CN109536519B - 一种在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法，该方法通过构建FADS2基因的过表达载体和干扰载体来对水牛的FADS2基因进行调控，从分子学水平上调节水牛乳腺细胞甘油酸三酯的含量，而目前，国内外还未见有从调节FADS2基因的调控从而达到在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的相关报道，该方法能为从分子水平上调控生产低脂水牛奶做出积极贡献。
Description
【技术领域】
本发明涉及水牛乳腺细胞甘油酸三酯基因调控技术领域，特别涉及一种在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法。
【背景技术】
水牛奶，与人们熟知的乳用牛(常见的是黑白花奶牛)产的奶不同。其具有产奶量低、营养价值高等优点，据检测，1公斤水牛奶所含营养价值相当于黑白花牛奶1.85公斤，最适宜儿童生长发育和抗衰老的锌、铁、钙含量特别高，氨基酸、维生素含量非常丰富，是老幼皆宜的营养食品，因此可称得上是奶中极品。水牛奶的脂肪、蛋白质、乳糖的含量是黑白花牛奶的数倍，矿物质和维生素含量也是黑白花牛奶和人乳的数十倍。其香醇浓厚，胆固醇低，维生素、微量元素丰富，尤其是酪蛋白含量高，能进行高质量乳制品的深加工。然而，随着生活水平的提高，对低酯水牛奶的需求也越来越大，目前，在市面上多是采用养殖后将水牛奶进行脱脂的方式来生产低脂牛奶，但是还未见关于从基因调控上减少牛奶脂肪合成的相关报道。
脂肪酸脱氢酶(fatty acid desaturases，FADS)是一类能催化脂肪酸生成PUFAs的关键酶，是催化与载体结合的脂肪酸在脂酰链上脱氢形成的脱氢酶家族，可催化脂肪酸生成多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，其中FADS2(△6-fattyacid desaturases2，FADS2)是FADS家族的重要成员之一，可以通过在已有双键和羧基之间的第六个和第七个碳原子之间引入双键，催化两种必需脂肪酸亚油酸(LA,C18:2)和α-亚麻酸(ALA,C18:3)转化为γ-亚麻酸(GLA,C18:3)十八碳四烯酸(18:4)，并进一步脱氢形成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)。FADS2基因在脂肪酸代谢中究竟怎样发挥作用尚不清晰，国外FADS家族基因的研究主要针对人类，国内较少研究的主要集中在鸡上，该基因在动物中的研究较少，尚未在水牛乳腺上对该基因在脂肪酸代谢方面进行研究。挖掘与鉴定影响奶牛乳成分性状的关键基因或致因突变是实施奶牛低脂富蛋白新品系分子培育的前提与基础。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法，该引物针对真核生物基因组中基因内含子区域或调控区域设计合成，具有设计简单、合成费用较低、通用性强、利用率高、扩增效率高和产生的多态性丰富等特点。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本申请提供了一种水牛FADS2基因，所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。
本申请还提供了一种用于过表达FADS2基因的过表达载体pcDNA3.1-FADS2，所述载体核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
本申请还提供了一种用于干扰FADS2基因的干扰片段siRNA-FADS2，所述干扰片段序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
本申请还提供了一种在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法，该方法包括如下步骤：
(1)利用权利要求2的过表达载体和权利要求3的干扰片段分别转染水牛乳腺原代细胞，在37℃条件下，含5％CO2的培养箱中反应48h；
(2)FADS2基因的表达检测：提取步骤(1)转染后的的水牛原代细胞总RNA；反转录总RNA；然后通过荧光定量PCR法测定；
(3)甘油酸三酯含量检测：收集步骤(1)的水牛原代细胞培养基在室温2000g离心5min，取上清测定甘油三酯浓度。
进一步的，所述荧光定量PCR法的内参基因为GAPDH基因。
进一步的，所述荧光定量PCR法的FADS2的荧光定量检测引物为：
上游引物序列：5’-ggaagaccgctgaggacatgaac-3’；
下游引物序列：5’-gcctgagaggtagcaaggacgaa-3’。
进一步的，所述步骤(1)过表达载体pcDNA3.1-FADS2的制备方法包括如下步骤：
A、根据水牛的FADS2基因的核苷酸序列，设计扩增FADS2的引物，进行PCR扩增；
B、用限制性内切酶Hind III和限制性内切酶Not I酶切pcDNA3.1质粒，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶回收，得到酶切后的pcDNA3.1开环质粒；
C、用连接酶将步骤A扩增得的FADS2基因片段与步骤B酶切后的pcDNA3.1开环质粒进行连接，得到重组质粒载体pcDNA3.1-FADS2。
进一步的，所述扩增FADS2的引物序列为：
上游引物序列：5’-ctagcgtttaaacttaagcttatggggaaggggggaaac-3’；
下游引物序列：5’-gccctctagactcgagcggccgctcatttgtggaggtaggcgtc-3’。
进一步的，所述PCR扩增的反应体系为：Premix Taq 25μL；浓度为25ng/μL的DNA模板1μL，浓度为10pmol/μL的上、下游引物各2μL；ddH2O 20μL。
进一步的，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
本发明具有如下有益效果：
本申请从分子水平上对水牛乳腺细胞的甘油酸含量进行调控，通过构建过表达载体pcDNA3.1-FADS2和干扰片段siRNA-FADS2分别转染水牛原代细胞，最终达到了在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的目的，该方法简单、高效、精确，能为后续挖掘与鉴定影响奶牛乳成分性状的关键基因或致因突变提供研究方向，是从分子水平上实施奶牛低脂富蛋白新品系分子培育的前提与基础。
【附图说明】
图1是本发明实施例的FADS2基因在泌乳前期(7d)，中期(140d)，后期(280)的表达图。
图2是本发明实施例的不同浓度催乳素处理水牛乳腺细胞后FADS2的表达变化表达图。
图3是本发明实施例的FADS2基因过表达后甘油三酯含量变化图；
图4是本发明实施例的FADS2基因干扰后甘油三酯含量变化图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例：
一、水牛乳腺细胞的采集：
实验材料：选用健康水牛为试验材料。分别在泌乳初期(7d)、盛期(50d)、中期(140d)、末期(280d)四个时期，每个时期随机选择3只奶水牛；
手术法采集上述乳腺腺泡组织样品5g，用生理盐水冲洗血液，立即投入液氮中。
二、提取RNA
使用PureLinkTM RNA Mini Kit试剂盒提取的乳腺腺泡组织样品的总RNA。
三、cDNA合成
将提取的总RNA通过反转录合成cDNA。
四、荧光定量PCR检测
根据FADS2的基因序列(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示)，设计FADS2的荧光定量检测引物(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5-6所示)，以GAPDH内参基因为对照，进行各细胞FADS2表达的实时定量PCR检测FADS2基因在泌乳期的表达，根据2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，并计算其标准差。
(1)FADS2和GAPDH基因扩增引物序列如表1所示：
表1
(2)荧光定量PCR总体系总体积为20μL，具体如下：
每个样本均设3个重复；PCR扩增程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸35s，共35个循环。
结果如图1所示，显示该基因在泌乳中期表达显著高于前期和后期(p＜0.05)(图1)，说明FADS2基因与水牛泌乳相关。
五、催乳素检测FADS2基因与水牛泌乳影响：
为进一步确认该基因是否参与泌乳活动，利用与泌乳活动相关的重要基因催乳素(PRL)处理水牛乳腺细胞，即在24孔板中，每个孔中分别加入不同浓度的催乳素，使得培养基中催乳素终浓度为0.05ug/ul,0.1ug/ul,2ug/ul,7ug/ul,10ug/ul,以不加催乳素(0ug/ul)的作为对照，每个浓度两个重复，36h后收集细胞并用荧光定量PCR检测该基因的表达，结果显示随着催乳素浓度的升高，FADS2基因的表达逐渐下降(图2)，可以确定FADS2基因与泌乳具有一定关系。
六、过表达FADS2和干扰FADS2的调控、检测方法：
(一)过表达调控
(1)构件过表达载体：针对FADS2基因序列构建过表达载体pcDNA3.1-FADS2；其序列如SEQ ID NO:2所示；
(2)细胞转染：利用步骤(1)的过表达载体转染水牛乳腺原代细胞，在37℃条件下，含5％CO2的培养箱中反应48h；
(3)提取步骤(2)转染后的的水牛原代细胞总RNA；
(4)反转录步骤(3)的总RNA为cDNA；
(5)通过荧光定量法qPCR检测。
其中，步骤(1)中建过表达载体pcDNA3.1-FADS2的构建方法按如下步骤进行：
A、根据水牛的FADS2基因的核苷酸序列，设计扩增FADS2的引物(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5-6所示)，进行PCR扩增；
B、用限制性内切酶Hind III和限制性内切酶Not I酶切pcDNA3.1质粒，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶回收，得到酶切后的pcDNA3.1开环质粒；
C、用连接酶将步骤A扩增得的FADS2基因片段与步骤B酶切后的pcDNA3.1开环质粒进行连接，得到重组质粒载体pcDNA3.1-FADS2。
步骤A扩增FADS2的引物序列(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7-8所示)：
上游引物序列：5’-ctagcgtttaaacttaagcttatggggaaggggggaaac-3’；
下游引物序列：5’-gccctctagactcgagcggccgctcatttgtggaggtaggcgtc-3’
步骤A的PCR扩增的反应体系为：Premix Taq 25μL；浓度为25ng/μL的DNA模板1μL，浓度为10pmol/μL的上、下游引物各2μL；ddH2O 20μL。PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
其中，步骤(2)细胞转染的具体步骤为：
转染体系包括：pcDNA3.1-FADS2质粒(试验组)和pcDNA3.1质粒(对照)
A、在50μL的opti-MEM培养基中添加1μL的LipofectamineTM 3000TransfectionReagent的转染试剂，充分混匀室温静置5min；
B、在50μL的opti-MEM培养基中添加1μL的P3000和1000ng待转染的pcDNA3.1-FADS2质粒，充分混匀室温静置5min；
C、在50μL的opti-MEM培养基中添加1μL的P3000和1000ng待转染的pcDNA3.1质粒，充分混匀室温静置5min；
将A和B溶液混合均匀，在室温静置10min得到pcDNA3.1-FADS2质粒的转染试剂复合物；将A和B溶液混合均匀，在室温静置10min得到pcDNA3.1质粒的转染试剂复合物；
D、将含有水牛乳腺原代细胞的24孔板过夜培养后，向其中的12个孔板滴加pcDNA3.1-FADS2质粒的转染试剂复合物，另外的12个孔板滴加pcDNA3.1质粒的转染试剂复合物，在37℃、含5％CO2的培养箱中反应48h，完成转染过程。
其中，步骤(3)提取步骤(2)转染后的的水牛原代细胞总RNA的方法如下：
转染48h后，使用PBS清洗细胞；使用TRIZOL试剂提取转染细胞的总RNA，通过电泳检测RNA抽提效果，当RNA的条带清晰无拖带现象，可用于后续实验。
其中，步骤(4)采用反转录试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit)对步骤(3)的总RNA的cDNA进行反转录；
其中，步骤(5)的qPCR检测方法为：
以步骤(4)反转录的cDNA为模板，使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix，通过设计特异引物(引物序列见表2)，以GAPDH内参基因为对照，进行各细胞的FADS2表达的实时定量PCR检测，并按照2-ΔΔCT分析各细胞FADS2的相对表达量。
表2
(2)荧光定量PCR总体系总体积为20μL，具体如下：
每个样本均设3个重复；PCR扩增程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸35s，共35个循环。
(二)干扰调控
(1)构件干扰片段：针对FADS2基因序列设计干扰片段siRNA-FADS2；其序列如SEQID NO:3所示；
(2)细胞转染：利用步骤(1)的干扰片段siRNA-FADS2转染水牛乳腺原代细胞，在37℃条件下，含5％CO2的培养箱中反应48h；
(3)提取步骤(2)转染后的的水牛原代细胞总RNA；
(4)反转录步骤(3)的总RNA为cDNA；
(5)通过荧光定量法qPCR检测显示：
其中，步骤(2)细胞转染的具体步骤为：
转染体系包括：干扰片段siRNA-FADS2(试验组)和siRNA-NC(其序列如SEQ ID NO:4所示)(对照组)
A、在50μL的opti-MEM培养基中添加1μL的
RNAiMAX的转染试剂，充分混匀室温静置5min；
B、在50μL的opti-MEM培养基中添加2μL(20μmol/μL)的干扰片段siRNA-FADS2，充分混匀室温静置5min；
C、在50μL的opti-MEM培养基中添加2μL(20μmol/μL)的空白片段siRNA-NC，充分混匀室温静置5min；
将A和B溶液混合均匀，在室温静置10min得到siRNA-FADS2的转染试剂复合物；将A和B溶液混合均匀，在室温静置10min得到siRNA-NC的转染试剂复合物；
E、将含有水牛乳腺原代细胞的24孔板过夜培养后，向其中的12个孔板滴加siRNA-FADS2的转染试剂复合物，另外的12个孔板滴加siRNA-NC的转染试剂复合物，在37℃、含5％CO2的培养箱中反应48h，完成转染过程。
其中，步骤(3)提取步骤(2)转染后的的水牛原代细胞总RNA的方法如下：
转染48h后，使用PBS清洗细胞；使用TRIZOL试剂提取转染细胞的总RNA，通过电泳检测RNA抽提效果，当RNA的条带清晰无拖带现象，可用于后续实验。
其中，步骤(4)采用反转录试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit)对步骤(3)的总RNA的cDNA进行反转录；
其中，步骤(5)的qPCR检测方法为：
以步骤(4)反转录的cDNA为模板，使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix，通过设计特异引物(引物序列见表3)，以GAPDH内参基因为对照，进行各细胞的FADS2表达的实时定量PCR检测，并按照2-ΔΔCT分析各细胞FADS2的相对表达量。
表3
(2)荧光定量PCR总体系总体积为20μL，具体如下：
每个样本均设3个重复；PCR扩增程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸35s，共35个循环。
七、细胞中甘油三酯含量的测定：
将转染了过表达载体和干扰片段、培养了48h后的水牛乳腺上皮细胞移去培养基后，利用北京普利莱(APPLYGEN)基因技术有限公司的甘油三酯检测试剂盒裂解液收集细胞，70℃10min,室温2 000g离心5min,取上清测定甘油三酯浓度。
甘油三脂工作液配置：按比例4:1将试剂R1与试剂R2均匀混合，即配即用；
标准品稀释：甘油标准品用蒸馆水或与样本缓冲液一致的液体倍比稀释为1000、500、250、125.5、62.5、31.25、15.625μmoL；将空白、标准品、样品加入孔板中，每个处理4个重复；混匀后在37℃反应10min，平衡后颜色在60min内稳定；先用蒸馆水空白管调零，然后利用酶标仪测定细胞甘油三酯含量；得到实验结果见图3和图4所示：
结果表明：
如图3所示，对FADS2基因的过表达可降低细胞中的甘油三酯含量；并且达到显著水平。
如图4所示，对FADS2基因的干扰可升高细胞中的甘油三酯含量；但并未达到显著水平。
综上所述，通过，构建过表达载体对FADS2基因进行过表达可降低细胞中的甘油三酯含量；构建干扰片段对FADS2基因进行干扰，可升高细胞中的甘油三酯含量，为后续从基因调控层面上研究低酯牛奶的合成奠定了坚实的基础。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区水牛研究所
<120> 一种在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法
<141> 2018-12-21
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
atggggaagg ggggaaacca ggacgagggg gccaccgagc ttgaggcgcc gatgcctacc 60
ttccgctggg aggagattca gaagcacaac ctgcgcaccg acaagtggct ggtcatcgat 120
cgcaaggtct acaacatcac caaatggtcc agccggcacc ccggggggca gcgggtcatc 180
gggcactacg ccggggaaga tgctacggac gccttcctgg ccttccaccg caaccttgat 240
tttgtgcgca agttcatgaa gcccctgtta attggcgagc tggcccccga ggagcccagc 300
caggaccgcg gcaagaattc ccagatcacc gaggacttcc gggccctgag gaagaccgct 360
gaggacatga acctgttcaa gagtaaccag ctcttcttcc ttctccacct ggcccacatc 420
atcgccatgg agagcatcgc ctggttcatt ctcttctact ttggcaacgg ctggattcca 480
accatcatta cggccttcgt ccttgctacc tctcaggccc aggctggatg gctgcaacat 540
gattacggcc acctctctgt ttacaagaag tccatgtgga accacatcgt ccacaagttc 600
atcatcggtc acttaaaggg tgcctctgcc aactggtgga accatcgcca cttccagcac 660
cacgccaaac ccaacatctt ccacaaggat ccagatgtga acatgctgca cgtgtttgtc 720
ctgggcgagt ggcagcccat tgagtacggc aagaagaagc tgaaatacct gccttacaac 780
caccagcatg agtacttctt cctgattggg ccgccgctgc tcatcccttt gtatttccag 840
taccagatca tcatgaccat gatcgttcga aaggactggg tggacttggc ctgggccatc 900
agctactaca cccgtttctt catcacctac atccctttct atggtgttct gggatccatc 960
cttttcctca acttcatcag gttcctggag agccactggt ttgtgtgggt cacacagatg 1020
aatcacatcg tcatggagat tgaccgagag ccctaccgcg actggttcag cagccagcta 1080
gcagccacct gcaatgtgga gcagtccttc ttcaatgact ggttcagtgg gcacctcaac 1140
ttccagatcg agcaccacct tttccccacc atgccccggc acaacctgca caagatcgcc 1200
cccctggtga ggtccctgtg cgccaagcat ggcattgagt accaggagaa gccgctgctc 1260
caggccctgc aagacatcat cgggtccctg aggaagtctg ggcagctgtg gctggacgcc 1320
tacctccaca aatga 1335
<210> 2
<211> 2224
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
gatatagcag agctctctgg ctaactagag aacccactgc ttactggctt atcgaaatta 60
atacgactca ctatagggag acccaagctg gctagcgttt aaacttaagc ttatggggaa 120
ggggggaaac caggacgagg gggccaccga gcttgaggcg ccgatgccta ccttccgctg 180
ggaggagatt cagaagcaca acctgcgcac cgacaagtgg ctggtcatcg atcgcaaggt 240
ctacaacatc accaaatggt ccagccggca ccccgggggg cagcgggtca tcgggcacta 300
cgccggggaa gatgctacgg acgccttcct ggccttccac cgcaaccttg attttgtgcg 360
caagttcatg aagcccctgt taattggcga gctggccccc gaggagccca gccaggaccg 420
cggcaagaat tcccagatca ccgaggactt ccgggccctg aggaagaccg ctgaggacat 480
gaacctgttc aagagtaacc agctcttctt ccttctccac ctggcccaca tcatcgccat 540
ggagagcatc gcctggttca ttctcttcta ctttggcaac ggctggattc caaccatcat 600
tacggccttc gtccttgcta cctctcaggc ccaggctgga tggctgcaac atgattacgg 660
ccacctctct gtttacaaga agtccatgtg gaaccacatc gtccacaagt tcatcatcgg 720
tcacttaaag ggtgcctctg ccaactggtg gaaccatcgc cacttccagc accacgccaa 780
acccaacatc ttccacaagg atccagatgt gaacatgctg cacgtgtttg tcctgggcga 840
gtggcagccc attgagtacg gcaagaagaa gctgaaatac ctgccttaca accaccagca 900
tgagtacttc ttcctgattg ggccgccgct gctcatccct ttgtatttcc agtaccagat 960
catcatgacc atgatcgttc gaaaggactg ggtggacttg gcctgggcca tcagctacta 1020
cacccgtttc ttcatcacct acatcccttt ctatggtgtt ctgggatcca tccttttcct 1080
caacttcatc aggttcctgg agagccactg gtttgtgtgg gtcacacaga tgaatcacat 1140
cgtcatggag attgaccgag agccctaccg cgactggttc agcagccagc tagcagccac 1200
ctgcaatgtg gagcagtcct tcttcaatga ctggttcagt gggcacctca acttccagat 1260
cgagcaccac cttttcccca ccatgccccg gcacaacctg cacaagatcg cccccctggt 1320
gaggtccctg tgcgccaagc atggcattga gtaccaggag aagccgctgc tccaggccct 1380
gcaagacatc atcgggtccc tgaggaagtc tgggcagctg tggctggacg cctacctcca 1440
caaatgagcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg 1500
tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 1560
aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 1620
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 1680
aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa 1740
ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 1800
gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 1860
tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 1920
gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 1980
attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga 2040
cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 2100
ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggatttgccg atttcggcct attgataaaa 2160
atgagctgat ttacaaattt acgcgaatta ttctgtgatg tgtgtcagta ggttgtgaaa 2220
gtcc 2224
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
gcctggttca ttctcttcta ctttg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
gggttctaca tcaatgattt caagt 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
ggaagaccgc tgaggacatg aac 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
gcctgagagg tagcaaggac gaa 23
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 7
ctagcgttta aacttaagct tatggggaag gggggaaac 39
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 8
gccctctaga ctcgagcggc cgctcatttg tggaggtagg cgtc 44
Claims (3)
1.一种在分子水平提高水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）利用干扰片段转染水牛乳腺原代细胞，在37 ℃条件下，含5%CO2的培养箱中反应48h；
（2）FADS2基因的表达检测：提取步骤（1）转染后的水牛原代细胞总RNA；反转录总RNA；然后通过荧光定量PCR法测定；
（3）甘油酸三酯含量检测：收集步骤（1）的水牛原代细胞培养基在室温2000 g离心5min，取上清测定甘油三酯浓度；
所述FADS2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；
所述干扰片段序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述一种在分子水平提高水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR法的内参基因为GAPDH基因。
3.根据权利要求1所述一种在分子水平提高水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR法的FADS2的荧光定量检测引物为：
上游引物序列：5’-ggaagaccgctgaggacatgaac-3’；
下游引物序列：5’-gcctgagaggtagcaaggacgaa-3’。
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|---|---|---|---|
| CN201811571294.8A CN109536519B (zh) | 2018-12-21 | 2018-12-21 | 一种在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201811571294.8A CN109536519B (zh) | 2018-12-21 | 2018-12-21 | 一种在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法 |
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Application publication date: 20190329 Assignee: Xingye County Jufeng Planting and Breeding Professional Cooperative Assignor: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION BUFFALO INSTITUTE Contract record no.: X2023980045684 Denomination of invention: A Method for Regulating Triglyceride Content in Buffalo Breast Cells at the Molecular Level Granted publication date: 20211102 License type: Common License Record date: 20231106 |