CN105861502B

CN105861502B - 干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA及其表达质粒和应用

Info

Publication number: CN105861502B
Application number: CN201610259139.7A
Authority: CN
Inventors: 张俊珍; 董常生; 范瑞文; 杨珊珊; 姬凯元; 石占全; 刘彧; 胡帅鹏; 刘学贤
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2016-04-25
Filing date: 2016-04-25
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2036-04-25
Also published as: CN105861502A

Abstract

本发明公开了一种干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA，具有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的正义链和反义链序列，以及构建了干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的pENTR/U6 shRNA表达质粒。本发明所述pENTR/U6 shRNA表达质粒在黑色素细胞系中的生物性效应体现为对羊驼黑色素细胞系TYR和MC1R的调节作用，以及对小鼠毛色表型变化的影响。

Description

干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA及其表达质粒和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA片段及其shRNA表达质粒。

背景技术

细胞周期素依赖蛋白激酶5(Cyclin-dependent Kinase 5，CDK5)属于细胞周期素(cyclin)依赖性蛋白激酶(CDK)家族成员，CDK5最早利用生物化学方法从牛脑组织中分离出来，于1992 年被发现。CDK5是由脯氨酸引导的丝氨酸/苏氨酸激酶，对真核细胞的细胞分裂周期起磷酸化/脱磷酸化的调控作用。

研究表明，CDK5主要在神经元表达，与神经系统发育和神经元的正常功能密切相关。近来发现CDK5在非神经元的组织或细胞中表达，如在鼠晶状体和兔角膜的上皮细胞中可调节细胞与基质及细胞间的粘附和迁移。Lee等人发现，CDK5在鼠的卵巢中表达，可能对卵巢内某些细胞的分化和凋亡起作用。

CDK5是一个新发现的能使体内外的酪氨酸羟化酶(TH)发生磷酸化的激酶，TH被CDK5磷酸化后的蛋白水平和活性均增加。TH是酪氨酸酶(TYR)的活性酶之一，TH在许多位点被不同的激酶磷酸化后，不同程度地影响着TH酶的活性。TYR是在黑色素合成起始过程中一种关键的起催化作用的限速酶，至少具有酪氨酸羟化酶(TH)和多巴氧化酶2 种活性。TYR催化酪氨酸产生真黑素和褐黑素，而真黑素和褐黑素的量决定着哺乳动物的毛色。专利申请201110162723.8发现，CDK5通过调控TYR基因的表达而参与调控羊驼毛色的形成。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中还没有最适宜的干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA的问题，提供一种干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA。

本发明提供的干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA包括正义链和反义链，分别具有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列：

正义链：5’－GCGACAAGAAGCUGACUUU－3’

反义链：5’－AAAGUCAGCUUCUUGUCGC－3’。

本发明同时还提供了包含上述Seq ID No.1和Seq ID No.2所示siRNA的shRNA，以及编码有所述shRNA的DNA。

所述shRNA具有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示的正义链和反义链序列：

Seq ID No.3：5’－CACCGCGACAAGAAGCUGACUUUCGAAAAAGUCAGCUUCUUGUCGC－3’

Seq ID No.4：5’－AAAAGCGACAAGAAGCUGACUUUUUCGAAAGUCAGCUUCUUGUCGC－3’。

所述DNA具有Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的正义链和反义链序列：

Seq ID No.5：5’－CACCGCGACAAGAAGCTGACTTTCGAAAAAGTCAGCTTCTTGTCGC－3’

Seq ID No.6：5’－AAAAGCGACAAGAAGCTGACTTTTTCGAAAGTCAGCTTCTTGTCGC－3’。

进而，本发明构建了一种可使上述shRNA在黑色素细胞系中转染的干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的pENTR/U6 shRNA表达质粒。

本发明还提供了干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的pENTR/U6 shRNA表达质粒在黑色素细胞系中的生物性效应，所述生物性效应体现为对羊驼黑色素细胞系TYR和MC1R的调节作用，以及对小鼠毛色表型变化的影响。

本发明根据所获得的羊驼皮肤CDK5基因，构建成pENTR/U6 shRNA表达质粒，将该表达质粒转染到羊驼黑色素细胞系后，调控羊驼毛色的重要关键基因的表达量发生了明显变化。同时将该表达质粒注射到小鼠受精卵雄原核，进行胚胎移植获得了转基因小鼠，在第一代转基因小鼠皮肤中检测到CDK5基因在转录水平的表达量下降。以上说明所构建的pENTR/U6 shRNA表达质粒对CDK5起到了抑制作用，而且该表达质粒可成为通过转基因技术改变羊驼毛色的基因资源。

附图说明

图1为siRNA 531、siRNA 171、siRNA 215在黑色素细胞中的干扰效果。

图2为pENTR/U6 shRNA表达质粒对羊驼黑色素细胞系中CDK5的表达量。

图3为pENTR/U6 shRNA表达质粒对羊驼黑色素细胞系中CDK5表达的影响。

图4为pENTR/U6 shRNA表达质粒对羊驼黑色素细胞系中TYR的表达量。

图5为pENTR/U6 shRNA表达质粒对羊驼黑色素细胞系中TYR表达的影响。

图6为pENTR/U6 shRNA表达质粒对羊驼黑色素细胞系中MC1R的表达量。

图7为pENTR/U6 shRNA表达质粒对羊驼黑色素细胞系中MC1R表达的影响。

图8为pENTR/U6 shRNA表达质粒对转基因小鼠皮肤黑色素细胞中黑色素颗粒产生的影响。

图9为pENTR/U6 shRNA表达质粒在转基因小鼠皮肤中的表达。

图10为CDK5在转基因小鼠皮肤中的表达量。

图11为转基因小鼠毛色的变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1。

设计干扰羊驼CDK5基因表达的siRNA人工合成序列，以细胞转染法筛选CDK5的siRNA。

根据从羊驼皮肤中扩增到得的CDK5全长序列（HM623674），参照siRNA设计原则，设计并筛选出以下表1所示的3个siRNA双链人工合成序列。

用六孔组织培养板，每孔接种2×10⁵黑色素细胞，2ml无抗生素含胎牛血清正常培养，在二氧化碳培养箱培养18-24小时，至细胞贴壁达60-80%。配置如下液体：溶液A：每次转染将2-8µl siRNA双链用100µl siRNA转染培养基sc-36868稀释；溶液B：每次转染将2-8µlsiRNA转染试剂sc-29528用100µl siRNA转染培养基sc-36868稀释。

用加样器将siRNA双链(溶液A)直接加入稀释后的转染试剂(溶液B)中，轻轻混匀并在室温下孵育15-45分钟。用2ml siRNA转染培养基sc-36868漂洗细胞一次，吸去培养基并迅速在siRNA转染试剂混合液(溶液A+溶液B)中加入0.8ml siRNA转染培养基，小心混匀并覆盖在漂洗过的细胞上。将细胞放入37℃二氧化碳培养箱孵育5-7小时。不移去原来的转染混合液，加入1ml含有2倍正常血清的培养基，继续孵育18-24小时。弃去原培养基，用1倍正常生长培养基替换并继续培养24-72小时后，对细胞进行测定。

筛选结果如图1所示。图中，A为FAM检测转染效率，B、C、D、E分别为CDK5在对照组(NC)、siRNA531、siRNA171和siRNA215组中的表达(n＝3)。

可以看出，在黑色素细胞中转染siRNA215后，CDK5蛋白的表达量明显下降，说明siRNA215对CDK5的表达起到了抑制作用，因此siRNA215是CDK5较理想的siRNA。

筛选出的干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA序列如Seq ID No.1和SeqID No.2所示：

Seq ID No.1：5’－GCGACAAGAAGCUGACUUU－3’

Seq ID No.2：5’－AAAGUCAGCUUCUUGUCGC－3’。

实施例2。

根据实施例1筛选到的CDK5 siRNA序列，设计具有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示正义链和反义链序列的shRNA，所述shRNA以Seq ID No.1和Seq ID No.2序列作为shRNA的茎结构，二者之间分别以CGAA和UUCG作发夹结构，由此构成shRNA结构：

正义链：5’－CACCGCGACAAGAAGCUGACUUUCGAAAAAGUCAGCUUCUUGUCGC－3’

反义链：5’－AAAAGCGACAAGAAGCUGACUUUUUCGAAAGUCAGCUUCUUGUCGC－3’。

根据上述shRNA序列，合成1对shRNA寡聚单链DNA，并附阴性对照序列，具体序列见表2。

双链DNA的退火：将1对合成好的寡聚单链DNA用ddH₂O溶解成100µM，互补单链各取5µl，两两混合，按表3给出的体系进行退火：在95℃加热5分钟，放置室温自然冷却20分钟形成双链DNA。

合成的双链DNA与载体进行连接、转化和克隆：使用载体构建试剂盒BLOCK-iT U6RNAi Entry Vector Kit进行重组克隆，将退火形成的双链shRNA oligo稀释成10nM，插入线性的shRNA表达载体pENTR/U6 vector中，室温连接30分钟，构建shRNA表达质粒，酶连接体系如表4所示。取5µl连接液，转化100µl 大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂卡那平板，37℃培养箱过夜培养。

每个转化平板分别挑取3个阳性克隆，摇菌后用质粒小抽试剂盒（JETSTAR），按照以下步骤抽提质粒。

1．柱平衡：在制备澄清裂解液之前，加入10ml E4溶液平衡纯化柱。

2．收集细菌细胞：离心沉淀大肠杆菌细胞，小心去除所有培养基。

3．细胞悬浮：在沉淀中加入4.0ml E1溶液，重悬细胞，直至细胞悬液均匀无细胞团。

4．细胞裂解：加入4.0ml E2溶液，轻柔地上下颠倒彻底混匀，直至裂解液均一，室温下孵育5分钟。

5．中和：加入4.0ml E3溶液，立即颠倒多次混匀，直至获得均一悬液。不应残留细胞裂解后出现的粘稠物质，在室温下以大于12000g离心混合物10分钟。

6．纯化柱装填：将第5步的上清部分上样到平衡过的JETSTAR柱中，让裂解液在重力流作用下流动。

7．纯化柱淋洗：用10.0ml E5溶液淋洗纯化柱两次，每次淋洗时，在重力流作用下流空纯化柱。

8．质粒洗脱：用5.0ml E6溶液洗脱DNA，勿强行排出剩余溶液。

9．质粒沉淀：以3.4ml异丙醇沉淀DNA，4℃下以大于12000g离心30分钟；用70%乙醇清洗质粒DNA，并再次离心；空气干燥沉淀10分钟，用适当体积的缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，TE缓冲液或水)重溶DNA，即得到了干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的羊驼CDK5pENTR/U6 shRNA表达质粒。

以pENTR/U6 vector正向测序引物5′-GGACTATCATATGCTTACCG-3′对获得的表达质粒进行测序，鉴定重组克隆中插入片段序列与设计的寡聚单链DNA序列一致，说明所述表达质粒转化成功。

实施例3。

以羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA表达质粒通过脂质体转染黑色素细胞，分析黑色素细胞的生物性效应。

转染时，取复苏的1×10⁵黑色素细胞接种于六孔板中，于黑色素细胞培养基(Sciencell, San Diego, USA)中培养24小时，贴壁至70%。第2天，弃培养基，加入800µL无血清的培养基，并加入DNA fectin Transfection Reagent (TIANGEN BIOTECH,BEIJINGCO. LTD)与羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA的复合物并混匀，37℃培养20小时。移去转染试剂，加入20ml含血清的完全培养基，37℃培养3天。收集细胞，用于RNA提取。每一实验组3个重复。

进行实时荧光定量PCR实验，以检测目标基因的表达量变化。

所需的引物如下：

实时荧光定量PCR：收集转染72小时的细胞，提取总RNA并反转录成cDNA。反应程序如下：

其中图2、图3显示了羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA表达质粒对羊驼黑色素细胞系中CDK5表达的影响。图2为siRNA215转染组与NC组中CDK5 mRNA的表达量(n＝3)，以18S rRNA作为看家基因。图3中A1为NC组CDK5蛋白表达量(n＝3)；A2为siRNA215转染组CDK5蛋白表达量(n＝3)；A3为阴性对照组(不加一抗)中CDK5蛋白表达量(n＝3)。

图4、图5则显示了羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA表达质粒对羊驼黑色素细胞系中TYR表达的影响。图4为siRNA215转染组与NC组中TYR mRNA的表达量(n＝3)，18S rRNA为看家基因。图5中A1为NC组TYR蛋白表达量(n＝3)；A2为siRNA215转染组TYR蛋白表达量(n＝3)；A3为阴性对照组(不加一抗)中TYR蛋白表达量(n＝3)。

图6、图7为羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA表达质粒对羊驼黑色素细胞系中MC1R表达的影响。其中图6为siRNA215转染组与NC组中MC1R mRNA的表达量(n＝3)，18S rRNA作为看家基因。图7中A1为NC组MC1R蛋白表达量(n＝3)；A2为siRNA215转染组MC1R蛋白表达量(n＝3)；A3为阴性对照组(不加一抗)中MC1R蛋白表达量(n＝3)。

上述结果表示，CDK5敲除显著降低了黑色素细胞中MC1R和TYR的mRNA和蛋白表达。

实施例4。

将羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA表达质粒通过显微注射法导入小鼠胚胎并进行胚胎移植后，产生转基因小鼠，检测所构建的表达质粒在小鼠皮肤中的生物性效应。

具体过程如下。

1．准备假孕母鼠：将雄鼠进行输精管结扎术后，与可育雌鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠生理变化，得到假孕母鼠。

2．准备受精卵：将孕马血清与绒毛膜促性腺激素(HCG)注射入可育雌鼠，促使其超数排卵，并与可育雄鼠交配。交配次日，以手术法从输卵管内取受精卵。

3．转基因：用显微注射系统将构建的羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA表达质粒DNA导入小鼠受精卵的雄原核内。

4．胚胎移植：将带有羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA表达质粒DNA的受精卵经手术法移入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在假孕母鼠内发育并产子。

5．鉴定转基因阳性鼠：1) 幼鼠在出生后第5-7天，取约3cm长的尾巴组织，并提取DNA，用PCR法(所用引物见表7)鉴定外源基因是否整合。2) 目标基因表达量的检测，取带有外源基因的小鼠皮肤RNA，用实时荧光定量PCR法(所用引物和反应程序同实施例3)鉴定CDK5的表达量，以鉴定羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA表达质粒在小鼠皮肤内的效应。3) 转基因小鼠毛色的变化，通过肉眼观察毛色变化，以鉴定转基因阳性鼠毛色表型的变化。

图8是pENTR/U6-CDK5-shRNA载体对黑色素细胞中黑色素颗粒产生的影响，图中可以看出，CDK5表达下调后可使黑色素细胞中黑色素颗粒的产量下降约40%。

图9为从所检测转基因小鼠中扩增出来的阳性片段显示，在所检测转基因小鼠中检测到了CDK5 pENTR/U6 shRNA的表达，表明转基因阳性鼠构建成功。

图10为以实时荧光定量PCR法测定转基因小鼠皮肤中CDK5基因的表达量结果。其中Negative为非转基因小鼠的CDK5表达量；sample为转基因小鼠的CDK5表达量。从图中可以看出，CDK5在转基因小鼠样皮肤中的表达量均明显低于非转基因小鼠中的表达量。

图11提供了转基因小鼠毛色变化的比对效果，图中A为野生型小鼠的毛色，B为转基因小鼠的毛色，可以看出毛色从野生型的黑色变为了棕色。

SEQUENCE LISTING

<110> 山西农业大学

<120> 干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA及其表达质粒和应用

<160> 4

<170> Patentin version 3.2

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA序列的正义链

<400> 1

gcgacaagaa gcugacuuu 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA序列的反义链

<400> 2

aaagucagcu ucuugucgc 19

<210> 3

<211> 46

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的shRNA序列的正义链

<400> 3

CACCGCGACA AGAAGCUGAC UUUCGAAAAA GUCAGCUUCU UGUCGC 46

<210> 4

<211> 46

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的shRNA序列的反义链

<400> 4

AAAAGCGACA AGAAGCUGAC UUUUUCGAAA GUCAGCUUCU UGUCGC 46

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的DNA序列的正义链

<400> 5

CACCGCGACA AGAAGCTGAC TTTCGAAAAA GTCAGCTTCT TGTCGC 46

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的DNA序列的反义链

<400> 6

AAAAGCGACA AGAAGCTGAC TTTTTCGAAA GTCAGCTTCT TGTCGC 46

Claims

1.用于干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA表达质粒，包含有Seq ID No.3、Seq ID No.4所示的DNA序列；

所述Seq ID No.3、Seq ID No.4所示的DNA序列编码含有Seq ID No.1、Seq ID No.2所示的干扰羊驼黑色素细胞CDK5基因表达的siRNA的shRNA：

Seq ID No.1：正义链：5’－GCGACAAGAAGCUGACUUU－3’

Seq ID No.2：反义链：5’－AAAGUCAGCUUCUUGUCGC－3’；

以所述羊驼CDK5 pENTR/U6 shRNA表达质粒转染黑色素细胞，可以显著降低黑色素细胞中MClR和TYR的mRNA和蛋白的表达。

2.权利要求1所述的表达质粒在调控羊驼毛色上的应用。