CN116143941B - 一种KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白、应用及试剂盒 - Google Patents

一种KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白、应用及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种KIR3DL1‑IgG‑Fc融合重组蛋白、应用及试剂盒，并联合液相芯片技术平台实现了KIR3DL1与配基HLA‑I类分子相互作用的检测。本发明通过体外构建并获得KIR3DL1分子胞外结构域与人IgG‑Fc融合重组蛋白，再与商品化的偶联97种HLA‑I类分子的Luminex磁珠反应，通过Lumiex荧光仪检测KIR3DL1‑IgG‑Fc融合重组蛋白与不同磁珠反应的荧光值，从而判断3DL1分子与不同HLA分子表达的配基相互作用强度，实现了KIR与HLA分子高通量、高灵敏性和快速检测。KIR与HLA相互作用研究是免疫移植领域的热点和难点问题之一，本发明提供了KIR3DL1与配基HLA相互作用的快速检测的方案，这对今后选择和分析判断合适的造血干细胞供者具有重要的参考价值。

Description

一种KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白、应用及试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白、应用及试剂盒。
背景技术
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Cell Immunoglobulin-like Receptor，KIR)属于免疫球蛋白样超家族，主要表达于NK细胞和部分T细胞表面，通过与靶细胞表面人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)-I类分子(配基)相互作用传导抑制或激活信号来调控NK细胞活性，在机体固有免疫、抗肿瘤、抗病毒感染、母胎耐受、器官移植和自身免疫性疾病等生理病理过程中起着重要作用。尤其在抗白血病免疫治疗方面的应用受到广泛关注，已经成为移植免疫领域的研究热点。造血干细胞移植供受者间KIR-HLA分子相互作用，可诱导供者NK细胞攻击受者细胞，能有效的杀伤患者体内残存的白血病细胞，介导移植物抗白血病效应，有助于植入成功。因此HLA-KIR分子相互作用在造血干细胞供者选择上越来越受到重视，越来越多的临床配型实验室已经将供患者KIR-HLA分子相互作用作为造血干细胞供者选择的参考标准。
KIR和HLA基因均为高度多态性的基因系统，同一基因座位有多个不同等位基因，不同KIR与HLA等位基因的相互作用强度不同，介导的NK细胞杀伤活性也存在差异。但大多数KIR与HLA不同等位基因相互作用强弱目前仍不清楚，无法预料在NK细胞抗白血病中的作用，影响了造血干细胞移植供者的选择，不利于NK细胞在抗白血病效应中的应用。因此检测KIR-HLA相互作用，对于预判其在异基因造血干细胞移植中介导的NK细胞抗白血病效应及造血干细胞移植预后具有重要的作用。
NK细胞杀伤活性中起主导作用的是抑制型KIR，其中作用较强的抑制型KIR为KIR3DL1，其配基为HLA-Bw4分子，KIR3DL1-HLA-Bw4相互作用在调节NK细胞杀伤活性、抗感染性疾病、恶性肿瘤和抗白血病中起重要的作用。KIR3DL1和配基HLA-Bw4均为高度遗传多态性的分子，目前已发现184个KIR3DL1等位基因，100多个编码HLA-Bw4的等位基因。专利申请人前期研究中国汉族人群KIR3DL1分布情况，发现不同的KIR3DL1等位基因在NK细胞上存在高表达、低表达和不表达的现象，但是这些表达差异的等位基因与HLA配基的相互作用如何尚不清楚，这在一定程度上影响了KIR在造血干细胞移植供者选择上的应用。目前KIR-HLA相互作用方法仅有极少数国外实验室在研究，仅报道应用表面等离子体共振技术研究KIR与HLA的相互作用，通过体外表达KIR和HLA全长编码区序列，将表达KIR和HLA分子的细胞株分别作为固定相和流动相于表面等离子体共振技术的芯片上进行检测。该技术需要将KIR分子和相应的许多个HLA配基分别进行体外克隆，并筛选出所有稳定表达细胞株进行后续实验，操作较为繁琐；其次还要保证KIR和HLA分子能在细胞表面稳定表达，对稳定表达体系要求比较高；而且，表面等离子体共振技术芯片昂贵，一个芯片只能偶联一种分子，无疑增加了检测的成本，不适合在实验室常规检测应用和推广。
发明内容
鉴于目前KIR-HLA相互作用技术的缺乏和局限性，本发明提供一种KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白、应用及试剂盒。
本发明的第一个方面在于，提供一种KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白，所述KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白由如下方式得到：
S101、根据KIR3DL1基因序列特点，设计并合成KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域序列特异性扩增引物；
S102、制备人基因组RNA，并逆转录为cDNA；
S103、将步骤S101合成的引物扩增步骤S102获得的cDNA，获取KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域扩增片段；
S104、将步骤S103获得的目的片段与TOPO TA载体连接，并转化大肠杆菌；
S105、挑取步骤S104获得的大肠杆菌单克隆，抽提质粒并测序筛选连接正确的TA重组质粒；
S106、将步骤S105获得的重组质粒和真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2进行双酶切；
S107、将步骤S106双酶切获得的KIR3DL1胞外-stem区域片段和pFUSE-hIgG1-Fc2载体连接反应并转化大肠杆菌；
S108、挑取步骤S107获得的大肠杆菌单克隆培养，抽提质粒并测序筛选连接正确的pFUSE-hIgG1-Fc2-KIR3DL1重组质粒；
S109、将步骤S108获得的重组质粒转染人胚胎肾细胞(HEK293)；
S110、提取步骤S109转染细胞表达的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案：
作为本发明的一种优选技术方案：所述步骤S101中，扩增KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域序列(1-319个密码子)的特异性扩增引物：
上游引物序列为GAATTCGCACATGGGTGGTCAGGACA(5’-3’)；
下游引物序列为AGATCTGTGCAGGTGTCTGGGGTTA(5’-3’)；
上游引物5’端设计EcoRI酶切位点(GAATTC)；
下游引物5’端设计BglII酶切位点(AGATCT)。
作为本发明的一种优选技术方案：所述步骤S103中，扩增获取KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域序列的PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液2.5μl、2.5mmol/LdNTP2.0μl、25mmol/L MgCl2 2.0μl、引物浓度0.5μmol/L、LA-Taq酶0.8U、cDNA 2μl，加H2O补足至25μl；
扩增获取KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域序列的PCR反应程序为：95℃预变性5min，然后95℃30s，63℃45s，72℃1min30 s，30个循环，72℃延伸10min后冷却至4℃。
作为本发明的一种优选技术方案：所述步骤S105中，质粒抽提试剂盒中测序引物4条：2条同扩增引物，2条为TOPO TA克隆载体引物T7和M13。
作为本发明的一种优选技术方案：所述步骤S106中，采用EcoRI和BglII限制性内切酶对TA重组载体和pFUSE-hIgG1-Fc2进行双酶切。
作为本发明的一种优选技术方案：所述步骤S107中，KIR3DL1胞外-stem区域序列和pFUSE-hIgG1-Fc2载体连接反应，连接酶为T4连接酶。
作为本发明的一种优选技术方案：所述步骤S108中，pFUSE-hIgG1-Fc2-KIR3DL1重组质粒测序引物6条，其中，2条是步骤S101中的扩增引物，另外4条为特异性测序引物，分别为：
pFuse-Il2-F1：CTGAGATCACCGGcGAAGGA(5’-3’)
pFuse-IgG-R1：TATCTTATCATGTCTGGCCAGCT(5’-3’)
pFuse-Il2-F2：CACCATGTACAGGATGCAACT(5’-3’)
pFuse-IgG-R2：TGGCCAGCTAGCACTCATTTA(5’-3’)。
本发明第二个方面在于，提供前文所述的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白在KIR3DL1与配基HLA-Bw4相互作用强度的快速便捷检测方面的应用。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案：
作为本发明的一种优选技术方案：所述应用包括如下步骤：
S201、KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白与携带HLA CLASS-I抗原的磁珠进行反应；
S202、将获得的磁珠反应复合物洗涤并加入PE-羊抗人IgG结合物进行孵育反应；
S203、将孵育反应得到的磁珠复合物进行洗涤，获取荧光结果，并依据不同磁珠的荧光值判断KIR3DL1与不同HLA-Bw4配基的相互作用强弱。
本发明还有一个方面在于，提供一种KIR3DL1与不同HLA-Bw4配基的相互作用强弱快速检测的试剂盒，所述试剂盒包括如前文所述的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白。
本发明提供一种KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白、应用及试剂盒，并联合液相芯片技术平台实现了KIR3DL1与配基HLA-I类分子相互作用的检测。本发明通过体外构建并获得KIR3DL1分子胞外结构域与人IgG-Fc融合重组蛋白，再与商品化的偶联97种HLA-I类分子的Luminex磁珠反应，通过Lumiex荧光仪检测KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白与不同磁珠反应的荧光值，从而判断3DL1分子与不同HLA分子表达的配基相互作用强度，实现了KIR与HLA分子高通量、高灵敏性和快速检测。KIR与HLA相互作用研究是免疫移植领域的热点和难点问题之一，本发明提供了KIR3DL1与配基HLA相互作用的快速检测的方案，这对今后选择和分析判断合适的造血干细胞供者具有重要的参考价值。
附图说明
图1为本发明所提供的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白的结构示意图。
图2为Luminex平台检测KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白和HLA CLASS-I磁珠反应示意图。
具体实施方式
本发明根据KIR3DL1基因编码区序列特点，设计特异性引物扩增并获取KIR3DL1胞外结构域和stem区域(1-319个密码子)扩增片段，并克隆入pFUSE-hIgG1-Fc2载体，通过转染和表达鉴定，获取KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白。将获得的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白与偶联97个HLA-I类分子的HLA-class I商品化磁珠反应，利用Luminex平台，实现了KIR3DL1与配基HLA-Bw4相互作用强度的有效检测，具体包括如下步骤：
S1、根据KIR3DL1基因序列特点，设计并合成KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域序列特异性扩增引物；
S2、制备人基因组RNA，并逆转录为cDNA；
S3、将步骤S1合成的引物扩增步骤S2获得的cDNA，获取KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域扩增片段；
S4、将步骤S3获得的目的片段与TOPO TA载体连接，并转化大肠杆菌；
S5、挑取步骤S4获得的大肠杆菌单克隆，抽提质粒并测序筛选连接正确的TA重组质粒；
S6、将步骤S5获得的重组质粒和真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2进行双酶切；
S7、将步骤S6双酶切获得的KIR3DL1胞外-stem区域片段和pFUSE-hIgG1-Fc2载体连接反应并转化大肠杆菌；
S8、挑取步骤S7获得的大肠杆菌单克隆培养，抽提质粒并测序筛选连接正确的pFUSE-hIgG1-Fc2-KIR3DL1重组质粒；
S9、将步骤S8获得的重组质粒转染人胚胎肾细胞(HEK293)；
S10、提取步骤S9转染细胞表达的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白；
S11、将步骤S10获取的融合重组蛋白进行纯化和western-blot鉴定；
S12、将步骤S11鉴定后的融合重组蛋白与商品化的携带HLA-class I抗原的磁珠进行反应；
S13、将步骤S12获得的磁珠反应复合物洗涤，加入PE-羊抗人IgG结合物进行孵育反应；
S14、将步骤S13得到的磁珠复合物进行洗涤，在FlexXMAP 3D设备读取数据，依据不同磁珠的荧光值判断KIR3DL1与不同HLA-Bw4配基的相互作用强弱。
步骤S1中，扩增KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域序列(1-319个密码子)的特异性扩增引物：
上游引物序列为：GAATTCGCACATGGGTGGTCAGGACA(5’-3’)；
下游引物序列为：AGATCTGTGCAGGTGTCTGGGGTTA(5’-3’)；
上游引物5’端设计EcoRI酶切位点(GAATTC)；
下游引物5’端设计BglII酶切位点(AGATCT)。
步骤S3中，扩增获取KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域序列的PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液2.5μl、2.5mmol/L dNTP 2.0μl、25mmol/L MgCl2 2.0μl、引物浓度0.5μmol/L、LA-Taq酶0.8U、cDNA 2μl，加H2O补足至25μl；
扩增获取KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域序列的PCR反应程序为：95℃预变性5min，然后95℃30s，63℃45s，72℃1min30 s，30个循环，72℃延伸10min后冷却至4℃。
步骤S4中，TOPO TA克隆所用的TA载体为ThermoFisher公司产品，感受态细胞为Takara公司产品。
步骤S5中，质粒抽提试剂盒为申能博彩质粒抽提试剂盒，测序引物4条，2条同扩增引物，2条为TOPO TA克隆载体引物T7和M13。
步骤S6中，采用EcoRI和BglII限制性内切酶对TA重组载体和pFUSE-hIgG1-Fc2进行双酶切，EcoRI和BglII限制性内切酶为NEB公司产品。
步骤S7中，KIR3DL1胞外-stem区域序列和pFUSE-hIgG1-Fc2载体连接反应，连接酶为Takara公司的T4连接酶。
步骤S8中，pFUSE-hIgG1-Fc2-KIR3DL1重组质粒测序引物6条，其中2条是步骤S1中的扩增引物，另外4条为特异性测序引物，分别为：
pFuse-Il2-F1：CTGAGATCACCGGcGAAGGA(5’-3’)
pFuse-IgG-R1：TATCTTATCATGTCTGGCCAGCT(5’-3’)
pFuse-Il2-F2：CACCATGTACAGGATGCAACT(5’-3’)
pFuse-IgG-R2：TGGCCAGCTAGCACTCATTTA(5’-3’)。
步骤S9中，重组质粒转染人胚胎肾细胞(HEK293)所用的转染试剂为ThermoFisher公司的Lipofectamine 3000转染试剂。
步骤S10中，获得转染细胞表达的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白，蛋白提取试剂盒为上海生工公司产品。
步骤S11中，融合重组蛋白进行纯化和western-blot鉴定，所用纯化柱Protein A/G混合柱料纯化树脂为BBI公司产品，SDS-PAGE凝胶和western-blot转膜液为Invitrogen公司产品，一抗Rabbit anti human KIR3DL1抗体为Abcom公司产品，二抗Goat anti-rabbitIgG HRP为santa cruz biotechnology公司产品。
步骤S12中，商品化的HLA-class I磁珠(LABScreenSingle CLASS-I)为onelambda公司的产品。
步骤S13中，PE-羊抗人IgG结合物为Invitrogen公司产品。
步骤S14中，分析软件为xPONENTTM。
以下结合实例对本发明的内容作进一步详细说明。
本实施具体以构建KIR3DL1*01502等位基因胞外结构域与人IgG-Fc段融合重组蛋白，再与商品化偶联97种HLA分子的HLA-I类磁珠反应检测KIR3DL1*01502与HLA-I类分子的相互作用做详细说明。
S1、设计并合成KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域序列特异性扩增引物
KIR3DL1胞外结构域和stem区域共319个氨基酸，根据这个区域的序列特点，设计上游引物序列为：GAATTCGCACATGGGTGGTCAGGACA(5’-3’)，下游引物序列为：AGATCTGTGCAGGTGTCTGGGGTTA(5’-3’)。上游引物5’端设计EcoRI酶切位点(GAATTC)，下游引物5’端设计BglII酶切位点(AGATCT)。
S2、制备人基因组RNA，并逆转录为cDNA
招募携带KIR3DL1*01502等位基因的献血者，收集5ml全血。从新鲜全血中提取RNA，采用商用试剂盒(Qiagen公司)，严格按照试剂说明进行操作抽提总RNA，逆转录采用SuperScript TMIII First-Strand Synthesis System试剂盒，取细胞总RNA 5μg作为模板，Oligod(T)2μmol，总反应体积20μl，50℃孵育1h，85℃10min灭活M-MLV。
S3、将步骤S1合成的引物扩增步骤S2获得的cDNA，获取KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)和stem区域序列；
利用设计合成的引物扩增KIR3DL1*01502胞外结构域和stem区域。
PCR扩增反应体系：10×PCR缓冲液2.5μl、2.5mmol/L dNTP 2.0μ、25mmol/L MgCl22.0μl、引物浓度0.5μmol/L、LA-Taq酶0.8U、cDNA 2μl，加H2O补足至25μl。
PCR反应程序均为：95℃预变性5min，然后95℃30s，63℃45s，72℃1min30s，30个循环，72℃延伸10min后冷却至4℃。取3μL PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳30min，Bio-Rad成像仪下观察结果，鉴定扩增结果。
S4、将步骤S3获得的目的片段与TOPO TA载体连接，并转化大肠杆菌
将扩增获取的cDNA目的片段TA克隆至pCRTM-TOPOTM载体，步骤简要如下：PCR扩增产物1μl，饱和盐溶液0.5μl，载体0.5μl，H2O 1μl常温下连接5min，加入TOP10感受态细胞25μl冰浴15min后热休克30秒，再加入125μl SOC溶液后37℃振摇1h后涂于含Amp100μg/ml的LB平板上。37℃孵育箱培养过夜。次日无菌环境下，挑取阳性克隆，接种至含Amp100μg/ml的5ml新鲜LB菌液中，于37℃200rpm的条件下摇菌过夜，然后进行质粒DNA提取。
S5、挑取步骤S4获得的大肠杆菌单克隆进行培养，抽提质粒并测序筛选连接正确的TA重组质粒
采用上海申能博彩的3S plasmid miniprep kit V3.1。操作步骤如下：将过夜培养的5ml菌液高速离心1min，彻底去除上清液。于细菌中加入100μl Solution I，振荡充分悬浮细菌。加入200μl Solution II，立即上下颠倒混匀使细菌充分裂解，室温放置2min作用至溶液变澄清。加入400μl Solution III，立即上下颠倒混匀5-10次，室温放置2min。12000rpm，离心15min。取出3S柱和2ml样本收集管中，在管壁标上样本号，将上清液全部转移到3S柱中，盖上离心管盖子，室温放置2min，12000rpm离心1min。取下3S柱，弃去收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700μl wash solution到3S柱，高速离心1min。重复wash solution步骤一次。取下3S柱，弃去废液，将3S柱放入同一收集管中，高速离心2min。将3S柱放入干净的1.5ml的离心管中，在3S柱膜中央加入30μl 50℃预热的TE，不要盖上离心管盖，室温放置2min，盖上离心管盖，高速离心1min。重复洗涤步骤一次，洗脱的质粒DNA-20℃保存。
以质粒DNA为模板，按BigDye Sequening kit(ABI公司)试剂盒进行测序反应，测序引物4条，2条同扩增引物，2条为TOPO TA克隆载体引物T7和M13。测序反应按如下进行操作：H2O 5.75μl，5×PCR Buffer 1.75μl，BigDye mix 0.5μl，Primer(3.2μmol/L)1.0μl，Plasmid DNA 1.0μl。测序扩增：95℃预变性5min，95℃30s，50℃30s，60℃4min，25个循环。测序反应后采用乙醇/EDTA/NaAC法纯化PCR产物，加入10μl Hi-Di Formamide溶解DNA，95℃变性3min迅速置冰上冷却后，于ABI公司的3730测序仪进行PAGE电泳。采用SequenceAnalysis软件进行序列分析。
S6、将步骤S5获得的重组质粒和真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2分别用EcoRI和BglII双酶切
选择TA克隆测序正确的重组质粒与真核重组表达质粒pFUSE-hIgG1-Fc2分别用EcoRI和BglII双酶切，质粒DNA 1μg，10×Bal Buffer 2μl，10×EcoRI Buffer 2μl，BglII(10U/μL)0.4μl，EcoRI(10U/μL)0.4μl，加H2O补足至20μL，37℃酶切1h。琼脂糖电泳分离后切胶回收。
S7、将步骤S6双酶切获得的KIR3DL1胞外结构域(D0、D1、D2)-stem区域序列和pFUSE-hIgG1-Fc2载体连接反应并转化大肠杆菌
获得的目的基因片段与线性化的pFUSE-hIgG1-Fc2连接后转化于表达宿主菌E.coli DH5a中(转化方法同步骤S4)，在含Zeocin的选择培养基上筛选阳性克隆。
S8、挑取步骤S7获得的大肠杆菌单克隆培养，抽提质粒并测序筛选连接正确的pFUSE-hIgG1-Fc2-KIR3DL1重组质粒。
挑取阳性克隆提取质粒(质粒提取方法同步骤S5)，双酶切(双酶切方法同步骤S6)和测序鉴定筛选连接正确的重组质粒。pFUSE-hIgG1-Fc2-KIR3DL1重组质粒测序引物6条，其中2条是步骤S1的扩增引物，另外4条为特异性测序引物，分别为：
pFuse-Il2-F1：CTGAGATCACCGGcGAAGGA(5’-3’)
pFuse-IgG-R1：TATCTTATCATGTCTGGCCAGCT(5’-3’)
pFuse-Il2-F2：CACCATGTACAGGATGCAACT(5’-3’)
pFuse-IgG-R2：TGGCCAGCTAGCACTCATTTA(5’-3’)。
测序反应同步骤S5。
S9、将步骤S8获得的重组质粒转染人胚胎肾细胞(HEK293)
转染前接种2×105HEK293细胞于6孔培养板上，37℃，5％CO2培养过夜。次日细胞汇合度达70％-80％时方可进行转染，采用Lipo3000 transfection试剂转染，参照试剂盒说明书。简要如下：A将2.5μg质粒溶于125μl Opti-MEM无血清培养基，并加入P3000 5μl。B将7.5μl1ipo3000溶于125μl Opti-MEM无血清培养基中，混匀室温放置5min。将AB两管混合，室温放置10min。将6孔板培养基换成无血清培养基，每孔800μ1。将C管mix共250μl加入6孔板对应孔中，6h后换成有血清培养基。
S10、提取步骤S9获得的转染细胞表达的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白
培养稳定转染细胞株48h，收集细胞培养上清，利用30K的Ultra-4超滤离心管对收集的细胞上清液进行浓缩。具体操作如下：将蛋白样本转移入/>Ultra超滤离心管，4000g离心40min，转移样本至干净离心管。胞膜蛋白提取步骤简要如下：在细胞孔中加300μL细胞裂解液(使用前每1000μL加入1μL DTT，10μL PMSF，1μL蛋白酶抑制剂和5μL磷酸酶抑制剂)置冰上，用细胞刮刀刮下孔内细胞，-80℃冰冻30min，再取出放冰上融化。反复冻融三次。3000g 4℃离心15min，去除沉淀(沉淀中为未破碎的细胞，细胞核和一些细胞碎片)，上清转至新管中，冷冻保存，避免反复冻融。
S11、将步骤S10获取的融合重组蛋白进行纯化和western-blot鉴定
采用Protein A/G混合柱对重组蛋白进行纯化，取10μL蛋白加入等量的上样缓冲液，12％的SDS-PAGE电泳，电压设为200V，电泳1h。将凝胶放置ibind转膜系统，进行转膜处理，125V电转移7min。将转膜后的硝酸纤维滤膜在1×TBS洗3次于含5％BSA的TBS中，37℃封闭1h。在1×TBS洗膜3次。1:1000封闭液稀释的Rabbit anti human KIR3DL1抗体4℃孵育过夜；1×TBS洗膜3次，1:5000封闭液稀释的Goat anti-rabbit IgG HRP二抗室温孵育2h，1×TBS洗膜3次。膜置干净平板中加入Clarity weatern ECL substrate显色液，常温孵育5min至显色。
S12、将步骤S11鉴定后的融合重组蛋白与商品化的HLA-class I磁珠进行Luminex反应取2μl HLA-class I荧光磁珠，加入1:3稀释的重组蛋白和阴性对照血清(LS-NC)分别加到96孔板中，混匀，室温避光孵育30min；孵育后，每孔加入180μl 1×洗液，1300g离心5min，轻轻甩干弃掉洗液，重复洗2次。
S13、将步骤S12获得的反应复合物，加入PE-羊抗人IgG结合物进行孵育反应
按1：100的比例稀释PE-羊抗人IgG结合物(LS-AB2)至1×抗体工作液。即1μl PE-羊抗人IgG结合物和99μl 1×洗液混合稀释成1×抗体工作液。每孔中加入100μl 1×抗人IgG-PE震荡混匀，室温轻摇避光孵育30min。
S14、将步骤S13得到复合物于FlexXMAP 3D设备读取数据，分析获得的荧光结果
步骤S13孵育结束后，将反应板置于离心机，1400g离心5min，将板中的1×PE-羊抗人IgG结合物工作液弃去。加入PBS再清洗两次，离心，弃去清洗液。每孔加入80μl 1×PBS，覆盖新的密封膜后震荡混匀，将反应板置于FlexXMAP 3D设备检测系统，读取各孔荧光值，根据不同磁珠的荧光值大小判断KIR3DL1与不同HLA-Bw4配基的相互作用强弱(表1)。
表1 KIR3DL1*01502重组蛋白与HLA-class I磁珠反应荧光值
注：此表仅列出了KIR3DL1*01502重组蛋白与HLA-class I磁珠中偶联了HLA-Bw4分子的磁珠反应荧光值，斜体代表的是磁珠的编号，上方黑色加粗字体为磁珠上偶联的相应HLA分子，这些分子均编码HLA-Bw4；最下方数字为荧光值。
由表可以看出，KIR3DL1*01502与HLA-A*32:01、HLA-B*53:01、HLA-B*57:01和HLA-B*57:03相互作用比较强。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白，其特征在于：所述KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白由如下方式得到：
S101、根据KIR3DL1基因序列特点，设计并合成KIR3DL1胞外结构域（D0、D1、D2）和stem区域序列特异性扩增引物；
S102、制备人基因组RNA，并逆转录为cDNA；
S103、将步骤S101合成的引物扩增步骤S102获得的cDNA，获取KIR3DL1胞外结构域（D0、D1、D2）和stem区域扩增片段；
S104、将步骤S103获得的目的片段与TOPO TA载体连接，并转化大肠杆菌；
S105、挑取步骤S104获得的大肠杆菌单克隆，抽提质粒并测序筛选连接正确的TA重组质粒；
S106、将步骤S105获得的重组质粒和真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2进行双酶切；
S107、将步骤S106双酶切获得的KIR3DL1胞外-stem区域片段和pFUSE-hIgG1-Fc2载体连接反应并转化大肠杆菌；
S108、挑取步骤S107获得的大肠杆菌单克隆培养，抽提质粒并测序筛选连接正确的pFUSE-hIgG1-Fc2-KIR3DL1重组质粒；
S109、将步骤S108获得的重组质粒转染人胚胎肾细胞（HEK293）；
S110、提取步骤S109转染细胞表达的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白；
所述步骤S101中，扩增KIR3DL1胞外结构域（D0、D1、D2）和stem区域序列（1-319个密码子）的特异性扩增引物：
上游引物序列为：GAATTCGCACATGGGTGGTCAGGACA（5’-3’）；
下游引物序列为：AGATCTGTGCAGGTGTCTGGGGTTA（5’-3’）；
上游引物5’端设计EcoRI酶切位点（GAATTC）；
下游引物5’端设计BglII酶切位点（AGATCT）。
2. 根据权利要求1所述的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白，其特征在于：所述步骤S103中，扩增获取KIR3DL1胞外结构域（D0、D1、D2）和stem区域序列的PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液2.5 μl、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μl、25 mmol/L MgCl2 2.0 μl、引物浓度0.5 μmol/L、LA-Taq酶0.8U、cDNA 2μl，加H2O 补足至25 μl；
扩增获取KIR3DL1胞外结构域（D0、D1、D2）和stem区域序列的PCR反应程序为：95℃ 预变性5 min，然后95℃ 30 s，63℃ 45 s，72℃ 1 min30 s，30个循环，72℃延伸10 min后冷却至4℃。
3. 根据权利要求1所述的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白，其特征在于：所述步骤S105中，质粒抽提试剂盒中测序引物4条：2条同扩增引物，2条为TOPO TA克隆载体引物T7和M13。
4.根据权利要求1所述的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白，其特征在于：所述步骤S106中，采用EcoRI和BglII限制性内切酶对TA重组载体和pFUSE-hIgG1-Fc2进行双酶切。
5.根据权利要求1所述的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白，其特征在于：所述步骤S107中，KIR3DL1胞外-stem区域序列和pFUSE-hIgG1-Fc2载体连接反应，连接酶为T4连接酶。
6. 根据权利要求1所述的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白，其特征在于：所述步骤S108中，pFUSE-hIgG1-Fc2-KIR3DL1重组质粒测序引物6条，其中，2条是步骤S101中的扩增引物，另外4条为特异性测序引物，分别为：
pFuse-Il2-F1：CTGAGATCACCGGcGAAGGA（5’-3’）
pFuse-IgG-R1：TATCTTATCATGTCTGGCCAGCT（5’-3’）
pFuse-Il2-F2：CACCATGTACAGGATGCAACT（5’-3’）
pFuse-IgG-R2：TGGCCAGCTAGCACTCATTTA（5’-3’）。
7.根据权利要求1所述的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白在KIR3DL1与配基HLA-Bw4相互作用强度的快速便捷检测方面的应用，所述应用为非诊断目的。
8.根据权利要求7所述的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白在KIR3DL1与配基HLA-Bw4相互作用强度的快速便捷检测方面的应用，其特征在于：所述应用包括如下步骤：
S201、KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白与携带HLA CLASS-I抗原的磁珠进行反应；
S202、将获得的磁珠反应复合物洗涤并加入PE-羊抗人IgG结合物进行孵育反应；
S203、将孵育反应得到的磁珠复合物进行洗涤，获取荧光结果，并依据不同磁珠的荧光值判断KIR3DL1与不同HLA-Bw4配基的相互作用强弱。
9.一种KIR3DL1与不同HLA-Bw4配基的相互作用强弱快速检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1所述的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白。
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Investigation of the Effect of KIR-HLA Pairs on Hepatocellular Carcinoma in Hepatitis C Virus Cirrhotic Patients;Takeji Umemura 等;Cancers;第13卷(第13期);摘要 *

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