CN109321643B - 一种获得高保真且3’末端加“a”产物的pcr法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得高保真且3’末端加“A”产物的PCR法，该方法为：首先在PCR反应体系中加入各反应组分与高保真Taq DNA polymerase，然后按如下反应程序进行PCR扩增：(1)95℃预变性2min；(2)95℃，15sec；退火温度，30sec；72℃，延伸时间；28循环；(3)在反应的PCR管中直接加入普通Taq DNA聚合酶并混匀；(4)95℃，15sec；退火温度，30sec；72℃，延伸时间；3循环；(5)72℃，10min。本发明在利用高保真Taq DNA polymerase进行PCR反应的最后3个循环中加入普通Taq DNA polymerase，PCR完成后即可获得具有高保真性的3'末端加“A”的PCR产物，克服了当前高保真PCR过程中无法在产物3'末端直接加“A”的问题，省略了以前需要对高保真PCR产物纯化后再用加“A”的过程，简化了高保真PCR产物TA克隆前的处理步骤。
Description
技术领域
本发明涉及一种获得高保真且3’末端加“A”产物的PCR法，属于PCR法技术领域。
背景技术
PCR技术是分子生物学领域最经典也是最常用的一种实验方法，主要用于基因检测和克隆，由于其过程简单、实验周期短、重复性好、且试剂成本相对较低，使其成为分子生物学领域中最受欢迎的方法之一。在基因获取上，虽然目前有许多方法可供选择，如化学合成，但PCR技术具有不可替代的优势，且仍是最重要的方法。
PCR技术用于基因克隆的基本过程是首先获取靶基因的DNA模板或cDNA模板，然后设计并合成靶基因的上游引物和下游引物，选用适当的Taq DNA polymerase和PCR程序经高效扩增获得PCR产物，即靶基因DNA，产物经纯化和适当处理后克隆入克隆载体，并经过细菌转化、筛选和鉴定获得靶基因。
PCR产物导入克隆载体中因产物的不同而有所差异，这与PCR过程中选择的TaqDNA polymerase密切相关。如果选用普通的Taq DNA polymerase，其PCR产物的3'末端有一个自带的突出的“A”，它可以与市面上的TA克隆载体直接通过T-A配对连接而高效获得带有靶基因的克隆载体。但是，由于普通Taq DNA polymerase自身特性，其PCR产物常伴有一定的碱基突变，不能真实克隆靶基因，为克服这一缺陷，目前分子生物学上常用具有保真性的Taq DNA polymerase替代常规的Taq DNA polymerase，如pfu DNA polymerase、platinumTaq DNA polymerase、High-Fidelity DNA polymerase等，但无论是哪一种高保真Taq DNApolymerase，其PCR产物末端为平末端，不存在3'突出“A”，为保证该PCR产物能够克隆入克隆载体中，目前生物试剂公司推出了平末端克隆载体，但克隆效率低这一缺陷限制了这种平末端载体的推广和运用。考虑到这一问题，生物试剂公司还推出对PCR平末端产物加“A”的A-tailing酶，通过对纯化的PCR平末端产物的3'末端加“A”，实现T-A克隆，这一方法效率较高，受到广大科研工作者的欢迎，但其过程需要对PCR产物进行电泳鉴定、纯化、加“A”等步骤才能进行TA克隆。
综上所述，用普通Taq DNA polymerase扩增的目的DNA片段虽然3'末端有突出的“A”，但其内部常含有突变位点；用高保真Taq DNA polymerase扩增的PCR产物其3'末端为平末端，不能直接进行TA克隆，需要对PCR产物用特殊的加“A”试剂盒在3'末端加“A”后才能进行TA克隆；而将普通Taq DNA聚合酶和高保真Taq DNA聚合酶直接混合使用(如某生物公司的Taq Platinum DNA Polymerase)虽然部分解决了上述问题，但PCR产物的高保真性和产物3'末端加“A”效率均明显下降。
因此，探索一种可以获得高保真PCR产物且3'末端加“A”的简单、快速的方法具有较高的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种获得高保真且3’末端加“A”产物的PCR法，利用单次PCR获得高保真且3'末端加“A”的PCR产物，既保证了PCR产物的高度保真性，又使其3'末端具有突出的“A”碱基，无需对PCR产物进行额外加“A”而直接进行TA克隆，以解决上述现有技术中存在的问题。
本发明采取的技术方案为：一种获得高保真且3’末端加“A”产物的PCR法，该方法：首先在PCR反应体系中加入PCR缓冲液、dNTP、上游引物和下游引物、模板和高保真Taq DNApolymerase，然后按如下反应程序进行PCR扩增：
(1)95℃预变性2min；
(2)95℃，15sec；退火温度，30sec；72℃，延伸时间；28循环；
(3)在反应的PCR管中直接加入普通Taq DNA聚合酶(1.25U/50μL反应体系)并混匀；
(4)95℃，15sec；退火温度，30sec；72℃，延伸时间；3循环；
(5)72℃，10min。
上述PCR缓冲液终浓度为“1×”，dNTP各为200μM，上游引物和下游引物为0.2μM，模板为500ng，高保真Taq DNA polymerase为1.25U/50μL，普通Taq DNA聚合酶为1.25U/50μL。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明在利用高保真Taq DNA polymerase进行PCR反应的最后3个循环中加入普通Taq DNA polymerase，PCR完成后即可获得具有高保真性的3'末端加“A”的PCR产物，克服了当前高保真PCR过程中无法在产物3'末端直接加“A”的问题，省略了以前需要对高保真PCR产物纯化后再用加“A”的过程，简化了高保真PCR产物TA克隆前的处理步骤，简化中间步骤，一步到位；还能节省试剂损耗，不再购买加“A”试剂盒，节约实验成本。
说明书附图
图1为反应程序进行PCR扩增示意图；
图2为琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物PKCε基因编码区DNA片段；
图3为PCR纯化产物的TA克隆；
图4为Xho I酶切鉴定TA克隆单克隆菌落；
图5为LA Taq DNA polymerase产物TA克隆获得的单克隆菌株质粒测序结果
序列比对结果；
图6为LA Taq DNA polymerase产物TA克隆获得的单克隆菌株质粒测序结果与PKCε基因蛋白编码区序列比对(注：比对结果显示6处发生点突变，分别是223A＞G、497A＞G、950G＞A、1257T＞C、1357A＞G、1379T＞C、2126T＞C)；
图7为GxL Taq DNA polymerase产物经3'末端加A后TA克隆获得的单克隆菌株质粒测序结果(注：序列比对后发现产物未发生点突变)；
图8为GxL Taq DNA polymerase联合Z-Taq DNA polymerase的PCR产物TA克隆获得的单克隆菌株质粒测序结果(注：序列比对后发现产物未发生点突变)。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进行进一步介绍。
实施例1：一种获得高保真且3’末端加“A”产物的PCR法，该方法：首先在PCR反应体系中加入终浓度为“1×”的PCR缓冲液、各200μM dNTP、0.2μM上游引物和下游引物、500ng模板和1.25U/50μL高保真Taq DNA polymerase，然后按如下反应程序进行PCR扩增：
(1)95℃预变性2min；
(2)95℃，15sec(此处是否表示秒)变性；退火温度，30sec；72℃，延伸时间；28循环；
(3)在反应的PCR管中直接加入普通Taq DNA聚合酶(1.25U/50μL反应体系)并混匀；
(4)95℃，15sec变性；退火温度，30sec；72℃，延伸时间；3循环；
(5)72℃，10min。
为了说明本发明的有效效果，进行如下试验：
以体外扩增人肝癌细胞内PKCε基因为例：
(一)试剂材料和主要仪器
1、试剂材料
RPMI-1640细胞培养液来源于GIBCO，新生牛血清来源于杭州四季青，SMMC-7721来源于中科院上海细胞库，Trizol来源于Invitrogen，各种有机化学试剂来源于上海国药，DNAA-Tailing Kit、Z-Taq DNApolymerase、TaKaRa LA
with GC Buffer、反转录试剂盒来源于Takara。
2、主要仪器
Thermo PCR仪、北京六一电泳仪、sigma高速冷冻离心机。
3、DNA测序
引物合成和DNA测序委托广州Invitrogen公司完成。
(二)操作过程
1、人肝癌细胞系SMMC-7721培养
在37℃、5％CO2条件下用添加了10％新生牛血清的RPMI-1640细胞培养液培养人肝癌细胞SMMC-7721。
2、Trizol法抽提细胞内总RNA
当细胞在直径6cm的培养皿中生长融合至80％-90％时，用DEPC处理的无菌PBS清洗培养皿中的细胞3次。然后加入1ml RNA抽提试剂Trizol，反复吹打培养皿底直至细胞全部裂解。将裂解液放入RNase-free的1.5ml离心管中，加入200μl氯仿，剧烈震荡15s后在4℃、10000g下离心10min。收集水相溶液，加入500μl异丙醇，倒置混匀后在7500g下离心5min，弃去上清液。白色沉淀用75％的乙醇清洗2次，每次7500g下离心5min并弃去上清液。室温自然干燥3min，用100μl灭菌的RNase-free ddH2O溶解白色RNA沉淀。
3、将mRNA反转录成cDNA
取2μg RNA，按Takara反转录试剂盒PrimeScriptTMII 1st Strand cDNASynthesis Kit说明书操作。将mRNA反转录成cDNA。
4、以cDNA为模板，扩增人肝癌细胞内PKCε基因蛋白编码区
根据NCBI中PKCε基因序列号(NM_005400)设计PCR引物，序列如下：
上游引物：5'-TCTCGAGCGACCATGGTAGTGTTCAATGGCCTTC-3'
下游引物：5'-TGGATCCCAGGGCATCAGGTCTTCACCAAAGTAG-3'
用Takara LA Taq DNA polymerase按说明书配制第1管PCR反应液；用Takara高保真PCR试剂盒
GXL DNA Polymerase按说明书配制第2、第3管PCR反应液；56℃退火，用三步法经过28个循环获得PCR产物。然后，在第2管反应液中加入Takara Z-TaqDNApolymerase。3管反应液继续反应3个循环。试剂具体用量和实验程序如下表1所示：
表1、试剂具体用量和实验程序
5、PCR产物进行TA克隆
将3管PCR产物分别用2倍体积的酸化乙醇沉淀，7500g离心5min后弃去上清液，DNA沉淀用75％的乙醇清洗2次，用无菌水重新溶解DNA，定容至1μg/μL。
取5μg反应管3的PCR纯化产物，按Takara DNAA-Tailing Kit说明书配制加A反应液，72℃反应30min。
各PCR产物进行TA克隆，反应液配制如下：
4℃反应过夜。
6、细菌转化和鉴定
取100μL感受态细菌置于冰浴中，将连接反应液加入到感受态细菌中，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴2min，加入900μl LB细菌培养基，37℃复苏1h，取200μl菌液涂布于添加氨苄青霉素的固体培养板上，37℃培养过夜。挑取克隆菌落扩大培养，质粒提取并用限制性核酸内切酶酶切(Xho I/BamH I)鉴定，酶切鉴定正确的质粒再进行DNA测序鉴定。
(三)实验结果
1、PKCε基因编码区DNA片段获得
如图2所示，用不同的Taq DNA polymerase通过PCR法扩增获得PKCε基因编码区DNA，其长度与预计的长度一致。
图2中：1、DNA分子量标准DL5000(takara)；2、LA Taq DNA polymerase扩增的PKCε基因编码区DNA；3、GXL Taq/Z-Taq DNA polymerase联合扩增的PKCε基因编码区DNA；4、GxLTaq DNA polymerase扩增的PKCε基因编码区DNA。
2、菌落克隆形成和质粒酶切鉴定pMD18T-PKCε
琼脂糖凝胶分离并纯化目的PKCε基因编码区DNA片段，并取一部分GXL Taq DNApolymerase扩增的PKCε基因编码区DNA进行3'末端加“A”，然后取等量的DNA进行TA克隆，结果如图3所示，用可以在产物3'末端加“A”的LA-Taq DNA polymerase扩增的产物可以直接进行TA克隆(图3A)，而用不能在产物3'末端加“A”的GXL Taq DNA polymerase扩增的产物TA克隆失败(图3D)，而这种高保真DNA聚合酶扩增的产物进行3'末端加“A”后可以进行TA克隆(图3B)，而高保真DNA聚合酶联合末端可加“A”的普通DNA聚合酶获得的产物可直接进行TA克隆(图3C)。挑取这些单克隆菌落，扩大培养和质粒抽提，并用Xho I酶切鉴定。结果如图4所示，PCR产物均有效克隆入TA克隆载体pMD18-T中。
图3中：A、LA Taq DNA polymerase扩增的PCR产物的TA克隆；B、GXL Taq DNApolymerase扩增的PCR产物经3'末端加“A”后TA克隆；C、GXL Taq DNA polymerase联合Z-Taq DNA polymerase扩增的PCR产物的TA克隆；D、GXL Taq DNA polymerase扩增的PCR产物的TA克隆。
图4中：1、LA-Taq DNA polymerase扩增的PCR产物TA克隆的单菌落质粒；2、GXLTaq DNA polymerase扩增的PCR产物经3'末端加“A”后TA克隆的单菌落质粒；GxL Taq DNApolymerase联合Z-Taq DNA polymerase扩增的PCR产物TA克隆的单菌落质粒。
3、PCR测序分析结果及序列比对
经DNA测序和拼接结果显示，用三种不同的方法获得的TA单克隆菌株均成功将PCR产物，即PKCε基因蛋白编码区成功克隆入T载体pMD18-T中(图5、图7、图8)。但是，用LATaqDNA polymerase扩增的PCR产物有6处发生了点突变，它们分别是223A＞G、497A＞G、950G＞A、1257T＞C、1357A＞G、1379T＞C、2126T＞C(图5、图6)。用GXL Taq DNA polymerase扩增的PCR产物均未发生点突变。
(四)实验结论
用普通Taq DNA polymerase扩增的目的片段虽然可以直接进行TA克隆，但其保真性显著不足。用高保真Taq DNA polymerase能够保真性扩增目的片段，但由于产物3'末端缺少突出的“A”，需要额外的加A试剂盒加“A”后才能进行TA克隆，而本实验中先用高保真Taq DNA polymerase扩增目的片段，然后在PCR反应的最后3个循环中直接在反应管中加入普通Taq DNA polymerase再完成反应，获得的产物不仅具有高保真性，而且PCR产物的3'端还添加了“A”，能够对PCR产物直接进行TA克隆。此方法简单方便，可解决目前高保真PCR需要额外加“A”步骤才能进行TA克隆的问题。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列_0 ATGGTAGTGTTCAATGGCCTTCTTAAGATCAAAATCTGCGAGGCCGTGAGCTTGAAGCCC
序列_1 ATGGTAGTGTTCAATGGCCTTCTTAAGATCAAAATCTGCGAGGCCGTGAGCTTGAAGCCC
************************************************************
序列_0 ACAGCCTGGTCGCTGCGCCATGCGGTGGGACCCCGGCCGCAGACTTTCCTTCTCGACCCC
序列_1 ACAGCCTGGTCGCTGCGCCATGCGGTGGGACCCCGGCCGCAGACTTTCCTTCTCGACCCC
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序列_0 TACATTGCCCTCAATGTGGACGACTCGCGCATCGGCCAAACGGCCACCAAGCAGAAGACC
序列_1 TACATTGCCCTCAATGTGGACGACTCGCGCATCGGCCAAACGGCCACCAAGCAGAAGACC
************************************************************
序列_0 AACAGCCCGGCCTGGCACGACGAGTTCGTCACCGATGTGTGCAACGGACGCAAGATCGAG
序列_1 AACAGCCCGGCCTGGCACGACGAGTTCGTCACCGATGTGTGCGACGGACGCAAGATCGAG
******************************************.*****************
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序列_1 CTGGCTGTCTTTCACGATGCCCCCATAGGCTACGACGACTTCGTGGCCAACTGCACCATC
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序列_0 CAGTTTGAGGAGCTGCTGCAGAACGGGAGCCGCCACTTCGAGGACTGGATTGATCTGGAG
序列_1 CAGTTTGAGGAGCTGCTGCAGAACGGGAGCCGCCACTTCGAGGACTGGATTGATCTGGAG
************************************************************
序列_0 CCAGAAGGAAGAGTGTATGTGATCATCGATCTCTCAGGGTCGTCGGGTGAAGCCCCTAAA
序列_1 CCAGAAGGAAGAGTGTATGTGATCATCGATCTCTCAGGGTCGTCGGGTGAAGCCCCTAAA
************************************************************
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序列_1 GACAATGAAGAGCGTGTGTTCAGGGAACGCATGCGGCCGAGGAAGCGGCAGGGGGCCGTC
************************************************************
序列_0 AGGCGCAGGGTCCATCAGGTCAACGGCCACAAGTTCATGGCCACCTATCTTCGGCAGCCC
序列_1 AGGCGCAGGGTCCATCGGGTCAACGGCCACAAGTTCATGGCCACCTATCTTCGGCAGCCC
****************.*******************************************
序列_0 ACCTACTGCTCCCATTGCAGAGACTTCATCTGGGGTGTCATAGGAAAGCAGGGATACCAG
序列_1 ACCTACTGCTCCCATTGCAGAGACTTCATCTGGGGTGTCATAGGAAAGCAGGGATACCAG
************************************************************
序列_0 TGTCAAGTCTGCACCTGCGTGGTCCACAAGCGGTGCCACGAGCTCATAATCACAAAGTGT
序列_1 TGTCAAGTCTGCACCTGCGTGGTCCACAAGCGGTGCCACGAGCTCATAATCACAAAGTGT
************************************************************
序列_0 GCTGGGTTAAAGAAGCAGGAGACCCCCGACCAGGTGGGCTCCCAGCGGTTCAGCGTCAAC
序列_1 GCTGGGTTAAAGAAGCAGGAGACCCCCGACCAGGTGGGCTCCCAGCGGTTCAGCGTCAAC
************************************************************
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序列_1 TCCCTGCTCTGGGGACTCTTGCGGCAGGGTTTGCAGTGTAAAGTCTGCAAAATGAATGTT
************************************************************
序列_0 CACCGTCGATGTGAGACCAACGTGGCTCCCAACTGTGGAGTGGATGCCAGAGGAATCGCC
序列_1 CACCGTCGATGTGAGACCAACGTGGCTCCCAACTGTGGAGTGGATGCCAGAGGAATCGCC
************************************************************
序列_0 AAAGTACTGGCCGACCTGGGCGTTACCCCAGACAAAATCACCAACAGCGGCCAGAGAAGG
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*************************************************.**********
序列_0 AAAAAGCTCATTGCTGGTGCCGAGTCCCCGCAGCCTGCTTCTGGAAGCTCACCATCTGAG
序列_1 AAAAAGCTCATTGCTGGTGCCGAGTCCCCGCAGCCTGCTTCTGGAAGCTCACCATCTGAG
************************************************************
序列_0 GAAGATCGATCCAAGTCAGCACCCACCTCCCCTTGTGACCAGGAAATAAAAGAACTTGAG
序列_1 GAAGATCGATCCAAGTCAGCACCCACCTCCCCTTGTGACCAGGAAATAAAAGAACTTGAG
************************************************************
序列_0 AACAACATTCGGAAAGCCTTGTCATTTGACAACCGAGGAGAGGAGCACCGGGCAGCATCG
序列_1 AACAACATTCGGAAAGCCTTGTCATTTGACAACCGAGGAGAGGAGCACCGGGCAGCATCG
************************************************************
序列_0 TCTCCTGATGGCCAGCTGATGAGCCCCGGTGAGAATGGCGAAGTCCGGCAAGGCCAGGCC
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************************************************************
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序列_1 AAGCGCCTGGGCCTGGATGAGTTCAACTTCATCAAGGTGTTGGGCAAAGGCAGCTTCGGC
******************************************************** ***
序列_0 AAGGTCATGTTGGCAGAACTCAAGGGCAAAGATGAAGTATATGCTGTGAAGGTCTTAAAG
序列_1 AAGGTCATGTTGGCAGAACTCAAGGGCAAAGATGAAGTATATGCTGTGAAGGTCTTAAAG
************************************************************
序列_0 AAGGACGTCATCCTTCAGGATGATGACGTGGACTGCACAATGACAGAGAAGAGGATTTTG
序列_1 AAGGACGTCATCCTTCAGGATGATGACGTGGACTGCGCAATGACAGAGAAGAGGATTTCG
************************************.********************* *
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序列_1 GCTCTGGCACGGAAACACCCGTACCTTACCCAACTCTACTGCTGCTTCCAGACCAAGGAC
************************************************************
序列_0 CGCCTCTTTTTCGTCATGGAATATGTAAATGGTGGAGACCTCATGTTTCAGATTCAGCGC
序列_1 CGCCTCTTTTTCGTCATGGAATATGTAAATGGTGGAGACCTCATGTTTCAGATTCAGCGC
************************************************************
序列_0 TCCCGAAAATTCGACGAGCCTCGTTCACGGTTCTATGCTGCAGAGGTCACATCGGCCCTC
序列_1 TCCCGAAAATTCGACGAGCCTCGTTCACGGTTCTATGCTGCAGAGGTCACATCGGCCCTC
************************************************************
序列_0 ATGTTCCTCCACCAGCATGGAGTCATCTACAGGGATTTGAAACTGGACAACATCCTTCTG
序列_1 ATGTTCCTCCACCAGCATGGAGTCATCTACAGGGATTTGAAACTGGACAACATCCTTCTG
************************************************************
序列_0 GATGCAGAAGGTCACTGCAAGCTGGCTGACTTCGGGATGTGCAAGGAAGGGATTCTGAAT
序列_1 GATGCAGAAGGTCACTGCAAGCTGGCTGACTTCGGGATGTGCAAGGAAGGGATTCTGAAT
************************************************************
序列_0 GGTGTGACGACCACCACGTTCTGTGGGACTCCTGACTACATAGCTCCTGAGATCCTGCAG
序列_1 GGTGTGACGACCACCACGTTCTGTGGGACTCCTGACTACATAGCTCCTGAGATCCTGCAG
************************************************************
序列_0 GAGTTGGAGTATGGCCCCTCCGTGGACTGGTGGGCCCTGGGGGTGCTGATGTACGAGATG
序列_1 GAGTTGGAGTATGGCCCCTCCGTGGACTGGTGGGCCCTGGGGGTGCTGATGTACGAGATG
************************************************************
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************************************************************
序列_0 CATGACGACGTGCTGTACCCAGTCTGGCTCAGCAAGGAGGCTGTCAGCATCTTGAAAGCT
序列_1 CATGACGACGTGCTGTACCCAGTCTGGCTCAGCAAGGAGGCTGTCAGCATCTTGAAAGCT
************************************************************
序列_0 TTCATGACGAAGAATCCCCACAAGCGCCTGGGCTGTGTGGCATCGCAGAATGGCGAGGAC
序列_1 TTCATGACGAAGAATCCCCACAAGCGCCTGGGCTGTGTGGCATCGCAGAATGGCGAGGAC
************************************************************
序列_0 GCCATCAAGCAGCACCCATTCTTCAAAGAGATTGACTGGGTGCTCCTGGAGCAGAAGAAG
序列_1 GCCATCAAGCAGCACCCATTCTTCAAAGAGATTGACTGGGTGCTCCTGGAGCAGAAGAAG
************************************************************
序列_0 ATCAAGCCACCCTTCAAACCACGCATTAAAACCAAAAGAGACGTCAATAATTTTGACCAA
序列_1 ATCAAGCCACCCTTCAAACCACGCATTAAAACCAAAAGAGACGTCAATAATTTTGACCAA
************************************************************
序列_0 GACTTTACCCGGGAAGAGCCGGTACTCACCCTTGTGGACGAAGCAATTGTAAAGCAGATC
序列_1 GACTTTACCCGGGAAGAGCCGGTACCCACCCTTGTGGACGAAGCAATTGTAAAGCAGATC
************************* **********************************
序列_0 AACCAGGAGGAATTCAAAGGTTTCTCCTACTTTGGTGAAGACCTGATGCCCTGA
序列_1 AACCAGGAGGAATTCAAAGGTTTCTCCTACTTTGGTGAAGACCTGATGCCC---
***************************************************
Claims (1)
1.一种获得高保真且3’末端加“A”产物的PCR法，其特征在于：该方法为：首先在PCR反应体系中加入PCR缓冲液、dNTP、上游引物和下游引物、模板和高保真Taq DNA polymerase，然后按如下反应程序进行PCR扩增：
（1） 95℃预变性2min；
（2） 95℃，15sec；退火温度，30sec；72℃，延伸时间；28循环；
（3）在反应的PCR管中直接加入普通Taq DNA聚合酶并混匀；
（4） 95℃，15sec；退火温度，30sec；72℃，延伸时间；3循环；
（5） 72℃，10min；
PCR缓冲液终浓度为“1×”，dNTP各为200μM，上游引物和下游引物为0.2μM，模板为500ng，高保真Taq DNA polymerase为1.25U/50μL，普通Taq DNA聚合酶为1.25U/50μL。
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Also Published As
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