができる、適用可能な、ヒドラゾン、オキシムまたはセミカルバゾンを形成させることができる。代替的には、強い求核分子は天然にコードされていないアミノ酸によって改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれることができ、水溶性ポリマー中に存在するケトン基またはアルデヒド基と優先的に反応するために使用される。
限定されないが、所望により約１００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ以上（限定されないが、時に、０．１ｋＤａ〜５０ｋＤａ、または１０ｋＤａ〜４０ｋＤａ）を含む、ＰＥＧに対する任意の分子量が特に望ましいとして使用され得る。ＰＥＧの分子量は、限定されないが、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上を含む、広い範囲であってもよい。ＰＥＧは、限定されないが、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａを含む。また、限定されないが、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ（限定されないが、１ｋＤａ〜５０ｋＤａまたは５ｋＤａ〜２０ｋＤａを含む）の範囲を有する各鎖を含むＰＥＧ分子を含む分岐鎖ＰＥＧを使用することができる。分岐鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、限定されないが、約１，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上であってもよい。分岐鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、および１，０００Ｄａを含む、約１，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであってもよい。一般に、ＰＥＧ分子の少なくとも１つの末端は、天然にコードされていないアミノ酸との反応に利用可能である。例えば、アミノ酸側鎖との反応に対するアルキンおよびアジドの部分を持つＰＥＧ誘導体を、本明細書に記載される天然にコードされていないアミノ酸にＰＥＧを付着するために使用することができる。天然にコードされていないアミノ酸がアジドを含む場合には、ＰＥＧは、典型的には、［３＋２］付加環化生成物の形成を達成するためのアルキン部分、またはアミド結合の形成を達成するためのホスフィン基を含む活性化されたＰＥＧ種（すなわち、エステル、炭酸塩）のいずれかを含む。代替的には、天然にコードされていないアミノ酸がアルキンであれば、ＰＥＧは典型的には［３＋２］ヒュスゲン付加環化生成物の形成を達成するためにアジド部分を含んでもよい。天然にコードされていないアミノ酸がカルボニル基を含む場合、対応するヒドラゾン、オキシムおよびセミカルバゾンのリンケージの形成をそれぞれ達成するため、ＰＥＧは典型的には強力な求核分子（限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはセミカルバジド官能性を含む）を含んでもよい。他の代替案では、上に記載される反応性基の配向の逆を使用することができ、すなわち、アルキンを含むＰＥＧ誘導体と天然にコードされていないアミノ酸中のアジド部分を反応させることができる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ誘導体を伴う改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在する化学の官能性と反応性の化学官能性を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、約８００Ｄａ〜約１００，０００の平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格を含む、アジド含有およびアセチレン含有のポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であってもよい。しかしながら、限定されないが、ポリ（エチレン）グリコールおよびポリ（デキストラン）およびポリ（プロピレングリコール）を含む他の関連するポリマーを含む多様な水溶性ポリマーもまた、ここに開示されるポリペプチドにおける使用に適しており、しかも、ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の用語の使用は、かかる分子を全て包含し、含むことが意図されることが理解されなければならない。
ポリマー骨格は、直鎖であってもよく、または分岐鎖であってもよい。分岐ポリマー骨格は、当該技術分野において一般的に知られている。典型的には、分岐ポリマーは、中心枝コア部分を有し、複数の鎖状ポリマーが中心枝コアに連結される。また、分岐鎖ＰＥＧは、ＰＥＧ（−ＹＣＨＺ２）ｎによって表されるフォーク状ＰＥＧ（ｆｏｒｋｅｄ ＰＥＧ）の形態であってもよく、式中、Ｙは連結基であり、Ｚは所定の長さ原子鎖によってＣＨに連結された活性化された末端基である。更に別の分岐鎖形態、ペンダントＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の端にではなくＰＥＧ骨格に沿って、カルボキシル等反応性基を有する。
また、他の多くのポリマーが本開示のポリペプチドにおける使用に適している。好適なポリマーの例として、限定されないが、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、そのコポリマー（限定されないが、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーを含む）、その三量体、それら混合等の他のポリ（アルキレングリコール）が挙げられる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は変わり得るが、典型的には約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、しばしば約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲にある。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、限定されないが約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００ｄａ、４００ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａ。を含む、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであってもよい。
水溶性ポリマーは、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに連結され得る。水溶性ポリマーは、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸、または天然にコードされていないもしくは天然にコードされたアミノ酸の任意の官能基もしくは置換基、または天然にコードされていない、または天然にコードされたアミノ酸に付加された任意の官能基もしくは置換基によって連結されてもよい。代替的には、水溶性ポリマーは、天然起源アミノ酸によって天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに連結される（限定されないが、システイン、リジンまたはＮ末端残基のアミン基を含む）。いくつかの場合には、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の非天然アミノ酸を含み、１または複数の天然にコードされていないアミノ酸（複数の場合がある）は、水溶性ポリマー（複数の場合がある）（限定されないが、ＰＥＧおよび／またはオリゴ糖を含む）に連結される。いくつかの場合には、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上の天然にコードされたアミノ酸を更に含む。いくつかの場合には、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１または複数の天然にコードされていないアミノ酸（複数の場合がある）、および水溶性ポリマーに連結された１または複数の自然起源アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本開示の中で使用される水溶性ポリマーは、配列番号１、配列番号２０１のＦＧＦ−２１ポリペプチド、上記水溶性ポリマーのない同じＦＧＦ−２１ポリペプチド、または本明細書に別記された別のコンパレータ化合物等のコンパレータ化合物と比較して、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの血清半減期を増強する。
本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに連結された水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ化またはグリコシル化の程度）は、変更された（限定されないが、増加された、または減少された）ｉｎ ｖｉｖｏ半減期等の薬理学的、薬物動態学的、薬力学的な特性を提供するため、調整され得る。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１の半減期は、未改変ポリペプチドに対して少なくとも約１０パーセント、２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍または少なくとも約１００倍増加される。
強い求核性基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはセミカルバジド）を含むＰＥＧ誘導体
本開示に或る一つの実施形態では、カルボニルを含む天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを、ＰＥＧ骨格に直接連結された末端のヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジドまたはセミカルバジド部分を含む、ＰＥＧ誘導体で改変してもよい。
水溶性ポリマーが改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに連結される程度および部位は、ＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体への改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの結合を調節し得る。いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、改変ＦＧＦ−２１についてＳｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：７８６２−７８６７（１９８８）に記載されるもの等の平衡結合アッセイによって測定される、約４００以下ｎＭのＫｄで、１５０ｎＭ以下のＫｄで、また、いくつかの場合には１００ｎＭ以下のＫｄで、ＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体を結合するように、リンケージを調整してもよい。
ペプチドの接合と同様にポリマーの活性化のための方法および化学は、文献に記載されており、当該技術分野において知られている。ポリマーの活性化のための一般に用いられている方法として、限定されないが、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド（ｂｉｅｐｏｘｉｄｅ）、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、スルホニルハロゲン化物、トリクロロトリアジン等による官能基の活性化が挙げられる。ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン等の天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのＰＥＧ化（すなわち、任意の水溶性ポリマーの付加）は、参照により本明細書に援用される米国特許第８，０１２，９３１号に記載されるもの等の任意の好適な方法によって実行さ得る。本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのアミノ酸に連結された水溶性ポリマーは、制限なく、更に誘導体化または置換され得る。
本開示の別の実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在するアルキン部分と反応し得るアジド部分を含む、ＰＥＧ誘導体で改変されてもよい。一般に、ＰＥＧ誘導体は、いくつかの実施形態において、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有してもよい。
いくつかの実施形態では、アジド末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有してもよい：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピル等）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５ｋＤａ〜４０ｋＤａである）である。
別の実施形態では、アジド末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有してもよい：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピル等）であり、ｍは２〜１０であり、ｐは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である（すなわち、平均分子量は５ｋＤａ〜４０ｋＤａである）。
本開示の別の実施形態では、アルキン含有アミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、分岐鎖ＰＥＧの各鎖が１０ｋＤａ〜４０ｋＤａ、および５ｋＤａ〜２０ｋＤａであってもよい範囲のＭＷを有する、末端アジド部分を含む分岐鎖ＰＥＧ誘導体によって、更に改変されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、アジド末端ＰＥＧ誘導体には以下の構造を有してもよい：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＮ３
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピル等）であり、ｍは２〜１０であり、ｐは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは、任意にＯ、Ｎ、Ｓまたはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、各場合において存在してもよくまたは不在であってもよい。
本開示の別の実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応し得るアルキン部分を含むＰＥＧ誘導体で改変されてもよい。本開示の別の実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応し得る、アリールホスフィン基を更に含む、活性化された官能基（限定されないが、エステル、炭酸塩を含む）を含む、ＰＥＧ誘導体で改変されてもよい。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、以下の例示的な方法によってヒドラジド含むＰＥＧに接合されてもよい。カルボニル含有アミノ酸（ｐＡｃＦ等）を組み込む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、上に記載される手順に従って作製されてもよい。一旦改変されると、以下の構造を有するヒドラジド含有ＰＥＧは、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに接合されてもよい：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
式中、例えば、Ｒ＝メチル、ｎ＝２、およびＮ＝１０，０００ＭＷ、ならびにＸはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含む精製された改変ＦＧＦ−２１を、２５ｍＭ ＭＥＳ（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ） ｐＨ ７．０、または１０ ｍＭ酢酸ナトリウム（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ｐＨ４．５に０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬで溶解させ、１倍〜１００倍の過剰なヒドラジド含有ＰＥＧと反応させ、最終濃度１０ｍＭ〜５０ｍＭまでＨ２Ｏに溶解されたストック１Ｍ ＮａＣＮＢＨ３（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の添加によってｉｎ ｓｉｔｕで対応するヒドラゾンを還元する。反応は、４℃から室温にて暗闇で１８時間〜２４時間行われる。反応は、約ｐＨ７．６の１Ｍ Ｔｒｉｓ（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を５０ｍＭの最終Ｔｒｉｓ濃度まで添加することによって停止される。または即時精製のため適切なバッファーへ希釈される。
アルキン含有アミノ酸の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドへの導入およびＭｐｅｇ−アジドによる誘導体化
アルキン含有アミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは生成され、以下の例示的な方法によってｍＰＥＧ−アジドで誘導体化されてもよい。選択された位置は、以下の天然にコードされていないアミノ酸により置換されてもよい：
Figure 0006702962
改変ＦＧＦ−２１へのｐ−プロパルギル−チロシンの部位特異的な組み込みに利用される配列は、上に記載される配列番号１（ＦＧＦ−２１）、配列番号１６または配列番号１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４であってもよい。プロパルギルチロシン含有改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、Ｅ．コリ中で発現され、カルボニル含有アミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの精製に対して上に記載される条件を使用して精製されてもよい。
ＰＢバッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ＝８）中の０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍＬで溶解させたプロパルギル−チロシンを含む精製された改変ＦＧＦ−２１、および１０倍〜１０００倍の過剰量のアジド含有ＰＥＧを、反応液に添加する。その後、触媒量のＣｕＳＯ４およびＣｕワイヤを反応液に加える。混合物をインキュベート（限定されないが、室温もしくは３７℃で４時間、または４℃で終夜を含む）した後、Ｈ２Ｏを添加し、該混合を透析膜によって濾過する。収率を確認するため、試料を分析してもよい。
Ｘ．改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む融合タンパク質
また、本開示は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド配列および融合パートナーを含む、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、またはそのフラグメントを提供する。融合パートナーは、限定されないが、半減期延長、タンパク質精製および／または製造の促進、溶解度または安定性の増加等の増強された生物物理学的特性、ならびに減少された免疫原性または毒性、機能特性を与え得る。または任意の他の目的を含む、例えば、融合タンパク質は、延長されたｉｎ ｖｉｖｏ半減期を示すことにより、治療レジメンにおいてそれほど頻繁でない投薬（１週間に２回、１週間に１回、または１週間おきに１回の投薬等）を容易にし得る。例示的な融合タンパク質は、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、ＰＫ伸長（ＰＫＥ）アドネクチン、ＸＴＥＮ、Ｆｃドメイン、または先のもののうちのいずれかのフラグメント、または先のもののうちのいずれかの組み合わせ等の融合パートナーに融合された改変ＦＧＦ−２１を含む。融合タンパク質は、連結ペプチドをコードする配列によって分離されてもよい、同じリーディングフレーム中に改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド配列および融合パートナー配列をコードする核酸を発現させることにより産生され得る。融合タンパク質は、例えば、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端に連結された１または複数の融合パートナー、または、Ｎ末端およびＣ末端の両方に連結された１または複数の融合パートナーの任意の順で、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドおよび融合パートナーを含んでもよい。
融合は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの一方の末端（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端のいずれか）に融合パートナーを付着させることにより、すなわち、融合のパートナー−改変ＦＧＦ−２１または改変ＦＧＦ−２１−融合パートナーの配置で形成され得る。さらに、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、任意に、いずれかの末端または両端で連結ペプチドによって両端で１または複数の融合パートナーに融合されてもよい。特定の実施形態では、融合パートナーおよび改変ＦＧＦ−２１は、連結ペプチドによって融合される。例示的な連結ペプチドは、配列番号７４〜配列番号１００、配列番号３０１、および配列番号３５０〜配列番号３８３から選択される配列、またはそれらの組み合わせ（例えば、先の２、３、またはそれより多い配列）を含んでもよく、またはそれからなってもよい。例示的な連結ペプチドは、０個（すなわち、連結ペプチドが存在しない）〜１００個以上のアミノ酸、例えば少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個から６０個、５０個、４０個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、または１１個のアミノ酸の長さを有してもよい。連結ペプチドの例示的で非限定的な長さとして、１個〜１００個のアミノ酸、１個および４０個（１ ａｎｄ ４０）のアミノ酸、１個〜２０個のアミノ酸、１個〜１０個のアミノ酸、または３個〜５個のアミノ酸が挙げられる。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、またはそのフラグメントは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその部分を含む融合タンパク質として産生され得る。かかる融合コンストラクトは、ＣＨＯ等の真核生物宿主細胞、またはＥ．コリ等の細菌における改変ＦＧＦ−２１またはそのフラグメントの発現を増強するのに適している場合がある。例示的なＨＳＡタンパク質として、参照により本明細書に援用される、米国特許第５，７６６，８８３号、およびＰＣＴ出願公開第９７／２４４４５号に開示される、Ｎ末端ポリペプチド（アミノ酸１〜３６９、１〜４１９、およびアミノ酸１で始まる中間の長さ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＨＳＡのＣ末端およびＮ末端端部の各々に付着された、改変ＦＧＦ−２１を有するＨＳＡタンパク質、またはそのフラグメントを含んでもよい。例示的なＨＳＡコンストラクトは、参照により本明細書に援用される、米国特許第５，８７６，９６９号において開示される。ＦＧＦ−２１の哺乳動物細胞発現の例示的な方法は、参照により本明細書に援用される、国際公開第２００５／０９１９４４号に記載される。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ＸＴＥＮ分子に融合されてもよい。また、ＸＴＥＮ分子は、非構造的組み換えポリマー、非構造的組み換えポリペプチド（ＵＲＰ）とも呼ばれ、一般に、各々の全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００９ Ｄｅｃ；２７（１２）：１１８６−９０、米国特許出願公開第号２０１２／０２２００１１、米国特許第７，８４６，４４５号、および国際公開第２０１２／１６２５４２号に記載される。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの半減期を、ＸＴＥＮ分子の構成を変えることによって、例えばそのサイズを変えることによって、変化させ得る。例えば、１時間〜５０時間の範囲、例えば少なくとも１時間、２時間、５時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、もしくは２５時間、またはそれよりも長時間の所望の半減期を達成するため、ＸＴＥＮ分子を選択してもよい。
例示的なＸＴＥＮ分子は、少なくとも４０個の隣接するアミノ酸を含むＵＲＰを含み、ここで、（ａ）ＵＲＰは、グリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）の残基からなる群から選択される少なくとも３つの異なる種類のアミノ酸を含み、ＵＲＰに含まれるアミノ酸の上記群の合計が、ＵＲＰの合計アミノ酸の約８０％超を構成し、上記ＵＲＰが２以上のプロリン残基を含み、上記２以上のプロリン残基を欠く、対応するＵＲＰと比較して、上記ＵＲＰがタンパク質分解に対して減弱された感受性を持ち、（ｂ）上記ＵＲＰのアミノ酸の少なくとも５０％が、チョウ−ファスマン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）アルゴリズムによって決定される二次構造を欠き；（ｃ）上記ＵＲＰのＴエピトープスコアが−５未満である。追加の例示的なＸＴＥＮ分子は、少なくとも約４０個の隣接するアミノ酸を含む非構造的組み換えポリマー（ＵＲＰ）を含み、（ａ）ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）の残基の合計がＵＲＰの合計アミノ酸の少なくとも８０％を構成し、その残部は、存在する場合は、アルギニンまたはリジンからなり、その残部は、メチオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンを含まず、上記ＵＲＰは、グリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される少なくとも３つの異なる種類のアミノ酸を含み；（ｂ）上記ＵＲＰ中の少なくとも４０個の隣接するアミノ酸の少なくとも５０％が、チョウ−ファスマンアルゴリズムによって決定される二次構造を欠き；（ｃ）ＵＲＰがＴエピトープスコアに−４未満を有する。
追加の例示的なＸＴＥＮ分子としてｒＰＥＧ分子が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｒＰＥＧ分子は、疎水性残基（例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＷまたはＹ）、側鎖アミド含有残基（例えばＮまたはＱ）、または正電荷を持つ側鎖残基（例えばＨ、ＫまたはＲ）を含まない場合がある。いくつかの実施形態では、増強部分は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、ＳまたはＴを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｒＰＥＧは、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９９％でグリシンを含んでもよく、または更にはグリシンを１００％含んでもよい。
上記ＸＴＥＮ分子は、ポリエチレングリコールに更に連結されてもよい。
「ＰＡＳ」および／または「ＰＡＳ化」の用語は、アミノ酸のＰｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒ（ゆえに「ＰＡＳポリペプチド」および「ＰＡＳ化」の用語）で構成される構造的に障害されたポリペプチド配列と改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド等の、目的の生物薬学的タンパク質の遺伝的融合を指す。ＰＡＳ化は血清半減期を増加し、溶解度、安定性、および／またはプロテアーゼに対する抵抗性を増加し、および／または、目的のタンパク質、例えば融合タンパク質の免疫原性を減少させ得る（参考のため、参照により本明細書に援用される、国際公開第２００８１５５１３４号Ａ１および米国特許出願公開第号２０１４００７３５６３号を参照されたい）。ＰＡＳ配列は、遺伝子融合によって改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、または両方の末端のいずれかに付着されてもよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＳポリペプチドは、少なくとも約１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、ランダムコイル構造を形成する、少なくとも２つのドメインを含んでもよく、上記第２のドメインは、アラニン、セリンおよびプロリンの残基を含むことによって、上記ランダムコイル構造がｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＡＳポリペプチドが融合される生物薬学的タンパク質の安定性の増加を媒介する。いくつかの実施形態では、アラニン、セリンおよびプロリンの残基を含む第２のドメインは、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号３１０）；ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号３１１）；ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号３１２）、ＳＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号３１３）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号３１４）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号３１５）およびＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号３１６）から選択されてもよい。ＰＡＳポリペプチドは、１または複数の共有結合性修飾用部位を含んでいてもよい。
例示的な実施形態では、改変ＦＧＦ−２１はアドネクチン、例えばアルブミン結合アドネクチンまたはＰＫＥアドネクチンに融合される。例示的なアドネクチンは、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１１／０３０５６６３号に開示される。上記アドネクチンは、１０番目のフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインに基づき、血清アルブミンに結合してもよい。上記アドネクチンは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含むＤＥループ、および、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を含むＦＧループの１または複数を含んでもよく、または配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２〜配列番号７２から選択されるポリペプチド、または配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２〜配列番号７２に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一のポリペプチドであって、それぞれ米国特許出願公開第号２０１１／０３０５６６３号の配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、および配列番号２４〜配列番号４４に相当するポリペプチドを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメイン（「Ｆｃドメイン」）、または機能性Ｆｃ領域等のそのフラグメントもしくは変異体に融合されてもよい。機能性Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎに結合するが、エフェクター機能を持たない。Ｆｃ領域またはそのフラグメントがＦｃＲｎに結合する能力は、当該技術分野において知られている標準的な結合アッセイによって決定され得る。例示的な「エフェクター機能」として、Ｃ１ｑ結合する；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体； ＢＣＲ）の下方制御等が挙げられる。かかるエフェクター機能は、かかる抗体エフェクター機能を評価するため当該技術分野において知られている様々なアッセイを使用して評価することができる。
例示な実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１サブクラスに由来するが、他のサブクラス（例えばＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）も使用され得る。ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメインの例示的な配列が下に示される：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号３０２）
いくつかの実施形態では、融合タンパク質の中で使用されるＦｃ領域は、Ｆｃ分子のヒンジ領域を含んでもよい。例示的なヒンジ領域は、上に提示される例示的なヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメイン配列の１位〜１６位（すなわち、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３０３））にまたがるコアヒンジ残基を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、一部は、上に提示される例示的なヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメイン配列のヒンジ領域内の６位および９位のシステイン残基のおかげで、多量体構造（例えば二量体）をとり得る。他の実施形態では、本明細書に使用されるヒンジ領域は、上に提示される例示的なヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメイン配列のコアヒンジ配列を挟むＣＨ１およびＣＨ２の領域に由来する残基を更に含んでもよい。更に他の実施形態では、ヒンジ配列はＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３０４）を含んでもよく、それからなってもよい。
いくつかの実施形態では、ヒンジ配列は、望ましい薬物動態学的、生物物理学的、および／または生物学的な特性与える１または複数の置換を含んでもよい。いくつかの例示的なヒンジ配列として、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号３０５）、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号３０６）、ＥＰＫＳＳＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号３０７）、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号３０８）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号３０９）が挙げられる。或る一つの実施形態では、上に提示される例示的なヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメイン配列の１８位の残基Ｐは、Ｆｃエフェクター機能を除去するためにＳで置換されてもよく、この置換は、配列ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号３０６）、ＥＰＫＳＳＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号３０７）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号３０９）を有するヒンジにおいて例証される。別の実施形態では、上に提示される例示的なヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメイン配列の１位〜２位の残基ＤＫは、可能性のあるクリップ部位を除去するためにＧＳで置換されてもよく、この置換は、配列ＥＰＫＳＳＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号３０７）において例証される。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１（すなわち、ドメインＣＨ１−ＣＨ３）の重鎖定常領域の１０３位のＣは、軽鎖がない状態での不適当なシステイン結合形成を予防するためＳで置換されてもよく、この置換は、配列ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号３０５）、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号３０６）およびＥＰＫＳＳＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号３０７）において例証される。
追加の例示的なＦｃ配列として以下が挙げられる：
ｈＩｇＧ１ａ＿１９１［Ａ ｓｕｂｔｙｐｅ］
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
（配列番号３２３）
ｈＩｇＧ１ａ＿１８９［ｈＩｇＧ１ａ＿１９１ ｓａｎｓ“ＧＫ”ｏｎ Ｃ ｔｅｒｍ；Ａ ｓｕｂｔｙｐｅ］
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
（配列番号３２４）
ｈＩｇＧ１ａ＿１９１ｂ［Ａ／Ｆｓｕｂｔｙｐｅ］
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号３２５）
ｈＩｇＧ１ｆ＿１．１＿１９１［Ｃｏｎｔａｉｎｓ ５ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｏ ａｌｔｅｒ ＡＤＣＣ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｆ ｓｕｂｔｙｐｅ］
DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
（配列番号３２６）
ｈＩｇＧ１ｆ＿１．１＿１８６［Ｃｏｎｔａｉｎｓ ５ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｏ ａｌｔｅｒ ＡＤＣＣ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃ２２５Ｓ（Ｅｄｌｅｍｅｎ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）；Ｆ ｓｕｂｔｙｐｅ］
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
（配列番号３２７）
ｈＩｇＧ１ａ＿（Ｎ２９７Ｇ）＿１９１［Ａ ｓｕｂｔｙｐｅ］
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号３２８）
ｈＩｇＧ１ａ＿１９０［ｈＩｇＧ１ａ＿１９０ ｓａｎｓ“Ｋ”ｏｎ Ｃ ｔｅｒｍ；Ａ ｓｕｂｔｙｐｅ］
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号３２９）
ｈＩｇＧ１ａ＿（Ｎ２９７Ｑ）＿１９１［Ａ ｓｕｂｔｙｐｅ］
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号３３０）
ｈＩｇＧ１ａ＿（Ｎ２９７Ｓ）＿１９１［Ａ ｓｕｂｔｙｐｅ］
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK （配列番号３３１）
ｈＩｇＧ１ａ＿（Ｎ２９７Ａ）＿１９１［Ａ ｓｕｂｔｙｐｅ］
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号３３２）
ｈＩｇＧ１ａ＿（Ｎ２９７Ｈ）＿１９１［Ａ ｓｕｂｔｙｐｅ］
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYHSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号３３３）
ｈＩｇＧ４
DKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号３３４）
ｈＩｇＧ４＿（Ｓ２４１Ｐ）
DKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号３３５）
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３０２および配列番号３２３〜配列番号３３５から選択されるアミノ酸配列を含む。ＦｃドメインのＣ末端リジンは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質の任意成分であることが理解されなければならない。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、そのＣ末端リジンが省略されること以外は、配列番号３０２および配列番号３２３〜配列番号３３５から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３０２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、そのＣ末端リジンが省略されること以外は、配列番号３０２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、アルブミン結合配列を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが作製される。例示的なアルブミン結合配列として、限定されないが、レンサ球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合領域（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７７：５３４−５４２（１９９６）ａｎｄ Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１：１１５−１２３ （１９９７）を参照されたい）、または例えば、Ｄｅｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）に記載されるもの等のアルブミン結合ペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは脂肪酸によりアシル化される。いくつかの場合には、脂肪酸が血清アルブミンへの結合を促進する。例えば、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：７２５−７３１（１９９５）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、血清アルブミン（限定されないが、ヒト血清アルブミンを含む）により直接融合される。当業者は、多様な他の分子を本開示中の改変ＦＧＦ−２１に連結して血清アルブミンまたは他の血清成分への結合を調節できることを認識するだろう。
ＸＩ．改変および未改変のＦＧＦ−２１ポリペプチドのグリコシル化
本開示は、糖残基を持つ１または複数の天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む。糖残基は、天然であってもよく（限定されないが、Ｎ‐アセチルグルコサミンを含む）、または非天然であってもよい（限定されないが、３−フルオロガラクトースを含む）。サッカライドは、Ｎ連結またはＯ連結グリコシド結合（限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンを含む）、または非天然リンケージ（限定されないが、オキシムまたは対応するＣ連結もしくはＳ連結グリコシド含む）のいずれかによって天然にコードされていないアミノ酸に連結されてもよい。
糖（限定されないが、グリコシル基を含む）部分は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドにｉｎ ｖｉｖｏでまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで付加することができる。本開示のいくつかの実施形態では、カルボニルを含む天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アミノオキシ基で誘導体化されたサッカライドで改変されて、オキシム結合によって連結される対応するグリコシル化ポリペプチドを生成し得る。一旦、天然にコードされていないアミノ酸に付着されると、サッカライドは、グリコシル移転酵素および他の酵素による処理によって更に複雑に作られて、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに結合したオリゴ糖を生成してもよい。例えば、Ｈ．Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１７０２−１７０３（２００３）を参照されたい。
本開示のいくつかの実施形態では、カルボニルを含んでいる天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、アミノオキシ誘導体として調製された規定の構造を有するグリカンで直接に改変されてもよい。アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびセミカルバジドを含む他の官能性は、サッカライドを天然にコードされていないアミノ酸に連結するために使用され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、アジド含有改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドまたはアルキニルを含む天然にコードされていないアミノ酸を、その後、限定されないが、それぞれアルキニルまたはアジド誘導体との、限定されないがヒュスゲン［３＋２］付加環化反応により、改変してもよい。
ＸＩＩ．ＦＧＦ−２１の二量体および多量体
また、本開示は、１または複数の天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１が、ポリペプチド骨格に直接、またはリンカーを介するいずれかにより、別のＦＧＦ−２１または改変ＦＧＦ−２１もしくはその変異体に結合、またはＦＧＦ−２１もしくは改変ＦＧＦ−２１もしくはその変異体ではない他のポリペプチドに結合される、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマー（すなわち、三量体、四量体等）等のＦＧＦ−２１および改変ＦＧＦ−２１の組み合わせを提供する。モノマーと比較して、その増加した分子量により、ＦＧＦ−２１二量体または多量体の抱合体は、限定されないが、モノマーのＦＧＦ−２１と比較して、異なる薬理学的、薬物動態学的、薬力学的、調節された治療的半減期、または調節された血漿内半減期を含む新しいまたは所望の特性を示してもよい。いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１二量体は、ＦＧＦ−２１受容体のシグナル伝達を調節してもよい。他の実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１二量体または多量体は、ＦＧＦ−２１受容体アンタゴニスト、アゴニストまたはモジュレーターとして作用してもよい。
ＸＩＩＩ．ＦＧＦ−２１ポリペプチド活性の測定、およびＦＧＦ−２１ポリペプチド受容体に対するＦＧＦ−２１ポリペプチドの親和性
その全体が参照によって援用される、米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号の実施例３に示される脂肪組織代謝に関する研究に利用されるｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて、ＦＧＦ−２１は、グルコース取込みを刺激し、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中のインスリン感受性を増強すると示される。２型糖尿病の特徴は、脂肪組織を含む様々な種類の組織におけるグルコース取込みの欠損である。したがって、改変ＦＧＦ−２１は、血糖レベルを低下させることにより２型糖尿病を治療するのに有用な可能性がある。さらに、改変ＦＧＦ−２１は、より速く、より効率的なグルコース利用によって、エネルギー消費を増加させることによって肥満を治療するのに有用な可能性がある。さらに、ＦＧＦ−２１は、インスリンから独立し方式で３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中のグルコース取込みを刺激することが示され、１型糖尿病を治療するのにも有用であることを示した。米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号を参照されたい。米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号において、ＦＧＦ−２１は、インスリン（５ｎＭ）の最適以下の濃度で、およびインスリンの不在下で、濃度依存的な方式で３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中のグルコース取込みを刺激すると示される。さらに、ＦＧＦ−２１は、米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ組織モデル中のグルコース取込みを誘導する。
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは生物活性に関するアッセイに供されてもよい。一般に、生物活性に対するテストは、所望の結果に対して、未改変ＦＧＦ−２１または本明細書に別記されるような別のコンパレータ化合物と比較した、生物活性の増加または減少、異なる生物活性、受容体または結合パートナーの親和性分析、改変ＦＧＦ−２１またはその受容体自体の配座または構造の変化、または血清半減期解析等の分析を提供するべきである。
３Ｔ３−Ｌ１の脂肪細胞への分化およびグルコース取込みアッセイに対する例示的な方法は、参照によってその全体が本明細書に援用される、米国特許第８，０１２，９３１号に記載される。
ＸＩＶ．効力、機能的なｉｎ ｖｉｖｏ半減期、および薬物動態学的パラメーターの測定
本開示の態様は、水溶性ポリマー部分に複合化されるか、または融合パートナーに融合された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの構築によって得ることが得る、遅延された生物学的半減期である。ＦＧＦ−２１ポリペプチド血清濃度の投与後の急速な減少は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドによる治療に対する生体応答を評価することを治療上重要なものとした。また、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、例えば、皮下、またはｉ．ｖ投与による投与後に延長された血清半減期を有し、例えば、ＥＬＩＳＡ法、または予備スクリーニングアッセイによる測定を可能とする。生体内の生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されるように行なわれる。
内部欠失および／または天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの効力および機能的なｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、当業者に知られて、本明細書に記載されるプロトコルに従って特定されてもよい。
例示的なアッセイでは、本明細書に記載される未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドに対する薬物動態学的パラメーターは、正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙの雄性ラット（治療群当たりＮ＝５匹の動物）において評価され得る。動物は、２５μｇ／ラットｉｖまたは５０μｇ／ラットｓｃの１回用量のいずれかを受けてもよく、一般的には、水溶性ポリマーに複合体化されていない天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドについては約６時間におよび、天然にコードされていないアミノ酸を含み、水溶性ポリマーに複合体化された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドについては約４日間のあらかじめ規定されたタイムコースに従っておよそ５〜７の血液試料を得てもよい。改変ＦＧＦ−２１に関する薬物動態学のデータを、配列番号１の野生型ＦＧＦ−２１ポリペプチド、配列番号２０１の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、すなわち内部欠失を欠く同じ改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド、または本明細書に記載される別のコンパレータ化合物等のコンパレータ化合物と比較することができる。
薬物動態学的パラメーターも霊長動物（例えばカニクイザル）において評価することができる。典型的には、単回注射は、皮下にまたは静脈内に投与され、血清ＦＧＦ−２１レベルは経時的にモニターされる。
本開示のポリペプチドを、肥満、不十分なグルコースクリアランス、高血糖、高インスリン血症等と同様に、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ：２型）およびインスリン依存型糖尿病（１型）を患う哺乳動物を治療するために使用してもよい。その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００４０２５９７８０号に示されるように、ＦＧＦ−２１は糖尿病および肥満の動物モデルに有効である。肥満および糖尿病の様々な動物モデルの間で代謝性プロファイルが異なることから、多数のモデルの分析が、高インスリン血症、高血糖および肥満の効果を分離ため試みられた。糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）および肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスは、重度の肥満、過食症、変動する高血糖、インスリン抵抗性、高インスリン血症および損なわれた熱生産性を特徴とする（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：１，１９８２；Ｅ． Ｓｈａｆｒｉｒ， ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ；Ｈ． Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｐｏｒｔｅ，Ｊｒ．Ｅｄｓ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｅｄ．４，１９９０），ｐｐ．２９９−３４０）。しかしながら、糖尿病は、ｄｂ／ｄｂモデルにおいてはるかに重度である（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：１，１９８２；Ｅ．Ｓｈａｆｒｉｒ， ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ；Ｈ． Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｐｏｒｔｅ，Ｊｒ．Ｅｄｓ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｅｄ．４，１９９０），ｐｐ．２９９−３４０）。、Ｚｕｃｋｅｒ（ｆａ／ｆａ）ラットは、重度の肥満で高インスリン血症であって、インスリン抵抗性であり（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：１，１９８２；Ｅ．Ｓｈａｆｒｉｒ，ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ；Ｈ．Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｐｏｒｔｅ，Ｊｒ．Ｅｄｓ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｅｄ．４，１９９０），ｐｐ．２９９−３４０）、ｆａ／ｆａ突然変異はネズミ科のｄｂ 突然変異のラット等価物の可能性がある（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６９：２１７−２２０，１９９２；Ｔｒｕｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７８０６，１９９１）。太った（ｔｕｂ／ｔｕｂ）マウスは、肥満、中程度のインスリン抵抗性および重大な高血糖のない高インスリン血症を特徴とする（Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ８１：４２４，１９９０）。
肥満が遺伝的モデルにおける重度ではなく、過食症、高インスリン血症およびインスリン抵抗性を伴わずに発症する、化学的に誘発された肥満に対するグルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）モデル（Ｏｌｎｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １６４：７１９，１９６９、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５：４１，１９７８）も検査されてもよい。最後に、化学的に誘発された糖尿病に対するストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデルは、肥満がない状態で高血糖の効果を検討するため試験されてもよい。ＳＴＺ−処理動物は、インスリンが不足しており、重度に高血糖である（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：１，１９８２；Ｅ．Ｓｈａｆｒｉｒ，ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ；Ｈ． Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｐｏｒｔｅ，Ｊｒ．Ｅｄｓ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｅｄ．４，１９９０），ｐｐ．２９９−３４０）。
本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、ｏｂ／ｏｂマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ敗血症性ショックモデルで評価され得る。その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５０１７６６３１号を参照されたい。
ＦＧＦ−２１によって引き起こされたＥＲＫ１／２リン酸化の分析のための方法
ＦＧＦ−２１（ＰＥＧまたは他のリンカー、ポリマーまたは生物学的活性分子に連結されたものを含む野生型または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド）によって引き起こされたＥＲＫ１／２リン酸化は、以下の例示な方法によって実行されてもよい：
ポリ−Ｌｙｓ被覆プレートにおいて１００，０００個の細胞／ウェル（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ）でヒトＫｌｏｔｈｏベータにより安定してトランスフェクトされた２９３を蒔く。翌日、細胞は１００％コンフルエントであり、ダルベッコ変法イーグル培地を吸引して除き、新鮮なダルベッコ変法イーグル培地で置換して、更に終夜インキュベートする。２４時間後、選択された未改変または改変されたＦＧＦ−２１またはＦＧＦ−２１類縁体、標準のＦＧＦ２１ＷＴとして使用し、細胞を刺激する。個々の化合物は、それぞれＰＢＳ／１％ＢＳＡ中でそれらを希釈することにより調製される。細胞は、３７℃のインキュベーター中の１０分間に亘って３回繰り返して処理される。１０分間インキュベーションの後、ダルベッコ変法イーグル培地を各ウェルから注意深く吸引して除き、細胞溶解物を生成ため、プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（ＰＩカクテル、Ｎａ３ＶＮ４およびＰＭＳＦ）を含む４０μｌの冷たい１×Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを各ウェルに添加する。９６ウェル／プレートを、２０分間氷上に置いた後、１０分間４０００ｒｐｍでスピンダウンする。細胞溶解物を−８０℃で冷凍する。後に、各試料を出して解凍し、１０μｌの細胞溶解物を、非リン酸化およびリン酸化形態のＥＲＫ１／２の両方を捕捉する抗体で被覆されたＭＳＤ処理プレートに添加する。一次抗体との２時間のインキュベーションの後、プレートを特定のバッファーで数回洗浄し、続いて二次抗体を付加する。１時間後、インキュベーションプレートを再び数回洗浄する。リーディングのためのバッファーを、各ウェルに添加する。プレートをＭＳＤリーダーに移す。生成される曲線は、抗リン酸化ＥＲＫ１／２リーディングユニットに基づき、ＥＣ５０はＳｉｇｍａ Ｐｌｏｔを使用して計算される。活性の倍損失は、ＷＴのＥＣ５０により試験された化合物のＥＣ５０を分割して計算される。
ラットにおける改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの薬物動態学特性の特定
これらの典型的な方法は、カテーテルが挿入されたラットにおいて、生来のおよび改変されたＦＧＦ−２１化合物の薬物動態学的特性を測定するために使用され得る。被験物質の薬物動態学を、薬物を投薬した後の特定の時点で得られた血清試料に由来するヒトＦＧＦ−２１に特異的なＥＬＩＳＡによって分析する。
研究開始時におよそ２５０グラム〜２７５グラムの重さの１２匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットは、頚静脈カテーテルを外科的に留置されていてもよい。動物は良好な状態で、研究の開始に先立って少なくとも３日間研究の場所に順応させてもよい。ラットは、被験物質投与の日に計量されてもよい。動物は、自由な摂食および飲水の標準的な病原体フリーの条件において収容されてもよい。
化合物は、例えば０．２５ｍｇ／ｋｇで皮下に投与される。
動物は被験物質の投与に先立って計量される。化合物は、μＬ単位の１×ＢＷで投与されるように製剤化される。被験物質の皮下投与は背の肩甲部に注入される。動物は、被験物質の単独注射（時間＝０）を受けてもよい。選択された時点では、全血を動物から採血し、ＳＳＴ微量採血チューブへ収集してもよい。血清を、遠心分離の前３０分間に亘って凝血させてもよい。血清を、マイクロストリップで密閉したポリプロピレンタイターチューブに移し、未改変または改変されたＦＧＦ−２１血清濃度を決定するためにＥＬＩＳＡによって分析されるまで−８０℃で貯蔵してもよい。
各動物を、ＰＫタイムコースに使用してもよい。およそ０．２５ｍＬの全血を頚静脈カテーテルから採血してもよい。採血直後にカテーテルを０．１ｍＬの食塩水で流してもよい。被験物質材料を受ける動物に対する以下の収集時間点は、選択を必要とするが（ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｓｅｌｅｃｔｅｄ）、被検物質の予期される薬物動態学的プロファイルに基づいて修正されてもよい。
出血前、投薬後１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、３２時間、４８時間、５６時間、７２時間および９６時間。薬物動態学のパラメーターは、Ｌａｍｂｄａ＿ｚ、Ｌａｍｂｄａ＿ｚ＿ｌｏｗｅｒ、Ｌａｍｂｄａ＿ｚ＿ｕｐｐｅｒ、ＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ＿ｚ、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、Ｃ０、ＡＵＣＩＮＦ＿ｏｂｓ、Ｖｚ＿ｏｂｓ、Ｃｌ＿ｏｂｓ、ＭＲＴＩＮＦ＿ｏｂｓ、および／またはＶｓｓ＿ｏｂｓを含み得る、各試験された化合物について決定される。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＺＤＦラットにおける改変ＦＧＦ−２１に関する研究
改変ＦＧＦ−２１、未改変ＦＧＦ−２１およびバッファー溶液をマウスまたはラットに投与する。結果は、未改変ＦＧＦ−２１と比較して、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの活性および半減期を示す。
国際公開第２００５／０９１９４４号は、本開示の化合物等のＦＧＦ−２１化合物を用いて行われ得る薬物動態研究を記載する。本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、マウスに静脈内または皮下の経路によって投与される。動物は、投薬に先立っておよび投薬後の時点に出血させられる。血漿を各試料から集め、放射免疫測定法によって分析する。排出半減期を計算することができ、内部欠失、および／または天然にコードされていないアミノ酸もしくは融合パートナーを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドと、野生型ＦＧＦ−２１もしくは本開示の様々な形態のＦＧＦ−２１ポリペプチドとを比較することができる。同様に、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをカニクイザルに投与してもよい。動物は、投薬に先立っておよび投薬後の時点に出血させられる。血漿を各試料から集め、放射免疫測定法によって分析する。
本開示のポリペプチドを、ＺＤＦ雄性ラット（糖尿病、肥満ラット；研究開始時に８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ−ＧＭＩ）に投与する。ラットはＰｕｒｉｎａ ５００８飼料を自由に与えられる。以下の試験群を設定する：生理食塩水；インスリン４Ｕ／日；未改変または改変されたＦＧＦ−２１、５００μｇ／日、急性（急性投薬群は１回投薬され、投薬後Ｔ＝０、２、４、８および２４の時間に出血させた）；未改変または改変されたＦＧＦ−２１（１００μｇ／日）；未改変または改変されたＦＧＦ−２１（２５０μｇ／日）；未改変または改変されたＦＧＦ−２１（５００μｇ／日）；未改変または改変されたＦＧＦ−２１（１回／日）５００μｇ／ｍｌ；Ｌｅａｎ 生理食塩水；Ｌｅａｎ インスリン４Ｕ／日；Ｌｅａｎ 未改変または改変されたＦＧＦ−２１ ５００μｇ／日。Ｌｅａｎ群は、糖尿病ではない、非肥満ＺＤＦラットを表す。
研究（７日間）期間に亘り１日当たり１回注射を受ける、第２の５００μｇ／日群を除いて、化合物は皮下に（ｓ．ｃ．）（ｂ．ｉ．ｄ．）注入される。対照ラットにビヒクル（ＰＢＳ；０．１ｍｌ）を注入する。７日間の投薬に続いて、動物を経口ブドウ糖負荷試験に供する。グルコースおよびトリグリセリドのための血液は、麻酔薬を用いずに尾のクリップ出血によって収集される。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、用量依存的な方式で血漿ブドウ糖レベルを低下させてもよい。また、インスリンを投薬されたラットと比較した場合、非肥満ＺＤＦラットは、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドへの曝露後に低血糖にならない場合がある。
ｏｂ／ｏｂ肥満モデルにおける改変ＦＧＦ−２１のｉｎ ｖｉｖｏ研究
ｏｂ／ｏｂマウスモデルは高血糖、インスリン抵抗性および肥満に対する動物モデルである。ビヒクルおよびインスリンの対照群と比較された未改変または改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドによる治療後の血漿ブドウ糖レベルは、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて測定されてもよい。この肥満モデルでは、雄性ｏｂ／ｏｂマウス（７週齢）の試験群は、７日間に亘って皮下に（０．１ｍｌ、ｂ．ｉ．ｄ）、ビヒクル（ＰＢＳ）単独、インスリン（４Ｕ／日）または未改変もしくは改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチド（５μｇ／日および２５μｇ／日）により注入される。血液は最初の化合物の注射の１時間後に、１日目、３日目および７日目の尾のクリップ出血によって収集し、血漿ブドウ糖レベルは標準プロトコルを使用して測定される。ビヒクル対照群と比較した場合、ＦＧＦ−２１ポリペプチドが血漿ブドウ糖レベルを低下させれば、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、グルコース取込みを賦活する。トリグリセリドレベルは、他の分子と比較して、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドによる治療後に比較されてもよい。ポリペプチドを、複数回投与、持続注入または単回投薬によりマウスに投与してもよい。
改変ＦＧＦ２１ポリペプチドの薬物動態学的評価：
ＰＥＧ接合の変化する部位を有する改変ＦＧＦ−２１の薬物動態学的特性を、ラットにおいて評価する。研究された他のパラメーターは、投与された化合物の用量と同様、ＰＥＧ ＭＷである。パーセントバイオアベイラビリティーが決定される。
全ての動物実験は、研究所の実験動物委員会によって承認されたプロトコルの下で行なわれる。雄性（１７５ｇ〜３００ｇ）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる。ラットを、１２時間の明／暗サイクルの部屋のケージに個々に収容され、実験に先立って少なくとも３日間動物施設に順応させる。動物には、認可されたＰｕｒｉｎａ齧歯類固形飼料５００１および水への自由なアクセスが提供される。
カテーテルは、血液収集のため頚静脈へ外科的に設置される。成功したカテーテル開放に続いて、投薬に先立って動物を治療群に割り当てる。化合物の１回用量は、１ ｍＬ／ｋｇの投薬容量で静脈内にまたは皮下に投与される。化合物の投薬濃度は、放出証明（Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ ｏｆ Ｒｅｌｅａｓｅ）に割り当てられるストック濃度を使用して、ＰＢＳ中の稀釈によってえられる。血液試料は留置カテーテルによって様々な時点で収集され、ＳＳＴ微量遠心管に入れられる。血清は、遠心分離の後に収集され、分析まで−８０℃で貯蔵される。
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの血清における改変ＦＧＦ−２１の定量のためのアッセイを以下の通り行う。マイクロプレートウェルを、捕獲試薬として使用されるヤギ抗ヒトＦＧＦ−２１ ＩｇＧポリクローナル抗体（ＰＡｂ；ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ クローンＡＦ２５３９）で被覆する。いずれも１００％Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット血清への未改変または改変されたＦＧＦ−２１をスパイキングすることによって作製された標準（ＳＴＤ）試料および品質管理（ＱＣ）試料を、研究試料はウェルにロードされる、Ｉ−Ｂｌｏｃｋバッファーによる１：１００の前処理後にウェルに充填する。ＳＴＤ、ＱＣおよび研究試料中の未改変または改変されたＦＧＦ−２１は、固定化ＰＡｂによって捕捉される。ウェルを洗浄して結合していない材料を除去する。ビオチンヤギ抗ヒトＦＧＦ−２１ ＩｇＧ ＰＡｂ（ＲｎＤシステムズ（クローンＢＡＦ２５３９））をウェルに添加し、その後、洗浄工程、および捕捉された未改変または改変されたＦＧＦ−２１の検出用のストレプトアビジン セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ；ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ９９８）の添加が続く。別の洗浄工程の後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）基質溶液はウェルに添加する。ＴＭＢは、ＨＲＰの存在下で過酸化物と反応し、第１工程の捕捉試薬によって結合されたＦＧＦ−２１（野生型または改変されたＦＧＦ−２１）の量に比例して、比色定量シグナルを生じる。発色は、２Ｎの硫酸の付加によって停止され、色の強度（光学密度、ＯＤ）は４５０ｎｍで測定される。研究試料に対するＯＤ単位および濃度に対するＱＣ変換は、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ ｖ５データ換算パッケージを使用して、５パラメーターロジスティク回帰モデルによって回帰推定される、同じプレート上の標準曲線に対するコンピューターソフトウェアを媒介とする比較を通じて達成される。結果はナノグラム／ｍＬ濃度単位で報告される。
また、濃度は、二抗体サンドイッチ測定法または当業者に知られている他の方法によって測定されてもよい。濃度は、対応する投薬された化合物から作製された標準曲線を使用して計算される。薬物動態学的パラメーターは、モデリングプログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（バージョン４．１））を使用して評価される。ｌｉｎｅａｒ−ｕｐ／ｌｏｇ−ｄｏｗｎ台形積分を用いる個々の動物データに対するノンコンパートメント解析を使用し、濃度データは均一に重みづけられる。
ＸＶ．投与および医薬組成物
また、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量および薬学的に許容可能な担体もしくは賦形剤を含む組成物が本明細書において提供される。かかる担体または賦形剤として、限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および／またはそれらの組み合わせが挙げられる。製剤は、投与の様式に適するように作製される。一般に、タンパク質を投与する方法は、当業者に知られており、本開示のポリペプチドの投与に適用することができる。
例えば、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、レシピエント患者体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの濃度で患者に投与されてもよい。或る一つの実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、レシピエント患者の体重の約０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの濃度で患者に投与されてもよい。別の実施形態では、本明細書に記載される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１日１回〜２週間に１回、１週間に約１回もしくは２回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、または６日に１回等の頻度でレシピエント患者に投与してもよい。
所与の患者に投与される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの濃度は、上に述べられる例示的な投与濃度より多くてもよく、または低くてもよいことが理解される。
本開示で提供される情報に基づき、当業者は、例えば、本明細書の開示、ならびにＧｏｏｄｍａｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｇｉｌｍａｎ，Ａ．，Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｌａｚｏ， Ｊ．Ｓ．，＆Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｌ．（２００６）．Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｈｏｗｌａｎｄ，Ｒ．Ｄ．，Ｍｙｃｅｋ，Ｍ．Ｊ．，Ｈａｒｖｅｙ，Ｒ．Ａ．，Ｃｈａｍｐｅ，Ｐ．Ｃ．，＆Ｍｙｃｅｋ，Ｍ．Ｊ．（２００６）．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ’ｓ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、およびＧｏｌａｎ，Ｄ．Ｅ．（２００８）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，（ｅｔｃ．）：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．の教示によって導かれる、日常の実験を通じて、投与の有効量および頻度を決定することができる。
改変ＦＧＦ−２１の平均量は変化する場合があり、特に、有資格医師の推薦および処方箋に基づくべきである。正確な量の改変ＦＧＦ−２１は、治療されている病状の正確な種類、治療されている患者の病状、また同様に組成物中の他の成分等の因子に対する優先対象事項である。また、本開示は、別の活性剤の治療的有効量の投与を提供する。与えられる量は、当業者によって容易に決定され得る。
「医薬組成物」は哺乳動物への投与に適している化学的または生物学的な組成物を指す。かかる組成物は、限定されないが、バッカル、皮膚上、硬膜外、吸入、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋肉内、鼻腔内、眼内、腹腔内、髄腔内、鞘内、静脈内、経口、腸管外、皮下、注腸または坐剤により直腸で、真皮下、舌下、経皮、および経粘膜的を含む多くの経路のうちの１または複数による投与に対して特に製剤化されてもよい。
さらに、投与は、注射、粉末、液体、ゲル、滴剤または投与の他の手段によってもたらされ得る。
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」または「賦形剤」として、任意の全ての溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、生理学的に適合性の等張剤および吸収遅延剤が挙げられる。或る一つの実施形態では、担体は非経口投与に適している。代替的には、担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、または舌下の投与に適していてもよい。薬学的に許容可能な担体として、無菌注射溶液または分散液、または無菌注射溶液もしくは分散駅の即席調製用の分散液もしくは無菌粉末が挙げられる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥形態であってもよい。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高い薬物濃度に適している他の規則構造として製剤化され得る。担体は、溶媒、または例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体のポリエチレングリコール）およびそれらの好適な混合物を含む分散媒であってもよい。本発明は、医薬組成物中の安定化剤の包括を意図する。適切な流動性は、例えば、分散物の場合の要求される粒度の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
多くの場合、等張の薬剤、例えば糖、組成物中のマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウム等の多価アルコールを含むことが好ましい場合がある。モノステアリン酸塩塩類およびゼラチン等の薬剤を含むことによって、注射用組成物の吸収が延長され得る。さらに、ポリペプチドは、例えば、遅延放出ポリマーを含む組成物において、徐放性製剤に製剤化され得る。活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤等の即時放出から化合物を保護し得る担体を用いて調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸とポリ乳酸ポリグリコール酸の共重合体（ＰＬＧ）等の生物分解性、生物学的適合のポリマーが使用され得る。かかる製剤の調製のための多くの方法が当業者に知られている。
本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドおよび組成物は、限定されないが、非経口的に、例えば、限定されないが、注射剤皮下にもしくは静脈内に、または注射剤もしくは点滴の他の形態を含む、タンパク質またはペプチドに適している任意の従来の経路によって投与され得る。ポリペプチド組成物は、限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮的、皮下、局所的、舌下、直腸の手段を含む、多くの経路によって投与され得る。また、改変ＦＧＦ−２１を含む組成物は、リポソームによって投与されてもよい。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、単独で使用されてもよく、または薬学的担体等の他の好適な構成要素と組み合わせて使用されてもよい。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、限定されないが、経口の抗糖尿病剤を含む他の薬剤と組み合わせて使用されてもよい。
「抗糖尿病剤」の用語は、治療、予防、または他の場合には任意のグルコース代謝障害の重症度、または本明細書に記載される病状、疾患もしくは合併症のいずれかを含む、その任意の合併症を軽減させるのに有用な任意の薬物を意味する。抗糖尿病剤として、インスリン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、安息香酸誘導体、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤等が挙げられる。
当該技術分野においてよく知られている、糖尿病、およびインスリン抵抗性等のその前駆症候群の管理のために使用される現在の薬物または抗糖尿病剤は、５つのクラスの化合物を含む：ビグアニド、例えばメトホルミン；チアゾリジンジオン、例えばトログリタゾン；
スルホニルウレア、例えばトルブタマイド、グリブライド；安息香酸誘導体、例えばレパグリニド；およびグルコシダーゼ阻害剤。これらの薬剤に加えて、限定されないが、ＤＰＰ−４阻害剤を含む多くの他の治療法は、グルコース制御を改善するために、本開示のＦＧＦ−２１ポリペプチドと組み合わせて使用されてもよい。臨床試験で検査されたリードＤＰＰ−４化合物は、ビルダグリプチン（Ｇａｌｖｕｓ）（ＬＡＦ２３７）、シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ）、サキサグリプチンおよびアログリプチンＮｏｖａｒｔｉｓ化合物１−［［［２−［（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］アセチル］−２−シアノ−（Ｓ）ピロリジン（ＮＶＰ ＤＰＰ７２８）を含む。
エトモキシル等のカルニチンパルミトイル基転移酵素Ｉの阻害剤（ＣＰＴ−Ｉ）である別のカテゴリーの抗糖尿病剤。
他の既知の抗糖尿病剤として、インスリン製剤（例えばウシおよびブタの膵臓から抽出された動物インスリン製剤；エシェリキア・コリ、酵母を使用して、遺伝学的に合成されたヒトインスリン調製；亜鉛インスリン；プロタミン亜鉛インシュリン；インスリンのフラグメントまたは誘導体（例えばＩＮＳ−１）、経口インスリン調製剤）、インスリン抵抗性改善薬（例えばピオグリタゾン、その塩（好ましくは塩酸塩）、ロシグリタゾンまたはその塩（好ましくはマレイン酸塩）、ネトグリタゾン、リボグリタゾン（ＣＳ−０１１）、ＦＫ−６１４、国際公開第０１／３８３２５号に記載される化合物、テサグリタザル（ＡＺ−２４２）、ラガグリタザル（Ｎ、Ｎ−６２２）、ムラグリタザル（ＢＭＳ−２９８５８５）、エダグリタゾン（ＢＭ−１３−１２５８）、メタグリダセン（ＭＢＸ−１０２）、ナベグリタザール（ＬＹ−５１９８１８）、ＭＸ−６０５４、ＬＹ−５１０９２９、ＡＭＧ−１３１（Ｔ−１３１）、ＴＨＲ−０９２１、α−グルコシダーゼ阻害薬（例えばボグリボース、アカルボース、ミグリトール、エミグリテート等）、ビグアニド（例えばフェンホルミン、メトホルミン、ブホルミンまたはその塩（例えば塩酸塩、フマル酸エステル、コハク酸塩））、インスリン分泌促進物質［スルホニルウレア（例えばトルブタマイド、グリベンクラミド、グリクラジド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリクロピラミド、グリメピリド、グリピジド、グリブゾール）、レパグリニド、ナテグリニド、ミチグリニドまたはそのカルシウム塩水酸化物］、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤（例えばビルダグリプチン（ＬＡＦ２３７）、Ｐ３２／９８、シタグリプチン（ＭＫ−４３１）、Ｐ９３／０１、ＰＴ−１００、サキサグリプチン（ＢＭＳ−４７７１１８））、Ｔ−６６６６、ＴＳ−０２１、β３アゴニスト（例えばＡＪ−９６７７）、ＧＰＲ４０アゴニスト、グルカゴン様ポリペプチド（Ｉ）（ｇｌｐ Ｉ）（ｇｌｐ２）、または他の糖尿病誘発性ペプチドホルモン、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト［例えばＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１ＭＲの薬剤、Ｎ，Ｎ−２２１１、ＡＣ−２９９３（エキセンディン−４）、ＢＩＭ−５１０７７、Ａｉｂ（８，３５）ｈＧＬＰ−１（７，３７）ＮＨ２、ＣＪＣ−［１３１］、アミリンアゴニスト（例えばプラムリンチド）、フォスフォチロシンホスファターゼ阻害剤（例えばバナジン酸ナトリウム）、糖新生阻害剤（例えばグリコーゲンフォスフォリラーゼ阻害剤、グルコース−６−ホスファターゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト）、ＳＧＬＴ２（ナトリウムグルコースコトランスポーター阻害剤（例えばＴ−１０９５）、１１β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素阻害剤（例えばＢＶＴ−３４９８）、アディポネクチンまたはそのアゴニストＩＫＫ阻害剤（例えばＡＳ−２８６８）、レプチン抵抗性を改善する薬物、ソマトスタチン受容体アゴニスト（国際公開第０１／２５２２８号、国際公開第０３／４２２０４号、国際公開第９８／４４９２１号、国際公開第９８／４５２８５号、国際公開第９９／２２７３．５号等に記載される化合物）、グルコキナーゼ活性化剤（例えばＲｏ−２８−１６７５）、グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド）等を言及することができる。
また、改変ＦＧＦ−２１は、吸入によって投与されるエアロゾル製剤（すなわち、「噴霧され」得る）にされる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧を許容可能な噴射剤に入れることができる。
例えば、関節内（関節の中で）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下の経路等による、非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、バッファー、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性の等張の無菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、粘稠化剤、安定化剤および防腐剤を含んでもよい、水性および水性の無菌の懸濁液を含む。改変ＦＧＦ−２１の製剤は、アンプルおよびバイアル等の単位用量またはマルチドーズ密封容器において提示され得る。
本開示の文脈の中で、患者に投与される用量は、その適用に応じて、患者において経時的に有益な治療効果または他の適切な活性を有するのに十分である。用量は、製剤の効能、および採用された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド活性、安定性、または血漿半減期、および患者の病状、また同様に、治療される患者の体重または表面積によって決定される。
例えば７０キログラムの患者に対して投与される用量は、典型的には、関連する組成物の変更された活性または血清半減期について調整された現在用いられている治療のタンパク質の量と等価な範囲にある。
投与について、本開示の製剤は、関連する製剤のＬＤ−５０もしくはＥＤ−５０、および／または、限定されないが、集団および患者の全体的な健康に適合される、様々な濃度での改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの任意の副作用に関する観察によって決定される比率で投与される。投与は単回用量または分割用量によってなされてもよい。
本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを、哺乳動物の被験体に直接投与することができる。投与は、被験体にＦＧＦ−２１ポリペプチドを導入するために通常使用される経路のいずれかによる。本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、薬学的に許容可能な担体と共に、単位用量の注射可能な形態（限定されないが、溶液、懸濁液、またはエマルジョンを含む）の混合物に調製され得る。また、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを、持続注入（限定されないが、浸透ポンプ等のミニポンプを使用する）、単一のボーラスまたは緩効性のデポ剤によって投与することができる。
投与に適した製剤として、酸化防止剤、バッファー、静菌剤、および製剤を等張にする溶質を含み得る、水性および非水性の溶液、等張の無菌液、ならびに沈澱防止剤、溶解剤、粘稠化剤、安定化剤および防腐剤を含み得る、水性および非水性の無菌の懸濁液が挙げられる。溶液および懸濁液は、先に記載される種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
本開示の医薬品組成物および製剤は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤を含んでもよい。
好適な担体として、限定されないが、コハク酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸塩、重炭酸塩および他の有機酸を含むバッファー；限定されないが、アスコルビン酸を含む酸化防止剤；限定されないが、約１０残基未満のものを含む低分子量ポリペプチド；限定されないが、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンを含むタンパク質；限定されないが、ポリビニルピロリドンを含む親水性ポリマー；限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジンもしくはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタメートまたはリジンを含むアミノ酸；限定されないが、トレハロース、スクロース、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；限定されないが、ＥＤＴＡおよびエデト酸（ｅｄｅｎｔａｔｅ）二ナトリウムを含み、これらに限定されないキレート剤；限定されないが、亜鉛、コバルトまたは銅を含む二価金属イオン；限定されないが、マンニトールまたはソルビトールを含む糖アルコール；限定されないが、ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含む塩形成対イオン；および／または限定されないが、非イオン性界面活性剤ＴｗｅｅｎＴＭ（限定されないが、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリソルベート８０）およびＴｗｅｅｎ ２０（ポリソルベート２０）を含む）、限定されないが、プルロニック酸Ｆ６８（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８）またはＰＥＧを含む、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭおよび他のプルロニック酸が挙げられる。好適な界面活性剤として、例えば、限定されないが、ポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（プロピレンオキサイド）−ポリ（エチレンオキサイド）に基づいたポリエーテル、すなわち（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）またはポリ（プロピレンオキサイド）−ポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（プロピレンオキサイド）、すなわち（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）、またはその組み合わせが挙げられる。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯおよびＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、Ｒ−ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、ＴｅｔｒｏｎｉｃｓＴＭおよびＲ−ＴｅｔｒｏｎｉｃｓＴＭの商品名で商業的に入手可能であり（ミシガン州ワイアンドットのＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ）、全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第４，８２０，３５２号に更に記載される。他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーが、好適な界面活性剤の可能性がある。界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、限定されないが、撹拌に起因するストレスを含む、１または複数の負荷に対してＰＥＧ化改変ＦＧＦ−２１を安定化させるために使用され得る。上記のもののうちのいくつかは、「充填剤」と呼ばれる場合がある。また、いくつかは「浸透圧調節剤」と呼ばれる場合がある。抗菌性防腐剤も製品安定性および抗菌的な有効性のため適用される場合があり、好適な防腐剤として、限定されないが、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、メタクレゾール、メチル／プロピルパラベン（ｐａｒａｂｅｎｅ）、クレゾール、またフェノール、またはその組み合わせが挙げられる。
また、ＰＥＧ等の水溶性ポリマーに連結されたものを含む、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、徐放系により、またはその一部として投与され得る。徐放性組成物は、限定されないが、フィルム、またはマイクロカプセルを含む、造形品の形態の半浸透性のポリマーマトリクスを含むが、これらに限定されない。徐放性マトリクスは、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート、エチレン酢酸ビニル（またはポリＤ−（−）３−ヒドロキシ酪酸、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（乳酸およびグリコール酸の共重合体）ポリアンヒドリド、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン等のアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーン等の生体適合性材料から含む。また、徐放性組成物は、リポソームに封入された化合物を含む。化合物を含有するリポソームは、既知の方法によって調製される。
本開示の文脈において患者に投与される用量は、被験体において有益な応答を経時的に引き起こすのに十分でなくてはならない。一般に、１回用量当たりの非経口的に投与される薬学的有効量の本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの合計は、治療的な判断によるが、患者の体重の約１００μｇ／ｋｇ〜約０．０１μｇ／ｋｇ／日、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲である。
いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、抗糖尿病の薬剤の効果を調節する。本開示の別の実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、抗糖尿病剤と同時投与されてもよい。本開示の別の実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、抗糖尿病剤による治療の前に投与されてもよい。本開示の別の実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、抗糖尿病剤による治療に続いて投与されてもよい。
本開示の別の実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドはメトホルミンと同時投与される。いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドはＫｌｏｔｈｏベータと同時投与される。いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、１または複数の天然にコードされていないアミノ酸を含むＫｌｏｔｈｏベータと同時投与される。いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏベータおよび抗糖尿病剤と同時投与される。いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、抗糖尿病剤と同時投与される。いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、下記の１または複数と組み合わせて使用される：タウリン、アルファリポ酸、桑の実抽出物、クロム、グルタミン、エニコステンマ リットラーレ ブルーメ（Ｅｎｉｃｏｓｔｅｍｍａ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ Ｂｌｕｍｅ）、スコパリア ドゥルシス（Ｓｃｏｐａｒｉａ ｄｕｌｃｉｓ）、タラゴンの抽出物、およびアンドログラフィス パニクラータ（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）。いくつかの実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、下記の１または複数と組み合わせて使用される：インスリン製剤（例えばウシおよびブタの膵臓から抽出された動物インスリン製剤）；エシェリキア・コリ、酵母を使用して、遺伝学的に合成されたヒトインスリン調製；亜鉛インスリン；プロタミン亜鉛インシュリン；インスリンのフラグメントまたは誘導体（例えばＩＮＳ−１）、経口インシュリン調製剤、インスリン抵抗性改善薬（例えばピオグリタゾンまたはその塩（好ましくは塩酸塩））、ロシグリタゾンまたはその塩（好ましくはマレイン酸塩）、ネトグリタゾンおよびリボグリタゾン（ＣＳ−０１１）、国際公開第０１／３８３２５号に記載される化合物、ＦＫ−６１４、テサグリタザル（ＡＺ−２４２）、ラガグリタザル（Ｎ、Ｎ−６２２）、ムラグリタザル（ＢＭＳ−２９８５８５）、エダグリタゾン（ＢＭ−１３−１２５８）、メタグリダセン（ＭＢＸ−１０２）、ナベグリタザール（ＬＹ−５１９８１８）、ＭＸ−６０５４、ＬＹ−５１０９２９、ＡＭＧ−１３１（Ｔ−１３１）、ＴＨＲ−０９２１、α−グルコシダーゼ阻害薬（例えばボグリボース、アカルボース、ミグリトール、エミグリテート等）、ビグアニド（例えばフェンホルミン、メトホルミン、ブホルミンまたはその塩（例えば塩酸塩、フマル酸エステル、コハク酸塩））、インスリン分泌促進物質［スルホニルウレア（例えばトルブタマイド、グリベンクラミド、グリクラジド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリクロピラミド、グリメピリド、グリピジド、グリブゾール）、レパグリニド、ナテグリニド、ミチグリニドまたはそのカルシウム塩水酸化物］、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤（例えばビルダグリプチン（Ｖｉｄａｇｌｉｐｔｉｎ）（ＬＡＦ２３７）、Ｐ３２／９８、シタグリプチン（ＭＫ−４３１）、Ｐ９３／０１、ＰＴ−１００、サキサグリプチン（ＢＭＳ−４７７１１８）、Ｔ−６６６６、ＴＳ−０２１）、β３アゴニスト（例えばＡＪ−９６７７）、ＧＰＲ４０アゴニスト、グルカゴン様ポリペプチド（Ｉ）（ｇｌｐ Ｉ）（ｇｌｐ２）、または他の糖尿病誘発性ペプチドホルモン、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト［例えばＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１ＭＲの薬剤、Ｎ，Ｎ−２２１１、ＡＣ−２９９３（エキセンディン−４）、ＢＩＭ−５１０７７、Ａｉｂ（８，３５）ｈＧＬＰ−１（７，３７）ＮＨ２、ＣＪＣ−［１３１］、アミリンアゴニスト（例えばプラムリンチド）、フォスフォチロシンホスファターゼ阻害剤（例えばバナジン酸ナトリウム）、糖新生阻害剤（例えばグリコーゲンフォスフォリラーゼ阻害剤、グルコース−６−ホスファターゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト）、ＳＧＬＵＴ（ナトリウム・グルコースコトランスポーター）阻害剤（例えばＴ−１０９５）、１１β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素阻害剤（例えばＢＶＴ−３４９８）、アディポネクチンまたはそのアゴニスト、ＩＫＫ阻害剤（例えばＡＳ−２８６８）、レプチン抵抗性改善薬、ソマトスタチン受容体アゴニスト（国際公開第０１／２５２２８号、国際公開第０３／４２２０４号、国際公開第９８／４４９２１号、国際公開第９８／４５２８５号、国際公開第９９／２２７３５号等に記載される化合物）、グルコキナーゼ活性化剤（例えばＲｏ−２８−１６７５）、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド）。
上記ポリペプチド、および本開示のポリペプチドを含む併用療法の治療効能が決定され得る１つの方法は、患者のＨｂＡ１ｃレベルの減少による。或る一つの実施形態では、本開示のポリペプチドは、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドで治療を始める前の２か月、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドで治療を始める３か月前にから、またはベースラインからの変化率で、ＨｂＡ１ｃレベルから少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または少なくとも５０％の変化によりＨｂＡ１ｃレベルを低下させる。別の実施形態では、抗糖尿病剤により治療されている患者に投与された本開示のポリペプチドは、抗糖尿病剤が血糖を低下させる能力を調節する。
別の実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、トログリタゾンのインスリン要求を減少させる能力を調節する。本開示のポリペプチドと組み合わせて使用されるトログリタゾンは、本開示の特定の実施形態における２型糖尿病を遅延するか、または予防するために使用され得る。
本開示の或る一つの実施形態では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、スルホニルウレアと同時投与されるか、またはスルホニルウレアによる治療の前もしくはその後に投与される。本開示のいくつかの実施形態では、治療的用量の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドによる治療は、血清グルコースを調節する。別の実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、血糖に対するポリペプチドの効果を調節するＫｌｏｔｈｏベータと共に投与される。別の実施形態では、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド単独の使用よりも多くの血糖を減少させるＫｌｏｔｈｏベータと共に投与される。
ＸＶＩ．本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的使用
本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ：２型）およびインスリン依存型糖尿病（１型）、肥満、不十分なグルコースクリアランス、高血糖、高インスリン血症、およびＦＧＦ−２１によって媒介され得る任意の他の疾患または病状を患う哺乳動物を治療するため使用されてもよい。
プラーダー−ヴィリ症候群（Ｐ．Ｗ．Ｓ．またはＰＷＳ）は、染色体１５（ｑ１１〜１３）上の７個の遺伝子（またはそのいくつかのサブセット）が欠失されるかまたは父方の染色体上で発現されない（染色体１５ｑの部分欠失）、まれな遺伝病である。ＰＷＳの特性は、低い筋緊張、低身長、不完全な性的発達、認識障害、問題行動、ならびに過食および生命を脅かす肥満に結びつく可能性がある慢性の空腹感である。
本開示は、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性、高インスリン血症、グルコース不耐症または高血糖の１または複数を示す哺乳動物を治療する方法であって、本開示の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの治療的有効量を、かかる治療を必要とする上記哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
上記治療方法は、上記哺乳動物において以下の緩和の少なくとも１つ達成するのに十分な可能性がある：体脂肪貯蔵の減少、インスリン抵抗性の減少（高インスリン血症の減少）、耐糖能の増加および高血糖の減少。
また、本開示は、重篤な患者に改変ＦＧＦ−２１の治療的有効量を投与することを含む、無感染性の病理学的な原因と同様に、敗血症、膵炎、虚血、多発外傷および組織傷害、出血性ショック、免疫媒介臓器傷害、呼吸困難、ショック、腎不全、および多臓器機能不全症候群（ＭＯＤＳ）等の感染性の傷害と関連する全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を患う重篤な患者の死亡率および罹患率を引き下げる方法を包含する。
或る一つの実施形態では、本開示は、インスリン抵抗性、インスリン分泌障害または高血糖等の損なわれたグルコース代謝を治療するための別の薬剤と組み合わせて本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを用いる、組成物および方法を提供する。かかる他の薬剤として、例えば、スルホニルウレア、ＰＰＡＲ−ガンマアゴニスト、ＧＰＬ−１受容体アゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、アミリン類縁体、ビグアニド、ドーパミンＤ２−受容体アゴニスト、メグリチニド、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、抗脂質異常症胆汁酸金属イオン封鎖剤、インスリン、サイトカイン療法、遺伝子療法および抗体療法の１または複数が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示した改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、別の治療の投与により、例えば、メトホルミン、ピオグリタゾン、スルホニルウレア、グリニド、ピオグリタゾン等の経口チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、エキセナチド等のグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニスト、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、アログリプチンリナグリプチンまたはテネリグリプチン等のＤＰＰ４阻害剤、またはメトホルミンとピオグリタゾン、メトホルミンとスルホニルウレア、メトホルミンとグリニド、メトホルミンとＴＺＤ、メトホルミンとピオグリタゾン、メトホルミンとＧＬＰ−１受容体アゴニスト、メトホルミンとエキセナチド、シタグリプチンとメトホルミン、シタグリプチンとシンバスタチン、ビルダグリプチンとメトホルミン、サキサグリプチンとメトホルミン、アログリプチンとピオグリタゾン、もしくはリナグリプチンとメトホルミン等の併用療法、またはダパグリフロジン、カナグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジンもしくはトホグリフロジン等のＳＧＬＴ２阻害剤による治療で正常血糖を達成しない患者に投与されてもよい。
ある実施形態では、本明細書に開示されｒｙ改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、肥満（例えば、少なくとも２５の肥満指数）の予防または治療のために投与されてもよい。上記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、オルリスタット、リモナバン、シブトラミン、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ、食欲を減退させる３６アミノ酸ペプチド）、ＰＹＹ類縁体、ＣＢ−１アンタゴニスト、リモナバン、レプチン、レプチン類縁体、またはフェンテルミン等の抗肥満剤と組み合わせて投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、プラーダー−ヴィリ症候群の予防または治療のために投与されてもよい。
本明細書に記載さる実施例および実施形態は、説明の目的に過ぎず、その観点からの様々な修飾または変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨および権限、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解される。また、本明細書に使用される用語は、例示的な実施形態を説明する目的に過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される、本開示の範囲を限定することを意図するものではないことが理解される。本出願で引用される全ての出版物、特許、特許出願、および／または他の文書は、あたかも、個々の出版、特許、特許出願、および／または他の文書が全ての目的に対して参照により援用されることが個別に示される程度まで、全ての目的に対し、それらの全体において参照により援用される。
以下の実施例は、説明のため提示されるが、請求項に記載の発明を限定するものではない。
実施例１
Ｅ．コリにおけるＦＧＦ−２１の発現および精製
Ｔ７プロモータの制御下に未改変または改変されたＦＧＦ−２１発現コンストラクトを含むプラスミドを、Ｔ７ポリメラーゼ発現がアラビノース誘導性プロモータの制御下にある、Ｅ．コリのＷ３１１０ Ｂ２菌株等のＥ．コリ株に形質転換する。終夜細菌培養を、２×ＹＴ培養培地を含む振盪フラスコへ１：１００に希釈して、約０．８のＯＤ６００まで３７℃で生育させることができる。タンパク質発現を、４ｍＭの終末濃度までアラビノース（０．２％、最終）およびパラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）を付加することで引き起こしてもよい。培養を、例えば３７℃で４時間の好適な持続時間および温度でインキュベートしてもよい。細胞をペレット化し、Ｂ−ＰＥＲ溶解バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌ／ＯＤ／ｍｌ＋１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ中で再懸濁して、３７℃３０分間でインキュベートすることができる。細胞形質成分を遠心分離によって除去することができ、上清を除去することができる。ペレットを、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ローディングバッファーの中で再懸濁することができる。試料を、ＭＥＳおよびＤＴＴを含む４％〜１２％のＰＡＧＥゲルにロードすることができる。ＦＧＦ−２１の精製に対する方法は、当業者に知られており、精製を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット解析、エレクトロスプレー−イオン化イオントラップ質量分析等によって確認することができる。
細胞ペーストを、４℃の封入体（ＩＢ）バッファーＩ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；４℃）中で最終１０％固体まで混合することによって再懸濁する。合計２回、マイクロフルダイザーに再懸濁された材料マイクロフルダイザーに通すことによって細胞を溶解した後、遠心分離し（１０，０００ｇ；１５分間；４℃）、上清をデカントする。ＩＢペレットを、ＩＢバッファーＩ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；４℃）の追加の容量中で再懸濁することにより洗浄し、再懸濁した材料を、マイクロフルダイザーを合計２回通過させた後、遠心分離を行って（１０，０００ｇ；１５分間；４℃）、上清をデカントする。ＩＢペレットを、バッファーＩＩ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４℃）１容量中に再懸濁した後、遠心分離を行い（１０，０００ｇ；１５分間； ４℃）、上清をデカントする。その後、ＩＢペレットをバッファーＩＩ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４℃）１／２容量に再懸濁する。ＩＢを適切な容器に等分した後、遠心分離を行い（１０，０００ｇ；１５分間；４℃）、上清をデカントする。封入小体を可溶化する（この時点で使用しなければ、更なる使用まで−８０℃で貯蔵することができる）。
可溶化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；８Ｍ尿素；１０ｍＭ ｓ−ＭＥ）中に終末濃度１０ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬまで封入小体を可溶化し、可溶化ＩＢを１時間に亘って混合しながら、室温でインキュベートする。不溶性材料を濾過（０．４５μｍ ＰＥＳフィルタ）によって除去し、タンパク質濃度を追加の可溶化バッファー（タンパク質濃度が高い場合）による稀釈によって調整する（必ずしも必要とは限らない）。
リフォールディングは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；４℃において、０．５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度までの稀釈によって果たすことができる。リフォールドのため、４℃で１８時間〜２４時間置いた。
精製のために、濾過したリフォールド反応を０．４５μＭ ＰＥＳフィルタを通すことができる。バッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中で平衡化されたＱ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に対してロードされた材料。１００％バッファーＢ（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５；２５０ｍＭ ＮａＣｌ）まで２０ＣＶに対する直線濃度勾配による未改変または改変されたＦＧＦ−２１の溶離。モノマーＦＧＦ−２１は、それによりプールされた溶出画分から生成され得る。Ｑ ＨＰプールを採取し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、２Ｍ尿素；１ｍＭ ＥＤＴＡにバッファーを交換する。ｐＨを５０％の氷酢酸で４．０まで落とす。試料を４．０±１．０ｍｇ／ｍＬまで濃縮する。試料に１２：１モル過剰量のＰＥＧおよび最終濃度１％の酢酸ヒドラジド、ｐＨ ４．０を添加する。試料を、２８℃で４８時間〜７２時間インキュベートする。その後、ＰＥＧ反応に対して、最終５０ｍＭのＴｒｉｓベースを添加し、ＲＯ水で１０倍希釈する。伝導性は１ｍＳ／ｃｍ未満、およびｐＨ８．０〜９．０と確認された。材料を、バッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）中で平衡化されたＳｏｕｒｃｅ３０Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に対してロードする。ＰＥＧ−ＦＧＦ−２１は、１００％Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ）までの２０ＣＶに対する直線濃度勾配によって溶出される。ＰＥＧ−ＦＧＦ−２１をプールし、バッファーを２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌに交換する。ＰＥＧ材料を、１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、０．２２μｍ ＰＥＳフィルタを使用して濾過滅菌する。材料を４℃で貯蔵する。長期保管には、急速冷凍して、−８０℃で貯蔵する。
実施例２
天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの生産方法
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む、導入された翻訳系は、天然にコードされていないアミノ酸を含む改変ＦＧＦ−２１を発現するために使用することができる。Ｏ−ＲＳは、天然にコードされていないアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。順番に、翻訳系はコードされたセレクタコドンに応じて、ＦＧＦ−２１に天然にコードされていないアミノ酸を挿入する。好適なＯ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡ配列は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される、「アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの組成物およびその使用」と題される国際公開第２００６／０６８８０２号（Ｅ９；配列番号１５）、および「ｔＲＮＡの組成物およびその使用」と題される国際公開第２００７／０２１２９７号（Ｆ１３；配列番号１６）に記載される。例示的な、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡ配列は、下記表２に含まれる。
Figure 0006702962
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改変ＦＧＦ−２１遺伝子および直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対（所望の天然にコードされていないアミノ酸に特異的）を含むプラスミドによるＥ．コリの形質転換は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドへの天然にコードされていないアミノ酸の部位特異的な組み込みを可能とする。
野生型の成熟したＦＧＦ−２１を、標準的なプロトコルを使用して、例えば、健康なヒト肝臓ｐｏｌｙＡ＋ ｍＲＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）に由来する、標準的なプロトコルを使用してｃＤＮＡ合成反応からのＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ３０等ベクターへとクローニングすることができる（例えば、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位を利用して）。任意に配列確認の後、ＦＧＦ−２１（Ｎ末端ＨＨＨＨＨＨＳＧＧ配列等の精製タグ含んでもよい）はサブクローニングされ得る。例えば、Ｅ．コリＧｌｎＲＳプロモータの制御下で直交チロシル−ｔＲＮＡ−合成酵素（ＭｊＴｙｒＲＳ）と同様に（ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ）、ＦＧＦ−２１を、例えば、Ｅ．コリリポタンパク質プロモーター配列（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｇｅｎｅ，１９８６）に由来する合成プロモータの恒常的な制御下で、メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍｊ ｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡ）由来のアンバーサプレッサーチロシルｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡを含み、好適なプロモータに連結される、抑制ベクターへサブクローニングすることができる。未改変または改変されたＦＧＦ−２１の発現は、Ｔ７プロモータの制御下であってもよい。アンバー変異は、標準的ｑｕｉｃｋ ｃｈａｎｇｅ突然変異誘発プロトコル（カリフォルニア州ラ・ホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して導入され得る。コンストラクトは確認された配列であってもよい。
２つの別個の天然にコードされていないアミノ酸が、核酸内の２つの別個の部位でセレクタコドンを導入することにより、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドへ導入されてもよい。
パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）による抑制
（同じもしくは異なるプラスミド中で、または安定して株へとトランスフェクトされてもよい）改変ＦＧＦ−２１発現コンストラクトと、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳ発現コンストラクトとを含むプラスミドを、Ｔ７ポリメラーゼの発現がアラビノース誘導性プロモータの制御下にある、Ｅ．コリのＷ３１１０ Ｂ２株に形質転換することができる。終夜細菌培養を、２×ＹＴ培養培地を含む振盪フラスコに１：１００で希釈し、約０．８のＯＤ６００まで３７℃で生育させることができる。タンパク質発現は、４ｍＭの最終濃度までのアラビノース（０．２％最終）およびパラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）の添加によって誘導され得る。培養物を、例えば３７℃で４時間の間、好適な持続時間および温度でインキュベートしてもよい。細胞をペレット化して、Ｂ−ＰＥＲ溶解バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌ／ＯＤ／ｍｌ＋１０μｇ／ｍｌ ＤＮアーゼ中で再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートすることができる。細胞形質成分を、遠心分離によって除去することができ、上清を除去することができる。ペレットを、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ローディングバッファー中で再懸濁する。試料を、ＭＥＳおよびＤＴＴを含む４％〜１２％ＰＡＧＥゲルにロードすることができる。ＦＧＦ−２１の精製方法は、当業者に知られており、精製をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット解析、エレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析等によって確認することができる。
Ｈｉｓタグ付き、またはＨｉｓタグのない突然変異体ＦＧＦ−２１タンパク質は、当業者に知られている方法を使用して精製され得る。例えば、ＰｒｏＢｏｎｄニッケル−キレート樹脂（カリフォルニア州カールスバードのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、製造業者によって提供される標準のＨｉｓタグ付タンパク質精製手順を用いて使用されてもよい。
実施例３
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドへのカルボニル含有アミノ酸の導入、およびアミノオキシ含有ＰＥＧとのその後の反応
以下の例示的な方法は、半減期延長部分に連結された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの生成に使用され得る。上記方法は、後に、およそ３０，０００Ｄａの分子量を有するアミノオキシ含有ＰＥＧ等の半減期延長部分と反応する、ケトンを含有する天然にコードされていないアミノ酸を組み込む。ＦＧＦ−２１の選択された残基は、以下の構造を有する天然にコードされていないアミノ酸と置換され得る。
Figure 0006702962
ＦＧＦ−２１へのｐ−アセチル−フェニルアラニン部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号１（ＦＧＦ−２１）、配列番号１６もしくは配列番号１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ヤンナスキイ）、配列番号１５、配列番号２９、配列番号３０もしくは配列番号３１（ＴｙｒＲＳ ＬＷ１、５または６）、または本明細書に記載される任意の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドであってもよい
一旦改変されると、以下の形態のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体とカルボニル含有アミノ酸を含むＦＧＦ−２１ポリペプチドとを反応させる：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
式中、Ｒはメチルあり、ｎは３であり、Ｎは選択された分子量、例えばおよそ３０，０００Ｄａである。
代替的には、ケトンを含有する天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造を有するＰＥＧ試薬に連結され（ｌｉｋｅｄ ｔｏ）得る：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝４、Ｎは選択された分子量、例えばおよそ３０，０００Ｄａである。
２５ｍＭ ＭＥＳ（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ｐＨ４．５に１０ｍｇ／ｍＬで溶解された、精製されたｐ−フェニルアラニン含有改変ＦＧＦ−２１を、アミノオキシ含有ＰＥＧの１０倍〜１００倍の過剰量と反応させた後、室温で１０時間〜１６時間に亘り撹拌する（Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９，８１，ｐｐ４７５）。その後、ＰＥＧ−ＦＧＦ−２１を、即時精製および分析のための適切なバッファーへ希釈する。
実施例４
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの生成
図１Ａ〜図１Ｂに示される各改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成した。ポリヌクレオチド配列におけるＤＮＡコドン使用頻度は、当該技術分野で既知の標準的な方法を使用して、Ｅ．コリ発現に対して最適化された。（配列番号３１７および配列番号３１８は、それぞれ化合物２およびＰＥＧ化化合物２をコードする例示的なポリヌクレオチド配列である）。コネクタペプチド（ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）が存在する場合、その暗号配列は、例えばグリシンに対してＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡまたはＧＧＧ、セリンに対してＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵまたはＡＧＣ、ヒスチジンに対してＣＡＵまたはＣＡＣ等の標準的な遺伝暗号に基づいて選択される。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドはＥ．コリにおいて発現され精製された（例示的な方法は本明細書に記載される）。天然にコードされていないアミノ酸であるパラ−アセチル−フェニルアラニンを含有する改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド（ｐＡＣＦまたはｐＡＦと略記する）を生成した（例示的な方法は、実施例２において提供される）。簡潔には、コードしているポリヌクレオチドは、ｐＡＣＦをコードするため、ポリヌクレオチド配列の対応する位置でセレクタコドンを組み込むように更に改変され、セレクタコドンが選択された位置にｐＡＣＦの介在物を管理するように、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を発現するために操作された細胞において発現された。その後、ｐＡＣＦを、約３０ｋＤａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）に連結した（例示的な方法は実施例３において提供される）。
化合物２コード配列（配列番号３１７）
Figure 0006702962
 ＰＥＧ化化合物２コード配列（配列番号３１８）
Figure 0006702962
続く実施例において詳述されるように、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物活性、安定性、脱アミド化および凝集体生成の傾向、ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解に対する抵抗性、免疫原性、薬物動態学、並び糖尿病モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性に関する試験を含む、特性評価を行った。
生成された改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの全ポリペプチド配列（それらの部分列は図１Ａ〜図１Ｂにおいて示される）は以下のとおりである。
化合物１
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS（配列番号１０１）
化合物２
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１０２）
化合物３
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１０３）
化合物４
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGKKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１０４）
化合物５
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１０５）
化合物６
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１０６）
化合物７
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１０７）
化合物８
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１０８）
化合物９
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGQKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１０９）
化合物１０
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１１０）
化合物１１
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１１１）
化合物１２
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPHHSGRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１１２）
化合物１３
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGKDSQDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１１３）
化合物１４
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS（配列番号１１４）
化合物１５
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGREPSYAS（配列番号１１５）
化合物１６
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVPSQGRSPSYAS（配列番号１１６）
化合物１７
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGSQGRSPSYAS（配列番号１１７）
化合物１８
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEP（配列番号１１８）
化合物１９
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１１９）
化合物２０
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGGHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１２０）
化合物２１
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１２１）
化合物２２
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLSGGPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１２２）
化合物２３
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGGGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１２３）
化合物２４
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGGRFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１２４）
化合物２５
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPSGGRFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１２５）
化合物２６
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHSGGPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１２６）
化合物２７
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHGSGGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１２７）
化合物２８
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPHGGRFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１２８）
化合物２９
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPHSGGRFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１２９）
化合物３０
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPHGSGRFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号１３０）
化合物３１
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVTPSQGRSPSYAS（配列番号１３１）
化合物３２
MHHHHHHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS
ＰＥＧ化化合物１
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS（配列番号２０１）
ＰＥＧ化化合物２
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２０２）
ＰＥＧ化化合物５
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPGDKSRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２０５）
ＰＥＧ化化合物６
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２０６）
ＰＥＧ化化合物１０
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLGSGGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２１０）
ＰＥＧ化化合物１１
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLGSGHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２１１）
ＰＥＧ化化合物１２
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPHHSGRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２１２）
ＰＥＧ化化合物１９
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLGSGPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２１９）
ＰＥＧ化化合物２０
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLGGHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２２０）
ＰＥＧ化化合物２１
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLGSGRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２２１）
ＰＥＧ化化合物２２
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLSGGPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２２２）
ＰＥＧ化化合物２３
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLGGGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号２２３）
追加の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは融合蛋白質として生成された。改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのうちのいくつかは、Ｆｃドメインもしくはそのフラグメント、ＰＫＥアドネクチン（「ＰＫＥ」）、または改変もしくは未改変のヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）配列、および任意に、連結ペプチド等の１または複数の融合パートナーに融合されたＮ末端メチオニンを含む、またはそれを含まない化合物２（配列番号１０２）の配列を含んだ。他の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドは、（Ｎ末端メチオニンを含む、またはそれを含まない）化合物１の野生型の配列に基づいた。異なるＰＫＥアドネクチン配列の形態が含まれた。これらは、「ＰＫＥ（１）」または「ＰＫＥＩ」、および「ＰＫＥ（２）」またはＰＫＥＩＩと呼ばれる。
ＰＫＥ（１）のアミノ酸配列は、ＧＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＨＳＹＹＥＱＮＳＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＹＳＱＴＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＹＧＳＫＹＹＹＰＩＳＩＮＹＲＴＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号 ３１９）であった。
ＰＫＥ（２）のアミノ酸配列は、ＧＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＲＥＶＱＫＹＳＤＬＧＰＬＹＩＹＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＳＧＥＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＰ（配列番号３２０）であった。
ＰＫＥ（１）またはＰＫＥ（２）が融合タンパク質のＮ末端に含まれる場合、Ｅ．コリにおいて発現された配列は、Ｅ．コリにおいて発現された場合、ｍｅｔ−エキソペプチダーゼによって切断されると予想される、Ｎ末端メチオニンを含み、Ｎ末端メチオニンを有しない成熟した配列をもたらし、Ｎ末端メチオニンのないＰＫＥ融合タンパク質の予想される成熟形態は、下記一覧に示される。
融合タンパク質のいくつかに含有されるヒト血清アルブミン配列は、ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）であった。そのアミノ酸配列は以下の通りである：
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALG（配列番号３２１）。
融合タンパク質のいくつかに含まれていた別のヒト血清アルブミン配列は、ＨＳＡ（Ｃ３４Ａ、ｄｅｓ Ｌｅｕ−５８５）であった。
そのアミノ酸配列は以下の通りである：
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALG（配列番号３２２）
Ｇ４Ｓ×３は、３回繰り返された配列ＧＧＧＧＳ、すなわち、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを指す。
例示的な融合蛋白質は、２以上の改変ＦＧＦ−２１ポリペプチド（例えば化合物１４１〜化合物１４６）を含んだ。
融合タンパク質化合物の配列は以下に示され、これらの融合タンパク質の特徴は図４０Ａ〜図４０Ｃに要約される。
化合物１０１：ＰＫＥ（２）−Ｌ１−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号：４０１）
化合物１０２：ＰＫＥ（２）−Ｌ２−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号：４０２）
化合物１０３：ＰＫＥ（２）−Ｌ３−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPEEEEDEEEEDHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４０３）
化合物１０４：ＰＫＥ（２）−Ｌ４−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４０４）
化合物１０５：ＰＫＥ（２）−Ｌ５−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPGSHHHHHHHHGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４０５）
化合物１０６：ＰＫＥ（２）−Ｌ６−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４０６）
化合物１０７：ＰＫＥ（２）−Ｌ７−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１０８：ＰＫＥ（２）−Ｌ８−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１０９：ＰＫＥ（２）−Ｌ９−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSTPPTPSPSTPPTPSPSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４０９）
化合物１１０：ＰＫＥ（２）−Ｌ１０−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４１０）
化合物１１１：ＰＫＥ（２）−Ｌ１１−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４１１）
化合物１１２：ＰＫＥ（２）−Ｌ１２−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１１３：ＰＫＥ（２）−Ｌ１３−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１１４：ＰＫＥ（２）−Ｌ１４−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１１５：ＰＫＥ（２）−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１１６：ＰＫＥ（２）−Ｌ１６−ＦＧＦ２１（２を合成する）
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化合物１１７：ＰＫＥ（２）−Ｌ１７−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１１８：ＰＫＥ（２）−Ｌ１８−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１１９：ＰＫＥ（２）−Ｌ１９−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１２０：ＰＫＥ（２）−Ｌ２０−ＦＧＦ２１（２を合成する）
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化合物１２１：ＰＫＥ（２）−Ｌ２１−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１２２：ＰＫＥ（２）−Ｌ２２−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１２３：ＰＫＥ（２）−Ｌ２３−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１２４：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｌ２０１−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１２５：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｌ２０２−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１２６：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｌ２０３−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１２７：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｌ２０４−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１２８：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｌ２０５−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１２９：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｌ２０６−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１３０：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｌ２０７−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１３１：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｌ２０８−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１３２：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｌ２０９−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１３３：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ、ｄｅｓ Ｌｅｕ−５８５）−Ｌ２１１−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１３４：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ、ｄｅｓ Ｌｅｕ−５８５）−Ｌ２０７−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１３５：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ、ｄｅｓ Ｌｅｕ−５８５）−Ｌ２１１−ＦＧＦ２１（化合物１）
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS（配列番号４３６）
化合物１３６：ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ、ｄｅｓ Ｌｅｕ−５８５）−Ｌ２０７−ＦＧＦ２１（化合物１）
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化合物１３７：ＦＧＦ２１（化合物２）−Ｌ２０５−ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−
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化合物１３８：ＦＧＦ２１（化合物２）−Ｌ２０９−ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−
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化合物１３９：ＦＧＦ２１（化合物２）−Ｌ２１０−ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−
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化合物１４０：ＦＧＦ２１（化合物１）−Ｌ２０９−ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−
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化合物１４１：ＦＧＦ２１（化合物２）−Ｌ２０９−ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｇ４Ｓｘ３−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１４２：ＦＧＦ２１（化合物１）−Ｌ２０９−ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｇ４Ｓｘ３−ＦＧＦ２１（化合物１）
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化合物１４３：ＦＧＦ２１（化合物２）−Ｌ２０９−ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ、ｄｅｓ Ｌｅｕ−５８５）−Ｇ４Ｓｘ３−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１４４：ＦＧＦ２１（化合物１）−Ｌ２０９−ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ、 ｄｅｓ Ｌｅｕ−５８５）−Ｇ４Ｓｘ３−ＦＧＦ２１（化合物１）
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化合物１４５：ＦＧＦ２１（化合物２）−Ｌ２１０−ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｇ４Ｓｘ３−ＦＧＦ２１（化合物２）
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYASGETGSSGEGTGSTGSGAGESGTGESGEGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYAS（配列番号４５０）
化合物１４６：ＦＧＦ２１（化合物１）−Ｌ２１０−ＨｕＳＡ（Ｃ３４Ａ）−Ｇ４Ｓｘ３−ＦＧＦ２１（化合物１）
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYASGETGSSGEGTGSTGSGAGESGTGESGEGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS（配列番号４５１）
化合物１４７：ＰＫＥ（１）−Ｌ１−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１４８：ＰＫＥ（１）−Ｌ２−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１４９：ＰＫＥ（１）−Ｌ３−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１５０：ＰＫＥ（１）−Ｌ４−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１５１：ＰＫＥ（１）−Ｌ５−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１５２：ＰＫＥ（１）−Ｌ６−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１５３：ＰＫＥ（１）−Ｌ７−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１５４：ＰＫＥ（１）−Ｌ８−ＦＧＦ２１（化合物２）
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化合物１５５：ＰＫＥ（１）−Ｌ９−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSTPPTPSPSTPPTPSPSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４６０）
化合物１５６：ＰＫＥ（１）−Ｌ１０−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４６１）
化合物１５７：ＰＫＥ（１）−Ｌ１１−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４６２）
化合物１５８：ＰＫＥ（１）−Ｌ１２−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４６３）
化合物１５９：ＰＫＥ（１）−Ｌ１３−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSTPPTPSPSTPPTPSPSPSTPPTPSPSTPPTPSPSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４６４）
化合物１６０：ＰＫＥ（１）−Ｌ１４−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４６５）
化合物１６１：ＰＫＥ（１）−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４６６）
化合物１６２：ＰＫＥ（１）−Ｌ１６−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４６７）
化合物１６３：ＰＫＥ（１）−Ｌ１７−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４６８）
化合物１６４：ＰＫＥ（１）−Ｌ１８−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPGGGSPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４６９）
化合物１６５：ＰＫＥ（１）−Ｌ１９−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPEEEDPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４７０）
化合物１６６：ＰＫＥ（１）−Ｌ２０−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPPTPEPEEEDPSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４７１）
化合物１６７：ＰＫＥ（１）−Ｌ２１−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPTPEPPSPEPPTPEPEEEDPSPEPPTPEPPSPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４７２）
化合物１６８：ＰＫＥ（１）−Ｌ２２−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPTPEPPSPEPPTPEPGGGGSPSPEPPTPEPPSPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４７３）
化合物１６９：ＰＫＥ（１）−Ｌ２３−ＦＧＦ２１（化合物２）
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPTPEPSPEPPTPEPSPEPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号：４７４）
化合物１７０［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１）−Ｌ７−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGSGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４７５）
化合物１７１［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１）−Ｌ２５０−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGSGGGGGSGGGSGGGGSGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４７６）
化合物１７２［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１）−Ｌ１２−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４７７）
化合物１７３［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１）−Ｌ２５１−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPSPEPPTPEPPSPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４７８）
化合物１７４［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１）−Ｌ５−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSHHHHHHHHGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４７９）
化合物１７５［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１）−Ｌ２５２−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKELQLEESAAEAQEGELEHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４８０）
化合物１７６［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９０）−Ｌ２５３−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSSGGGGSGGGSGGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４８１）
化合物１７７［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１）−Ｌ６−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４８２）
化合物１７８［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１８９）−Ｌ６−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４８３）
化合物１７９［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１）−Ｌ７−ＦＧＦ２１−１ａａ］（Ｃ末端アミノ酸が欠失したＣｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGSGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYA（配列番号４８４）
化合物１８０［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１）−Ｌ７−ＦＧＦ２１−３ａａ］（３個のＣ末端アミノ酸が欠失したＣｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGSGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPS（配列番号４８５）
化合物１８１［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ｆ＿１．１＿１８６）−Ｌ７−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGSGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４８６）
化合物１８２［Ｆｃ（ｈＩｇＧ１ａ＿１９１ｂ）−Ｌ７−ＦＧＦ２１］（Ｃｍｐ．２）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGSGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS（配列番号４８７）
実施例５
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦＧＦ−２１欠失分子の効能
この実施例では、いくつかの改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの効能を試験し、細胞に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏでの受容体活性化アッセイにおけるＰＥＧ化化合物１の効能と比較する。ＰＥＧ化化合物２を含むいくつかの改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、ＰＥＧ化化合物１に匹敵する効能を有していることが示される。
方法
安定してヒトβ−ｋｌｏｔｈｏを発現するクローンヒト胎児性腎（ＨＥＫ）２９３細胞株を作製し、予備のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＦＧＦ２１変異体を特性評価した。製造業者のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬に関するプロトコルに従い、サイトメガロウィルスプロモーターの制御下のＣ末端ＦＬＡＧタグ（１文字アミノ酸コードでＮ−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−Ｃ）を有するヒトβ−ｋｌｏｔｈｏをコードする直線化されたプラスミドを使用してＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクトした。陽性クローンを、選択培地において１４日間の生育の後に単離した。［Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む４．５ｇ／ｌのＤ−グルコースを有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の６００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］。
予備のアッセイは、安定してヒトβ−ｋｌｏｔｈｏを発現するクローンのＨＥＫ−２９３細胞株において、細胞外のシグナル制御キナーゼ１／２（ｐＥＲＫ１／２）のＦＧＦ２１変異体依存性リン酸化を測定した。アッセイに対して、細胞を９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に２００μＬの選択培地中１ウェル当たり４０，０００個の細胞で接種し、加湿された５％ＣＯ２雰囲気において３７℃で維持した。４８時間の後、全ての選択培地を無血清培地（ウシ血清アルブミン不含の４．５ｇ／ｌＤ−グルコースおよび０．１％脂肪酸を含むＤＭＥＭ）と取り替え、細胞を加湿した５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で６時間維持した。試験される化合物を、無血清培地で連続的に希釈した。アッセイは、細胞上の無血清培地を希釈された化合物で置き換えることにより開始され、インキュベーションを室温で７分間行い、上記反応は、化合物を取り除き、各ウェルに１００μＬの溶解バッファー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎキット）添加することによって終了された。プレートを、室温でおよそ１０分間に亘って約８０ｒｐｍで振蕩し、−８０℃で凍結保存した。３４８ウェル白色プロキシプレートを使用し、Ｓｕｒｅｆｉｒｅ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ｐＥＲＫ１／２キット、およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ＩｇＧ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット、プロテインＡ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に関する製造業者のプロトコルに従って、解凍された細胞溶解物の各ウェル由来の部分標本（４μｌ）をｐＥＲＫ１／２について分析した。プレートを室温にて暗やみで２時間インキュベートした後、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプロトコルを使用して、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０３マルチプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄプリズム５ソフトウェアを使用して、非線形回帰によって４つのパラメーターｌｏｇ（アゴニスト）対レスポンス方程式にデータを適合した。
結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの効能は、内因性に発現されたＦＧＦＲスプライス変異体とのコレセプターとして機能するようにβ−Ｋｌｏｔｈｏをヒトに安定して導入されたヒト胎児性腎（ＨＥＫ）２９３細胞株において細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）１／２のＦＧＦ２１依存性リン酸化を測定することにより決定された。効能は、平均ＥＣ５０または各試験済みの化合物に対するｐＥＣ５０値（１リットル当たりのモル単位で発現されたＥＣ５０濃度の負の常用対数）の決定により評価された。例示的な用量反応曲線は、ＰＥＧ化化合物１およびＰＥＧ化化合物２について図２に示される。追加の試験済みの化合物に関する結果は表４および５に示される。
Figure 0006702962
Figure 0006702962
実施例６
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの熱安定性試験
この実施例では、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの熱安定性を熱走査蛍光発光（ＴＳＦ）および示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を使用して測定した。熱安定性は、凝集塊を形成する傾向の決定に対する予測値を有すると文献において認められる。（例えばＷｅｂｓｔｅｒ，“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３７，Ｉｓｓｕｅ １１，ｐｐ．４２−４８，（Ｎｏｖ ２，２０１３）を参照されたい）。
方法
変性の熱の中点は、ＭｉｃｒｏＣａｌ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）自動ＶＰ−ＤＳＣにおいて示差走査熱量測定法によって測定された。ＤＳＣ分析については、毎時９０℃の走査速度によりおよそ２ｍｇ／ｍＬでタンパク質試料を２５０ｍＭショ糖、２０ｍｍヒスチジンｐＨ７．０中で製剤化した。参照セルを、タンパク質なしの同一のバッファーで満たした。適用された溶液条件および走査速度もと、フォールドされたタンパク質ドメインと、熱によりアンフォールディングされたタンパク質ドメインとの間の相変化の遷移中点（Ｔｍ）は、サーモグラムトレース（矢印）で見られたピーク最大値から決定された。
熱走査蛍光発光（ＴＳＦ）については、タンパク質は目的のバッファーに０．２ｍｇ／ｍＬまで希釈され、小量の蛍光性の蛍光体であるアニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）が添加される。試料を９６ウェル薄壁プレートに入れ、試料の蛍光がＢｉｏ−Ｒａｄ ＣＴ１０００−ＲＴ ＰＣＲ機器上でモニターされている間、外部の蛍光体の存在下でタンパク質試料の温度を増加する。タンパク質のタンパク質熱アンフォールディングの中点は、それが熱によりタンパク質を変性させる新しく露出された疎水性コアと相互作用するにつれて、プローブの蛍光シグナルの増加をモニターすることによって決定される。検討されたバッファーおよび走査速度の条件の下でアンフォールディングの中点（Ｔｍ）での温度は、蛍光シグナル増加曲線の温度変曲点として定義された。
結果
代表的なＤＳＣ走査結果を図３に示す。ＰＥＧ化化合物２は、ＰＥＧ化化合物１よりもおよそ８℃高い遷移中点（「Ｔｍ」）温度を有することが観察された。熱可逆性は９５％超（データは示されていない）だった。
図４は、ＴＳＦに関する代表的な結果を示す。化合物１０は、化合物１（Ｅ．コリでの発現のためＮ末端メチオニンが含まれることを除き、野生型ＦＧＦ−２１配列を有する）に関して全量のおよそ８℃のＴｍの増加を示した。追加の化合物に対する結果を表６に示す。
これらの結果は共に、例示的な化合物、例えば化合物２、化合物１０および１化合物６が、凝集塊を形成する傾向の減少を有すると合理的に予想されるだろうということを示す。凝集塊を形成する傾向の減少は、より長い保存期間および／またはより高い濃度に製剤化される能力を与えると予想される。
Figure 0006702962
実施例７
脱アミド化および凝集体形成
この実施例は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの（ｆｏｒ ｏｆ）脱アミド化および凝集体形成に関する評価を記載する。
方法
熱応力試験：
目的のタンパク質試料を、７．５ｍｇタンパク質／ｍＬの濃度で試験バッファー（２５０ｍＭショ糖、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．５およびｐＨ７、または２０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５）において作製する。試料を分析型サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）、および時間＝０において画像化毛管等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）によりチャージバリアント分析により検査した。その後、２５℃で１週間、その後４０℃で５週間、インキュベーターにタンパク質試料を入れることによって応力を試験した。４週間〜５週間に亘って様々な時間点でｉｃＩＥＦおよびａＳＥＣによって引き出され、検査された部分標本を引き出し、モニター安定性に対するａＳＥＣおよびｉｃＩＥＦによって更に検査した。
ａＳＥＣ
サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（米国カリフォルニア州サンタクララのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、３００×４．６ｍｍの寸法のＺｅｎｉｘ−Ｃ ３００ＳＥＣカラム（米国デラウェア州ニューアークのＳｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で実施された。使用される移動相は、０．３５ｍＬ／分の流速の、ｐＨ６．９に調整された２００のｍＭリン酸水素二カリウムおよび１５０のｍＭ塩化ナトリウムであった。およそ２０のμｇ試料が各分析のために注入された。分離は、ＵＶ２８０ｎｍにおいてモニターされた。モノマー対ＨＭＷ種の定量は、各種に対応する保持時間での曲線下面積の積分によって行われた。
ｉｃＩＥＦ
脱アミド化は、フルオロカーボン被覆毛細管、１００μｍ×５０ｍｍを使用して、ｉＣＥ２８０機器（米国カリフォルニア州サンタクララのＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）上で行われる、画像化毛管等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）によって実施される、電荷変異体分析（脱アミド化は、タンパク質の純陰電荷および酸性変異体の形成を増加させる）によって検出された。０．３５％メチルセルロース、４％ｐＨ３−１０ Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ、４Ｍ尿素および２％ｐＩマーカーを含む溶液を使用して、試料を０．３ｍｇ／ｍＬまで希釈した。アノード液およびカソード液は、それぞれ０．０８Ｍリン酸および０．１Ｍ水酸化ナトリウムである。集束は、２分間１．５ｋＶを印加した後、１１分間３．０ｋＶを印加することによって達成された。親種に対する（−）チャージ改変種の定量を対応する曲線下面積の積分によって行った。
結果
ＰＥＧ化化合物２の生物物理学的特性は、ＰＥＧ化化合物１に対して優位であることを実証した。ＰＥＧ化化合物１と比べて４０℃での条件において加速下で観察された低い分解速度と結び付けられる、２℃〜８℃での５週間に亘る分解は観察されなかった（図５）。８週間の加速研究は、ＰＥＧ化化合物２が試験済みの製剤（ヒスチジン／ショ糖ｐＨ７．０）においてＰＥＧ化化合物１より優れていることを示す。これらの賦形剤の条件下で、脱アミド化は停止され、ＰＥＧ化化合物２は可溶性の高分子量（ＨＭＷ）凝集塊を形成する減少した傾向を有する。これらの結果は、ＰＥＧ化化合物２がＰＥＧ化化合物１にと比べて減少した凝集傾向を有する製剤化オプションに対する広いｐＨウインドウを有していることを示唆する。
また、ＨＭＷ凝集体生成を評価した。所与の濃度でのより低いＨＭＷ凝集体生成は、より大きな溶解度を示し、これは、より高い濃度に製剤化される能力をもたらす可能性がある。図６は、いくつかの改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドおよび化合物１に関するＨＭＷ凝集体生成を説明する。大半の試験済みの化合物については、ＰＥＧ化化合物１（例えばＰＥＧ化化合物２およびＰＥＧ化化合物１０）と比べて凝集体生成は減少した。少数の化合物については、ＨＭＷ凝集体生成は類似したか、またはＰＥＧ化化合物１よりも高かった。
また、脱アミド化を評価した。図７は、いくつかの改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドおよびＰＥＧ化化合物１に対する、脱アミド化の検出されたレベルを説明する（酸性変異体の経時的な形成によって示される）。示された全て改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドについて、検出された脱アミド化のレベルはＰＥＧ化化合物１と比較して減少した。
実施例８
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの溶解度評価
この実施例は、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの相対的溶解度の測定を記載する。
結果は、化合物が比較的より高い濃度に製剤化される能力を示し、有効量のより容易な投与を可能とする。
方法
相対的溶解度の評価は、連続するプラグフロー濃度サイクルの後のサイズ排除クロマトグラフィー分析により行われた。類似するが同一でない開始濃度でＰＢＳ ｐＨ７．２中に製剤化された試料を、３ｋＤａ分子量カットオフ遠心分離集中させる装置へピペットで移し、４℃で１０分間、１５分間、および３０分間のサイクルに亘り４，７５０ＲＰＭで遠心した。遠心サイクルの間にアリコートを濃度装置から取り出し、（ＰＢＳ ｐＨ ７．２バッファーで平衡化されたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−７５ １０／３００ ＧＬカラム上で）分析型サイズ排除クロマトグラフィー分析（ａＳＥＣ）を行って溶液中のＨＭＷおよびモノマー種の濃度を決定した。
濃度の合計を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光測光器を用いて２８０ｎｍで吸光度により決定した。高分子量の割合は、ＳＥＣクロマトグラムトレースにおけるモノマーピークに対する高分子量ピークの曲線下面積の計算によって決定された。試験された条件下で最も可溶でないコンストラクトから最も可溶なコンストラクトの順番を可視化するため、得られたデータポイントをプロットし、測定点によって作られる勾配が低くなるほど、試験された条件下においてタンパク質変異体がより安定である。
結果
タンパク質濃度の関数として高分子量（ＨＭＷ）凝集塊の形成を測定することによって、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの相対的な溶解度を決定した。所与の濃度でのより低いＨＭＷ凝集体生成は、より大きな溶解度を示し、より高い濃度へと製剤化される能力をもたらす。
試験済みの化合物に対するプラグフロー溶解度曲線の勾配を、下記表７に示される（より低い値はより少ない凝集体生成を示し、したがってより高い濃度へと製剤化される能力を示す）。いくつかの化合物（例えば、化合物２および化合物１０）に対して比較的低い凝集体生成レベルが観察され、より低い凝集体生成およびより大きな溶解度を示した（図８および表７）。最も高いプラグフロー溶解度勾配が化合物１について観察された。
Figure 0006702962
実施例９
ＦＧＦ−２１欠失分子の免疫原性試験
Ｔ細胞活性化応答研究を行い、大半の化合物に使用されるタンパク質配列が、ＰＥＧ化化合物１に使用されるタンパク質配列に等価な応答を提示したことを示す。
方法
免疫原性を、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖アッセイによって評価した。ヒト血液ドナーの多様なセットに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール勾配を使用して単離した。ドナーは、ヒト集団に存在するＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子における変異性の被覆度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を保証するため分類されたＨＬＡであった。標識化の後、７日間に亘って試験される化合物の存在下、標準的な細胞培養培地中、１ウェル当たり２００，０００個の細胞でカルボキシフルオレスセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を含むＰＢＭＣを９６ウェルフォーマットに蒔いた。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を、抗ＣＤ４抗体および流動細胞計測法による標識化によって分析した。顕著なＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答対培地対照を示すドナーのパーセンテージとして、パーセンテージ抗原性タンパク質が計算される。
結果
ヒトＴ細胞増殖アッセイを利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫原性リスク評価では、４０名のドナーのうち、化合物１（Ｅ．コリでの発現のためＮ末端メチオニンが含まれることを除き、野生型ＦＧＦ−２１配列を有する）からの陽性のシグナルを示した１５名と比較して、４０名のドナーのうち１３名（３２．５％）が、化合物２に対する７日間の曝露の後にＣＤ４＋増殖応答を示した（図９）。この細胞に基づいた実験は、現実世界のヒト免疫性（ｉｍｍｕｎｌｏｇｉｃ）応答の観察を置き換えないものの、この分析は、野生型ＦＧＦ２１と比較された化合物２に対する増加したヒト免疫原性リスクがないことを示唆する。
更に改変されたＦＧＦ−２１ポリペプチドを、化合物１と比較してＣＤ４＋増殖反応測定法において試験した（図９）。免疫原性は、比較的より高い免疫反応を示した、化合物１０を除き、概して対照ＦＧＦ２１配列（化合物１）について観察されたものに類似し、
ヒト患者に投与された場合、上記化合物が不要に免疫原性である可能性を示した。
実施例１０
Ｃ末端インタクト（活性な）改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ安定性
この研究は、Ｃ末端インタクト（すなわち活性な）改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのレベルをｉｎ ｖｉｖｏで評価した。ＰＥＧ化化合物２は、ペグ化化合物１と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ活性のより長い持続期間を含む、Ｃ末端インタクトの活性なポリペプチドの割合の大幅な増加を示した。
方法
ＰＥＧ化化合物２およびＰＥＧ化化合物１の薬物動態学を、それぞれ、皮下（ＳＣ）投薬量０．２５ｍｇ／ｋｇおよび０．２２５ｍｇ／ｋｇに従って、カニクイザルにおいて評価した。投薬後血液サンプル（０．２ｍＬ）を０時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、３時間、７時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間で収集し、生物分析まで−８０℃で保存した。
血清または血漿中の濃度対時間データのノンコンパートメント解析によって、合計およびＣ末端インタクトＰＥＧ化化合物１およびＰＥＧ化化合物２のＰＫパラメーターを得た（Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）、６．３、ミズーリ州セントルイスのＰｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。直線および対数の台形積算の組み合わせを用いて、時点０から無限［ＡＵＣ（ｔｏｔ）］までの曲線下面積を計算した。ＡＵＣおよび半減期（ｔ１／２）の推定を、計量可能な濃度を有する最低３つの時点を使用して作製した。
検証されていない、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）に基づく電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）を使用して、単回用量ＰＫ研究の総ＰＥＧ化化合物１の濃度を測定した。ＰＥＧ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、ＰＥＧ化化合物１を捕捉するために使用した後、総ＰＥＧ化化合物１の検出のためにウサギ抗ＦＧＦ２１ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を使用した。
また、ＰＥＧ化化合物２およびＰＥＧ化化合物１の皮下（ＳＣ）薬物動態学（ＰＫ）を、優性Ｏｂ／Ｏｂマウスにおいて評価した
ＰＥＧ化化合物２を、単一のＳＣ０．１ｍｇ／ｋｇの注射としてマウス（ｎ＝３／時点／経路）に投与した。ＰＥＧ化化合物１を、単一のＳＣ投薬量０．０５ｍｇ／ｋｇとして投与した。薬物投与の後、血液試料を様々な時間点で収集し、本質的にはカニクイザルについて記載されるように処理した。
呼び出しは、捕捉試薬および検出試薬によって結合されたＰＥＧ化化合物１の総量に比例した相対発光量（ＲＬＵ）で表される、電気化学ルミネセンスによるものであった。標準曲線は０．２ｎｇ／ｍＬ〜１５４ｎｇ／ｍＬであった。試験試料を、１／Ｙの重み係数による４つのパラメーターロジスティックスフィット回帰モデルを使用して定量した。
ＺＤＦラットおよびカニクイザルの血清中でのＣ末端インタクトＰＥＧ化化合物１の濃度を測定するため、ＰＥＧ化化合物１のＣ末端に特異的なウサギ抗ＦＧＦ２１ｐＡｂ以外を検出に使用した以外は、同じアッセイを使用した。標準曲線は０．２ｎｇ／ｍＬ〜１５４ｎｇ／ｍＬであった。試験試料を、１／Ｙの重み係数による４つのパラメーターのロジスティックスフィット回帰モデルを使用して定量した。
結果
ＰＥＧ化化合物１は、経時的に大半の化合物がトランケートな不活性の形態になるように、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質分解を経る。ＰＥＧ化化合物１および２のｉｎ ｖｉｖｏのタンパク質分解安定性を、ｏｂ／ｏｂ マウス（図１０）およびカニクイザル（図１１）において直接（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）比較した。これらの結果は、活性なＣ末端インタクト形態のＡＵＣは、ＰＥＧ化化合物１と比較して、欠失を含む改変ＦＧＦ−２１（ＰＥＧ化化合物２）に対して７倍〜８倍増加したことを示し、ＰＥＧ化化合物２がｉｎ ｖｉｖｏで増加したタンパク質分解安定性を有することを示した。
実施例１１
改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの薬物動態研究
この実施例は、マウス、ラットおよびカニクイザルにおいて改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを使用する薬物動態研究の結果を示す（下記表８を参照）。
簡潔には、ＰＥＧ化化合物２のクリアランスは、マウス、ラットおよびサルにおいて低かった（範囲：０．９４ｍＬ／時間／ｋｇ〜２．６ｍＬ／時間／ｋｇ）。約０．０４〜０．０５Ｌ／ｋｇでの分布容積（Ｖｓ）は、血漿量に近似し、また血管外腔への最小の分布を示した。皮下（ＳＣ）バイオアベイラビリティーは、マウス（４０％）およびサル（５８％）において受容できたが、ラット（１６％）において比較的低かった。この低いＳＣバイオアベイラビリティーは、他のＰＥＧ化分子が同様の現象を有することが観察されることから、ラットに特異的な可能性がある（ラットにおける低いＳＣバイオアベイラビリティーマウスに対して、サルおよびヒトにおける良好なバイオアベイラビリティー）。より重要なことには、これらの種（ラットを含む）におけるＰＥＧ化化合物２に対するＳＣバイオアベイラビリティーは、ペグ化化合物１に対して２〜３．４倍高かった。
マウス、ラットおよびサルへのＰＥＧ化化合物２のＳＣ投与の後、ペグ化化合物１に対して、インタクトタンパク質の投与量標準化暴露（ＡＵＣ）における一貫した（７倍〜８倍）増加があった。皮下投与後のインタクトＰＥＧ化化合物２の暴露の増加は、ＰＥＧ化化合物１に対して、３つ全ての種における皮下バイオアベイラビリティーの改善（２倍〜３．４倍）と共に、より低い全身クリアランス（２倍〜５倍）に起因すると考えられる。
また、タンパク質分解フラグメントとインタクトＰＥＧ化化合物２との混合物で構成される、総ＰＥＧ化化合物２を、これらの薬物動態研究で測定した。ＩＶ投与後のマウスおよびラットにおける総ＰＥＧ化化合物２に対するインタクトＰＥＧ化化合物２のＡＵＣ率は１に近く、最小の全身的なタンパク質分解を示した。しかしながら、ＳＣ投与の後、上記比率はこれらの種において０．６〜０．８６であり、ＳＣ部位における一部のタンパク質分解を示した。同様の傾向がサルで認められ、ここでは総ＰＥＧ化化合物２に対するインタクトＰＥＧ化化合物２のＡＵＣ率は、ＩＶと比較してＳＣ投与後に適度により低かった（ＳＣ後０．７ｖｓＩＶ投薬後０．８）。
全体として、ＰＥＧ化化合物２は、バイオアベイラビリティーの増加、クリアランスの減少（ｄｅｓｃｅａｓｅｄ）、およびＡＵＣ（血漿中濃度−時間曲線下面積）の増加を含む、有利なｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物動態学の特性を実証した。
Figure 0006702962
 略語：Ｃｌ：血漿からの薬物の明白な全身クリアランス；Ｖｓｓ：定常状態の分布の見掛体積；ＭＲＴ：平均滞留時間；ＳＣ ＢＡ：皮下バイオアベイラビリティー；ＳＣ ＡＵＣ：皮下の血漿中濃度−時間曲線下面積。
実施例１２
糖尿病のマウスモデルにおける改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの反復投薬ｉｎ ｖｉｖｏ研究
ＰＥＧ化化合物２およびＰＥＧ化化合物１は、２１日間の反復投薬研究において評価された直接比較であった。結果は、両方の化合物が代謝性の症状の改善に有効だったのに対し、特に毎週の投薬の効果を比較する場合、活性なＰＥＧ化化合物２のより長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、より大きな治療効果をもたらしたことを実証する。
方法
雄性ｏｂ／ｏｂマウス（メーン州バーハーバーのＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、研究開始時に８週齢であった。マウスは、体重およびグルコースレベルに基づいて治療群へと無作為化された。全ての群を、１ｍｌ／ｋｇの投薬溶液の皮下（ｓ．ｃ．）投与によって処理した。治療群は以下の通りであった：１）ビヒクル（２５０ｍＭスクロース／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３）週２回（ＢＩＷ）、２）ＰＥＧ化化合物１、０．１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷ、３）ＰＥＧ化化合物２、０．１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷ、４）ＰＥＧ化化合物１、０．３ｍｇ／ｋｇ、週１回（ＱＷ）、または５）ＰＥＧ化化合物２、０．３ｍｇ／ｋｇ ＱＷ。ＢＩＷ群が化合物の毎週の２回目の注射を投与される日には、化合物を毎週１回投与されるのみであったマウスにビヒクルを投与した。給餌状態の２１日間の投与期間を通して、体重、血漿ブドウ糖、トリグリセリド（Ｏｌｙｍｐｕｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＵ６８０）、およびインスリン（ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ Ｉｎｃ．）を決定した。また、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を、Ｏｌｙｍｐｕｓアナライザーにより、研究開始時および終了時に全血において決定した。
結果
０．１５ｍｇ／ｋｇを毎週２回（ＢＩＷ）、および０．３ｍｇ／ｋｇのＱＷの投薬量を使用することにより、ＰＥＧ化化合物１およびＰＥＧ化化合物２の両方を皮下に投与した。２１日目のトラフ値で測定された血漿中濃度は、ＱＷまたはＢＩＷのそれぞれの投与後、総（インタクトおよびタンパク質分解された）ＦＧＦ２１の曝露は、両方の変異体に類似したが、活性なＣ末端インタクトＰＥＧ化化合物２の曝露は、ＰＥＧ化化合物１より１２倍〜２５倍高かったことを示す。
Figure 0006702962
糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）は、このタンパク質内の特定のアミノ酸へのグルコースの非酵素的付加よりｉｎ ｖｉｖｏで生成され、測定されるパーセントＨｂＡ１ｃは、循環赤血球の寿命に亘って統合された平均血糖に相当する。６．５％超のＨｂＡ１ｃ値は、糖尿病の診断基準である。反復投薬研究の２１日目のＨｂＡ１ｃにおけるビヒクル補正変化を図１２に示す。０．１５ｍｇ／ｋｇのいずれかのＦＧＦ２１ポリペプチドは、２１日間の投与語の５％未満の値に対してＨｂＡ１ｃを標準化した。しかしながら、ＰＥＧ化化合物２のみが、０．３ｍｇ／ｋｇのＱＷ投与によるΔＨｂＡ１ｃｖｓビヒクルを統計学的に有意に減少した。活性なＣ末端インタクトタンパク質への機能的な暴露における著しい増加と一致した。これらの結果は、標的トラフ濃度（Ｃトラフ）の維持が、効能に対して十分となり得ることを示す。
また、減少したＨｂＡ１ｃ結果と一致して、血漿グルコースレベルは、研究を通して有意に減少した（ＰＥＧ化化合物２は統計的有意差（ｐ＜０．０５）を達成し、ＰＥＧ化化合物１は有意ではなかった、２日目〜２１日目の全ての群ｐ＜０．０１対ビヒクル、１４日目のＱＷ用量以外）（図１６）。全体として、グルコースＡＵＣ（ビヒクルとのパーセンテージ差）の変化は、一連の研究に亘って全ての治療により有意に減少された（ｐ＜０．００１対ビヒクル）（図１７）。
さらに、血漿トリグリセリドレベルは、ＰＥＧ化化合物１ ＱＷ群についての２日目および１７日目（ｐ＜０．０５）（図１８）と同様に、ＰＥＧ化化合物２群対ビヒクルにおいて、ＢＩＷ群について２日目および４日目（ｐ＜０．０１）、ならびにＱＷ群について２日目、４日目、１０日目および１７日目（ｐ＜０．０１）に、著しく低下した。
ｏｂ／ｏｂマウスにおける２１日間の研究課程を通してビヒクルまたはＰＥＧ化化合物１に対して、ＰＥＧ化化合物２は、パーセント体重増加量を著しく減少した（図１３および図１４）。ＰＥＧ化化合物２の０．３ｍｇ／ｋｇのＱＷ投与が、体重が再びトラフ値で測定された場合、７日目、１４日目および２１日目の効能を減少したことを示し、ここでも標的トラフ値濃度（Ｃトラフ）維持が効能に十分となり得ることを示す。
ＰＥＧ化化合物２の０．１５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷ投与は、ｏｂ／ｏｂマウスにおける２１日間の反復投薬研究全体に亘って血漿インスリンレベルを著しく減少し（図１５）、ＢＩＷ ＰＥＧ化化合物１は、１０日目の後に血漿インスリンを著しく減少することができなかった。ＰＥＧ化化合物２の０．３ｍｇ／ｋｇのＱＷ投与は、インスリンが化合物のトラフ値で測定された場合に、１４日目および２１日目のビヒクル群における値を超える傾向を伴って、明らかな「鋸歯状の」プロファイルを生じた。このパターンは、ＰＥＧ化化合物２が慢性的な投薬を伴う膵臓におけるインスリン含有量を保存し得ることを示唆する。
これらの結果は、０．１５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷ部門においてＰＥＧ化化合物２に対して１７５ｎｇ／ｍｌのトラフ値濃度の維持は、血糖および体重の変化の測定において顕著な改善をもたらしたことを示す（表９）。
ＰＥＧ化化合物１と比べて、ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける活性なＣ末端インタクトＰＥＧ化化合物２に対する曝露の増加は、用量基準での増強されたｉｎ ｖｉｖｏ効能、およびＱＷ投与による延長された作用持続時間を生じ、ＨｂＡ１ｃ、体重増加、および血漿インスリンにおける優れた減少をもたらした。
実施例１３
脂肪症から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）までの進行は、最後には肝線維症をもたらす場合がある。この実施例は、１０８位でグルタミンに対するパラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの置換を含むように改変され、で３０ｋＤａポリ（エチレングリコール）に連結されたヒトＦＧＦ−２１ポリペプチド（ＰＥＧ化化合物１または「ＰＥＧ−化合物１」、配列番号２０１）を含む、ＦＧＦ−２１ポリペプチドの線維症モデルにおける使用を記載する。具体的には、糖尿病を誘導するためＣ５７ＢＬ６を誕生直後ストレプトゾトシンにより処理した後、４週齢において高脂肪食とする、ＮＡＳＨのＳｔｅｌｉｃ研究所の２−ヒットモデルにおいて、ＰＥＧ化合物１を試験した。これらのマウスは、再生可能なタイムコースに亘って、脂肪肝（５週間）、ＮＡＳＨ（７週間）、肝線維症（９週間）、また最後には肝細胞癌（１６週）になる。ＰＥＧ−化合物１は、マウスを５週齢〜９週齢（予防モデル）、または７週齢〜９週齢（治療モデル）治療した場合、ＳｔｅｌｉｃモデルにおけるＮＡＳＨの発症を予防または効果的に後進させた。また、ＰＥＧ−化合物１は、この研究の９週間の時点で肝線維症を減少させた。
ＰＥＧ−化合物１の配列は以下のとおりである：
ＭＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹ（ｐＡＦ）ＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＰＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ（配列番号２０１）、ｐＡＦが３０ｋＤａのＰＥＧに連結される場合。
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（妊娠１５日目の雌）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．社（日本国神奈川県）から得られた。研究で使用される全ての動物を、動物使用のための日本薬理学会ガイドラインに従って収容し、世話した。
動物を、温度（２３±２℃）、湿度（４５±１０％）、照明（１２時間の明暗サイクル；８：００〜２０：００まで明期）、および換気の一定条件の下、ＳＰＦ設備において維持した。施設の汚染を予防するため、実験室では高圧（２０±４Ｐａ）を維持した。１ケージ当たり最高４匹のマウスでポリカーボネート製ケージＫＮ−６００（日本国の株式会社夏目製作所）に動物を収容した。殺菌済みＰＵＬＭＡＳμ（日本国のＭａｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒを敷きわらに使用し、週に一度交換した。
殺菌済み固体高脂肪食（ＨＦＤ）をケージの上の金属蓋に置いて自由供給した。ゴム栓およびシッパーチューブを装備した水ボトルから純水を自由に供給した。水ボトルを週に１回交換し、洗浄し、オートクレーブで殺菌して再使用した。
ＮＡＳＨは、２００μｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ、米国のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．）溶液の単回皮下注射によって４０匹の雄性マウスにおいて生後２日目に誘導され、４週齢の後に高脂肪食（ＨＦＤ、５７ｋｃａｌ％脂肪、カタログ番号：ＨＦＤ３２、日本国の ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．）を給餌していた（「ＳＴＡＭマウス」）。摂食量を、治療期間中、１週間当たり毎日測定した。
ＰＥＧ−化合物１およびビヒクル（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５０ｍＭスクロース、ｐＨ８．３）を、１ｍＬ／ｋｇの容量において皮下経路によって投与した。ＰＥＧ−化合物１を、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの用量で１週当たり２回投与した。
非空腹時血中グルコースを、ＬＩＦＥ ＣＨＥＣＫ（日本国のエーディア株式会社）を使用して、全血中で測定した。血漿生化学については、血液を、抗凝血剤（ノボ・ヘパリン、日本国の持田製薬会社）を含むポリプロピレンチューブに収集し、４℃で１５分間に亘り１，０００×ｇで遠心分離した。上清を収集し、使用まで−８０℃で保存した。血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、トリグリセリドおよび総コレステロールレベルを、ＦＵＪＩ ＤＲＩ−ＣＨＥＭ ７０００（日本国の富士フイルム株式会社）によって測定した。
肝臓全脂質抽出物をＦｏｌｃｈ法によって得た（Ｆｏｌｃｈ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７；２２６：４９７）。肝臓試料を、クロロホルム−メタノール（２：１、体積／体積）中で均質化し、室温で終夜インキュベートした。クロロホルム−メタノール−水（８：４：３、体積／体積／体積）で洗浄した後、抽出物を蒸発乾燥させ、イソプロパノールに溶解させた。肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含有量を、トリグリセリドＥ−試験およびコレステロールＥ−試験（日本国の和光ピュア化学工業株式会社）によってそれぞれ測定した。
ヘマトキシリンおよびエオジン（ＨＥ）染色のため、ブワン固定液中で予備固定した肝臓組織のパラフィンブロックから切片を切り出し、Ｌｉｌｌｉｅ−Ｍａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（日本国の武藤化学株式会社）、およびエオジン溶液（和光ピュア化学工業）で染色した。ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）をＫｌｅｉｎｅｒ（Ｋｌｅｉｎｅｒ ＤＥ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００５；４１：１３１３）の基準に従って計算した。大滴性および小滴性の脂肪を可視化するため、１０％中性緩衝ホルマリンで予備固定され、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（日本国のサクラファインテックジャパン株式会社）に包埋された凍結肝臓組織から凍結切片を切り出し、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。免疫組織化学のため、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドに包埋した凍結肝臓組織から切片を切り出してアセトンで固定した。内因性ペルオキシダーゼ活性を５分間０．０３％のＨ２Ｏ２を使用してブロックした後、１０分間Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本国の日本住友製薬会社）と共にインキュベーションした。切片を室温にて終夜、２００倍稀釈の抗Ｆ４／８０抗体（スイス国のＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いてインキュベートした。二次抗体（ＨＲＰヤギ抗ラット抗体、米国のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたインキュベーションの後、３，３’−ジアミノベンジジン／Ｈ２Ｏ２溶液（日本国の株式会社ニチレイバイオサイエンス）を使用して、酵素基質反応を行った。
線維症、脂肪沈着および炎症面積の定量的分析のため、中心静脈の周囲を倍率２００倍でデジタルカメラ（ＤＦＣ２８０；ドイツ国のＬｅｉｃａ）を使用して、シリウスレッド染色、オイルレッド染色、およびＦ４／８０免疫染色された切片の明視野像をキャプチャし、５視野／切片の陽性面積をＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国のＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を使用して測定した。
定量的ＰＣＲについて、トータルＲＮＡを製造業者の指示に従ってＲＮＡｉｓｏ（日本国のタカラバイオ株式会社）を使用し、肝臓試料から抽出した。１μｇのＲＮＡを、４．４ｍＭ ＭｇＣｌ２（スイス国のＦ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ．）、４０Ｕ ＲＮａｓｅ阻害剤（日本国の東洋紡株式会社）、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（米国のＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、６．２８μＭランダムヘキサマー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、５×第１鎖バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０ｍＭジチオトレイトール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および最終容量中２０μＬの２００Ｕ ＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む反応混合物を使用して逆転写した。その反応を３７℃で１時間の後、９９℃で５分間行った。リアルタイムＰＣＲを、リアルタイムＰＣＲ ＤＩＣＥおよび ＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を使用して行った。相対的なｍＲＮＡ発現レベルを計算するために、各遺伝子の発現を参照遺伝子３６Ｂ４（遺伝子記号：Ｒｐｌｐ０）のそれに標準化した。ＰＣＲプライマー配列は以下のとおりであった：
６Ｂ４：
フォワード５’−ＴＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＧＧＣＡＴＣＡ−３’；
リバース５’−ＡＴＧＴＴＣＡＧＣＡＴＧＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＧ−３’；
アルファ−ＳＭＡ：
フォワード５’−ＡＡＧＡＧＣＡＴＣＣＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣ−３’；
リバース５’−ＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣ−３’；
ＴＩＭＰ−１：
フォワード５’−ＴＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡ−３’；
リバース５’−ＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＴＣＣＡＣＡＡ−３’；
Ｉ型コラーゲン：
フォワード５’−ＣＣＡＡＣＡＡＧＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＴＡＧＧＡＧ−３’；
リバース５’−ＧＣＡＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡ−３’；
ＴＧＦベータ：
ＭＡ０３０３９７フォワード５’−ＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＧＴＧＧＡＡＣＴＣＴＡ−３’；
リバース５’−ＴＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡ−３’。
遺伝子アイデンティティーは以下の通りである：
３６Ｂ４：リボソームタンパク質、大きい、Ｐ０、
アルファ−ＳＭＡ：筋肉アクチン、アルファ、平滑筋、大動脈（Ａｃｔａ２）、
Ｔｉｍｐ−１：メタロプロテイナーゼ１の筋肉組織阻害剤（Ｔｍｐ１）、転写変異体
１型コラーゲン：筋肉コラーゲン分解酵素阻害（Ｔｉｍｐ１）、転写変異体、
Ｉ型コラーゲン：筋肉コラーゲン、Ｉ型、アルファ２（Ｃｏｌ１ａ２）、
ＴＧＦベータ：トランスフォーミング成長因子ベータ。
５週間〜９週間の治療期間に対して、統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（米国ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して、ボンフェローニ多重比較テストを使用して行なわれた。７週間〜９週間の治療期間に対して、ｔ統計学的分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４を使用して、スチューデントのｔ検定を使用して行なわれた。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とした。片側ｔ検定がＰ値＜０．１０を返した場合、統計学的有意差に対する傾向または傾きが識別された。結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。
各試験群は、週２回、１ｍＬ／ｋｇの容量でビヒクルまたはＰＥＧ−化合物１のいずれかで皮下治療されたマウスを含んだ。９週で動物を犠牲した。試験群は以下の通りであった。
群１：ビヒクル。８匹のＮＡＳＨマウスに、５週齢〜９週齢の間、毎週２回１ｍＬ／ｋｇの容量のビヒクルを皮下処理した。
群２：ＰＥＧ−化合物１−低用量。８匹のＮＡＳＨマウスに、５週齢〜９週齢の間、毎週２回１ｍｇ／ｋｇの用量のＰＥＧ−化合物１で補足されたビヒクルを皮下処理した。
群３：ＰＥＧ−化合物１−高用量。８匹のＮＡＳＨマウスに、５週齢〜９週齢の間、毎週２回３ｍｇ／ｋｇの用量のＰＥＧ−化合物１で補足されたビヒクルを皮下処理した。
群４：ビヒクル。８匹のＮＡＳＨマウスに、７週齢〜９週齢の間、毎週２回１ｍＬ／ｋｇの容量のビヒクルを皮下処理した。
群５：ＰＥＧ−化合物１−高用量。８匹のＮＡＳＨマウスに、７週齢〜９週齢の間、毎週２回３ｍｇ／ｋｇの用量のＰＥＧ−化合物１で補足されたビヒクルを皮下処理した。
生存率、臨床症状および行動を毎日モニターした。体重を治療前に記録した。各投与のおよそ６０分後に毒性、瀕死および死亡の重大な臨床症状についてマウスを観察した。試験終了時に、エーテル麻酔（和光ピュア化学工業）下、直接心臓穿刺による瀉血によって動物を犠牲した。
結果
体重変化を図１９に示す。
５週間〜９週間の治療期間の間（１群、２群および３群）、体重は、治療期間中、徐々に増加した。ＰＥＧ−化合物１−低群の平均体重は、１１日目、１３日目、１５日目、１６日目、１８日目、１９日目、および２２日目から２８日目において、ビヒクル群よりも著しく低かった。ＰＥＧ−化合物１−高群の平均体重は、１０日目から２８日目までにおいて、ビヒクル群よりも著しく低かった。いずれの動物も、一般的な状態において悪化を示さなかった。
７週間〜９週間の治療期間の間（４群および５群）、体重は、治療期間中、徐々に増加した。ＰＥＧ−化合物１−高群の平均体重は、５日目、６日目、９日目、および１１日目から１４日目において、ビヒクル群よりも著しく低かった。いずれの動物も、一般的な状態において悪化を示さなかった。
総摂食量を図２０に示す。
５週間〜９週間の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１治療群との間の摂食量の合計に有意差はなかった（ビヒクル：１３０±４ｇ／マウス、ＰＥＧ−化合物１−低：１３０±３ｇ／マウス、ＰＥＧ−化合物１−高：１３１±３ｇ／マウス）。
７週間〜９週間の治療期間（４群および５群）の間、摂食量の合計は、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群において増加する傾向があった（ビヒクル：６２±３ｇ／マウス、ＰＥＧ−化合物１−高：６８±２ｇ／マウス）。
犠牲の際の体重を図２１および表１０に示す。
５週間〜９週間の治療期間（１群、２群および３群）の間、犠牲の際、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１治療群は、平均体重の顕著な減少を示した（ビヒクル：２１．７±１．４ｇ、ＰＥＧ−化合物１−低：１９．５±１．４ｇ、ＰＥＧ−化合物１−高：１８．９±１．６ｇ）。
７週間〜９週間の治療期間（４群および５群）の間、犠牲の際、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群は、平均体重の顕著な減少を示した（ビヒクル：２１．５±１．４ｇ、ＰＥＧ−化合物１−高：１９．８±１．０ｇ）。
肝臓重量、および肝重量体重比を、図２２および図２３、ならびに表１０に示す。
５週間〜９週間の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１治療群は、平均肝臓重量の顕著な減少を示した（ビヒクル：１５１１±６６ｍｇ、ＰＥＧ−化合物１−低：１１６３±１１７ｍｇ、ＰＥＧ−化合物１−高：９７０±２３７ｍｇ）。ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１治療群は、平均肝重量体重比の顕著な減少を示した（ビヒクル：７．０±０．４％、ＰＥＧ−化合物１−低：６．０±０．５％、ＰＥＧ−化合物１−高：５．１±０．９％）。
７週間〜９週間の治療期間（４群および５群）の間、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群は、平均肝臓重量の顕著な減少を示した（ビヒクル：１３６４±１２６ｍｇ、ＰＥＧ−化合物１−高：１００８±１３５ｍｇ）。ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群は、平均肝重量体重比の顕著な減少を示した（ビヒクル：６．４±０．５％、ＰＥＧ−化合物１−高：５．１±０．８％）。
Figure 0006702962
全血糖を図２４および表１１に示す。
５週間〜９週間の治療期間（群１、群２および群３）の間、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物の１−高群は、平均全血糖の顕著な減少を示した。血糖レベルは、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−低群において減少する傾向があった。（ビヒクル：６９１±１１４ｍｇ／ｄＬ、ＰＥＧ−化合物１−低：５６６±１１９ｍｇ／ｄＬ、ＰＥＧ−化合物１−高：４９３±１３６ｍｇ／ｄＬ）。
７週間〜９週間の治療期間（群４および群５）の間、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群は、平均全血糖の顕著な減少を示した（ビヒクル：６５６±８５ｍｇ／ｄＬ、ＰＥＧ−化合物１−高：４５４±１０４ｍｇ／ｄＬ）。
血漿ＡＬＴを図２５および表１１に示す。
５週間〜９週間の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１治療群との間の血漿ＡＬＴレベルで有意差はなかった（ビヒクル：８２±６６Ｕ／Ｌ、ＰＥＧ−化合物１−低：６４±３６Ｕ／Ｌ、ＰＥＧ−化合物１−高：１０８±７８Ｕ／Ｌ）。
７週間〜９週間の治療期間（４群および５群）の間、血漿ＡＬＴレベルは、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群において減少する傾向があった（ビヒクル：２２９±２８５Ｕ／Ｌ、ＰＥＧ−化合物１−高：３６±８Ｕ／Ｌ）。
血漿トリグリセリドレベルを図２６および表１１に示す。
５−９治療期間週（１、２および３をグループ化する）の間、ビヒクル群（ビヒクル：３２２±３４１ｍｇ／ｄＬおよびＰＥＧ化合物、１−低い：７５±３９ｍｇ／ｄＬおよびＰＥＧ化合物、１−高い：６４±２２ｍｇ／ｄＬ）と比較して、ＰＥＧ化合物１つの治療群は、血漿トリグリセリドレベルの顕著な減少を示した。
７週間〜９週間の治療期間（４群および５群）の間、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群は、血漿トリグリセリドレベルの顕著な減少を示した（ビヒクル：１３９±３９ｍｇ／ｄＬ、ＰＥＧ−化合物１−高：５９±５１ｍｇ／ｄＬ）。
血漿総コレステロールレベルを図２７および表１１に示す。
５週間〜９週間の治療期間（１群、２群および３群）の間、血漿総コレステロールレベルは、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群において減少する傾向があった。ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１−低群との間の血漿総コレステロールレベルに有意差はなかった（ビヒクル：１２１±２０ｍｇ／ｄＬ、ＰＥＧ−化合物１−低：１１４±１９ｍｇ／ｄＬ、ＰＥＧ−化合物１−高：９８±３１ｍｇ／ｄＬ）。
７週間〜９週間の治療期間（４群および５群）の間、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１−高群との間の血漿総コレステロールレベルに有意差はなかった（ビヒクル：１２１±１９ｍｇ／ｄＬ、ＰＥＧ−化合物１−高：１１５±２９ｍｇ／ｄＬ）。
肝臓トリグリセリド含有量を図２８および表１１に示す。
５週間〜９週間の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１治療群は、肝臓トリグリセリド含有量の顕著な減少を示した（ビヒクル：５４±１３ｍｇ／ｇ肝臓、ＰＥＧ−化合物１−低：２５±７ｍｇ／ｇ肝臓、ＰＥＧ−化合物１−高：２２±９ｍｇ／ｇ肝臓）。
７週間〜９週間の治療期間（４群および５群）の間、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群は、肝臓トリグリセリド含有量の顕著な減少を示した（ビヒクル：５３±１１ｍｇ／ｇ肝臓、ＰＥＧ−化合物１−高：１７±６ｍｇ／ｇ肝臓）。
肝臓コレステロール含有量を図２９および表１１に示す。
５週間〜９週間の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１治療群との間の肝臓コレステロール含有量に有意差はなかった（ビヒクル：２．９±０．７ｍｇ／ｇ肝臓、ＰＥＧ−化合物１−低：２．９±０．６ｍｇ／ｇ肝臓、ＰＥＧ−化合物１−高：３．１±０．４ｍｇ／ｇ肝臓）。
７週間〜９週間の治療期間（４群および５群）の間、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１治療群との間の肝臓コレステロール含有量に有意差はなかった（ビヒクル：３．１±０．８ｍｇ／ｇ肝臓、ＰＥＧ−化合物１−高：３．６±１．５ｍｇ／ｇ肝臓）。
Figure 0006702962
組織学的分析：
ＨＥ染色およびＮＡＦＬＤ活性スコア
ＨＥ染色切片の代表的な顕微鏡写真を図３０Ａ〜図３０Ｂに示し、ＮＡＦＬＤ活性スコアの結果を図３１、図３２Ａ〜図３２Ｃおよび表１２に示す（ＮＡＬＦＤ活性スコア（図３１）は、脂肪症、肝細胞風船様腫大、および小葉内炎症のスコアの合成である）。
表１２に示される結果は、表１３に示される得点基準に基づいた。
Figure 0006702962
Figure 0006702962
５週間〜９週間の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群に由来する肝臓切片は重度の小滴性および大滴性の脂肪沈着、肝細胞風船様腫大、および炎症性細胞浸潤を示した。ＰＥＧ−化合物１治療群は、ビヒクル群と比較したＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）の顕著な減少と共に、脂肪沈着、肝細胞風船様腫大、および炎症性細胞浸潤における著しい改善（減少）を示した（ビヒクル：５．６±０．７、ＰＥＧ−化合物１−低：４．０±１．２、ＰＥＧ−化合物１−高：２．９±１．２）。
７週間〜９週間の治療期間（４群および５群）の間、ＰＥＧ−化合物１−高群は、ビヒクル群と比較したＮＡＳの顕著な減少と共に、脂肪沈着、肝細胞風船様腫大、および炎症性細胞浸潤の著しい改善（減少）を示した。（ビヒクル：５．６±０．７、ＰＥＧ化合物、１−高い：２．４±１．３）。
組織学的分析：シリウスレッド染色
シリウスレッド染色の結果を、図３３Ａ〜図３３Ｂ、図３４（代表的な染色を示す）、および表１４に示す。
５週間〜９週間の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群に由来する肝臓切片は、肝小葉の中心周囲領域にコラーゲン堆積を示した。ビヒクルと比較して、線維症面積（シリウスレッド陽性面積）は、ＰＥＧ−化合物１治療群において著しく減少した群（ビヒクル：１．１０±０．２４％、ＰＥＧ−化合物１−低：０．７１±０．１７％、ＰＥＧ−化合物１−高：０．７１±０．１９％）。
７週間〜９週間の治療期間（４群および５群）の間、ビヒクル群と比較して、線維症面積は、ＰＥＧ化合物の１−高い群において著しく減少した（ビヒクル：１．２５±０．２９％、ＰＥＧ−化合物１−高：０．７５±０．２１％）。
組織学的分析：Ｆ４／８０免疫組織化学
Ｆ４／８０免疫組織化学の結果を、図３５Ａ−図３５Ｂ、図３６（代表的な染色を示す）、および表１４において示す。
５週間〜９週間の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群に由来する（ｆｏｒｍ）肝臓切片のＦ４／８０免疫染色は、肝小葉中のＦ４／８０＋細胞の蓄積を実証した。炎症面積（Ｆ４／８０陽性面積）の割合と同様に、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１治療群との間でＦ４／８０＋細胞の数およびサイズに有意差はなかった（ビヒクル：６．９±０．９％、ＰＥＧ−化合物１−低：７．６±１．５％、ＰＥＧ−化合物１−高：７．１±０．７％）。
７週目〜９週目の治療期間（４群および５群）の間、炎症面積の割合と同様に、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１−高群との間のＦ４／８０＋細胞の数およびサイズに有意差はなかった（ビヒクル：７．１±０．７％、ＰＥＧ−化合物１−高群：６．３±１．１％）。
組織学的分析：オイルレッド染色
オイルレッド染色の結果を、図３７Ａ〜図３７Ｂ（代表的な染色を示す）、図３８および表１４に示す。
５週目〜９週目の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群に由来する肝臓切片は、肝細胞中の小滴性および大滴性の脂肪沈着を示した。ビヒクル群と比較して、脂肪沈着面積（オイルレッド陽性面積）の割合は、ＰＥＧ−化合物１治療群において著しく減少した（ビヒクル：３０．４±４．８％、ＰＥＧ−化合物１−低：２０．５±８．８％、ＰＥＧ−化合物１−高：１６．２±６．１％）。
７週目〜９週目の治療期間（４群および５群）の間、ビヒクル群と比較して、脂肪沈着面積の割合は、ＰＥＧ−化合物１−高群において著しく減少した（ビヒクル：３０．７±５．６％、ＰＥＧ−化合物１−高：１３．９±７．７％）。
Figure 0006702962
遺伝子発現解析
遺伝子発現解析の結果は、アルファ−ＳＭＡ、ＴＩＭＰ−１、Ｉ型コラーゲンおよびＴＧＦベータについて図３９Ａ〜図３９Ｄ、および表１５に示される。
５週目〜９週目の治療期間（１群、２群および３群）の間、アルファ−ＳＭＡ ｍＲＮＡ発現レベルは、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群において下方制御される傾向があった。ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１−低群との間にα−ＳＭＡ ｍＲＮＡ発現レベルに有意差はなかった（ビヒクル：１．００±１．１４、ＰＥＧ−化合物１−低：０．５２±０．６０、ＰＥＧ−化合物１−高：０．３９±０．３０）。
７週目〜９週週目の治療期間（４群および５群）の間、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１−高群との間でα−ＳＭＡ ｍＲＮＡ発現レベルに有意差はなかった（ビヒクル：１．００±０．８８、ＰＥＧ−化合物１−高：１．１４±１．０１）。
５週目〜９週目の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群と比較して、ＴＩＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現レベルはＰＥＧ−化合物１−低群において下方制御される傾向があった。ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１−高との間のＴＩＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現レベルに有意差はなかった（ビヒクル：１．００±０．３９、ＰＥＧ−化合物１−低：０．７３±０．２８、ＰＥＧ−化合物１−高：０．８８±０．３１）。
７週目〜９週週目の治療期間（４群および５群）の間、ビヒクル群と比較して、ＴＩＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現レベルはＰＥＧ−化合物１−高群において下方制御される蛍光があった（ビヒクル：１．００±０．５７、ＰＥＧ−化合物１−高：０．６５±０．３４）。
５週目〜９週目の治療期間（１群、２群および３群）の間、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１治療群との間のＩ型コラーゲンｍＲＮＡ発現レベルに有意差はなかった（ビヒクル：１．００±０．２２、ＰＥＧ−化合物１−低：０．８８±０．２４、ＰＥＧ−化合物１−高：０．８９±０．３４）。
７週目〜９週週目の治療期間（４群および５群）の間、ビヒクル群と比較して、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡ発現は、ＰＥＧ−化合物１−高群において著しく減少した（ビヒクル：１．００±０．２９、ＰＥＧ−化合物１−高：０．６９±０．２０）。
５週目〜９週目の治療期間（１群、２群および３群）の間、ＴＧＦ−βｍＲＮＡ発現レベルは、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−低群において下方制御される傾向があった。ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１−高群との間のＴＧＦ−βｍＲＮＡ発現レベルに有意差はなかった（ビヒクル：１．００±０．２４、ＰＥＧ−化合物１−低：１．０７±０．６０、ＰＥＧ−化合物１−高：０．９０±０．２６）。
７週目〜９週週目の治療期間（４群および５群）の間、ＴＧＦ−βｍＲＮＡ発現レベルは、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１−高群において下方制御される傾向があった（ビヒクル：１．００±０．４５、ＰＥＧ−化合物１−高：０．７７±０．２２）。
Figure 0006702962
上に述べられるように、ＰＥＧ−化合物１は、ヘマトキシリン−エオジンまたはオイルレッドＯによる肝臓切片の染色の後、肝臓のトリグリセリド含有量を測定する生化学アッセイ、および組織学によって評価される肝臓の脂肪沈着を減少した。この生来のＦＧＦ２１の抗脂肪性活性（ａｎｔｉ−ｓｔｅａｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、マウスにおいてアディポネクチンに依存することが文献に報告されている（各々が全体において参照により本明細書に援用される、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１７：７７９−７８９（２０１３）、Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １７：７９０−７９７（２０１３）を参照されたい）。したがって、総アディポネクチンの濃度は、治療されたマウスから作製されたターミナル血清試料において測定された。血清アディポネクチンは、市販のＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ カタログ番号４７−ＡＤＰＭＳ−Ｅ０１）を使用して、製造業者のプロトコルに従って測定された。
３ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物１の毎週２回の投与は、対応するビヒクル群と比較して、試験した全ての最終時間点において血清総アディポネクチンを有意に増加した（図６１）。この結果は、アディポネクチンがＳｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨモデルにおけるＰＥＧ−化合物１の効能に寄与するという仮説と一致している。
考察
この実施例は、ＮＡＳＨの予防および治療の両方のモデルにおけるＰＥＧ−化合物１の効能を試験した実験の結果を示す。予防のモデルでは、このモデルにおいて脂肪症が明らかな時に治療を開始した（５週目から開始、すなわち５週目〜９週目群）。治療のモデルでは、このモデルにおいてＮＡＳＨが明らかな時に治療を開始した（７週目から開始、すなわち７週目〜９週目群）。したがって、ＰＥＧ−化合物１治療の効能は、予防および治療の両方のモデルにおいて実証された。
ＰＥＧ−化合物１による治療は両方の治療モデルにおいて線維症面積（シリウスレッド染色によって検出される）を著しく減少し、ＰＥＧ−化合物１の抗線維症効果を実証した。また、ＰＥＧ−化合物１の治療は、α−ＳＭＡ、ＴＩＭＰ−１およびＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現レベルを低下させた、ＰＥＧ−化合物１の抗線維症特性を更に支持した。また、ＰＥＧ−化合物１による治療は、体重および肝臓重量、肝重量体重比、血糖、血漿および肝臓のトリグリセリド、ＮＡＦＬＤ活性スコア、脂肪沈着面積（オイルレッド染色によって検出される）の統計学的に有意な減少をもたらした。
全てのＰＥＧ−化合物１治療群は、ＮＡＳＨの活性を評価するための臨床上のエンドポイントのうちの１つである、ＮＡＳの顕著な減少を示した（Ｓａｎｙａｌ ＡＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１１；５４：３４４）。
さらに、ＰＥＧ−化合物１は、全血糖レベル、血漿トリグリセリドレベル、および肝臓トリグリセリド含有量の減少によって証明されるように、脂質およびグルコースの代謝を改善した。
結論として、ＰＥＧ−化合物１は、本研究において改善された脂質およびグルコースの代謝に関連する抗ＮＡＳＨおよび抗線維症の効果を示した。
実施例１４
融合パートナーを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの溶解度評価
この実施例は、融合パートナーを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの相対的溶解度の測定を記載する。結果は、化合物が比較的より高い濃度に製剤化される能力を示し、それは有効量のより容易な投与を可能とするであろう。
方法
相対的溶解度の評価を、連続するプラグフロー濃度サイクルの後のサイズ排除クロマトグラフィー分析により行った。類似するが同一でない開始濃度の２０ｍＭヒスチジンバッファーｐＨ ７．０に製剤化された試料を、３ｋＤａ分子量カットオフ遠心分離濃縮器へピペットで移し、４℃で１５分間、１５分間、および４０分間のサイクルに亘り４，７５０ＲＰＭで遠心した。遠心サイクルの間に、アリコートを濃縮装置から取り出し、また、分析型サイズ排除クロマトグラフィー分析（ａＳＥＣ）（ＰＢＳ ｐＨ７．２バッファー中で平衡化されたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−７５ １０／３００ ＧＬカラム上）を行って溶液中のＨＭＷおよびモノマー種の濃度を決定した。
合計濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光測光器を用いて２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。ＳＥＣクロマトグラムトレース中のモノマーピークに対する高分子量ピークの曲線下領域の計算によって、高分子量パーセンテージを決定した。得られたデータポイントを、試験された条件下で最も可溶性でないコンストラクトから最も可溶性のコンストラクトへの順番を視覚化するためにプロットする。データポイントによって作られた勾配が低いほど、試験された条件下でより変異体タンパク質の安定性が高くなる。
結果
融合パートナーを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの相対的溶解度を、タンパク質濃度の関数として高分子量（ＨＭＷ）凝集塊の形成を測定することにより決定した。所与の濃度でのより低いＨＭＷ凝集体生成は、より大きな溶解度を示し、より高い濃度に製剤化される能力をもたらす。
結果を図４１においてグラフで示す。試験した化合物に対するプラグフロー溶解度曲線の勾配を下記表１６に示す（より低い値はより少ない凝集体生成を示し、したがって、より高い濃度に製剤化される能力を示す）。
Figure 0006702962
実施例１５ 非アルコール性脂肪性肝炎の成人におけるＰＥＧ化合物１の安全性、薬物動態および薬力学的効果を評価する無作為化、二重盲検、プラセボ対照、並列群、複数回投与研究
アメリカ合衆国では、ＮＡＳＨは成人における硬変の主要原因のうちの１つであり、ＮＡＳＨを有する成人の最大２０％は肝硬変を発症する。ＮＡＳＨの組織学の知見は、肝臓における変動する量の細胞周囲の線維症を伴う脂肪症、炎症および気球状変性を含み、顕著なアルコール摂取がない状態において起こる。ＮＡＳＨ患者は、心血管、肝臓、および癌と関連する死亡率の増加を示す。特定の薬物療法の選択肢は、利用可能ではない。
この実施例は、（ｐＡＦが３０ｋＤａのＰＥＧに連結される、配列番号２０１のポリペプチド）ＰＥＧ化合物１のＮＡＳＨを有する成人における安全性、忍容性およびＭＲＩによる肝臓の脂肪画分（％）における変化の評価を含む、安全性、薬物動態および薬力学的効果を評価するために無作為化、二重盲検、およびプラセボ対照のヒト臨床試験を記載する。
研究集団：２１歳〜７５歳のおよそ９０名の男女の被験体が以下の基準を全て満たし、登録される。異なるスコアリングシステムを使用するＮＡＳＨ ＣＲＮ線維症ステージ１〜ステージ３、または等価物によるＮＡＳＨの文書化された結果を伴う、スクリーニングの１年以内に行われた肝生検；ＢＭＩ３０以上（重量（ｋｇ）／［高さ（ｍ）］２）；脂肪症インデックス６０以上；検査期間に行なわれたＭＲＩによる肝臓の脂肪画分（％）１０％以上。被験体は、無作為化の前４２日以内に適格性を決定するためにスクリーニング評価を経る。
慢性肝疾患（ＮＡＳＨ以外）、肝硬変、非代償性肝疾患、管理されていない糖尿病、および特定の他の病状または病歴を含む併発症の証拠がある場合、被験体は研究から除外される。
ベースラインスキャンは磁気共鳴画像（ＭＲＩ）による肝臓の脂肪含量、磁気共鳴エラストグラフィー（ＭＲＥ）による肝硬度、および、２重エネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ）による身体組成を含む、活性薬物またはプラセボの、１日目の投薬のおよそ１４日前〜３５日前に行われる。追加のベースライン患者の評価は、重量、ＢＭＩおよびウエスト周りの決定を含む。
治療レジメン：ＰＥＧ化合物１を、ＮＡＳＨを有する成人に１６週間に亘って毎日または毎週投与する。治療は、プラセボを含む注射器の適切な使用を７日間患者にトレーニングさせた後、皮下に自己投与される。およそ９０名の適格な被験体が、３つの治療群（１群当たり３０名）のうちの１つへの最初上で無作為化される。その後、彼らは以下のように治療される（１日目から開始して）：治療Ａ：１０ｍｇのＰＥＧ−化合物１毎日；治療Ｂ：
２０ｍｇのＰＥＧ−化合物１毎週；治療Ｃ：プラセボ毎日。被験者は、現在の米国糖尿病協会の基準に基づく２型糖尿病の診断（有ｖｓ無）を使用して階級に分けられる。
全ての被験体は、ＰＥＧ−化合物１またはプラセボを毎日１回自己投与する。ＰＥＧ−化合物１は、１０ｍｇ／ｍＬの溶液で提供される。治療Ｂ（２０ｍｇ／週）群については、各々１ｍＬの２つの注射剤を、１日目（Ｄ１）、および２日目〜７日目に同時に与え、その注射はプラセボである。また、盲検を維持するため、他の２つの群は、その片方または両方ともがプラセボを含む、２つの１日目の注射を有する。２日目〜７日目の注射は、１ｍＬのＰＥＧ化合物１（治療Ａ群）または１ｍＬのプラセボ（治療Ｃ群）である。治療を１１２日目（Ｄ１１２）（すなわち、１６週）まで継続する。
患者の評価：患者の評価は、−７日目（プラセボのみの導入部の開始）、１日目、１５日目、２９日目、４３日目、５７日目、８６日目、および１１２日目に行う。理学的検査、バイタルサイン測定、１２誘導心電図（ＥＣＧ）、臨床検査室評価、ならびにＭＲＩ、ＭＲＥおよびＤＸＡのスキャンを行う。ＭＲＩ、ＭＲＥおよびＤＸＡの治療終了時のスキャンを、１１２日目（＋／−１週）に行う。経過観察の診察を、最後の投薬から６ヶ月（＋／−２週）に行われるＤＸＡの経過観察スキャンと共に１４２日目および２９２日目あたりに行う。
血液を、薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の分析のために収集する。ＰＥＧ化合物１（全体およびＣ末端インタクト）の血清濃度を検証されたアッセイによって測定する。全て、モデルに基づいたパラメーター（ＣＬ／Ｆ、Ｖｃ／Ｆ、Ｋａなど）を評価するために、研究で集められたＰＫデータは、高度に発展した個体群ＰＫモデルによって評価される。さらに、個々の暴露パラメーター（定常状態でのＣａｖｇ、Ｃｍｉｎ、ＣｍａｘおよびＡＵＣ等）の推定値は、モデルに基づくパラメーターに由来する。被験体を、研究全体に亘る有害事象について緊密にモニターする。
主要エンドポイント：主な目的は、ＮＡＳＨであると生検で証明された患者におけるＭＲＩによる、安全性、耐用性および肝臓の脂肪画分（％）に対するＰＥＧ化合物１の毎日か週線量の効果を評価することである。これは、陽子密度脂肪画分肝臓ＭＲＩによって決定される、ベースラインから１６週目までのパーセント肝臓脂肪画分（％）の変化の主要エンドポイントによって判断される。ベースラインは、全てのエンドポイントに対して最後の欠測のない（ｌａｓｔ ｎｏｎ−ｍｉｓｓｉｎｇ）投与前測定として定義される。１６週間に亘って毎日または毎週ＮＡＳＨを有する患者に投与されるＰＥＧ−化合物１は、プラセボより大きな程度のより低い肝臓脂肪画分（％）が予測される。また、主要エンドポイントは、ＡＥ、重大なＡＥ、ならびに注射部位評価、臨床検査、バイタルサイン測定、ＥＣＧ、理学的検査および規定の時間点でＤＸＡスキャンによって収集された骨塩量（ＢＭＤ）における明らかな異常と同様に、停止に結びつくＡＥ、および死亡を含む特に注目される事象の発生を含む安全エンドポイントを含む。
副次的エンドポイント：副次的エンドポイントは、薬物動態学的エンドポイントおよび免疫原性エンドポイントを含む。薬物動態学的エンドポイントは、ＰＥＧ化合物１の（全体およびＣ末端インタクト）血清濃度のモデルに基づく薬物動態パラメーターによって評価され、Ｃａｖｇ、Ｃｍｉｎ、ＣｍａｘおよびＡＵＣ（ＴＡＵ）は選択された時点で行なわれた測定から決定される。免疫原性エンドポイントは、抗−ＰＥＧ化合物１抗体および抗ＦＧＦ２１抗体の患者レベルによって評価される。ＰＥＧ化合物１（全体およびＣ末端インタクト）血清濃度のモデルに基づく薬物動態パラメーターが決定される。主要なＰＫパラメーターは次のものを含んでいる：ＣＬ／Ｆ（静脈外投与の後の明白なクリアランス）；Ｖ／Ｆ（静脈外投与の後の分布の見掛体積）；およびＫａ（血液循環中への注射部位からの吸収速度定数）。主要なＰＫパラメーターより、Ｃｍａｘ（計算された最大血中濃度）を含む２次的なＰＫパラメーターが得られる；Ｔ１／２（排出半減期）；ＡＵＣ（ＴＡＵ）（１つの投与間隔の濃度時間曲線下面積）；Ｃｍｉｎ（投与間隔内の最小の濃度）；およびＣａｖｇ（投与間隔内の平均濃度）。
分析：継時的反復測定分析は、ベースラインおよび少なくとも１つのポストベースライン測定の両方を有する治療された集団におけるベースラインからの１６週目における肝臓の脂肪画分（％）の変化を分析するために使用される。モデルは、主効果として治療群、週と週単位による治療と相互作用を含み、共変数としてベースライン肝臓脂肪画分（％）およびベースライン糖尿病状態を含む。無構造共分散行列は、各被験体内の反復される測定の相関を表わすために使用される。モデルは、治療内の、およびその治療間のベースラインからの平均変更対する推定値、標準誤差および両側の９０％信頼区間を提供する。Ｐ値は、１６週目に２つのＰＥＧ化合物１治療群の各々（毎日１０ｍｇ、および毎週２０ｍｇ）における治療効果をプラセボ治療群のそれと比較するため計算される。治療群比較は、それぞれ片側０．０５の有意水準で行なわれる。多様性に対する調整は行わない。
ＰＥＧ化合物１（全体およびＣ末端インタクト）曝露と他のバイオマーカーまたはエンドポイントとの関係は、当量反応関係を示すことが調査される。また、これらの測定は、肝臓の脂肪画分における変化との関係、およびこれらのバイオマーカーがどのようにその変化を予測するか、またはその変化に関するのかを示すために分析される。これらのエンドポイントおよびバイオマーカーとして、疾患進行および合併症のリスクに関連するバイオマーカーと同様に、ＭＲＥ、体重、ＢＭＩ、ウエスト周り、ＤＸＡによる身体組成、グルコースホメオスタシス、インスリン感受性、絶食時脂質、骨ホメオスタシス、ＡＬＴおよびＡＳＴによる肝硬度の変化が挙げられる。ＮＡＳＨは、典型的にはアディポネクチン（低アディポネクチン血症）のレベル低下に関連し、レベル低下は広範囲な壊死性炎症に関係する。アディポネクチンは、脂肪酸化を増強しおよび肝臓の脂質蓄積を減少することにより、インスリン感受性を増加させると考えられる。血清総アディポネクチンレベルは、ＰＥＧ化合物１治療によって増加されると予想される。また、ＰＥＧ化合物１の治療は、ＮＡＳＨ患者において絶食時トリグリセリド、ＬＤＬ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ３を減少し、ＨＤＬを増加させると予想される。
上に記載されるような非体系的な共分散行列を使用する研究結果の分析を行って、プラセボ対照と比較して、（毎日と毎週の両方の投与試験群において）ＰＥＧ化合物１で治療された患者における肝臓の脂肪画分の統計的に有意な（ｐ＜０．０５）減少を示す。
実施例１６
この実施例は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のＳＴＡＭモデルにおけるＰＥＧ−化合物１の効能を更に調査する。マウスを、９週齢から１２週齢または１５週齢で治療した。
方法
ＰＥＧ−化合物１およびビヒクル（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５０ｍＭスクロース、ｐＨ８．３）を提供した。投薬溶液を作製するため、ＰＥＧ−化合物１の溶液を提供されるビヒクルを用いて適切な稀釈によって作製した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（妊娠１５日目の雌）を日本ＳＬＣ社（日本国、静岡）から得た。研究の中で使用される全ての動物を、動物使用のための日本薬理学会ガイドラインに従って収容し、世話した。２００μｇストレプトゾトシン（ＳＴＺ、米国Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液の単回皮下注射によって６０匹の雄性マウスにおいて、生後２日目にＮＡＳＨを誘導し、４週齢の後、高脂肪食（ＨＦＤ、５７ｋｃａｌ％脂肪、カタログ番号：ＨＦＤ３２、日本国ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．）を給餌していた。
１週間に２回、３ｍｇ／ｋｇの用量で１ｍＬ／ｋｇの容量においてＰＥＧ−化合物１およびビヒクルを皮下経路により投与した。動物を、温度（２３±２℃）、湿度（４５±１０％）、湿度（４５±１０％）、照明（１２時間の人工明暗サイクル；明期８：００〜２０：００）、および換気の一定条件下、ＳＰＦ設備において維持した。施設の汚染を予防するため、実験室において高圧（２０±４Ｐａ）を維持した。１ケージ当たり最高４匹のマウスでポリカーボネート製ケージＫＮ−６００（日本国の株式会社夏目製作所）に動物を収容した。殺菌済みＰａｐｅｒ−Ｃｌｅａｎ（日本ＳＬＣ）を敷きわらに使用し、週に１回交換した。ケージの上部の金属蓋に置いた殺菌済み固体ＨＦＤを自由供給した。ゴム栓およびシッパーチューブを装備した水ボトルから純水を自由に供給した。水ボトルを週に１回交換し、洗浄し、オートクレーブで殺菌して再使用した。イヤリングに刻まれた数字によってマウスを識別した。ケージを、それぞれ識別コードで標識した。
非空腹時血中グルコースを、ＬＩＦＥ ＣＨＥＣＫ（日本国のＥＩＤＩＡ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して、全血中で測定した。血漿生化学のため、血液を抗凝血剤と共にポリプロピレンチューブ（Ｎｏｖｏ−Ｈｅｐａｒｉｎ、日本国の持田製薬株式会社）に収集し、４℃で１５分間に亘り１，０００×ｇで遠心分離した。上清を収集し、使用まで−８０℃で保存した。血漿ＡＬＴ、トリグリセリドおよび総コレステロールのレベルをＦＵＪＩ ＤＲＩ−ＣＨＥＭ ７０００（日本国の富士フイルム株式会社）によって測定した。
肝臓全脂質抽出物をＦｏｌｃｈ法（Ｆｏｌｃｈ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７；２２６：４９７）によって得た。肝臓試料を、クロロホルム−メタノール（２：１、体積／体積）中で均質化し、室温で終夜インキュベートした。クロロホルム−メタノール−水（８：４：３、体積／体積／体積）で洗浄した後、抽出物を蒸発乾燥させ、イソプロパノールに溶解させた。肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含有量を、トリグリセリドＥ−試験およびコレステロールＥ−試験（日本国の和光ピュア化学工業株式会社）によってそれぞれ測定した。
ＨＥ染色のため、ブワン固定液中で予備固定した肝臓組織のパラフィンブロックから切片を切り出し、Ｌｉｌｌｉｅ−Ｍａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（日本国の武藤化学株式会社）、およびエオジン溶液（和光ピュア化学工業）で染色した。ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）をＫｌｅｉｎｅｒ（Ｋｌｅｉｎｅｒ ＤＥ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００５；４１：１３１３）の基準に従って計算した。コラーゲン蓄積を可視化するため、ブワン固定液で固定された肝臓切片を、ピクロ−シリウスレッド溶液（ドイツ国のＷａｌｄｅｃｋ）を使用して染色した。大滴性および小滴性の脂肪を可視化するため、１０％中性緩衝ホルマリンで予備固定され、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（日本国のサクラファインテックジャパン株式会社）に包埋された凍結肝臓組織から凍結切片を切り出し、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。免疫組織化学のため、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドに包埋した凍結肝臓組織から切片を切り出してアセトンで固定した。内因性ペルオキシダーゼ活性を５分間０．０３％のＨ２Ｏ２を使用してブロックした後、１０分間Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本国の日本住友製薬会社）と共にインキュベーションした。切片を４℃にて終夜、２００倍稀釈の抗Ｆ４／８０抗体（スイス国のＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いてインキュベートした。二次抗体（ＨＲＰヤギ抗ラット抗体、米国のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたインキュベーションの後、３，３’−ジアミノベンジジン／Ｈ２Ｏ２溶液（日本国の株式会社ニチレイバイオサイエンス）を使用して、酵素基質反応を行った。
腎臓をブワン固定液中で固定した。糸球体の構造を、０．５％過ヨウ素酸によって酸化され、シッフの試薬（いずれも和光純薬工業株式会社製）で染色された切片を用い、ＰＡＳ染色法を使用して観察した。コラーゲン蓄積を可視化するため、腎臓切片をピクロシリウスレッド溶液（Ｗａｌｄｅｃｋ）で染色した。
線維症、脂肪沈着および炎症面積の定量的分析のため、肝臓については中心静脈の周囲、または腎臓については間質領域で、倍率２００倍でデジタルカメラ（ＤＦＣ２８０；ドイツ国のＬｅｉｃａ）を使用して、シリウスレッド染色、オイルレッド染色、およびＦ４／８０免疫染色された切片の明視野像をキャプチャし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国の国立衛生研究所）を使用して５視野／切片の陽性面積を測定した。
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（米国のＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）によりボンフェローニ多重比較検定を使用して行った。Ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意とした。片側ｔ検定のＰ値＜０．０５を返した場合、傾向または傾きを仮定した。結果を平均±ＳＤとして表した。
結果
研究群は、以下の通りであった（下記表１７に要約される）。
群１：ビヒクル。９週齢から１２週齢または１５週齢まで、２０匹のＮＡＳＨマウスに、１週間に２回、１ｍＬ／ｋｇの容量でビヒクルを投与した。
群２：ＰＥＧ−化合物１。９週齢から１２週齢、または１５週齢まで、２０匹のＮＡＳＨマウスに３ｍｇ／ｋｇの用量のＰＥＧ−化合物１で補足されたビヒクルを１週間に２回皮下投与した。
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生存率、臨床症状、および行動を毎日モニターした。体重を治療の前に記録した。マウスは、各投与のおよそ６０分後に毒性、瀕死および死亡の重大な臨床症状が観察された。動物を、エーテル麻酔（和光ピュア化学工業）の下で直接心臓穿刺による瀉血によって犠牲した。以下のアッセイのため、１２週齢で全ての群の６匹の動物を犠牲し、残りの動物を１５週齢での犠牲の日まで保有した。
全ての群で体重は、治療期間中、明らかには変化しなかった。ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群との間で、平均体重において有意差はなかった。
治療期間中、マウスは以下の通り、４０日目に達する前に死亡した。ビヒクル群では２０匹中８匹のマウスが死亡した。ＰＥＧ−化合物１群では死亡した動物はいなかった。死亡の原因は不明のままであり、ビヒクル群で関連する疾患の進行の可能性がある。個々のマウスの死亡日は、７日目、１７日目（２匹のマウス）、２０日目（２匹のマウス）、３４日目、３８日目および４０日目であった。５匹のマウスがビヒクル群で死亡した後、オリジナルの研究プロトコルを修正し、各群少なくとも６匹のマウスが１５週目まで生存することを保証しようと、１２週目において犠牲されるマウスの数を１群当たり８匹から６匹に減らすことを決めた。
９週目〜１２週目の間に治療された動物において、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群との間の犠牲の日の平均体重に有意差はなかった（図４２Ａ）。同様に、９週目〜１５週目の間に治療された動物において、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群との間の犠牲の日の平均体重に有意差はなかった（図４２Ｂ）。
臓器重量、および肝重量体重比を図４３〜図４６に示し、表１８に要約する。
９週目〜１２週目の間に治療された動物において、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１群は、平均肝臓重量の減少傾向を示した（図４３Ａ）。ビヒクル群と比較して、肝重量体重比は、ＰＥＧ−化合物１群において有意に減少した（ｐ＜０．０１）（図４４Ａ）。ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群との間の平均右腎重量に有意差はなかった（図４５Ａ）。平均左腎重量は、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１群において減少する傾向があった（図４６Ａ）。
９週目〜１５週目の間、治療された動物では、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１群は、平均肝臓重量（ｐ＜０．００１）（図４３Ｂ）および平均肝重量体重比（ｐ＜０．００１）（図４４Ｂ）を有意に減少させた。ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群とで、平均右腎重量（図４５Ｂ）および平均左腎重量（図４６Ｂ）に有意差はなかった。
Figure 0006702962
生化学の測定結果を図４７〜図５２に示し、下記表１９に要約する。
９週目〜１２週目の間に治療された動物では、ビヒクル群とＰＥＧ化合物１群との間の全血グルコースレベルに有意差はなかった（図４７Ａ）。
９週目〜１５週目の間に治療された動物では、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１群における全血グルコースレベルは、有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図４７Ｂ）。
９週目〜１２週目の間に治療された動物では、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群との間の血漿ＡＬＴレベルに有意差はなかった（図４８Ａ）。
９週目〜１５週目の間に治療された動物では、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１群における血漿ＡＬＴレベルは有意に減少した（ｐ＜０．０１）（図４８Ｂ）。
９週目〜１２週目の間に治療された動物では、ＰＥＧ−化合物１群は、ビヒクル群と比較して、血漿トリグリセリドレベルで減少する傾向を示した（図４９Ａ）。
９週目〜１５週目の間に治療された動物では、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群との間の血漿トリグリセリドレベルに有意差はなかった（図４９Ｂ）。
９週目〜１２週目の間に治療された動物では、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群との間の血漿総コレステロールに有意差はなかった（図５０Ａ）。
９週目〜１５週目の間に治療された動物では、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群との間の血漿総コレステロールに有意差はなかった（図５０Ｂ）。
９週目〜１２週目の間に治療された動物では、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１群における肝臓トリグリセリド含有量は有意に減少した（ｐ＜０．０１）（図５１Ａ）。
９週目〜１５週目の間に治療された動物では、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ化合物１群における肝臓トリグリセリド含有量は有意に減少した（ｐ＜０．００１）（図５１Ｂ）。
９週目〜１２週目の間に治療された動物では、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１群における肝臓コレステロール含有量は有意に減少した（ｐ＜０．０１）（図５２Ａ）。
９週目〜１５週目の間に治療された動物では、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１群における肝臓コレステロール含有量は有意に減少した（ｐ＜０．００１）（図５２Ｂ）。
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肝臓試料の組織学的分析を示す代表的な顕微鏡写真図を、図５３、図５５、図５７および図５９に示す。組織学の結果の概要を、図５４、図５６、図５８および図６０にグラフで示し、下記表２２に示す。
９週目〜１２週目間に治療された動物では、ビヒクル群由来のＨＥ染色肝臓切片は、重度の小滴性および大滴性の脂肪沈着、肝細胞風船様腫大、および炎症性細胞浸潤を示した（図５３Ａ−Ｂ）。ＰＥＧ−化合物１群は、ビヒクル群と比較したＮＡＳの有意な減少と共に、脂肪沈着、肝細胞風船様腫大、および炎症性細胞浸潤の著しい進行を示した（図５３Ｃ〜図５３Ｄ）。
９週目〜１５週目の間に治療された動物では、ＰＥＧ−化合物１群は、ビヒクル群（図５３Ｇ〜図５３Ｈ）と比較してＮＡＳの有意な減少と共に、脂肪沈着、肝細胞風船様腫大、および炎症性細胞浸潤（図５３Ｅ〜５３図Ｆ）の著しい進行を示した。
ＮＡＬＦＤ活性スコアの結果は、９週目〜１２週目および９週目〜１３週目の間に治療された動物について、図５４Ａ〜図５４Ｂにおいてグラフにそれぞれ示され、表２０に要約される。ＮＡＬＦＤ活性スコアは、両方の治療群で有意に減少した（９〜１２と９週目〜１５週週目の間に治療された動物について、それぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）。
Figure 0006702962
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９週目〜１２週目の間に治療された動物では、ビヒクル群に由来するシリウスレッド染色肝臓切片は、肝小葉の中心周囲の領域にコラーゲン沈着を示した（図５５Ａ〜図５５Ｂ）。図５６Ａに要約されるように、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群（図５５Ｃ〜図５５Ｄ）との間の線維症面積には有意差はなかった。
９週目〜１５週目の間に治療された動物では、ビヒクル群（図５５Ｇ−Ｈ）と比較して、図５６Ｂ（ｐ＜０．０５）に要約されるように、線維症面積は、ＰＥＧ−化合物１群（図５５Ｅ〜図５５Ｆ）において有意に減少した。
Ｆ４／８０免疫染色された切片の代表的な顕微鏡写真を図５７に示す。
９週目〜１２週目の間に治療された動物では、ビヒクル群由来の肝臓切片のＦ４／８０免疫染色は、肝小葉においてＦ４／８０＋細胞の実証された蓄積を形成する（図５７Ａ〜図５７Ｂ）。図５８Ａに要約されるように、ビヒクル群とＰＥＧ−化合物１群との間のＦ４／８０＋細胞の数およびサイズに有意差はなかった（図５７Ｃ〜図５７Ｄ）。
９週〜１５週に治療された動物では、図５８Ｂに要約されるように、ビヒクル群（図５７Ｅ〜図２７ＦＦ）とＰＥＧ−化合物１群（図５７Ｇ〜図５７Ｈ）と間のＦ４／８０＋細胞の数およびサイズに有意差はなかった。
オイルレッド染色切片の代表的な顕微鏡写真を図５９Ａ〜図５９Ｈに示す。
９週目〜１２週目に治療された動物では、ビヒクル群由来のオイルレッド染色肝臓切片は、肝細胞中の小滴性および大滴性脂肪沈着を示した（図５９Ａ〜図５９Ｂ）。ビヒクル群と比較して、図６０Ａ（ｐ＜０．００１）に要約されるように、脂肪沈着面積（オイルレッド陽性路油域）の割合は、ＰＥＧ−化合物１群において有意に減少した（図５９Ｃ〜図５９Ｄ）。
９週目〜１５週目に治療された動物では、図６０Ｂ（ｐ＜０．００１）で要約されるように、ビヒクル群（図５９Ｇ〜図５９Ｈ）と比較して、脂肪沈着面積の割合は、ＰＥＧ−化合物１群（図５９Ｅ〜図５９Ｆ）において有意に減少した。
Figure 0006702962
上に述べられるように、ＰＥＧ−化合物１は、ヘマトキシリンおよびエオシン、またはオイルレッドＯによる肝臓切片の染色の後、肝臓トリグリセリド含有量および組織学を測定する生化学のアッセイによって評価される肝臓の脂肪沈着を減少した。生来のＦＧＦ２１のこの抗脂肪性活性は、マウスにおいてアディポネクチンに依存すると文献で報告されている（各々その全体において参照により本明細書に援用される、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１７：７７９−７８９（２０１３）、Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １７：７９０−７９７（２０１３）を参照されたい）。したがって、総アディポネクチン濃度を、治療されたマウスから作製された終末血清試料において測定した。血清アディポネクチンを、市販のＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏカタログ番号４７−ＡＤＰＭＳ−Ｅ０１）を使用して、製造業者のプロトコルに従って測定した。
３ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物１の２度毎週の投与は、全ての試験した最終時点において、対応するビヒクル群と比較して、統計的に有意に血清総アディポネクチンを増加した（図６２）。この結果は、アディポネクチンがＳｔｅｌｉｃ ＮＡＳＨモデルにおいてＰＥＧ−化合物１の効能に寄与するという仮説と一致している。
要約すると、ＰＥＧ化合物１による３週間の治療は、肝重量体重比、肝臓脂質含有量（トリグリセリドおよびコレステロール）、脂肪沈着面積、およびＮＡＳを著しく減少した。これらの効果に加えて、ＰＥＧ−化合物１による６週間の治療は、全血グルコース、血漿ＡＬＴおよび線維症面積を著しく減少した。さらに、ビヒクル群と比較して、ＰＥＧ−化合物１治療は生存率を改善した。
結論として、ＰＥＧ−化合物１は、改善された脂質およびグルコース代謝を含む、抗ＮＡＳＨおよび抗線維症の効果を示した。
実施例１７
ｉｎ ｖｉｔｒｏで安定して−Ｋｌｏｔｈｏを発現するヒト胎児性腎細胞のＰＥＧ化された化合物２の特性評価。
ＦＧＦ２１は、その組織特異的なシグナル活性に対するＦＧＦ受容体と共にコレセプターとしてβｋｌｏｔｈｏを利用する（例えば、それぞれその全体において参照により本明細書に援用される、Ｋｕｒｏｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２６６８７−２６６９５、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｏｆ Ｓｃｉ．，ＵＳＡ １０４：７４３２−７４３７を参照されたい）。ＦＧＦ２１は、最初にβ−ｋｌｏｔｈｏに結合し、その後、該複合体がＦＧＦ受容体を活性化し、数分間に亘って細胞外のシグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）を急速に活性化する細胞内シグナル伝達カスケードを開始することができる。より長時間に亘り、活性化され、リン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）は細胞核へと移動することができ、Ｅ Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｉｘ（ＥＴＳ）様タンパク質１（Ｅｌｋ１）と呼ばれる三元複合体因子を含む、多くの転写調節因子をリン酸化し活性化すルことができる。活性化されたＥｌｋ１は、特定の遺伝子の発現を調節するため、特定のＤＮＡ塩基配列に結合する血清刺激応答因子と共に複合体を形成する。
トβ−ｋｌｏｔｈｏおよびＥｌｋ１ルシフェラーゼトランス−リポーターコンストラクトを安定して共発現する細胞株の作製
Ｅｌｋ１ルシフェラーゼトランス−レポーティング細胞株は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅのＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ Ｅｌｋ１ ｔｒａｎｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを利用してＨＥＫ２９３細胞で生成された。この系は、酵母転写活性化因子タンパク質であるＧａｌ４からのＤＮＡ結合ドメインの融合タンパク質を発現する、トランス活性化因子融合プラスミド、それに続くＥｌｋ１の活性化ドメインを有する。転写活性化因子、Ｅｌｋ１がＦＧＦ２１による刺激で細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）によってリン酸化され、活性化される場合、融合アクティベータプロテインは二量体としてＧＡＬ４上流の活性化配列に結合し、ルシフェラーゼレポーター酵素の転写を活性化する。レポータープラスミドからのルシフェラーゼ発現は、融合トランスアクティベータプロテインの活性化を示し、したがって内因的なプロテインキナーゼの存在を示す。したがって、ルシフェラーゼ活性は、細胞および対応する信号伝達経路におけるＥＲＫの活性化、この場合はＥｌｋ１の活性化を反映する。
ＨＥＫ２９３細胞は、融合トランス−アクチベータプラスミド、レポータープラスミドおよびヒトβ−ｋｌｏｔｈｏをコードするプラスミドでコトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は、Ｇ−４１８（５００μｇ／ｍｌ）およびブラストサイジン（１０μｇ／ｍｌ）の選択の下にあった。２重の抗生物質選択から生存クローンを、ＦＧＦ２１コンストラクトで刺激し、その後Ｅｌｋ１ルシフェラーゼ活性により分析した。ＨＥＫ Ｌｕｃ クローン２を、全て将来のアッセイのための細胞株として選択した。
細胞に基づくＥｌｋ１ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３ Ｌｕｃクローン２細胞を、１ウェル当たり２５，０００個の細胞の密度で９６ウェルプレートに蒔いた。プレートを、２日間に亘って５％ＣＯ２で３７℃にて組織培養インキュベーターの中でインキュベートした。アッセイの日、ＦＧＦ２１タンパク質の３倍系列希釈シリーズを、１×Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２〜ｐＨ７．５、および１０％ＦＢＳで補足されたフェノールレッド不含ＤＭＥＭダルベッコ変法イーグル培地中に作製した。古い細胞培養増殖培地を除去した。治療を始めるため、試験する化合物を含む５０μｌのフェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地を、各ウェルに添加し、プレートを細胞培養インキュベーターに戻した。５時間のインキュベーションの終了時、等容量のルシフェラーゼ基質試薬混合物を各ウェルに添加した。プレートを覆い、６００ｒｐｍで３分間に亘ってオービタルシェーカーに置いた。発光をＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ上で測定した。
データ分析
全ての個々の複製測定点からの生データを、非線形回帰分析を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム５ソフトウェア（カリフォルニア州のＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社）で分析した。データは、４つのパラメーター：底（最小）、頂上（最大）、ｌｏｇ ＥＣ５０（効力の基準）および Ｈｉｌｌ ｓｌｏｐｅ変数による応答方程式に対して対数（アゴニスト）を使用して適合された効力（ＥＣ５０）は、ベースラインの上の応答の最大半量の増加をもたらす濃度として定義され、カーブフィッティングプログラムによって計算された。
結果
３つのＦＧＦ２１変異体（Ｎ−末端Ｈｉｓタグ付き化合物１（Ｈｉｓ−化合物１）、ＰＥＧ−化合物１およびＰＥＧ−化合物２）に関する代表的な濃度−反応曲線、ならびに５時間のＥｌｋ１ルシフェラーゼアッセイにおいて計算された効力および効能の値は、図６３および表２３に示される。３つの変異体の効力は、５時間のＥｌｋ１ルシフェラーゼアッセイにおいて類似した（表２３）。
Figure 0006702962
ａ 平均±Ｓ．Ｄ。
ｂ 幾何平均（９５％信頼区間）
ｃ 対照は、Ｈｉｓ−化合物１として定義された。
ｄ Ｐ＜０．０５、Ｈｉｓ−化合物１と比較、ＡＮＯＶＡと共にテューキー−クレーマーポストホック検定と共に分散分析と比較された。
様々なＦｃ−ＦＧＦ−２１融合分子を、細胞に基づくＥｌｋ１ルシフェラーゼアッセイにおいて比較した。化合物１８０および化合物１７５以外の全ての分子が、一桁以下のｎＭ効力を示し、ＰＥＧ化合物２の測定された力価に匹敵するか、またはそれよりも低かった（図６４および下記表２４）。
Figure 0006702962
実施例１８
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるアディポネクチンレベルに対するＦＧＦ−２１の変異体化合物の効果
ＦＧＦ２１は、脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌を刺激し、それによってＦＧＦ２１の作用が他の組織まで及ぶ、アディポネクチン受容体の広い分布は可能性のある方法を提供する。その抗脂肪性活性を含む生来のＦＧＦ２１の代謝効果の多くは、マウスにおいてアディポネクチンを必要とすると報告された（各々、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｌｉｎ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１７：７７９−７８９（２０１３）、Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １７：７９０−７９７（２０１３））。本実施例は、正常、非糖尿病のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＦＧＦ２１活性の選択された薬力学的マーカーに対するＰＥＧ化合物２の単回漸増投与量の効果を報告する。
８週齢の老齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、以下の治療群（例数ｎ＝１０／群）：１）ビヒクル、２）ＰＥＧ化合物２、０．０３ｍｇ／ｋｇ、３）ＰＥＧ化合物２、０．１ｍｇ／ｋｇ、４）ＰＥＧ化合物２、０．３ｍｇ／ｋｇまたは５）ＰＥＧ化合物２、１．０ｍｇ／ｋｇに無作為化し、５ｍｌ／ｋｇでそれぞれの治療を皮下に投薬した。非絶食状態での投薬の後、血液サンプルを遠心分離機し、２０μｌ血漿を、総アディポネクチンおよび高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチンの定量決定のため等分した（ニューハンプシャー州セーレムのＡｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号４７−ＡＤＰＭＳ−Ｅ０１）。単回の急性投薬の後、２４時間、４８時間、７２時間および１４４時間、血漿ブドウ糖およびアディポネクチンの分析のため、マウスを非絶食状態で再び採血し、各採血に先立って体重を測定した。
全アディポネクチンおよび高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチンの血漿中濃度は、マウス全およびＨＭＷ ＥＬＩＳＡキット（ニューハンプシャー州セーレムのＡｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に関する製造業者プロトコルプロトコルに従って測定された。ＰＥＧ−化合物２の血漿暴露は、ＥＬＩＳＡによって決定された。全てのデータの統計学的分析は、対照としてのビヒクル群（ノースカロライナ州ケーリー、ＳＡＳからのＪＭＰ）を使用して、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡの後のダネットのｔ検定を使用して行なわれた。統計的有意差を確率（Ｐ）＜０．０５で決定した。
体重を、治療後２４時間、４８時間、７２時間および１４４時間にベースライン（０）で決定した。ベースライン（０日目）の体重からパーセント変化に変換される場合、著しい用量依存的な減少が、ＰＥＧ−化合物２の単回ＳＣ投与に応じて観察された（図６５）。
パーセント減量効果は、投薬後７２時間で最大であり、１．０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＥＧ−化合物２に対する応答はビヒクル群のそれと比較して著しく減少したまま、６日目までにベースライン値に戻り始めた。７２時間における０．３ｍｇ／ｋｇの治療群に対して（Ｐ＜０．００１）、ならびに４８時間（Ｐ＜０．０５）、７２時間（Ｐ＜０．０００１）および１４４時間（Ｐ＜０．００１）における１．０ｍｇ／ｋｇの治療群に対して、体重は、ビヒクル治療群と比較して著しく減少した。
血漿全アディポネクチン濃度は、投薬後７２時間および１４４時間で０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＥＧ−化合物２による治療によってビヒクルに対して、著しく増加された（図６６Ａ）。０．０３ｍｇ／ｋｇの用量の試験したＰＥＧ−化合物２は、測定されたどの時点でもビヒクルと比較して、全アディポネクチン結果を著しく増加させなかった。血漿総アディポネクチンは、０．１ｍｇ／ｋｇの治療群において７２時間（Ｐ＜０．００１）および１４４時間（Ｐ＜０．０１）、０．３ｍｇ／ｋｇの治療群において７２時間（Ｐ＜０．０１）および１４４時間（Ｐ＜０．０１）、ならびに１ｍｇ／ｋｇの治療群において７２時間（Ｐ＜０．０００１）および１４４時間（Ｐ＜０．０００１）に有意に増加された。
ベースラインからパーセント変化として表される場合、血漿総アディポネクチン濃度は、いくつかの時点でＰＥＧ−化合物２の全ての用量による治療によって、ビヒクルと比較して、著しく増加された（図６６Ｂ）。ＰＥＧ−化合物２の任意の用量による治療後２４時間、および投薬後７２時間でビヒクルと比べて、総アディポネクチンにおいてベースラインからのパーセント変化に有意差はなく、ビヒクルと比較して、全ての用量のＰＥＧ−化合物は、統計学的に有意な増加をもたらした。観察された最大の変化は、１ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−化合物２による投薬後１４４時間のベースラインアディポネクチンからの変化における７５％の増加であった。血漿総アディポネクチンにおけるパーセント変化を、０．０３ｍｇ／ｋｇの治療群において７２時間（Ｐ＜０．０１）、０．１ｍｇ／ｋｇの治療群において４８時間（Ｐ＜０．０１）、７２時間（Ｐ＜０．０００１）、および１４４時間（Ｐ＜０．００１）、０．３ｍｇ／ｋｇの治療群において７２時間（Ｐ＜０．０００１）、および１４４時間（Ｐ＜０．０００１）、ならびに１．０ｍｇ／ｋｇの治療群において４８時間（Ｐ＜０．０１）、７２時間（Ｐ＜０．０００１）、１４４時間（Ｐ＜０．０００１）に有意に増加した。
血漿ＨＭＷアディポネクチン濃度は、０．１ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＥＧ化合物２による治療によって、ビヒクルと比較して、著しく増加されたのに対し、測定されたどの時点でも、ビヒクルと比較して、０．０３ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇの用量のＰＥＧ化合物２はＨＭＷアディポネクチンを著しく増加させなかった（データは示されない）。
治療の１４４時間後の研究の終了時に測定される場合、ＰＥＧ−化合物２の血漿濃度は、表２５の活性な、カルボキシ（Ｃ）末端インタクトおよび全（インタクトおよびタンパク質分解された）形態の分子の両方に対して用量依存的に増加した。
Figure 0006702962
ＳＣ投薬後１１４時間のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス血漿における合計およびＣ末端インタクトＰＥＧ化合物２
全ての値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
９週〜１１週の高齢Ｃ５８ＢＬ／６Ｊマウスにより、ＰＥＧ−化合物２０、化合物１０５、化合物１１２、化合物１８２、化合物１７１、化合物１７０、化合物１８１、およびＰＥＧ−化合物１を用いて、総アディポネクチンをベースライン、投薬後３日目（７２時間）および６日日目（１４４時間）に測定したのみであることを除き、同様のプロトコルに従った。化合物は、ＨＥＫ細胞において発現された化合物１８１以外は、Ｅ．コリにおいて発現された。全ての化合物は、ビヒクルと比較して、３日目および６日目の所定の試験した用量で血漿総アディポネクチンを有意に増加させた（図６７Ａ−Ｅを参照）。
０．３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇの投薬量では、ＰＥＧ化合物２およびＰＥＧ化合物２０は各々、６日目の投薬後に血漿総アディポネクチンの有意な増加をもたらした（１ｍｇ／ｋｇのいずれかの化合物に対してＰ＜０．００１、０．３ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−化合物２に対してＰ＜０．０１、および０．３ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−化合物２０に対してＰ＜０．０５）（図６７Ａ）。
５４．３ｎｍｏｌ／ｋｇの投薬量では、血漿総アディポネクチンにおけるベースラインからのパーセント変化は、（ビヒクル治療対象と比較して）３日目および６日目のＰＥＧ−化合物２、化合物１０５および化合物１１２によって有意に増加された（３日目のＰＥＧ−化合物２、Ｐ＜０．０５以外の全ての測定点に対してＰ＜０．００１）（図６７Ｂ）。さらに、ビヒクル治療対照と比較して、５．４３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の化合物１１２は、３日目のみ血漿総アディポネクチンにおけるパーセント変化を有意に増加させた（Ｐ＜０．０５）（図６７Ｂ）。
血漿総アディポネクチンにおけるベースラインからのパーセント変化は、１８．１ｎｍｏｌ／ｋｇ（Ｐ＜０．０１、３日目および６日目の両方）、および５４．３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量（３日目および６日目でそれぞれＰ＜０．００１およびＰ＜０．０５）で化合物１８２によって有意に増加された（図６７Ｃ）。５．４３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の化合物１８２に対する血漿総アディポネクチンにおけるパーセント変化の増加は、６日目のみ有意であった（Ｐ＜０．０５）。さらに、ＰＥＧ化合物２（５４．３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量）は、３日目および６日目の両方の血漿総アディポネクチンにおけるパーセント変化を増加させた（Ｐ＜０．００１、両方の日）（図６７Ｃ）。
血漿総アディポネクチンにおけるベースラインからのパーセント変化は、ビヒクル治療対照と比較して、３日目および６日目の両方において、用量依存的な様式で化合物１７１および化合物１８１の両方によって有意に増加された（６日目の用量５．４３ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物１８１に対してＰ＜０．０１を除き、全ての測定点に対してＰ＜０．００１）（図６７Ｄ）。さらに、ＰＥＧ化合物２（５４．３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量）は、３日目および６日目の両方の血漿総アディポネクチンにおけるパーセント変化を増加させた（Ｐ＜０．００１、両方の日）（図６７Ｄ）。
血漿総アディポネクチンにおけるベースラインからのパーセント変化は、１８．１ｎｍｏｌ／ｋｇ（Ｐ＜０．０１、両方の日）および５４．３ｎｍｏｌ／ｋｇ（Ｐ＜０．０５、３日目、およびＰ＜０．００１、６日目）の３日目および６日目の化合物１７０によって有意に増加され；５．４３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の血漿総アディポネクチンにおけるパーセント変化の増加は、６日目においてのみ有意であった（Ｐ＜０．０５）（図６７Ｅ）。さらに、ＰＥＧ化合物２（５４．３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量）は、３日目および６日目の両方の血漿総アディポネクチンにおけるパーセント変化を有意に増加させた（Ｐ＜０．００１、両方の日）（図６７Ｅ）。
血漿総アディポネクチンにおけるベースラインからのパーセント変化は、３日目および６日目の用量１０ｍｇ／ｋｇの化合物１によって有意に増加された（Ｐ＜０．００１、両方の日）。さらに、ＰＥＧ化合物２（１ｍｇ／ｋｇ）は、６日目の血漿総アディポネクチン中の変化率を有意に増加させた（Ｐ＜０．００１）（図６７Ｆ）。
実施例１９
ｄｂ／ｄｂマウスにおける糖尿病性腎疾患に対する効果
片腎摘出された（ｕｎｉｘ）ｄｂ／ｄｂマウスは、糖尿病性腎疾患（ＤＫＤ）の齧歯類モデルであり、１つの腎臓の外科の摘除は、２型糖尿病に起因する腎傷害および機能障害を悪化および加速する（その全体において参照により本明細書に援用される、Ｎｉｎｉｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ １２：３５１−３５５（２００７））。
４週間試験
この研究では、糖尿病性腎症の発症を促進するため、８週齢のｄｂ／ｄｂマウスを５％イソフルランによる麻酔下で左腎摘出に供した。１４匹の片腎摘出マウスの群を、クレアチニン比（ｕＡＣＲ）、血糖および体重の順で尿アルブミンによる無作為化に基づいて、ＰＥＧ化合物２またはビヒクル治療のいずれかに分布した。ｄｂ／ｍの非肥満（ｌｅａｎ）マウスの群（ｎ＝１２）を、非糖尿病の正常な対照として割り当てた。ＰＥＧ化合物２またはビヒクルのいずれかによる治療は、片腎摘出ｄｂ／ｄｂマウスにおいて手術後３週に開始した。０．１５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物２を、２５０のｍＭスクロース、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３を含むビヒクル中、皮下（ＳＣ）注射によって毎週２回（ＢＩＷ）投与した。ベースライン血液サンプルを、５％イソフルランによる麻酔下の眼窩後出血により収集した。尿中ブドウ糖、アルブミンおよびクレアチニンの測定のための複数の３時間のスポット採尿は、ベースラインおよび２週間、３週間および４週間の治療後に各マウスから得られた。
４週間の治療後、イソフルラン麻酔下でマウスを犠牲した。データの統計学的分析は、別段の指定がない限り、一元配置分散（ＡＮＯＶＡ）分析の後のダネットの検定を使用して行なわれた（ノースカロライナ州ケーリーのＳＡＳ、ＪＭＰ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）。統計学的有意差を、確率（Ｐ）＜０．０５で決定した。重症腎盂腎炎を示したことから、ｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂビヒクル群の４匹のマウスをデータ分析（食物および水分の摂取以外）から除外された。
ＰＥＧ−化合物２群およびビヒクル群は、治療に先立ってベースラインで同様の血漿ブドウ糖のレベルを示した（７６５±４２ｖｓ８１５±４６、Ｐ＞０．０５）。研究の終了時、４週間の治療の後、ＰＥＧ−化合物２群における血漿ブドウ糖は、ビヒクル群より２３％低かった（４８５±３９ｖｓ６２９±４３、Ｐ＜０．０５）（表２６を参照）。
Figure 0006702962
ａ．データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表わされる。
ｂ．Ｐ＜０．０５、疾患（ｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂ、ビヒクル、ｎ＝９）対正常（ｄｂ／ｍ、非肥満、ｎ＝１０）。
ｃ．Ｐ＜０．０５、ＰＥＧ−化合物２（ｎ＝１４）対ビヒクル（ｎ＝９）。
ＰＥＧ化合物２による治療開始の後、尿中ブドウ糖レベルは次第に減少した。ビヒクル群と比較した場合、ＰＥＧ−化合物２群の尿グルコースレベルは２週間、３週間および４週間の治療でそれぞれ７１％、７３％および８４％の著しい減少を示した（全てＰ＜０．０５；表５）。
Figure 0006702962
ａ データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表される。
ｂ Ｐ＜０．０５、疾患（ｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂ、ビヒクル、ｎ＝９〜１０）対正常（ｄｂ／ｍ非肥満、ｎ＝１０〜１２）。
ｃ Ｐ＜０．０５、ＰＥＧ−化合物２（ｎ＝１３〜１４）対ビヒクル（ｎ＝９〜１０）．
微量アルブミン尿（３０μｇ／ｍｇ超のクレアチニンに対する尿アルブミン比（ｕＡＣＲ））は、糖尿病患者における初期のネフロパシーの最も感受性で最も特異的な指標のうちの１つであると文献に報告されている（その全体において参照により本明細書に援用される、Ｃｈａｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０１２；２７：７８４−７８７を参照されたい）。微量アルブミンを３時間のスポット採尿から測定し、値を尿クレアチニンに対して標準化した。非糖尿病ｄｂ／ｍ非肥満マウスは、試験課程の間２１μｇ／ｍｇ〜３７μｇ／ｍｇの範囲の平均ｕＡＣＲ値を有した（図６８および表２８）。
試験中、ｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂマウスにおけるｕＡＣＲは、非糖尿病の非肥満ｄｂ／ｍマウスと比較して、６２倍〜２３倍（全てＰ＜０．０５）まで著しく増加した（図６８および表２８）。ビヒクル治療群のｕＡＣＲは、進行性の腎損傷と一致して、４週間後にベースラインにおける８３８±１５９μｇ／ｍｇから１３４１±２８４μｇ／ｍｇまで進行した（表２８）。
ビヒクル群と比較すると、ＰＥＧ−化合物２治療ｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂマウスは、２週間、３週間および４週間の治療により、それぞれ４９％、５３％および６６％のｕＡＣＲ値の著しい減少を示した（全てＰ＜０．０５；図６８）。ＰＥＧ−化合物２治療後のｕＡＣＲ値は、前処理ベースラインで測定されたものより低かった（表２８）。
Figure 0006702962
腎臓湿重量は、糖尿病における過剰濾過に起因する腎肥大の状態を反映する。非糖尿病非肥満マウスと比較すると、ｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂマウスにおける平均腎臓重量は著しく大きく、ビヒクルで治療されたｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂマウスの腎臓重量の５９％の増加を有した。４週間に亘るＰＥＧ化合物２による治療は、糖尿病マウスにおける腎臓重量の増加を有意に阻害した（２８６±６．３対２５３±７．４、ビヒクル対ＰＥＧ化合物２、Ｐ＜０．０５）。
８週間試験
８週齢において、糖尿病腎症の発症を加速するため、ｄｂ／ｄｂマウスを酸素中３％のイソフルランの下で左腎摘出に供した。片腎摘出の３週間後、１４匹の片腎摘出マウス群をブロックし（ｂｌｏｃｋｅｄ）、無作為化して、クレアチニンに対する尿アルブミン比（ｕＡＣＲ）、血糖および体重の順に基づいて、０．１５ｍｇ／ｋｇもしくは０．０１５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物２、またはビヒクル治療のいずれかに分配した。ｄｂ／ｍ非肥満マウス（ｎ＝１１）群は、非糖尿病の正常な対照として割り当てられた。ｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂマウスにおける０．１５ｍｇ／ｋｇもしくは０．０１５ｍｇ／ｋｇのいずれかのＰＥＧ化合物２、またはビヒクルによる週２回の皮下治療は、手術から３週間後に開始された。８週間の治療後、酸素中３％のイソフルランに続いて頸椎脱臼によりマウスを犠牲した。腎臓を切除し、皮膜を取り（ｄｅｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）、計量した。
用量０．０１５ｍｇ／ｋｇの群は、顕著な血糖降下または腎パラメーターの改善を示さなかった。０．１５ｍｇ／ｋｇの用量のＰＥＧ化合物２は、ビヒクル治療マウスのものと比較して、血液および尿中ブドウ糖レベルを著しく低下させ、タンパク尿を約５０％減少した（全て、Ｐ＜０．０５）。炎症性および線維症の遺伝子のクラスタは、片腎摘出されたｄｂ／ｄｂマウス対非肥満マウスの腎臓において著しく上方制御され、０．１５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−化合物２による治療は、非肥満ｄｂ／ｍ対照マウスにおいて見られるレベルに対してこれらの遺伝子の発現を著しく減少した。また、片腎摘出されたｄｂ／ｄｂマウスにおける平均腎臓湿重量は、非肥満マウスと比較して、著しく高く、また、５７日間の０．１５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物２による治療は、ビヒクルと比較して、著しく平均腎臓湿重量を減少した。
腎臓の中間１／３からの切片を、組織学的分析のためヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。腎臓病変は、表２９に対する注意書きに定義された基準によって採点された。全てのｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂ マウスは、このモデルの予想される表現型である、メサンギウムの糸球体症を示した（表２９）。０．０１５ｍｇ／ｋｇではなく０．１５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物２による治療は、メサンギウムの糸球体症の重症度を低下させるように見えた。数匹のｕｎｉｘ ｄｂ／ｄｂマウスは、上記モデルの根本的な病原論と一致する糸球体症に次いで尿細管−間質性病変を示した。
これらの観察は、０．１５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物２が慢性の２型糖尿病の状況において腎保護的であるという証拠を提供する。
Figure 0006702962
ａ糸球体のメサンギウム拡大は、限局性または拡散性であり、帯状または包括的である。グレード２は、メサンギウム拡大、および／または少なくとも１つの糸球体中の更なるメサンギウム、毛細管、上皮、または被膜の病変を有する５０％超の糸球体の推定値に基づく。グレード３は、これらの追加の糸球体病変の２つ以上に基づく。
ｂ尿細管病変は、拡張、萎縮、および／または過形成を含む；間質性病変は、典型的には糸球体の病変に関係し、最小の炎症または局所的な尿細管周囲の線維症を特徴とする。グレード１は限局性である；グレード２は２〜４の病巣を有する多病巣性である。
ｃ化膿性炎症；グレード１は腎盂上皮に限定される炎症に基づく；グレード２は腎盂髄質または腎盂周囲皮質の中への拡張に基づく。
実施例２０
イソプロテレノールを注入したＢａｌｂ／Ｃマウスにおける心臓肥大および心臓線維症に対する効果
イソプロテレノール（Ｉｓｏ）−注入Ｂａｌｂ／ｃマウスは、心臓線維症および肥大の齧歯動物モデルである。
１０〜１２週の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、薬の投与に先立って体重に基づいて無作為化した。Ｉｓｏまたはビヒクル（食塩水中の０．０２％のアスコルビン酸）は、３つの作品用の浸透のミニポンプによって皮下に投与された。３週間に亘って０．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物２またはビヒクルを同時に毎週２度（ＢＩＷ）マウスに投薬した。その後、動物を安楽死させ、心臓を大血管で摘除し、心室中のいかなる血液も除去するため軽くブロットした後、計量した。各群の残りの２４匹のマウスに由来する心臓全体をドライアイス上で凍結し、ヒドロキシプロリン（ＨＰ）分析のために−７０℃で保存した。
心臓ＨＰ含有量（心臓線維症エンドポイント）分析は、製造業者の指示（オランダ国Ｑｕｉｃｋｚｙｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って、総コラーゲンアッセイキットを使用して行った。
３週間の存命相の終わりに、全心臓ＨＰ含有量を測定した。標準化されたＨＰ含有量は、シャム＋ビヒクル群（９．９６±０．３８μｇ／ｍｇ）と比較して、Ｉｓｏ＋ビヒクル群（２１．３５±０．８１μｇ／ｍｇ）で１１４％（Ｐ＜０．０５）増加した。これは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＩｓｏ注入に応答して心臓線維症が確立されたことを示した。Ｉｓｏ＋ＰＥＧ化合物２（０．５ｍｇ／ｋｇ）（１５．９１±０．４９μｇ／ｍｇ）を受けるマウスの心臓ＨＰ含有量は、Ｉｓｏ＋ビヒクル動物におけるよりも有意に少なかった（図６９および表３０）。したがって、予防の方式で投与された場合、ＰＥＧ化合物２（０．５ｍｇ／ｋｇ）は心臓肥大および線維症の範囲を減少した。
Figure 0006702962
ＰＥＧ−ＦＧＦ２１変異体による３週間の治療を開始する前に、１週間のＩｓｏが既に注入されていたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物２が、予め確立されている心臓肥大および線維症の進行を遅らせる、または逆転させることができるかどうかを特定するため、介入研究を行った。ＰＥＧ化合物２（０．５ｍｇ／ｋｇ）の介入は、左心室（ＬＶ）質量（心エコー検査によって評価された心臓肥大エンドポイント）の２４％の減少をもたらした。この観察は、著しい、体重の１４％の減少、およびアディポネクチンの循環レベルの２３％の上昇と関連した。心臓線維症（ＨＰ含有量）または収縮期の心臓機能（心エコー装置によって測定される）において、Ｉｓｏ＋ビヒクル群とＩｓｏ＋ＰＥＧ化合物２群の間で有意差は観察されなかった。
実施例２１
ＰＥＧ化合物２の健康な被験体における安全性、認容性、薬物動態学および薬力学を評価するための無作為化、プラセボ対照、単回および複数用量漸増試験
上記研究は、３部からなる：Ａ部：単回投与量漸増（ＳＡＤ；Ｂ部：複数投与量漸増（ＭＡＤ）；およびＣ部：日本人被験体における複数投与量漸増（Ｊ−ＭＡＤ）。ＰＥＧ化合物２またはプラセボは、盲検化治療として皮下注射によって投与される。Ａ部の被験体は、盲検化治療の単回投与を受ける、Ｂ部およびＣ部の被験体は、盲検化治療の複数回投与を受ける。
ＳＡＤにおいて、０．６ｍｇのＰＥＧ化合物２の開始用量が選択される。また、見積もられた効果的な用量範囲の高用量域を調査するため、ＳＡＤにおける最大用量、およびＭＡＤに対する６０ｍｇの毎週の用量を選択する。被験体は、ＳＡＤ部門において０．６ｍｇ、２ｍｇ、６ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、または最大６０ｍｇのＰＥＧ−化合物２の用量を受ける場合がある。ＭＡＤ部門では、被験体は、２ｍｇ、６ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇまたは６０ｍｇ（ＱＷまたはＢＩＷ）の毎週の用量を受ける場合がある。
３０〜４０（Ａ部およびＢ部）、または２０〜３５（Ｃ部）のＢＭＩを有する２１歳〜５５歳の健康な男女の被験体が含まれ得る。
主要エンドポイント：
目的（健康な被験者におけるＰＥＧ化合物２の単回および複数回の皮下投与の安全性および認容性の評価）は、以下の安全性エンドポイント：ＡＥの発生率、重大なＡＥ、および注射部位評価を含む、特殊な目的の事象、停止に結びつくＡＥ、および死亡、また同様に、臨床検査試験における著しい異常、バイタルサイン測定、ＥＣＧ、研究医薬品の最後の用量から３０日以内の理学的検査によって測定される。
副次エンドポイント：
Ａ部：単回用量治療の日、および該単回用量後の４週間のまで洗い出し（ｗａｓｈｏｕｔ）の間の、単回用量後のＣ末端インタクトＰＥＧ化合物２血清濃度対時間データに由来する単回用量の薬物動態学的パラメーター（Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ（０Ｔ）、ＡＵＣ（ＩＮＦ）、Ｔ−ＨＡＬＦおよびＣＬＴ／Ｆ）。
Ｂ部およびＣ部：第１の用量および最後の用量の後のＰＥＧ化合物２の血清濃度対時間データに由来するパラメーター（Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ（ＴＡＵ）および蓄積インデックス（ＡＩ））。Ｔ−ＨＡＬＦは、最後の用量に対してのみ計算される。ＰＥＧ化合物２のトラフ値血清濃度（ＣＴｒｏｕｇｈ）は、２２日間の治療の間、および最後の用量の後の４週以内の選択された日に得られるであろう。
実施例２２
ＮＡＳＨマウスモデルにおけるＰＥＧ化合物１、ＰＥＧ化合物２、および化合物１７０の評価
３つのＦＧＦ−２１変異体、ＰＥＧ化合物１、ＰＥＧ化合物２および化合物１７０を、上の実施例１３に記載される、Ｓｔｅｌｉｃ研究所の２−ｈｉｔ ｍｏｄｅｌのＮＡＳＨモデルにおいて試験した。ＮＡＳＨは、４０匹の雄性マウスにおいて、生後２日に２００μｇストレプトゾトシン溶液の単回の皮下注射によって誘導され、４週齢の後高脂肪食（ＨＦＤ；ｋｃａｌで５７％脂肪）を摂取していた、（「ＳＴＡＭマウス」）。７週齢〜９週齢の間、１週間当たり２回の皮下経路によって、３ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物１（ｎ＝８）、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化合物（ｎ＝８）、２．５ｍｇ／ｋｇの化合物１７０（ｎ＝８）２、またはビヒクル（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５０ｍＭスクロース、ｐＨ ８．３）（ｎ＝８）をマウスに投与した。様々な分析のため、９週齢でこれらのマウスを犠牲した。８匹のマウスの別の群は、基線対照としての役割を果たし、７週齢で犠牲された。
総アディポネクチンおよび高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチンの濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ カタログ番号４７−ＡＤＰＭＳ−Ｅ０１）を使用して、製造業者のプロトコルに従い、マウスから作製すされた末端血清試料中で測定した。ビヒクル群と比較すると、３つ全てのＦＧＦ２１変異体が、血清総アディポネクチンを有意に増加させ（図７０Ａ）（ＰＥＧ−化合物１、ＰＥＧ−化合物２、および化合物１７０に対してｐ＜０．０００１）、血清ＨＭＷアディポネクチン（図７０Ｂ）（ｐ＜０．００５、ＰＥＧ−化合物１；ならびにｐ＜０．０００１、ＰＥＧ−化合物２、および化合物１７０）、ならびにＨＭＷ／総アディポネクチンの比率（図７０Ｃ）（ｐ＜０．０５、ＰＥＧ化合物１；ならびにｐ＜０．０１、ＰＥＧ化合物２、および化合物１７０）。
体重、肝臓重量、肝臓トリグリセリド、肝臓コレステロールおよび血漿ブドウ糖、トリグリセリド、ならびにＡＬＴレベルが決定された。３つ全てのＦＧＦ２１変異体が、体重（図７２Ａ）、肝臓重量（図７２Ｂ）、肝臓対体重の比率（図７２Ｃ）、肝臓トリグリセリド（図７２Ｄ）、および血漿ＡＬＴ（図７２Ｅ）を著しく減少した。ＰＥＧ化合物２および化合物１７０は肝臓コレステロールを著しく減少し（図７２Ｆ）、ＰＥＧ−化合物２は血漿トリグリセリドを著しく減少した（図７２Ｇ）。この研究において、いずれの化合物も血漿コレステロールまたはグルコースを著しく減少しなかった（データは示されていない）。
実施例２３
ｏｂ／ｏｂマウスにおける３週間のＢＩＷ投薬中のＰＥＧ化合物２および化合物１７０ 評価
ＰＥＧ化化合物２および化合物１７０は、２１日間の反復投薬研究で評価された。結果は、ビヒクルと比較して、肝臓の外側左葉において、両方の化合物が肝臓重量の減少および肝細胞脂肪症の用量依存的な減少を引き起こしたことを実証する。
８週齢の雄性ｏｂ／ｏｂマウス（メーン州バーハーバーのＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、実施例１２に記載される５つの群へと無作為化された。マウスに毎週２回（ＢＩＷ）皮下にビヒクル、ＰＥＧ化化合物２、および化合物１７０を以下の通り投与した。
１）ビヒクル（２５０ｍＭスクロース／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３）；
２）ＰＥＧ化化合物２（８．１４ｎｍｏｌ／ｋｇ（０．１５ｍｇ／ｋｇ））；
３）化合物１７０（８．１４ｎｍｏｌ／ｋｇ）；
４）ＰＥＧ化化合物２（８１．４５ｎｍｏｌ／ｋｇ（１．５ｍｇ／ｋｇ））；および
５）化合物１７０（８１．４５ｎｍｏｌ／ｋｇ）。
給餌状態で２１日間の投与期間を通して、体重、血漿ブドウ糖、トリグリセリド、インスリン、非エステル結合型脂肪酸（ＮＥＦＡ）、β−ＯＨ酪酸塩、総アディポネクチン、および高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチンを特定した。全血中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を、研究開始時および終了時に決定した。肝臓重量および肝臓トリグリセリドを研究終了時に決定した。肝臓組織学を、肝細胞脂肪症を評価するために肝臓の外側左葉で行った。組織を１０％中性ホルマリン中で固定し、組織学用に処理加工した。パラフィン包埋された組織の切片を、標準的な方法を使用して、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。各治療群の中の最初の６匹のマウスを評価した（合計３０匹のマウス）。肝細胞脂肪症（マイクロかつマクロの小胞性の脂肪変化）は、対照マウスにおいて区域ＩＩ／ＩＩＩにほぼ限定され。この程度の脂肪症は、便宜的に等級（スコア）２に割り当てられた。他の試料は、盲検法（観察された最も低い程度の脂肪症に割り当てられた等級０）で採点された。さらに、推測上は星状（伊藤）細胞である、脂質蓄積類洞周囲細胞は、伊東細胞が肝細胞脂肪症によって不明瞭になったビヒクルではなく、ＰＥＧ化合物２または化合物１７０のいずれかで治療されたマウスにおいて観察された。伊東細胞の存在量は、盲検法（計数せずに）で評価され、各試料を、半定量的評価を提供するため便宜的に採点した（スコア３は最も高い存在量を示す）。
両方の化合物の両方の用量は、正常血糖のレベル（データは示されていない）への供給されたグルコースを著しく減少し、血漿インスリンおよびＨｂＡ１ｃ（データは示されていない）を著しく減少した。ビヒクルに対する高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチンの著しい増加は、量依存性の傾向を伴って、８日目〜２１日目に観察されたのに対し、血漿総アディポネクチンは、いくつかの小さいが一貫しないビヒクルに対する増加を実証した（データは示されていない）。血漿ＮＥＦＡおよびβ−ＯＨ酪酸塩は、いずれも両方の化合物（特に高用量で）ビヒクルに対して増加し、脂肪酸酸化の増加を示唆した。絶対肝臓重量および体重に対して補正された肝臓重量の両方における有意な減少は、全ての治療群の２１日目に観察された（図７１Ａおよび７１Ｂ）。特に、ＦＧＦ−２１変異体で治療された４つ全ての群において、ビヒクル対照と比較して、絶対肝臓重量は有意に減少し（ｐ＜０．０００１）、ＰＥＧ化合物２のより高い用量は、より低い用量のその化合物と比較して絶対肝臓重量を有意に減少させた（ｐ＜０．０５）（図７１Ａ）。さらに、ＦＧＦ−２１変異体で治療された４つ全ての群において、ビヒクル対照と比較して肝臓重量対体重の比率は有意に減少した（ｐ＜０．０００１）（図７１Ｂ）。肝細胞脂肪症の重症度の用量依存的な減少が、ビヒクルと比較して、ＰＥＧ化合物２または化合物１７０のいずれかで治療されたマウスで観察された（表３１）。ＰＥＧ化合物２および化合物１７０で治療されたマウス由来の切片において、脂質蓄積類洞周囲細胞（推測上、伊東細胞または肝臓星細胞）が観察された（表３２）が、ビヒクルで治療されたマウス由来の切片においては、肝細胞脂肪症に由来する干渉のため、それらを視覚化することができなかった。ＰＥＧ−Ｃｍｐｄ２または化合物１７０のいずれかで治療されたマウスに由来する切片において、伊東細胞突起（ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）の重症度の用量依存的な減少が観察された。
Figure 0006702962
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Claims (22)

  1. 非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝臓線維症または硬変から選択される線維症に関連する疾患を患者において治療する方法において使用するための、配列番号２０１のポリペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む組成物であって、前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのパラ−アセチル−フェニルアラニン残基が、ポリ（エチレングリコール）部分に連結される、組成物。
  2. 前記線維症に関連する疾患がＮＡＳＨである、請求項１に記載の組成物。
  3. ＮＡＳＨを患者において治療または予防する方法において使用するための、配列番号２０１のポリペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む組成物であって、前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのパラ−アセチル−フェニルアラニン残基が、ポリ（エチレングリコール）部分に連結される、組成物。
  4. 前記線維症に関連する疾患が硬変である、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記線維症に関連する疾患が肝臓線維症である、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ポリ（エチレングリコール）が約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記ポリ（エチレングリコール）が約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有する、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記ポリ（エチレングリコール）が約３０ｋＤａの分子量を有する、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、前記患者において、肝臓の脂肪画分の減少およびアディポネクチンレベルの増加の１つ以上をもたらす、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 治療前に前記患者が、少なくとも約６０の脂肪症インデックスおよび／または少なくとも１０％の磁気共鳴画像によって任意に決定される肝臓の脂肪画分の割合を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 治療前に前記患者が、肝生検によって任意に決定されるＮＡＳＨ ＣＲＮ線維症ステージ１〜ステージ３を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが皮下注射によって投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、１日当たり約１回、１週間当たり約１回、１週間当たり約２回、２週間当たり約１回、３週間当たり約１回、または４週間当たり約１回の頻度で投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、患者の体重の約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療する方法において使用するための、配列番号２０１のポリペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む組成物であって、前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのパラ−アセチル−フェニルアラニン残基が、ポリ（エチレングリコール）部分に連結され、前記ポリ（エチレングリコール）が、約３０ｋＤａの分子量を有し、前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、１週間当たり約１回の頻度で、患者の体重の約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの量で投与される、組成物。
  16. 非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療する方法において使用するための、配列番号２０１のポリペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドを含む組成物であって、前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのパラ−アセチル−フェニルアラニン残基が、ポリ（エチレングリコール）部分に連結され、前記ポリ（エチレングリコール）が、約３０ｋＤａの分子量を有し、前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドが、１週間当たり約１回の頻度で、２０ｍｇの量で皮下注射によって投与される、組成物。
  17. 前記薬物が単位用量である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記パラ−アセチル−フェニルアラニン残基がオキシム結合によって前記ポリ（エチレングリコール）部分に連結され、前記オキシム結合がカルボニル基およびアミノオキシ基の反応に起因する構造を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 患者において非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するための組成物の製造のための配列番号２０１のポリペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの使用であって、前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのパラ−アセチル−フェニルアラニン残基が、ポリ（エチレングリコール）部分に連結され、前記ポリ（エチレングリコール）が、約３０ｋＤａの分子量を有し、前記組成物が、１週間当たり約１回の頻度で、患者の体重の約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの量の投与用である、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの使用。
  20. 患者において非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するための組成物の製造のための配列番号２０１のポリペプチドを含む改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの使用であって、前記改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドのパラ−アセチル−フェニルアラニン残基が、ポリ（エチレングリコール）部分に連結され、前記ポリ（エチレングリコール）が、約３０ｋＤａの分子量を有し、前記組成物が、１週間当たり約１回の頻度で、２０ｍｇの量で皮下注射による投与用である、改変ＦＧＦ−２１ポリペプチドの使用。
  21. 前記組成物が単位用量として提供される、請求項１９〜２０のいずれか一項に記載の使用。
  22. 前記パラ−アセチル−フェニルアラニン残基がオキシム結合によって前記ポリ（エチレングリコール）部分に連結され、前記オキシム結合がカルボニル基およびアミノオキシ基の反応に起因する構造を有する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の使用。
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