CN114601932A - 突变型fgf-21肽缀合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含经由糖基接头附接至突变型FGF‑21肽的PEG部分的突变型成纤维细胞生长因子‑21(FGF‑21)肽缀合物及其用途。进一步提供了一种用于产生突变型FGF‑21肽缀合物的方法以及包含所述突变型FGF‑21肽缀合物的药物组合物和容器。

Description

突变型FGF-21肽缀合物及其用途
分案信息
本申请是2018年9月4日递交的申请号为201880067272.X、发明名称为“突变型FGF-21肽缀合物及其用途”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月4日提交的美国临时申请号62/553,970的优先权，将其整体出于所有目的通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及包含经由糖基部分(moiety)附接至突变型(mutant)FGF-21肽的聚乙二醇(PEG)部分的突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物(conjugate)及其治疗用途。本文还涵盖了用于产生该突变型FGF-21肽缀合物的方法以及包含该突变型FGF-21肽缀合物的药物组合物和容器。
背景技术
FGF-21是作为单体非糖基化蛋白天然存在的内分泌激素。与FGF-19和FGF-23一起，FGF-21属于内分泌作用亚家族，而其余18种哺乳动物FGF配体被归类为五个旁分泌作用亚家族。与旁分泌作用FGF相反，内分泌作用FGF对硫酸肝素仅表现出低亲和力，并且因而能够进入血液循环。因此，内分泌FGF能够调节代谢过程，比如胆汁酸稳态、肝葡萄糖和蛋白质代谢(FGF-19)、葡萄糖和脂质代谢(FGF-21)以及维生素D和磷酸盐(phosphate)稳态(FGF-23)。
发明内容
本文描述了具有出人意料的特性的突变型FGF-21肽缀合物。本文还描述了包含至少一种本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的药物组合物以及包含至少一种本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的药物容器。更具体地，本文描述了如下突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，其包含突变型FGF-21肽和20kDa聚乙二醇(PEG)，该突变型FGF-21肽在至少一个脯氨酸残基的C末端侧上包含与至少一个脯氨酸(P)残基相邻的至少一个苏氨酸残基，从而形成至少一个O-连接的糖基化位点，该位点在相应的天然FGF-21中不存在，其中相应的天然FGF-21具有与SEQ ID NO：1至少95％相同的氨基酸序列，其中该20kDa PEG经由糖基部分在至少一个苏氨酸残基处共价附接至突变型FGF-21肽。进一步提供了一种用于产生突变型FGF-21肽缀合物的方法以及该突变型FGF-21肽缀合物在治疗糖尿病和相关疾病(特别是2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或代谢综合征)中的至少一种中的用途。在更具体的实施方案中，治疗人类受试者的2型糖尿病、NASH或代谢综合征。还提供了一种用于治疗需要这种治疗的受试者的糖尿病和相关疾病的方法，特别2型糖尿病、非酒精性NASH和/或代谢综合征，更特别是人类受试者的2型糖尿病、NASH和/或代谢综合征。本文还涵盖了用于治疗2型糖尿病、非酒精性NASH和/或代谢综合征，更特别是人类受试者的2型糖尿病、NASH和/或代谢综合征的突变型FGF-21肽缀合物。在另一方面，突变型FGF-21肽缀合物用于制备治疗2型糖尿病、非酒精性NASH和/或代谢综合征，更特别是人类受试者的2型糖尿病、NASH和/或代谢综合征的药剂。
与本领域中的一般教导相反，发明人出人意料地发现，靠近C末端的PEG化是耐受的，并且包含靠近C末端的PEG化的蛋白质缀合物在体外和体内具有生物活性。还注意到，如在各种体外和体内测定中所证明的，20kDa PEG残基与突变型FGF-21肽的附接生成了具有出人意料的治疗特性的突变型FGF-21肽缀合物。此类出人意料的特性包括改善的半衰期(其在人类中估计为～80小时)，以及在有需要的受试者中降低HbA1c(血糖指数的稳定指标)、血清甘油三酯水平或血清胰岛素水平中的至少一种的能力。此类受试者包括但不限于怀疑患有糖尿病和/或相关疾病(例如，2型糖尿病、NASH和/或代谢综合征)或患有糖尿病和/或相关疾病(例如，2型糖尿病、NASH和/或代谢综合征)的受试者。包含20kDa PEG残基的突变型FGF-21肽缀合物还表现出高生物利用度，如通过小鼠和大鼠中38％的生物利用度和猴中56％的生物利用度所反映的。
在一方面，本文描述了一种突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，其包含
i)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的突变型FGF-21肽，
ii)糖基部分，和
iii)20kDa聚乙二醇(PEG)，
其中突变型FGF-21肽通过SEQ ID NO：2的氨基酸位置173处的苏氨酸与糖基部分的第一位点之间的共价键附接至糖基部分，并且其中糖基部分通过糖基部分的第二位点与20kDa PEG之间的共价键附接至20kDa PEG。在其具体的实施方案中，糖基部分包含以下中的至少一种：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基、半乳糖(Gal)残基、唾液酸(Sia)残基、Sia残基的5-胺类似物、甘露糖(Man)残基、甘露糖胺、葡萄糖(Glc)残基、N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，GlcNAc)残基、岩藻糖残基、木糖残基或其组合。在另一个具体的实施方案中，糖基部分包含以下中的至少一种：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基、半乳糖(Gal)残基、唾液酸(Sia)或其组合。在其更具体的实施方案中，至少一个Sia残基是九碳羧化糖。仍更具体地，至少一个Sia残基是N-乙酰基-神经氨酸(2-酮(keto)-5-乙酰胺基-3，5-双脱氧-D-甘油(glycero)-D-半乳壬酮吡喃-1糖酸(galactononulopyranos-1-onic acid)，Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)、2-酮-3-脱氧-壬酮糖酸(nonulosonic acid)(KDN)或9-取代的唾液酸。在更具体的实施方案中，9-取代的唾液酸是9-O-乳酰基(lactyl)-Neu5Ac、9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac或9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。在甚至更具体的实施方案中，糖基部分包含结构-GalNAc-Sia-。
在一方面，本文所述的包含20kDa PEG部分的突变型FGF-21肽缀合物通过共价键至接头(a covalent bond to a linker)附接至糖基部分，其中接头包含至少一个氨基酸残基。示例性氨基酸包括：极性且中性氨基酸(例如，丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)和具有相对简单的侧链的非极性氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸)。在具体的实施方案中，至少一个氨基酸残基是至少一个甘氨酸(Gly)。在仍更具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)。
在甚至更具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含以下结构：
Figure BDA0003549953810000041
其中n是选自450至460的整数。
本文所述的突变型FGF-21肽缀合物可以包含作为线性或支化PEG的20kDa PEG。在更具体的实施方案中，20kDa PEG是线性PEG。在仍更具体的实施方案中，20kDa PEG是20kDa甲氧基-PEG。
在另一方面，提出了一种药物组合物，其包含本文所述的突变型FGF-21肽缀合物中的任何一种或至少一种和药学上可接受的运载体。突变型FGF-21肽缀合物可以按从0.1mg/mL至50mg/mL、特别是从1mg/mL至45mg/mL、更特别是从10mg/mL至40mg/mL的范围的浓度、最特别是按26±4mg/mL的浓度在药物组合物中存在。在具体的实施方案中，药物组合物进一步包含缓冲剂、特别是Tris缓冲液。在另一个实施方案中，缓冲剂以从1mM至100mM、特别是从2mM至75mM、更特别是从5mM至50mM、甚至更特别是从10mM至25mM、最特别是16±2mM的浓度存在。更具体地，pH在从6.0至8.5、特别是从6.5至8.0、更特别是从6.75至8.0的范围内，最特别地是7.5±0.3。在另一个具体的实施方案中，药物组合物进一步包含盐、特别是无机盐、更特别是NaCl。更具体地，盐以从30mM至200mM、特别是从40mM至150mM、更特别是从50mM至100mM、最特别是56±2mM的浓度存在。药物组合物可以进一步包含张力调节剂。此类张力调节剂包括但不限于甘油、氨基酸、氯化钠、蛋白质、糖和糖醇；特别地，张力调节剂是糖；更特别地，张力调节剂是蔗糖。在另一个实施方案中，张力调节剂以50mM至200mM的浓度、更特别地以100mM至175mM的浓度存在，甚至更特别地以135mM至160mM的浓度、最特别地以150±2mM的浓度存在。在另一个实施方案中，药物组合物进一步包含表面活性剂、特别是非离子表面活性剂，其中表面活性剂或非离子表面活性剂是基于聚山梨酯的非离子表面活性剂、特别是聚山梨酯20或聚山梨酯80、更特别是聚山梨酯20。在具体的实施方案中，表面活性剂或非离子表面活性剂以0.01mg/mL至1mg/mL的浓度、特别地以0.05至0.5mg/mL的浓度、更特别地以0.2±0.02mg/mL的浓度存在。
在示例性实施方案中，药物组合物包含0.1mg/mL至50mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物，1mM至100mM缓冲剂、特别是Tris缓冲液，30mM至200mM盐、特别是NaCl，50mM至200mM张力调节剂、特别是蔗糖，以及0.01mg/mL至1mg/mL表面活性剂或非离子表面活性剂、特别是聚山梨酯20，并且具有6.0至8.5的pH。
本文还涵盖了一种包含本文所述的突变型FGF-21肽缀合物或包含本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的药物组合物中的任何一种或至少一种的药物容器。示例性的此类药物容器包括但不限于注射器、小瓶、输液瓶、安瓿、注射管(carpoule)、配备有针保护系统的注射器或注射笔(injection pen)内的注射管。
在进一步的方面，提出了一种产生本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的方法，其包括以下步骤：
(1)在表达宿主中重组产生突变型FGF-21肽；和
(2)将PEG-糖基部分酶促地附接至步骤(1)的突变型FGF-21肽，其中PEG具有20kDa，从而形成突变型FGF-21肽缀合物。在具体的实施方案中，表达宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)。在该方法的另一个具体的实施方案中，步骤(2)包括以下步骤(2a)：在适合于将GalNAc从GalNAc供体转移到SEQ ID NO：2的氨基酸位置173处的苏氨酸的条件下，使突变型FGF-21肽与GalNAc供体和GalNAc转移酶接触。在仍更具体的实施方案中，GalNAc供体是UDP-GalNAc。在又另一个具体的实施方案中，GalNAc转移酶是MBP-GalNAcT2。在该方法的另一个具体的实施方案中，步骤(2)进一步包括以下步骤(2b)：在适合于将20kDa PEG-Sia从20kDa PEG-Sia供体转移到SEQ ID NO：2的氨基酸位置173处的苏氨酸残基或者在存在步骤(2a)时转移到附接至SEQ ID NO：2的氨基酸位置173处的苏氨酸残基的GalNAc的条件下，使步骤(1)或步骤(2a)(如果存在)的产物与20kDa PEG-Sia供体和唾液酸转移酶接触。在该方法的进一步具体的实施方案中，20kDa PEG-Sia供体是20kDa PEG-Sia-CMP。在该方法的仍更具体的实施方案中，唾液酸转移酶是ST6GalNAc1。在该方法的甚至更具体的实施方案中，20kDa PEG-Sia供体包含以下结构：
Figure BDA0003549953810000061
其中n是选自450至460的整数。
在该方法的另一个具体的实施方案中，该方法在步骤(1)之后并且在步骤(2)之前进一步包括以下步骤(3)：在重组产生后纯化突变型FGF-21肽。该方法在步骤(2)之后可以进一步包括以下步骤(4)：纯化在步骤(2)中形成的突变型FGF-21肽缀合物。在具体的实施方案中，步骤(3)包括使突变型FGF-21肽经受和/或步骤(4)包括使突变型FGF-21肽缀合物经受选自由离子交换色谱、亲和色谱、过滤及其组合组成的组的方法。纯化步骤可以包括一个或多个离子交换色谱步骤、特别是两个离子交换色谱步骤。在其具体的实施方案中，离子交换色谱是阴离子交换色谱、特别是强阴离子交换色谱。在其具体的实施方案中，阴离子交换色谱采用选自由以下组成的组的成员：亲水性聚乙烯醚基的基质、聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物基质、三甲基铵乙基(TEAE)、二乙基氨基乙醇(DEAE)、琼脂糖、季铵(Q)强阴离子交换色谱及其组合。在其另一个具体的实施方案中，步骤(3)包括使用亲水性聚乙烯醚基的基质进行的两个阴离子交换色谱步骤。在其另一个具体的实施方案中，步骤(4)包括两个季铵(Q)强阴离子交换色谱步骤。在具体的实施方案中，在步骤(2)中和/或在步骤(3)(如果存在)中添加精氨酸、特别是至少400mM的精氨酸。在另一个具体的实施方案中，该方法在步骤(3)之后并且在步骤(2)之前进一步包括以下步骤(5)：去除内毒素，其中使用内毒素去除过滤器过滤步骤(3)的产物。
本文还涵盖了一种通过本文所述的任何一种方法可获得的突变型FGF-21肽缀合物。
在另一方面，提出了一种用于治疗糖尿病或糖尿病相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用一定量的本文所述的或通过本文所述的方法可获得的突变型FGF-21肽缀合物或者包含本文所述的或通过本文所述的方法可获得的突变型FGF-21肽缀合物的药物组合物。糖尿病或糖尿病相关疾病可以包含2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或代谢综合征中的至少一种。在具体的实施方案中，受试者是人类受试者。在更具体的实施方案中，施用降低了HbA1C水平，其中降低HbA1C水平指示血糖水平随时间持续降低。本领域已知并且本文描述了多种示例性指标，包括但不限于葡萄糖、胰岛素、体重、血清脂质(总胆固醇、LDL、甘油三酯)、肝酶(ALT、AST)、肝重、相对肝重(％体重)、NAFLD活动评分(NAS)、纤维化评分(例如，肝纤维化)、促炎性细胞因子(例如，IL1β、MCP-1)、纤维化生物标志物(αSMA、胶原1α)、肝胆固醇、肝甘油三酯和肝脂肪酸的降低。高分子量(HMW)脂联素(adiponectin)或HDL中至少一种的增加也是本文所述化合物和组合物的临床功效的指标。
本文还涵盖了在用于治疗糖尿病或糖尿病相关疾病的方法中使用的本文所述的任何一种突变型FGF-21肽缀合物或包含本文所述的任何一种突变型FGF-21肽缀合物的药物组合物。糖尿病或糖尿病相关疾病可以包含2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或代谢综合征中的至少一种。在具体的实施方案中，糖尿病或糖尿病相关疾病困扰人类受试者。在更具体的实施方案中，该用途降低了HbA1C水平，其中降低HbA1C水平指示血糖水平随时间持续降低。本领域已知并且本文描述了多种示例性指标，包括但不限于葡萄糖、胰岛素、体重、血清脂质(总胆固醇、LDL、甘油三酯)、肝酶(ALT、AST)、肝重、相对肝重(％体重)、NAFLD活动评分(NAS)、纤维化评分(例如，肝纤维化)、促炎性细胞因子(例如，IL1β、MCP-1)、纤维化生物标志物(αSMA、胶原1α)、肝胆固醇、肝甘油三酯和肝脂肪酸的降低。高分子量(HMW)脂联素或HDL中的至少一种的增加也是本文所述化合物和组合物的临床功效的指标。
在另一方面，提出了本文所述的突变型FGF-21肽缀合物在制备用于治疗糖尿病或糖尿病相关疾病的方法的药剂中的用途。糖尿病或糖尿病相关疾病可以包含2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或代谢综合征中的至少一种。在具体的实施方案中，糖尿病或糖尿病相关疾病困扰人类受试者。在更具体的实施方案中，该用途降低了HbA1C水平，其中降低HbA1C水平指示血糖水平随时间持续降低。本领域已知并且本文描述了多种示例性指标，包括但不限于葡萄糖、胰岛素、体重、血清脂质(总胆固醇、LDL、甘油三酯)、肝酶(ALT、AST)、肝重、相对肝重(％体重)、NAFLD活动评分(NAS)、纤维化评分(例如，肝纤维化)、促炎性细胞因子(例如，IL1β、MCP-1)、纤维化生物标志物(αSMA、胶原1α)、肝胆固醇、肝甘油三酯和肝脂肪酸的降低。高分子量(HMW)脂联素或HDL中的至少一种的增加也是本文所述化合物和组合物的临床功效的指标。
在另一方面，提出了一种突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，其包含
i)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的突变型FGF-21肽，
ii)糖基部分，其中糖基部分包含结构-GalNAc-Sia-，和
iii)30kDa聚乙二醇(PEG)，
其中突变型FGF-21肽通过SEQ ID NO：2的氨基酸位置173处的苏氨酸与糖基部分的第一位点之间的共价键附接至糖基部分，并且其中糖基部分通过糖基部分的第二位点与30kDa PEG之间的共价键附接至30kDa PEG。在具体的实施方案中，30kDa PEG部分通过共价键至接头附接至糖基部分，其中接头包含至少一个氨基酸残基。示例性氨基酸包括：极性且中性氨基酸(例如，丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)和具有相对简单的侧链的非极性氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸)。在具体的实施方案中，至少一个氨基酸残基是至少一个甘氨酸(Gly)。在仍更具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(30kDa)。本文所述的突变型FGF-21肽缀合物可以包含作为线性或支化PEG的30kDa PEG。在更具体的实施方案中，30kDa PEG是线性PEG。在仍更具体的实施方案中，30kDa PEG是30kDa甲氧基-PEG。
附图说明
图1：本发明的具体实施方案的结构，也就是包含FGF-21(Thr)-GalNAc-Sia-Gly-PEG的示例性结构的突变型FGF-21肽缀合物的结构。选择n以给出所需的PEG分子量。关于20kDa PEG，n在选自450至460的范围内。
图2：在纯化和配制示例性野生型/天然FGF-21和突变体后，以mg蛋白质FGF-21/升发酵液摇瓶给出的总分离产率。
图3：示例性细胞扩增、产生和收获过程流程图。
图4：示例性重折叠和突变型FGF-21肽纯化过程流程图。
图5：示例性糖PEG化和最终纯化过程流程图。
图6：在(2-8)℃和40℃下储存一周的20kDa PEG-FGF-21(P(172)TQGAS)突变型缀合物样品的非还原性SDS-PAGE。泳道1：分子量标志物，泳道2：储存在(2-8)℃下的pH 5样品，泳道3：储存在40℃下的pH 5样品，泳道4：储存在(2-8)℃下的pH 6样品，泳道5：储存在40℃下的pH 6样品，泳道6：储存在(2-8)℃下的pH 7样品，泳道7：储存在40℃下的pH 7样品。样品组成如下：
Figure BDA0003549953810000101
如可以从凝胶图像看出的，当与pH为5或6的样品相比时，pH为7的样品含有最少的聚集体(在较高分子量的条带)和其他降解产物(在较低分子量的条带)。
图7：随聚山梨酯20浓度变化的≥10μm的亚可见颗粒的浓度。
图8：突变型20kDa PEG-FGF-21(P(172)TQGAS)肽缀合物对糖尿病食蟹猴中HbA1c的影响(参见实施例12)。
图9：突变型FGF-21肽缀合物对口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的影响(参见实施例12)。每种处理的数据显示为曲线下面积(AUC)。*p＜0.05，**p＜0.01。
图10：突变型FGF-21肽缀合物对糖尿病食蟹猴中血清ALT浓度的影响。
图11：使用突变型FGF-21肽缀合物治疗的糖尿病食蟹猴中的甘油三酯水平。
图12：使用突变型FGF-21肽缀合物治疗的糖尿病食蟹猴中的HDL胆固醇水平。
图13：使用突变型FGF-21肽缀合物治疗的糖尿病食蟹猴中的脂联素水平。
图14：使用突变型FGF-21肽缀合物(在本文中称为TEV-47948)治疗后STAM模型中的NAFLD活动评分。NAS＝NAFLD活动评分。
图15A-D：突变型FGF-21肽缀合物(在本文中称为TEV-47948)在DIN(饮食诱导的NASH模型)模型中显著降低了NAFLD活动评分(NAS)，如通过脂肪变性(A)、炎症(B)和纤维化(C)减少所反映的。总NAS评分的降低示于(D)中。
图16A-D：突变型FGF-21肽缀合物(在本文中称为TEV-47948)在DIN模型中显著降低了促炎性细胞因子的表达，如通过白细胞介素1β(IL1β)(A)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)(B)以及α平滑肌肌动蛋白(αSMA)(C)和胶原1α1(D)降低所反映的。
图17：突变型FGF-21肽缀合物(在本文中称为TEV-47948)在DIN模型中减轻了体重。
图18A-C：突变型FGF-21肽缀合物(在本文中称为TEV-47948)在DIN模型中显著降低了葡萄糖水平(A)、血浆胰岛素(B)和稳态模型胰岛素抵抗评估(HOMA-IR)(C)。
图19A-B：突变型FGF-21肽缀合物(在本文中称为TEV-47948)在DIN模型中显著降低了总胆固醇水平(A)和总甘油三酯(B)。
图20A-C：突变型FGF-21肽缀合物(在本文中称为TEV-47948)在DIN模型中显著降低了肝胆固醇水平(A)、肝甘油三酯(B)和肝脂肪酸(C)。
在已经公开的那些益处和改善中，根据结合附图进行的以下描述，本发明的其他目的和优点将变得清楚。本文公开了本发明的详细实施方案；然而，应当理解，所公开的实施方案仅是可以按各种形式来体现的本发明的说明。另外，结合本发明的各种实施方案给出的每个实施例旨在是说明性的，而非限制性的。
定义
为了清楚和可读起见，提供以下定义。可以在本发明的每个实施方案上阅读针对这些定义提及的任何技术特征。在这些实施方案的上下文中可以明确地提供另外的定义和解释。除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。通常，本文所用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学以及核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域熟知并且通常采用的那些。将标准技术用于核酸和肽合成。技术和程序通常根据贯穿本文件提供的本领域的常规方法和各种一般参考文献(例如，Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2d ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)进行。
酶：酶是进行生物化学反应(比如将糖基部分或修饰的糖基部分从各自的糖基供体转移到FGF-21的氨基酸或转移到附接至肽的另一个糖基部分)的催化活性生物分子。
蛋白质：蛋白质通常包含一种或多种肽或多肽。蛋白质通常折叠成3维形式，这可能是蛋白质发挥其生物功能所需的。通常将蛋白质或肽的序列理解为按顺序，即其氨基酸的连续(succession)。
重组蛋白：术语“重组蛋白”是指在异源系统中(即在不天然地产生这种蛋白质或这种蛋白质变体的生物体中)产生的蛋白质，即蛋白质或肽是“重组产生的”。通常，本领域中用于产生重组蛋白的异源系统是细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia(E.)coli))、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces(S.)cerevisiae))或某些哺乳动物细胞培养系。
表达宿主：表达宿主表示用于重组蛋白产生的生物体。一般的表达宿主是细菌(比如大肠杆菌)、酵母(比如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))或者还有哺乳动物细胞(比如人类细胞)。
RNA，mRNA：RNA是核糖核酸的常用缩写。它是核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是一磷酸腺苷、一磷酸尿苷、一磷酸鸟苷和一磷酸胞苷单体，它们沿着所谓的主链相互连接。主链是通过第一相邻单体的糖(即核糖)和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成的。将单体的具体连续称为RNA序列。
DNA：DNA是脱氧核糖核酸的常用缩写。它是核酸分子，即由核苷酸单体组成的聚合物。这些核苷酸通常是一磷酸脱氧腺苷、一磷酸脱氧胸苷、一磷酸脱氧鸟苷和一磷酸脱氧胞苷单体，它们独立地由糖部分(脱氧核糖)、碱基部分和磷酸部分组成，并且通过特征性的主链结构聚合。主链结构通常是通过第一相邻单体的核苷酸的糖部分(即脱氧核糖)和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成的。将单体的特定顺序(即与糖/磷酸主链相连接的碱基的顺序)称为DNA序列。DNA可以是单链或双链的。在双链形式中，第一链的核苷酸通常与第二链的核苷酸杂交，例如通过A/T碱基配对和G/C碱基配对。
核酸分子的序列/核酸序列：通常将核酸分子的序列理解为按特定和单独的顺序，即其核苷酸的连续。
氨基酸分子的序列/氨基酸序列：通常将蛋白质或肽的序列理解为按顺序，即其氨基酸的连续。
序列同一性：如果两个或更多个序列表现出相同的长度和核苷酸或氨基酸顺序，则它们是相同的。同一性百分比通常描述两个序列相同的程度，即它通常描述在其序列位置中与参考序列(如天然或野生型序列)的相同核苷酸相对应的核苷酸的百分比。为了确定同一性程度，认为要比较的序列表现出相同的长度，即要比较的序列中最长的序列的长度。这意味着由8个核苷酸/氨基酸组成的第一序列与由包含第一序列的10个核苷酸/氨基酸组成的第二序列80％相同。换句话说，在本发明的上下文中，序列同一性尤其涉及序列的在两个或更多个具有相同长度的序列中具有相同位置的核苷酸/氨基酸的百分比。通常将空位视为不相同的位置，无论它们在比对中的实际位置如何。
新引入的氨基酸：“新引入的氨基酸”表示与天然/野生型氨基酸序列相比，新引入氨基酸序列中的氨基酸。为了在氨基酸序列内的所需位置处具有某个氨基酸侧链，通常通过诱变来改变天然氨基酸序列。在本发明中，特别是将氨基酸苏氨酸新引入氨基酸序列中在C末端侧与脯氨酸残基相邻。
官能团：该术语应根据本领域技术人员的一般理解来理解，并且表示如下化学部分，其存在于分子上、特别是存在于肽或肽的氨基酸或附接至肽的糖基残基上，并且可以参与另一个化学分子的共价或非共价键，即允许例如糖基残基或PEG的附接。
天然氨基酸序列：该术语应根据本领域技术人员的一般理解来理解，并且表示呈天然存在的形式而没有进行任何人工突变或氨基酸修改的氨基酸序列。也将它称为“野生型序列”。“天然FGF-21”或“野生型FGF-21”表示具有天然存在的氨基酸序列(比如SEQ IDNO：1中所描绘的人FGF-21的(未突变的)氨基酸序列)的FGF-21。N末端甲硫氨酸的存在与否取决于所使用的表达宿主，通常不会改变被认为具有其自然或天然/野生型序列的蛋白质的状态。
突变的：该术语应根据本领域技术人员的一般理解来理解。如果氨基酸序列与其自然或天然氨基酸序列相比，在其氨基酸序列中含有至少一个增加的、缺失的或交换的氨基酸，即如果它含有氨基酸突变，则将其称为“突变的”。也将突变的蛋白质称为突变体。在本发明中，突变的FGF-21肽特别是在脯氨酸残基的C末端侧具有与脯氨酸残基相邻的氨基酸交换的肽。因此，将用于O-连接的糖基化的共有序列引入FGF-21中，使得突变型FGF-21肽包含新引入的O-连接的糖基化侧。氨基酸交换通常如下表示：S172T，这意味着在位置172处的氨基酸丝氨酸(如在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中)被氨基酸苏氨酸交换。
药物有效量：在本发明的上下文中，药物有效量通常被理解为足以诱导药物作用的量。
疗法/治疗：术语“疗法”是指疾病或病症的“治疗”(“treating”或“treatment”)、抑制疾病(减慢或阻止其发展)、提供缓解疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)以及缓解疾病(导致疾病消退)。
治疗有效量：是化合物的足以治疗疾病或病症、抑制疾病或病症、提供缓解疾病的症状或副作用和/或引起疾病或病症消退的量。
半衰期：在施用突变型FGF-21肽和/或其缀合物的上下文中，如本文所用的术语“半衰期”定义为在受试者中药物(即突变型FGF-21肽和/或缀合物)的血浆浓度降低一半所需的时间。
O-连接的糖基化：“O-连接的糖基化”发生在丝氨酸或苏氨酸残基处(Tanner etal.，Biochim.Biophys.Acta.906：81-91(1987)；和Hounsell et al.，Glycoconj.J.13：19-26(1996))。在本发明中，O-连接的糖基化位点(其是肽的氨基酸序列中的被糖基转移酶识别为糖基残基的附接点的氨基酸基序)包括不存在于天然/野生型氨基酸序列中的氨基酸基序脯氨酸-苏氨酸(PT)。具体而言，将苏氨酸残基新引入与脯氨酸相邻并且在脯氨酸残基的C末端侧。然后，通过糖基转移酶将糖基部分附接至苏氨酸残基的-OH基团。
新引入的O-连接的糖基化侧：“新引入的O-连接的糖基化侧”表示在如本文所述的将苏氨酸引入与脯氨酸残基相邻并且在其C末端侧之前，不存在于天然或野生型FGF-21中的O-连接的糖基化侧。
相邻：相邻表示在各自的氨基酸的N末端或C末端，氨基酸在氨基酸序列中紧挨另一个氨基酸。在本发明中，例如在脯氨酸残基的C末端侧，新引入的苏氨酸残基与脯氨酸残基相邻。
糖基部分：糖基部分是由一个或多个相同或不同的糖基残基组成的部分，其将突变型FGF-21肽与聚乙二醇(PEG)相连接，从而形成包含肽、糖基部分和PEG的缀合物。糖基部分可以是单糖基、二糖基、三糖基或寡糖基部分。糖基部分可以包含一个或多个唾液酸残基、一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基、一个或多个半乳糖(Gal)残基等。可以比如使用PEG或甲氧基-PEG(m-PEG)(PEG的烷基衍生物)修饰糖基部分。
糖缀合：如本文所用，“糖缀合”是指PEG修饰的糖基部分与(多)肽(例如，本发明的突变型FGF-21)的氨基酸或糖基残基的酶促介导的缀合。“糖缀合”的亚属是“糖-PEG化”，其中修饰的糖基部分的修饰基团是PEG或m-PEG。PEG可以是线性或支化的。通常，支化PEG具有中心分支核心部分和与中心分支核心相连接的多条线性聚合物链。PEG通常以支化形式使用，该支化形式可以通过将环氧乙烷添加到各种多元醇(如甘油、季戊四醇和山梨糖醇)中来制备。中心分支部分也可以衍生自几种氨基酸，比如赖氨酸。支化PEG可以按一般形式表示为R(-PEG-OX)m，其中R代表核心部分(如甘油或季戊四醇)，X代表封端基团或端基，并且m代表臂数。术语“糖-PEG”和“糖基-PEG”可互换使用，并且表示由PEG或甲氧基-PEG(mPEG或m-PEG)、一个或多个糖基残基(或糖基部分)和任选地PEG/甲氧基-PEG与糖基部分之间的接头(如氨基酸，例如甘氨酸)组成的化学部分。糖基-PEG/糖-PEG部分的实例是PEG-唾液酸(PEG-Sia)。应当注意，术语“糖-PEG”和“糖基-PEG”以及“PEG-唾液酸”和“PEG-Sia”以及糖-PEG部分的相似术语可以包括或者可以不包括PEG和一个或多个糖基部分之间的接头，即“PEG-唾液酸”涵盖例如PEG-唾液酸以及PEG-Gly-唾液酸以及mPEG-Gly-唾液酸。
序列基序：序列基序表示短氨基酸序列(比如仅包含两个氨基酸的短氨基酸序列)，其存在于较长氨基酸序列中(比如在人FGF-21的氨基酸序列中)的任何可能位置处。序列基序例如被表示为p172T，这意味着在位置172处的脯氨酸在C末端紧接苏氨酸残基。
唾液酸：术语“唾液酸”或“Sia”是指九碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙酰基-神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺基-3，5-双脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮吡喃-1-糖酸(通常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。该家族的第二个成员是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基被羟基化。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱氧-壬酮糖酸(KDN)(Nadano et al.(1986)J.Biol.Chem.261：11550-11557)。还包括9-取代的唾液酸，比如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac(如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac)、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。关于唾液酸家族的综述，参见例如Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)。
药学上可接受的赋形剂：“药学上可接受的”赋形剂包括当与本发明的突变型FGF-21肽缀合物组合时保留缀合物的活性并且与受试者的免疫系统无反应性的任何材料。实例包括但不限于任何标准药物赋形剂，比如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、盐、乳剂如油/水乳剂和各种类型的润湿剂。
药物容器：“药物容器”是适合于携带药物组合物，并且通常由惰性材料制成并且无菌的容器。
施用：术语“施用”意指针对受试者的口服施用，吸入，作为栓剂施用，外用接触，静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鼻内或皮下施用或者植入缓释装置(例如，微量渗透泵)。施用是通过任何途径，包括肠胃外和经粘膜(例如，口服、经鼻、经阴道、经直肠或经皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、室内和颅内。其他递送方式包括但不限于使用脂质体配制品、静脉内输注、经皮贴剂等。
糖尿病和糖尿病相关疾病：“糖尿病(diabetes)”是通常称为糖尿病(diabetesmellitus)的熟知并且良好表征的疾病。该术语描述了一组代谢疾病，其中由于胰岛素产生不足或者由于机体的细胞对胰岛素的反应不充分或者二者，人具有高的血糖水平(血糖)。具有高血糖的患者通常将经历多尿(尿频)，他们将变得越来越口渴(多饮)和饥饿(多食)。“糖尿病相关疾病”是特征在于比如肥胖、多尿、多饮和多食等相同症状的疾病。
2型糖尿病：“2型糖尿病”是糖尿病的最常见形式。2型糖尿病最常见地在成年期出现，更可能在超重和缺乏运动的人中发生。不像1型糖尿病(其目前无法预防)，可以改变2型糖尿病的许多风险因素。国际糖尿病基金会列出了标志需要进行糖尿病检查的四个症状：a)尿频，b)体重减轻，c)精力不足和d)过度口渴。胰岛素抵抗通常是2型糖尿病的前兆，葡萄糖进入细胞需要比平时更多的胰岛素的病症。肝中的胰岛素抵抗导致产生更多的葡萄糖，而周围组织中的抵抗意指葡萄糖的摄取受损。
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)：脂肪沉积在肝中，伴随后续肝损伤和炎症的病症。
代谢综合征：与2型糖尿病和心血管疾病的发展相关的一组明确的风险因素(生物化学和生理变化)。
具体实施方式
在一系列胰岛素抵抗动物模型中，重组FGF-21已经显示影响血浆葡萄糖和胰岛素水平，以降低肝和循环甘油三酯和胆固醇水平，并且改善胰岛素敏感性、能量消耗、肝脂肪变性和肥胖。出于此原因，FGF-21是治疗人2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和相关代谢疾病的感兴趣的靶标。
天然FGF-21具有比较短的体内半衰期，据报道在啮齿动物和非人灵长类动物中循环半衰期范围是从0.5至4小时，这限制了其临床应用性。重组人FGF-21的半衰期是1-2小时。为了改善FGF-21的药代动力学特性，已经开发了各种半衰期延长策略。
本文所用的缩写包括：PEG，聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；Ara，阿拉伯糖基(arabinosyl)；Fru，果糖基；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰氨基葡萄糖基；Man，甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖胺酯(mannosaminyl acetate)；Xyl，木糖基；NeuAc，唾液酸基(sialyl)或N-乙酰神经氨酸基(N-acetylneuraminyl)；Sia，唾液酸基或N-乙酰神经氨酸基；及其衍生物和类似物。
PEG化
延长蛋白质半衰期的一种方法是将一个或多个PEG部分附接至蛋白质，这种附接通常增加蛋白质的生物物理溶解度和稳定性。对于增加具有适合于治疗有需要的受试者的特性的蛋白质的治疗半衰期，证明这种方法具有特殊价值。然而，天然FGF-21缺乏特异性蛋白质PEG化位点。缺乏特异性蛋白质PEG化位点的化学PEG化是非位点特异性的，并且通常导致生成非均质的(inhomogeneous)产物群体，这需要大量纯化以获得均质且高纯度的产物——这是作为药物组合物获得市场准入的前提。因此，FGF-21的位点特异性PEG化对于生成具有改善的半衰期和良好的生物活性的位点特异性PEG化的FGF-21肽是期望的的。
基于酶的合成具有区域选择性和立体选择性的优点。此外，可以使用未保护的底物进行酶促合成。一种将PEG残基位点特异性地附接至蛋白质的可能方法是糖PEG化。在糖PEG化中，可以使用糖基转移酶将PEG部分转移到附接至蛋白质或肽的氨基酸的氨基酸或糖基残基。一般的最终结构是蛋白质-糖基部分-任选的其他接头-PEG。更具体的最终结构是蛋白质-蛋白质的(N-、C-或内部)氨基酸-一个或多个糖基残基-任选的接头(例如，氨基酸接头)-各种长度的线性或支化PEG部分，其中糖基部分可以包含一个或多个糖基残基。包含将蛋白质连接到PEG部分的结构的至少一部分的一个或多个糖基残基可以是任何可能的糖基残基。用于糖PEG化蛋白质的多种不同的方法是本领域已知的，并且在下文中详细描述。
在蛋白质PEG化中，缀合的PEG部分越大，PEG缀合的蛋白质的预期半衰期越长。这是由于较大的PEG部分保护缀合的蛋白质免受血流中存在的蛋白酶影响的能力相对增强。与较小的PEG部分相比，较大的PEG部分赋予PEG缀合的蛋白质更大的有效半径。与较小的蛋白质相比，较大的蛋白质在血流中的降解和清除更慢，因为较大的蛋白质进入肾脏更慢或完全无法进入肾脏。因此，技术人员偏爱如下PEG化过程，其要求将较高分子量的较长PEG残基(例如，≥30kDa PEG)、总数较高的PEG残基和/或更高分支的PEG残基按顺序附接至蛋白质，以产生相对于缀合到较短/较小的PEG部分的相同蛋白质具有优异特性的PEG化的蛋白质。
然而，与聚乙二醇化相关的值得考虑的缺点是潜在的空间位阻，由此缀合的PEG部分在物理上阻断了对于蛋白质活性重要或必需的蛋白质活性位点。例如，PEG部分可以特异性地阻断蛋白质与其受体的受体结合位点，这进而导致蛋白质活性的显著且有害的损失。为了避免此类潜在的聚乙二醇化抑制作用，本领域技术人员避免将PEG附接在参与受体结合的氨基酸附近。
对于FGF-21，C末端对于β-Klotho结合至关重要，并且N末端对于FGFR活化很重要。此外，基于其他FGF-21家族蛋白的晶体结构进行的FGF-21的计算机模拟(in silico)建模和体外效价测定证明，位于假定受体结合结构域的氨基酸残基的PEG化是无活性的，而在远端位点处的PEG化则产生了最具活性的类似物。此外，当将PEG部分置于FGF-21中的位置180处时，在基于细胞的效价测定中观察到效价损失大于100倍。还检查了FGF-21与抗体的Fc部分的融合，并且在FGF-21的C末端处的融合产生了比在N末端处的融合弱得多的类似物。相比之下，已经生成了在N末端PEG化的FGF-21，并且其已经显示出生物活性。因此，基于本领域的知识，鉴于蛋白质的此区域在结合和信号传导中所起的作用，技术人员将避免PEG化靠近FGF-21的C末端。
在此背景下，发明人着手生成多种突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，每种包含
i)突变型FGF-21肽，其在至少一个脯氨酸残基的C末端侧上包含与所述至少一个脯氨酸(P)残基相邻的至少一个苏氨酸(T)残基，从而形成至少一个不存在于相应的天然FGF-21中的O-连接的糖基化位点，其中相应的天然FGF-21具有与SEQ ID NO：1至少95％相同的氨基酸序列，和
ii)20kDa聚乙二醇(PEG)，其中所述20kDa PEG经由至少一个糖基部分在所述至少一个苏氨酸残基处共价附接至所述突变型FGF-21肽。
在具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含含有氨基酸序列PT的突变型FGF-21肽。在其具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸序列：P172T、P156T、P5T、P3T、P9T、P50T、P61T、P79T、P91T、P116T、P129T、P131T、P134T、P139T、P141T、P144T、P145T、P148T、P150T、P151T、P158T、P159T、P166T、P178T及其组合，其中脯氨酸和苏氨酸的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含选自由P172T、P156T、P5T及其组合组成，特别是由P172T、P156T及其组合组成的组的至少一个氨基酸序列，其中脯氨酸和苏氨酸的位置是基于如SEQID NO：1中所描绘的氨基酸序列。在仍更具体的实施方案中，脯氨酸残基位于突变型FGF-21肽的氨基酸145和C末端之间，其中氨基酸145的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含氨基酸序列P172T，其中脯氨酸和苏氨酸的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变S173T和R176A，其中氨基酸S和R的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列；特别地，突变型FGF-21肽包含如SEQ ID NO：2中所描绘的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变Q157T，其中氨基酸Q的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列；特别地，突变型FGF-21肽包含如SEQ IDNO：4中所描绘的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变D6T，其中氨基酸D的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列；特别地，突变型FGF-21肽包含如SEQ ID NO：5中所描绘的氨基酸序列。
在其他具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含选自由SEQ ID NO：2至28组成的组的氨基酸序列、特别是选自由SEQ ID NO：2至5组成的组的氨基酸序列、更特别是选自由SEQ ID NO：2至4组成的组的氨基酸序列；最特别地，突变型FGF-21肽包含如SEQ ID NO：2中所描绘的氨基酸序列。
在其他具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含至少一个糖基部分，该糖基部分包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖(Gal)和/或唾液酸(Sia)。在其具体的实施方案中，至少一个糖基部分包含结构-GalNAc-Sia-。
在其他具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含20kDa PEG部分，该20kDaPEG部分经由氨基酸残基、特别是甘氨酸(Gly)附接至至少一个糖基部分。在甚至更具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)。仍更具体地，突变型FGF-21肽缀合物包含以下结构：
Figure BDA0003549953810000221
其中n是选自450至460的整数。
在其他具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含作为线性或支化PEG、特别是线性PEG的20kDa PEG。仍更具体地，20kDa PEG是20kDa甲氧基-PEG。
本文还涵盖了一种药物组合物，其包含至少一种本文所述的突变型FGF-21肽缀合物和药学上可接受的运载体(carrier)。在具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物以从0.1mg/mL至50mg/mL、特别是从1mg/mL至45mg/mL、更特别是从10mg/mL至40mg/mL的范围的浓度、最特别是以26±4mg/mL的浓度存在。缓冲剂可以是Tris缓冲液。缓冲剂可以按从1mM至100mM、特别是从2mM至75mM、更特别是从5mM至50mM、甚至更特别是从10mM至25mM、最特别是16±2mM的浓度存在。pH可以在从6.0至8.5、特别是从6.5至8.0、更特别是从6.75至8.0的范围内，最特别地是7.5±0.3。药物组合物可以进一步包含盐、特别是无机盐、更特别是NaCl。药物组合物可以包含盐，盐以从30mM至200mM、特别是从40mM至150mM、更特别是从50mM至100mM、最特别是56±2mM的浓度存在。药物组合物可以进一步包含张力调节剂。合适的张力调节剂包括甘油、氨基酸、氯化钠、蛋白质或糖和糖醇；特别地，张力调节剂是糖；更特别地，张力调节剂是蔗糖。张力调节剂以50mM至200mM的浓度、更特别地以100mM至175mM的浓度存在，甚至更特别地以135mM至160mM的浓度、最特别地以150±2mM的浓度存在。药物组合物可以进一步包含表面活性剂、特别是非离子表面活性剂。表面活性剂或非离子表面活性剂可以是基于聚山梨酯的非离子表面活性剂、特别是聚山梨酯20或聚山梨酯80、更特别是聚山梨酯20。表面活性剂或非离子表面活性剂可以按0.01mg/mL至1mg/mL的浓度、特别地按0.05至0.5mg/mL的浓度、更特别地按0.2±0.02mg/mL的浓度存在。
在具体的实施方案中，药物组合物包含0.1mg/mL至50mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物，1mM至100mM缓冲剂、特别是Tris缓冲液，30mM至200mM盐、特别是NaCl，50mM至200mM张力调节剂、特别是蔗糖，以及0.01mg/mL至1mg/mL表面活性剂或非离子表面活性剂、特别是聚山梨酯20，并且具有6.0至8.5的pH。
本文还涵盖了一种包含至少一种本文所述的突变型FGF-21肽缀合物和/或包含至少一种本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的药物组合物的药物容器。合适的药物容器包括但不限于注射器、小瓶、输液瓶、安瓿、注射管、配备有针保护系统的注射器和注射笔内的注射管。
本文还涵盖了一种产生根据实施方案1至17中任一项所述的突变型FGF-21肽缀合物的方法，其包括以下步骤：
(1)在表达宿主中重组产生突变型FGF-21肽；和
(2)将PEG-糖基部分酶促地附接至步骤(1)的突变型FGF-21肽，其中PEG具有20kDa，从而形成突变型FGF-21肽缀合物。在具体的实施方案中，表达宿主是大肠杆菌。在更具体的实施方案中，步骤(2)包括以下步骤(2a)：在适合于将GalNAc从GalNAc供体转移到突变型FGF-21肽的至少一个苏氨酸残基的条件下，使突变型FGF-21肽与GalNAc供体和GalNAc转移酶接触。在仍更具体的实施方案中，GalNAc供体是UDP-GalNAc。在另一个具体的实施方案中，GalNAc转移酶是MBP-GalNAcT2。在另一个具体的实施方案中，步骤(2)进一步包括以下步骤(2b)：在适合于将20kDa PEG-Sia从20kDa PEG-Sia供体转移到突变型FGF-21肽的至少一个苏氨酸残基或者在存在步骤(2a)时转移到突变型FGF-21肽处的GalNAc的条件下，使步骤(1)或步骤(2a)(如果存在)的产物与20kDa PEG-Sia供体和唾液酸转移酶接触。在更具体的实施方案中，20kDa PEG-Sia供体是20kDa PEG-Sia-CMP。在仍更具体的实施方案中，唾液酸转移酶是ST6GalNAc1。在仍进一步具体的实施方案中，20kDa PEG-Sia供体包含以下结构：
Figure BDA0003549953810000241
其中n是选自450至460的整数。
在另一个具体的实施方案中，该方法在步骤(1)之后并且在步骤(2)之前进一步包括以下步骤(3)：在重组产生后纯化突变型FGF-21肽。在更具体的实施方案中，该方法在步骤(2)之后进一步包括以下步骤(4)：纯化步骤(2)中形成的突变型FGF-21肽缀合物。在另一个具体的实施方案中，其中步骤(3)包括使突变型FGF-21肽经受和/或步骤(4)包括使突变型FGF-21肽缀合物经受离子交换色谱、亲和色谱、过滤或其组合。更具体地，其中纯化步骤包括一个或多个离子交换色谱步骤，特别地它包括两个离子交换色谱步骤。在另一个具体的实施方案中，其中离子交换色谱是阴离子交换色谱，更特别地它是强阴离子交换色谱。更具体地，其中阴离子交换色谱采用选自由以下组成的组的成员：亲水性聚乙烯醚基的基质、聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物基质、三甲基铵乙基(TEAE)、二乙基氨基乙醇(DEAE)、琼脂糖、季铵(Q)强阴离子交换色谱及其组合。在另一个具体的实施方案中，其中在步骤(3)中进行两个阴离子交换色谱步骤，此类步骤使用亲水性聚乙烯醚基的基质。仍更具体地，其中在步骤(4)中进行季铵(Q)强阴离子交换色谱步骤，进行两个季铵(Q)强阴离子交换色谱步骤。更具体地，其中在步骤(2)中和/或在步骤(3)中(如果存在)添加精氨酸，特别地它是至少400mM的精氨酸。在更具体的实施方案中，该方法在步骤(3)之后并且在步骤(2)之前可以进一步包括以下步骤(5)：去除内毒素，其中使用内毒素去除过滤器过滤步骤(3)的产物。
在进一步的方面，涵盖了一种通过上述方法可获得的突变型FGF-21肽缀合物，以及进一步包含药学上可接受的赋形剂或运载体的其药物组合物。
在另一方面，提出了一种用于治疗糖尿病和相关疾病，特别是2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或代谢综合征的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的突变型FGF-21肽缀合物或包含至少一种本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的药物组合物。在具体的实施方案中，有需要的受试者是人类受试者。
用于FGF-21肽糖基化和糖缀合的方法
肽和蛋白质的表达后体外修饰通常被用于产生糖肽和糖蛋白。可获得转移糖供体部分的多种不同的酶，从而使具有定制设计的糖基化模式和糖基结构的糖缀合物的体外酶促合成成为可能。参见例如，美国专利号5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；以及公开的专利申请WO 98/31826；WO 01/88117；WO 03/031464；WO03/046150；WO 03/045980；WO 03/093448；WO 04/009838；WO05/089102；WO 06/050247；WO 12/016984；US2002/142370；US2003/040037；US 2003/180835；US 2004/063911；US 2003/207406；和US2003/124645，将其各自通过引用并入本文。
由于酶的多功能性和可用于在肽上添加和/或修饰糖基残基的方法，糖基连接基团可以具有基本上任何结构。因此，糖基连接基团可以包含几乎任何单糖或寡糖。糖基连接基团可以通过侧链或通过肽主链附接至氨基酸。可替代地，糖基连接基团可以通过糖基部分附接至肽，该部分可以是肽上的O-连接的或N-连接的聚糖结构的一部分。
根据以上所述，发明人着手制备糖基化的突变型FGF-21的缀合物，其具有不存在于相应的野生型FGF-21序列中的糖基化位点。通过将修饰的糖酶促地附接至糖基化的FGF-21肽来形成此类缀合物。当插入肽和糖上的修饰基团之间时，修饰的糖在本文中可以称为“糖基连接基团”。利用酶(比如糖基转移酶)的精细选择性，发明人生成了在一个或多个特定位置处具有所需基团的突变型FGF-21肽。更具体地，发明人使用糖基转移酶将修饰的糖附接至突变型FGF-21糖肽上的碳水化合物部分。
FGF-21缀合物
在另一方面，提出了修饰的糖和突变型FGF-21肽的示例性缀合物。参见例如，下文的实施例1-7。更具体地，制备了突变型FGF-21肽缀合物，其包含突变型FGF肽和至少一种修饰的糖，其中至少一种修饰的糖中的第一个通过糖基连接基团与肽的氨基酸相连接。如本文所述，使与糖基连接基团附接的氨基酸突变以产生被糖基转移酶识别的位点。
在另一个示例性实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物可以包含突变型FGF-21肽和附接至突变型FGF-21肽的突变的氨基酸残基的糖基。
在示例性实施方案中，糖基是完整的糖基连接基团。在另一个示例性实施方案中，糖基进一步包含修饰基团。在另一个示例性实施方案中，修饰基团是非糖苷修饰基团。在另一个示例性实施方案中，修饰基团不包括天然存在的糖部分。
修饰的糖
在示例性实施方案中，使突变型FGF-21肽与修饰的糖反应，从而形成肽缀合物。修饰的糖包含“糖供体部分”和“糖转移部分”。糖供体部分是修饰的糖的将通过糖基部分或氨基酸部分附接至肽作为本文所述的缀合物的任何部分。糖供体部分包括在其从修饰的糖转化为突变型FGF-21肽缀合物的糖基连接基团期间被化学改变的那些原子。糖转移部分是修饰的糖的将不附接至肽作为本文所述的缀合物的任何部分。
对于本文所述的修饰的糖，糖基部分可以是糖、脱氧糖、氨基糖或N-酰基糖。术语“糖”(“saccharide”)及其等效物“糖基”(“saccharyl”)、“糖”(“sugar”)和“糖基”(“glycosyl”)是指单体、二聚体、寡聚物和聚合物。还使用修饰基团将糖部分官能化。修饰基团通常通过与糖上的胺、巯基或羟基(例如，伯羟基)部分缀合而与糖基部分缀合。在示例性实施方案中，修饰基团通过糖上的胺部分(例如，通过酰胺、尿烷或脲)附接，酰胺、尿烷或脲通过胺与修饰基团的反应性衍生物的反应形成。
任何糖基部分都可以用作修饰的糖的糖供体部分。糖基部分可以是已知的糖，如甘露糖、半乳糖或葡萄糖，或具有已知糖的立体化学的种类。这些修饰的糖的通式是：
Figure BDA0003549953810000271
可用于本文所述的方法中的其他糖基部分包括但不限于岩藻糖和唾液酸，以及氨基糖，比如氨基葡萄糖、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-胺类似物等。糖基部分可以是自然界发现的结构，或者它可以被修饰以提供用于缀合修饰基团的位点。例如，在一个实施方案中，修饰的糖提供唾液酸衍生物，其中9-羟基部分被胺取代。胺易于使用所选的修饰基团的活化类似物衍生。可用于本文所述的方法中的修饰的糖的实例在PCT专利申请号PCT/US05/002522中提出，将其通过引用以其整体并入本文。
在进一步的示例性实施方案中，本发明利用了修饰的糖，其中6-羟基位置被转化为相应的胺部分，其具有接头修饰基团盒比如以上列出的那些。可以用作这些修饰的糖的核心的示例性糖基包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。以下列出了根据此实施方案的代表性的修饰的糖：
Figure BDA0003549953810000281
其中R11-R14是独立地选自H、OH、C(O)CH3、NH和NH C(O)CH3的成员。R10是与例如另一个糖基残基(-O-糖基)的连接。R14是OR1、NHR1或NH-L-R1。R1和NH-L-R1是如本文所述的。
在仍进一步的示例性实施方案中，用作修饰的糖(其中6-羟基位置被转化为相应的胺部分)的核心的糖基包括Gal和/或GalNAc。
糖基连接基团
在示例性实施方案中，提出了包含本文所述的修饰的糖和突变型FGF肽的突变型FGF-21肽缀合物。在此实施方案中，修饰的糖的糖供体部分(比如糖基部分和修饰基团)变为“糖基连接基团”。“糖基连接基团”可以可替代地指代插入肽和修饰基团之间的糖基部分。
在以下示例性实施方案中，通过参考呋喃糖和吡喃糖的所选的衍生物的使用来说明本发明。本领域技术人员将理解，通常可跨糖基连接基团和修饰的糖的种属应用列出的结构和组成。因此，糖基连接基团可以包含几乎任何单糖或寡糖。
在示例性实施方案中，本文所述的方法利用具有下式的糖基连接基团：
Figure BDA0003549953810000291
其中J是糖基部分，L是键或接头，并且R1是修饰基团，例如聚合修饰基团。示例性键是在糖基部分上的NH2部分与修饰基团上的互补反应性基团之间形成的那些。例如，当R1包括羧酸部分时，此部分可以被活化并且与糖基残基上的NH2部分偶联，从而提供具有结构NHC(O)R1的键。J优选地是“完整的”，没有通过暴露于切割吡喃糖或呋喃糖结构的条件(例如，氧化条件，例如高碘酸钠)降解的糖基部分。
示例性接头包括烷基和杂烷基部分。接头包括连接基团，例如基于酰基的连接基团，例如-C(O)NH-、-OC(O)NH-等。连接基团是在缀合物的各组分之间(例如，在糖基部分和接头(L)之间，或在接头和修饰基团(R1)之间)形成的键。其他示例性连接基团是醚、硫醚和胺。例如，在一个实施方案中，接头是氨基酸残基，比如甘氨酸残基。通过与糖基残基上的胺反应，甘氨酸的羧酸部分被转化为相应的酰胺，并且通过与修饰基团的活化的羧酸或碳酸酯反应，甘氨酸的胺被转化为相应的酰胺或尿烷。
NH-L-R1的示例性种类具有式：-NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1，其中指数s和t独立地是0或1。指数a、b和d独立地是从0至20的整数，并且c是从1至2500的整数。其他相似的接头是基于其中-NH部分被另一个基团(例如，-S、-O或-CH2)替代的种类。如本领域所理解的，对应于指数s和t的一个或多个带括号的部分可以用取代的或未取代的烷基或杂烷基部分替代。
更具体地，本文所述的化合物可以包含NH-L-R′，其中NH-L-R′是：NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)aNHR1、NH(CH2)aNHR1和NHR1。在这些式中，指数a、b和d独立地选自从0至20、优选地从1至5的整数。指数c是从1至约2500的整数。
在示例性实施方案中，选择c以使得PEG部分是大约1kD、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD、40kD、45kD、50kD、55kD、60kD或65kD。
在更具体的实施方案中，选择c以使得PEG部分的范围是从15-25kD、16-25kD、17-25kD、18-25kD、19-25kD、20-25kD、21-25kD、22-25kD、23-25kD、24-25kD、15-20kD、16-20kD、17-20kD、18-20kD、19-20kD、20-30kD、21-30kD、22-30kD、23-30kD、24-30kD、25-30kD、26-30kD、27-30kD、28-30kD、29-30kD。在仍更具体的实施方案中，选择c以使得PEG部分是20kD、22kD、23kD、24kD、25kD、26kD、27kD、28kD、29kD或30kD。
出于清楚的目的，此节(section)的剩余部分中的糖基连接基团是基于唾液酸基部分。然而，本领域技术人员将认识到，另一个糖基部分(比如甘露糖基、半乳糖基、葡萄糖基或岩藻糖基)可以用于代替唾液酸基部分。
在示例性实施方案中，糖基连接基团是完整的糖基连接基团，其中形成连接基团的一个或多个糖基部分不被化学(例如，偏高碘酸钠)或酶促(例如，氧化酶)过程降解。本发明的所选的缀合物包括附接至氨基糖(例如，甘露糖胺、氨基葡萄糖、半乳糖胺、唾液酸等)的胺部分的修饰基团。在示例性实施方案中，本发明提供了包含具有选自下式的完整的糖基连接基团的肽缀合物：
Figure BDA0003549953810000311
在式I中，R2是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7代表H、取代的或未取代的烷基或者取代的或未取代的杂烷基。当COOR7是羧酸或羧酸酯时，两种形式均以单个结构COO或COOH的名称(designation)代表。在式I和II中，符号R3、R4、R5、R6和R6′独立地代表H、取代的或未取代的烷基、OR8、NHC(O)R9。指数d是0或1。R8和R9独立地选自H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、唾液酸或聚唾液酸。R3、R4、R5、R6或R6′中的至少一个包括修饰基团。此修饰基团可以是通过键或连接基团连接的聚合修饰部分，例如PEG。在示例性实施方案中，R6和R6′与它们所附接的碳一起是唾液酸的丙酮酰基侧链的组分。在进一步的示例性实施方案中，使用聚合修饰基团将丙酮酰基侧链官能化。在另一个示例性实施方案中，R6和R6′与它们所附接的碳一起是唾液酸侧链的组分，并且聚合修饰基团是R5的组分。
根据此基序的示例性修饰基团-完整的糖基连接基团盒是基于唾液酸结构，比如具有下式的那些：
Figure BDA0003549953810000321
在上式中，R1和L是如上所述的。以下提供了关于示例性R1基团结构的进一步细节。
在仍进一步的示例性实施方案中，缀合物是在肽和修饰的糖之间形成的，其中修饰基团在修饰的糖的6-碳位置处通过接头附接。因此，根据此实施方案的说明性糖基连接基团具有下式：
Figure BDA0003549953810000322
其中自由基是如上所论述的。糖基连接基团包括但不限于葡萄糖、氨基葡萄糖、N-乙酰基-氨基葡萄糖、半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、甘露糖胺、N-乙酰基-甘露糖胺等。
在一个实施方案中，本发明提供了包含下列糖基连接基团的突变型FGF-21肽缀合物：
Figure BDA0003549953810000323
其中D是选自-OH和R1-L-HN-的成员；G是选自H和R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成员；R1是包含直链或支化的聚(乙二醇)残基的部分；并且L是接头，例如键(“零级”)、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。在示例性实施方案中，当D是OH时，G是，并且当G是-C(O)(C1-C6)烷基时，D是R1-L-NH-。
本发明提供了包括具有下式的糖基连接基团的肽缀合物：
Figure BDA0003549953810000331
在其他实施方案中，糖基连接基团具有下式：
Figure BDA0003549953810000332
其中指数t是0或1。
在仍进一步的示例性实施方案中，糖基连接基团具有下式：
Figure BDA0003549953810000333
其中指数t是0或1。
在又另一个实施方案中，糖基连接基团具有下式：
Figure BDA0003549953810000334
其中指数p代表从1至10的整数；并且a是0或1。
在示例性实施方案中，糖PEG化的肽缀合物选自下面列出的式：
Figure BDA0003549953810000341
在上式中，指数t是从0至1的整数，并且指数p是从1至10的整数。符号R15′代表H、OH(例如，Gal-OH)、唾液酸基部分、唾液酸基连接基团(即，唾液酸基连接基团-聚合修饰基团(Sia-L-R1)或与聚合物修饰的唾液酸基部分结合的唾液酸基部分(例如，Sia-Sia-L-R1)(“Sia-Siap”))。示例性的聚合物修饰的糖基部分具有根据式I和II的结构。本发明的示例性肽缀合物将包括至少一种具有R15′的聚糖，R15′包括根据式I或II的结构。式I和II的具有开放化合价(open valence)的氧优选地通过糖苷键附接至Gal或GalNAc部分的碳。在进一步的示例性实施方案中，氧在半乳糖残基的位置3处附接至碳。在示例性实施方案中，修饰的唾液酸以α2，3-连接至半乳糖残基。在另一个示例性实施方案中，唾液酸以α2，6-连接至半乳糖残基。
在示例性实施方案中，唾液酸基连接基团是与聚合物修饰的唾液酸基部分结合的唾液酸基部分(例如，Sia-Sia-L-R1)(“Sia-Siap”)。在此，糖基连接基团通过唾液酸基部分与半乳糖基部分相连接：
Figure BDA0003549953810000351
使用形成Sia-Sia键的酶，例如CST-11、ST8Sia-II、ST8Sia-III和ST8Sia-IV，通过将Sia-L-R1与聚糖的末端唾液酸缀合来制备根据此基序的示例性种类。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物上的聚糖具有选自下组的式：
Figure BDA0003549953810000352
及其组合。
在每个上式中，R15′是如上所论述的。此外，本文所述的示例性突变型FGF-21肽缀合物将包括至少一种具有R15部分的聚糖，R15部分具有根据式I或II的结构。
在另一个示例性实施方案中，糖基连接基团包括至少一个具有下式的糖基连接基团：
Figure BDA0003549953810000361
其中R15是所述唾液酸基连接基团；并且指数p是选自1至10的整数。
在示例性实施方案中，糖基连接部分具有下式：
Figure BDA0003549953810000362
其中b是从0至1的整数。指数s代表从1至10的整数；并且指数f代表从1至2500的整数。
在示例性实施方案中，聚合修饰基团是PEG。在另一个示例性实施方案中，PEG部分具有20-30kDa的分子量。在示例性实施方案中，PEG部分具有17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa或33kDa的分子量。在另一个示例性实施方案中，PEG部分具有20kDa的分子量。在另一个示例性实施方案中，PEG部分具有30kDa的分子量。在另一个示例性实施方案中，PEG部分具有约5kDa的分子量。在另一个示例性实施方案中，PEG部分具有约10kDa的分子量。在另一个示例性实施方案中，PEG部分具有约40kDa的分子量。
在示例性实施方案中，糖基连接基团是线性10kDa-PEG-唾液酸基，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价附接至肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是线性20kDa-PEG-唾液酸基，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价附接至肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是线性30kDa-PEG-唾液酸基，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价附接至肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是线性5kDa-PEG-唾液酸基，并且这些糖基连接基团中的一个、两个或三个共价附接至肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是线性40kDa-PEG-唾液酸基，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价附接至肽。
在仍进一步的示例性实施方案中，根据本文所述的方法聚乙二醇化突变型FGF-21肽。在具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变S172T和R176A，其中氨基酸S和R的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列。更具体地，突变型FGF-21肽包含如SEQ ID NO：2中所描绘的氨基酸序列。如上文所详述，附接至苏氨酸残基并且将新引入的苏氨酸残基连接至PEG部分的至少一个糖基部分实际上可以是任何可能的糖基部分。唯一的限制是它应当能够附接至苏氨酸，并且是它应当能够附接至PEG或m-PEG，更具体地经由接头，例如氨基酸残基、特别是甘氨酸。在具体的实施方案中，至少一个糖基部分包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖(Gal)和/或唾液酸(Sia)。在更具体的实施方案中，至少一个糖基部分包含结构-GalNAc-Sia-，即两个糖基部分，也就是GalNAc和Sia，其中PEG残基可以附接至GalNAc或Sia，特别是附接至Sia。未附接至PEG部分的糖基部分可以附接至新引入的苏氨酸残基。
在另一个具体的实施方案中，20kDa PEG部分经由接头(例如氨基酸残基，特别是小氨基酸，如丙氨酸或甘氨酸，更特别是经由甘氨酸(Gly))附接至至少一个糖基接头。因此，PEG或m-PEG部分附接至氨基酸，并且氨基酸附接至糖基部分，比如Sia。糖基部分附接至氨基酸接头(如果存在)，并且附接至突变型FGF-21氨基酸序列中新引入的苏氨酸残基。氨基酸残基经由WO 03/031464中所述的方法附接至PEG和糖基残基，将所述专利通过引用并入本文。
在具体的实施方案中，突变型FGF-21肽(例如，SEQ ID NO：2)缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)，其中GalNAc附接例如至新引入的苏氨酸残基并且附接至Sia。Sia经由甘氨酸残基进一步附接至17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa或33kDa的PEG。
在更具体的实施方案中，突变型FGF-21肽(例如，SEQ ID NO：2)缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)，其中GalNAc附接例如至新引入的苏氨酸残基并且附接至Sia。Sia经由甘氨酸残基进一步附接至20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa或30kDa的PEG。
在仍更具体的实施方案中，突变型FGF-21肽(例如，SEQ ID NO：2)缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)，其中GalNAc附接例如至新引入的苏氨酸残基并且附接至Sia。Sia经由甘氨酸残基进一步附接至20kDa、25kDa或30kDa的PEG。
在进一步具体的实施方案中，突变型FGF-21肽(例如，SEQ ID NO：2)缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)，其中GalNAc附接例如至新引入的苏氨酸残基并且附接至Sia。Sia经由甘氨酸残基进一步附接至20kDa或30kDa的PEG。
在仍进一步具体的实施方案中，突变型FGF-21肽(例如，SEQ ID NO：2)缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)，其中GalNAc附接例如至新引入的苏氨酸残基并且附接至Sia。Sia经由甘氨酸残基进一步附接至20kDa的PEG。
在非常具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含以下结构：
Figure BDA0003549953810000381
其中n是选自450至460的整数，还如图1所描绘。
20kDa PEG可以是线性或支化的，更具体地，20kDa PEG是线性20kDa PEG。进一步地，20kDa PEG特别是20kDa甲氧基-PEG(mPEG，m-PEG)。可以从各供应商获得不同分子量的PEG和mPEG，如从美国德克萨斯州普莱诺的美国键凯科技公司(JenKem Technology USA)或德国乌尔姆的默克勒生物科技公司(Merckle Biotec)。在本领域中理解的是，PEG 20kDa意指PEG残基的大小平均是20kDa，并且大多数PEG残基的大小是20kDa。
突变型FGF-21肽及其缀合物
如本文所述，发明人制备了具有出人意料的特性的成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的变体，包括具有异常长的半衰期的变体，该变体是包含以下的肽缀合物：
i)突变型FGF-21肽，其在至少一个脯氨酸残基的C末端侧上包含与至少一个脯氨酸(P)残基相邻的至少一个苏氨酸(T)残基，从而形成至少一个不存在于相应的天然FGF-21中的O-连接的糖基化位点，其中相应的天然FGF-21具有与SEQ ID NO：1至少95％相同的氨基酸序列，以及
ii)20-30kDa聚乙二醇(PEG)，其中所述20-30kDa PEG经由至少一个糖基部分在至少一个苏氨酸残基处共价附接至所述突变型FGF-21肽。
为了20-30kDa PEG残基的附接，将苏氨酸残基引入天然FGF-21的氨基酸序列中与脯氨酸残基相邻并且在其C末端侧上，该脯氨酸残基已经存在于天然FGF-21的氨基酸序列中，即是天然脯氨酸残基。出于此目的，(i)可以将另外的苏氨酸紧挨天然脯氨酸残基引入，或者(ii)将存在于FGF-21的天然氨基酸序列中与天然脯氨酸残基相邻并且位于其C末端侧的天然氨基酸交换为苏氨酸残基。在本发明中，选项(ii)是示例性实施方案。如本文所述，可以将多于一个苏氨酸残基引入与已经存在的脯氨酸残基相邻并且在其C末端。因此，本发明的突变型FGF-21可以包含另外引入的苏氨酸残基和已经引入代替天然氨基酸的苏氨酸残基。
通过在脯氨酸残基的C末端侧上并且与脯氨酸残基相邻引入新的苏氨酸残基，形成O-糖基化酶的共有序列。由于脯氨酸残基通常在蛋白质表面上发现(在例如转角、扭结和/或环中)，因此要求紧邻脯氨酸残基使用PEG-糖基部分进行O-糖基化和PEG化的设计受益于用于转移糖基或糖-PEG部分的糖基转移酶的靶标附接位点的相对可及性以及在不破坏蛋白质结构的情况下容纳缀合的糖基和/或PEG结构的潜力。
为了将苏氨酸残基引入FGF-21的天然氨基酸序列中，使用重组遗传学领域的常规技术。公开本发明的一般使用方法的基本文稿包括Sambrook and Russell，MolecularCloning，A Laboratory Manual(3rd ed.2001)；Kriegler，Gene Transfer andExpression：A Laboratory Manual(1990)；和Ausubel et al.，eds.，Current Protocolsin Molecular Biology(1994)。
在具体的实施方案中，天然FGF-21氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1中描绘的人FGF-21的天然氨基酸序列。
在具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含氨基酸序列PT，即苏氨酸残基在C末端与脯氨酸相邻。序列PT不存在于天然FGF-21氨基酸序列中。
任选地，突变型FGF-21肽包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸序列：P172T(例如SEQ ID NO：2或3)、P156T(例如SEQ ID NO：4)、P5T(例如SEQ ID NO：5)、P3T(例如SEQ IDNO：6)、P9T(例如SEQ ID NO：7)、P50T(例如SEQ ID NO：8)、P61T(例如SEQ ID NO：9)、P79T(例如SEQ ID NO：10)、P91T(例如SEQ ID NO：11)、P116T(例如SEQ ID NO：12)、P120T(例如SEQ IDNO：13)、P125T(例如SEQ ID NO：14)、P129T(例如SEQ ID NO：15)、P131T(例如SEQ ID NO：16)、P134T(例如SEQ ID NO：17)、P139T(例如SEQ ID NO：18)、P141T(例如SEQ ID NO：19)、P144T(例如SEQ ID NO：20)、P145T(例如SEQ ID NO：21)、P148T(例如SEQ ID NO：22)、P150T(例如SEQ IDNO：23)、P151T(例如SEQ ID NO：24)、P158T(例如SEQ ID NO：25)、P159T(例如SEQ ID NO：26)、P166T(例如SEQ ID NO：27)、P178T(例如SEQ ID NO：28)及其组合，其中脯氨酸和苏氨酸的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的FGF-21的天然氨基酸序列；特别地，突变型FGF-21肽包含选自由P172T、P156T、p5T及其组合组成，更特别地由P172T、P156T及其组合组成的组的至少一个氨基酸序列；甚至更特别地，突变型FGF-21肽序列包含序列基序P172T，基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列，其中脯氨酸和苏氨酸的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，脯氨酸残基位于突变型FGF-21肽的氨基酸145和C末端之间，其中氨基酸145的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列。如本文所呈现的结果证明的，FGF-21的C末端出人意料地耐受PEG的附接、特别是糖基-PEG部分的附接。这是出乎意料的，因为文献报道完整的C末端对于FGF-21的β-Klotho结合是必需的。
在具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变S172T和R176A，其中氨基酸S和R的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列；特别地，突变型FGF-21肽包含如SEQ IDNO：2中所描绘的氨基酸序列。已经发现，在苏氨酸173处引入O-连接的糖基化位点后，突变R176A有益于蛋白质的总体稳定性。通过此突变，去除了相对较大的精氨酸侧链，并且被小的丙氨酸侧链替代。推测较小的丙氨酸侧链对将要附接至thindicae突变的FGF-21肽的大体积的糖基-PEG部分的干扰较小。
在可替代的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变Q157T，其中氨基酸Q的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列；特别地，突变型FGF-21肽包含如SEQ ID NO：4中所描绘的氨基酸序列或突变D6T，其中氨基酸D的位置是基于如SEQ ID NO：1中所描绘的氨基酸序列；特别地，突变型FGF-21肽包含如SEQ ID NO：5中所描绘的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含选自由SEQ ID NO：2至28组成的组的氨基酸序列、更特别是选自由SEQ ID NO：2至5组成的组的氨基酸序列、甚至更特别是选自由SEQ ID NO：2至4组成的组的氨基酸序列；最特别地，突变型FGF-21肽包含如SEQID NO：2中所描绘的氨基酸序列。
进一步提供了一种药物组合物，其包含突变型FGF-21肽缀合物和药学上可接受的运载体，如水或生理上相容的缓冲液。药物组合物通常包含治疗有效量或药学有效量的突变型FGF-21肽缀合物作为活性剂。
本发明的药物组合物适用于多种药物递送系统。用于本发明的合适的配制品发现于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)。关于药物递送方法的简要综述，参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)。药物组合物旨在用于肠胃外、鼻内、外用、口服或局部施用，比如通过皮下注射、气溶胶吸入或经皮吸收，用于预防性和/或治疗性治疗。通常，肠胃外(例如，皮下或静脉内)施用药物组合物。因此，本发明提供了用于肠胃外施用的组合物，其包含溶解或悬浮于可接受的运载体(特别是水性运载体，例如水、缓冲水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)等)中的突变型FGF-21肽缀合物。组合物还可以含有去污剂，如Tween20和Tween 80；稳定剂，如甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖；以及防腐剂，如EDTA和间甲酚。组合物可以含有如近似生理条件所需的药学上可接受的助剂，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、去污剂等。
本发明的药物组合物可以通过常规灭菌技术灭菌，或者可以是经无菌过滤的。所得的水性溶液可以按原样包装使用，或者被冻干，在施用前将冻干制剂与无菌水性运载体组合。可以施用含有FGF肽缀合物的组合物用于预防性和/或治疗性治疗，特别是用于糖尿病或糖尿病相关疾病的治疗，特别是用于2型糖尿病、NASH和代谢综合征的治疗。在治疗应用中，将组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病及其并发症的症状的量施用已经患有与糖尿病相关的疾病或病症的受试者。将足以实现此目标的量定义为“治疗有效量”，并且通常取决于患者的健康状态和体重。当在各种NASH和2型糖尿病动物模型中测试时，有效剂量的范围是从0.1mg/kg至6mg/kg。
本发明提供了用于治疗疾病和/或障碍或其症状的方法，其包括向受试者(例如，哺乳动物，比如人)施用治疗有效量的化合物(本文所述的突变型FGF-21肽缀合物)或包含该化合物(本文所述的突变型FGF-21肽缀合物)的药物组合物。因此，一个实施方案是一种用于治疗患有糖尿病或糖尿病相关疾病(例如，2型糖尿病、NASH或代谢综合征)或其症状的受试者的方法。该方法包括以下步骤：在治疗疾病或障碍的条件下向哺乳动物施用一定量的本文所述的化合物(以足以治疗疾病或障碍或其症状的量)或包含本文所述的化合物的药物组合物。
可以用由治疗医生选择的剂量水平和模式来进行组合物的单次或多次施用。在任何情况下，药物组合物应当提供足以用于有效治疗需要这种治疗的受试者的量的本发明的突变型FGF-21肽缀合物。
在药物组合物中，突变型FGF-21肽缀合物通常以从0.1mg/mL至50mg/mL、特别是从1mg/mL至45mg/mL、更特别是从10mg/mL至40mg/mL的范围的浓度、最特别是以26±4mg/mL的浓度存在。在更具体的实施方案中，药物组合物中突变型FGF-21肽缀合物的浓度是33±7mg/mL，或者甚至更特别是26±4mg/mL。
在测试非常多的不同条件、化合物及其浓度之后，已经仔细选择了药物组合物的所有组分以及组分的特定浓度。因此，本文公开的药物组合物不是化合物和化合物浓度的任意选择，而是已经发现对于用作药剂的含有根据本发明的突变型FGF-21肽缀合物或突变型FGF-21的水性药物组合物是最佳的条件的特定且合理的选择。
进一步地，药物组合物特别包含缓冲剂、特别是磷酸盐或Tris缓冲液、更特别是Tris缓冲液，例如三(羟甲基)氨基甲烷(THAM)。任选地，缓冲剂以从1mM至100mM、特别是从2mM至75mM、更特别是从5mM至50mM、甚至更特别是从10mM至25mM、最特别是16±2mM的浓度存在。选择Tris缓冲液，因为发现蛋白质的溶解度优于其他缓冲液系统，并且它适合于将pH保持在pH 7.5。此pH似乎是对于延长PEG化的突变型FGF-21肽缀合物储存最佳的pH。此外，在较低温度下Tris结晶的可能性低于基于磷酸盐的缓冲剂的可能性。
发明人发现突变型FGF-21肽缀合物可以经历pH低于6.0的沉淀。任选地，药物组合物的pH在从6.0至8.5、特别是从6.5至8.0、更特别是从6.75至8.0、甚至更特别是从7.0至8.0的范围内，最特别是7.5±0.3，因为如果pH在7-8的范围内，则观察到SDS-PAGE中最低的片段化和SEC中最少的聚集。关于粘度，此pH也被确定为是任选的。由于溶液的pH可能取决于溶液的温度，因此应当特别调整pH并且在25±2℃下测量。用HCl调节pH。药物组合物可以进一步包含盐、特别是无机盐、更特别是NaCl。任选地，盐以从30mM至200mM、特别是从40mM至150mM、更特别是从50mM至100mM、最特别是56±2mM的浓度存在。盐(特别是NaCl)的存在有利于降低粘度，粘度在含有样品的PEG中是增加的。出于相同的原因，包括山梨糖醇和/或甘氨酸也是有益的。
药物组合物可以进一步包含张力调节剂。张力调节剂可以选自由甘油、氨基酸、氯化钠、蛋白质、糖和糖醇组成的组。在具体的实施方案中，张力调节剂是糖；更特别地，张力调节剂是蔗糖。发现张力调节剂(特别是蔗糖)对药物组合物具有有利的作用，因为它减少了活性剂(也就是突变型FGF-21肽(缀合物))的聚集。
张力调节剂(特别是蔗糖)可以按50mM至200mM的浓度、更特别地按100mM至175mM的浓度、甚至更特别地按135mM至160mM的浓度、最特别地按150±2mM的浓度存在。
进一步地，药物组合物可以包含表面活性剂、特别是非离子表面活性剂。表面活性剂或非离子表面活性剂特别是基于聚山梨酯的非离子表面活性剂、更特别是聚山梨酯20或聚山梨酯80、甚至更特别是聚山梨酯20。发现表面活性剂(特别是聚山梨酯20)将亚可见颗粒减小到低于10μm，因此似乎对药物组合物具有稳定作用。
表面活性剂或非离子表面活性剂(特别是聚山梨酯20或80、更特别是聚山梨酯20)任选地以0.01mg/mL至1mg/mL、特别地以0.05至0.5mg/mL的浓度、最特别地以0.2±0.02mg/mL的浓度存在。发现聚山梨酯20或80(特别是聚山梨酯20)稳定配制品以防聚集。
在具体的实施方案中，药物组合物包含0.1至50mg/mL、特别是33±7mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物；1mM至100mM、特别是20±2mM的缓冲剂、特别是Tris缓冲液；30mM至200mM、特别是70±2mM的盐、特别是NaCl；并且具有7.5±0.3的pH(特别是在25℃±2℃下测量的)。
更具体的药物组合物包含0.1至50mg/mL、特别是26±4mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物；1mM至100mM、特别是16±2mM的缓冲剂、特别是Tris缓冲液；30mM至200mM mM、特别是56±2mM的盐、特别是NaCl；50mM-200mM的张力调节剂、特别是蔗糖；以及0.01至1mg/mL、特别是0.2±0.02mg/mL的表面活性剂或非离子表面活性剂、特别是聚山梨酯20；并且具有7.5±0.3的pH(特别是在25℃±2℃下测量的)。
本文还提供了一种药物容器，其包含本发明的且如本文所述的突变型FGF-21肽缀合物或本发明的且如本文所述的药物组合物。在具体的实施方案中，药物容器是注射器、小瓶、输液瓶、安瓿、注射管、配备有针保护系统的注射器或注射笔内的注射管。
本发明进一步提供了一种产生本发明的突变型FGF-21肽缀合物的方法，其包括以下步骤：
(1)特别是在表达宿主中重组产生突变型FGF-21肽；和
(2)将PEG-糖基部分酶促地附接至步骤(1)的突变型FGF-21肽，其中PEG例如是20kDa PEG或30kDa PEG，并且其中步骤(2)特别是无细胞的体外过程，从而形成突变型FGF-21肽缀合物。
在具体的实施方案中，该方法如下：首先，将突变(该突变邻近脯氨酸残基并且在脯氨酸残基的C末端侧上引入苏氨酸)以及任选地一个或多个其他突变引入编码天然或突变的FGF-21(比如SEQ ID NO：1中的人FGF-21)的核酸序列中。将编码突变的FGF-21肽的核酸序列引入适合于在表达宿主中表达蛋白质的表达载体中。用于将突变引入核酸序列中的方法(比如定点诱变)以及将突变的核酸序列掺入表达载体中是技术人员熟知的(参见例如，“A Guide to Methods in the Biomedical Sciences”，R.B.Corley，SpringerScience&Business Media，2006)。
蛋白质表达、任选地纯化之后，经由至少一个糖基部分和任选地经由存在于PEG和糖基残基之间的至少一个氨基酸残基，特别是在新引入的苏氨酸残基处，将PEG残基附接至突变型FGF-21肽。
为了获得编码本发明的突变型FGF-21的核酸的高产率表达，通常将编码突变型成纤维细胞生长因子的多核苷酸亚克隆进入表达载体中，该表达载体含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域熟知的，并且描述于例如Sambrook和Russell(同上)以及Ausubel等人(同上)。用于表达天然或突变型FGF-21的细菌表达系统可在例如大肠杆菌(Escherichia coli(E.coli))、芽孢杆菌属物种(Bacillussp.)、沙门氏菌属(Salmonella)和柄杆菌属(Caulobacter)中获得。用于此类表达系统的试剂盒是可商购获得的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域熟知的，并且也是可商购获得的。在一个实施方案中，真核表达载体是腺病毒载体、腺相关(adeno-associated)载体或逆转录病毒载体。在具体的实施方案中，突变型FGF-21肽是在大肠杆菌细胞中重组产生的，即表达宿主是大肠杆菌。
此段落中描述了示例性的产生方法：突变型FGF-21肽在大肠杆菌中表达为包涵体(inclusion body)。通过离心将细胞从收获物中回收、破坏，并且将包涵体洗涤并且通过离心回收。非PEG化的突变型FGF-21肽的纯化开始于从包涵体中溶解突变型FGF-21肽和肽的重折叠。通过两次阴离子交换色谱操作，两次均采用Eshmuno Q色谱树脂并且以结合和洗脱模式操作，将重折叠的突变型FGF-21肽过滤和纯化。如有需要，可以使用Pellicon 2(5kDMWCO)膜通过超滤浓缩纯化的突变型FGF-21肽。将纯化的突变型FGF-21肽分配到无菌PETG瓶中，并且可以在≤70℃下储存。
可以通过连续或同时进行的两个酶促反应来进行突变型FGF-21肽的糖PEG化。此步骤后可以后接0.2μm过滤和两次阴离子交换色谱操作，两次均采用Q Sepharose FastFlow色谱树脂并且以结合和洗脱模式操作。可以使用Pellicon XL Biomax(10kDa MWCO)通过超滤进行最终浓缩步骤。图3至5说明了示例性的产生方法。
在碳水化合物的合成中使用两种主要类别的酶，即糖基转移酶(例如，唾液酸转移酶、寡糖基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶)和糖苷酶。将糖苷酶进一步分类为外切糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶)和内切糖苷酶(例如，Endo-A、Endo-M)。这些种类的酶中的每一种都已经成功地用于合成地制备碳水化合物。关于一般综述，参见Crout etal.，Curr.Opin.Chem.Bio1.2：98-111(1998)。还参见PCT公开号：WO 2003/031464；WO2005/089102；WO2006/050247；和WO 2012/016984，将其中每个的整体内容通过引用并入本文。
在具体的实施方案中，步骤(2)包括以下步骤(2a)：在适合于将GalNAc从GalNAc供体转移到突变型FGF-21肽的至少一个苏氨酸残基的条件下，使突变型FGF-21肽与GalNAc供体和GalNAc转移酶接触。此转移的条件描述于实施例部分。任选地，GalNAc供体是UDP-GalNAc，并且具体地，GalNAc转移酶是MBP-GalNAcT2。
在具体的实施方案中，更具体地与前述段落的实施方案相结合，步骤(2)进一步包括以下步骤(2b)，特别是与步骤(2a)相结合：在适合于将20kDa PEG-Sia从20kDa PEG-Sia供体或将30kDa PEG-Sia从30kDa PEG-Sia供体转移到突变型FGF-21肽的至少一个苏氨酸残基(如果步骤(2a)不存在)或者转移到突变型FGF-21肽处的GalNAc(如果步骤(2a)存在)的条件下，使步骤(2a)(如果存在)或步骤(1)的产物与例如20kDa PEG-Sia供体或30kDaPEG-Sia供体和唾液酸转移酶接触。任选地，20kDa PEG-Sia供体是20kDa PEG-Sia-CMP，或者30kDa PEG-Sia供体是30kDa PEG-Sia-CMP，和/或唾液酸转移酶是ST6GalNAc1。如上已经一般解释的，术语“20kDa PEG-Sia”还包括“20kDa PEG-接头-Sia”和“20kDa PEG-Gly-Sia”，并且术语“30kDa PEG-Sia”还包括“30kDa PEG-接头-Sia”和“30kDa PEG-Gly-Sia”。
在更具体的实施方案中，20kDa PEG-Sia供体包含以下结构：
Figure BDA0003549953810000481
其中n是选自450至460的整数，其导致20kDa的分子量。此结构包括Gly接头。技术人员理解用于产生该结构的方法描述于PCT公开号WO 2003/031464，将其整体内容通过引用并入本文。
在表达之后并且在糖PEG化反应之前，需要纯化突变型FGF-21肽。因此，任选地，该方法在步骤(1)之后并且在步骤(2)之前进一步包括以下步骤(3)：在重组产生后纯化突变型FGF-21肽。进一步地，该方法在步骤(2)之后可以包括以下步骤(4)：纯化步骤(2)中形成的突变型FGF-21肽缀合物。
纯化步骤(3)和/或(4)可以包括使突变型FGF-21肽经受选自由离子交换色谱、亲和色谱、过滤及其组合组成的组的方法。步骤(3)和/或步骤(4)可以包括离子交换色谱、亲和色谱、过滤或其组合的一个或多个步骤。
步骤(3)和/或步骤(4)可以特别包括使突变型FGF-21肽经受一个或多个离子交换色谱步骤，更特别地经受至少两个离子交换色谱步骤、甚至更特别地阴离子交换色谱。在更具体的实施方案中，在步骤(3)和步骤(4)中，使突变型FGF-21肽经受两个阴离子交换色谱步骤，更特别地经受两个强阴离子交换色谱步骤。
阴离子交换色谱特别采用选自由以下组成的组的成员：亲水性聚乙烯醚基的基质、二乙基氨基乙醇(DEAE)、三甲基铵乙基(TEAE)、琼脂糖、聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物基质、季铵(Q)强阴离子交换色谱及其组合；甚至更特别地，在步骤(3)中使用两个使用亲水性聚乙烯醚基的基质的柱；高度特别地，在步骤(3)中使用两个
Figure BDA0003549953810000491
-Q柱。具有亲水性聚乙烯醚基的基质的
Figure BDA0003549953810000492
-Q树脂例如可从德国达姆施塔特默克集团(Merck KGaA)的默克密理博公司(Merck Millipore)获得。Source 15Q树脂也可用于本发明(通用医疗生命科学公司(GE Health Care Life Sciences)，英国查尔芬特-圣贾尔斯(Chalfont StGiles))。亲和色谱可以是阴离子蒽醌染料亲和色谱，并且过滤可以采用改性的亲水性聚醚砜(PES)膜。在另一个实施方案中，进行两个弱阴离子交换色谱步骤或一个强阴离子交换色谱步骤和一个弱阴离子交换色谱步骤。
在可替代的实施方案中，如下进行步骤(3)中的纯化，任选地以给定的顺序进行：
1.离子交换色谱、特别是阴离子交换色谱，
2.任选地亲和色谱，
3.任选地离子交换色谱、特别是阴离子交换色谱，和
3.过滤。
在实施例部分中进行了示例性纯化。通常，应根据制造商的方案进行色谱纯化步骤。其他信息可以例如摘自“Protein Purification Protocols”，Paul Cutler，SpringerScience&Business Media，2004)。
在任选的实施方案中，该方法在步骤(2)之后进一步包括以下步骤(4)：纯化步骤(2)中形成的突变型FGF-21肽缀合物，特别是通过离子交换色谱、更特别是通过强阴离子交换色谱、甚至更特别是通过季铵(Q)强阴离子交换色谱。在具体的实施方案中，在步骤(4)中进行两个阴离子交换色谱步骤。Q-琼脂糖凝胶是适合于在步骤(4)中纯化本发明的突变型FGF-21肽缀合物的更具体的柱材料。Q琼脂糖凝胶例如可从美国伊利伊诺州芝加哥的通用医疗生命科学公司获得。
在具体的实施方案中，在步骤(2)和(3)中添加精氨酸、特别是至少400mM的精氨酸。任选地添加精氨酸以抑制蛋白酶，否则蛋白酶将降解蛋白质。因此，精氨酸帮助防止蛋白质损失。
最后，在步骤(3)之后并且在步骤(2)之前，在任选的步骤(5)中去除可能源自表达宿主的内毒素。在此步骤中，使用内毒素去除过滤器(比如Mustang E，0.2微米过滤器)过滤步骤(3)的产物。
进一步地，可以无菌过滤突变型FGF-21肽缀合物。
还提供了通过本发明的方法可获得的突变型FGF-21肽缀合物。
本发明还提供了本发明的突变型FGF-21肽缀合物和/或本发明的药物组合物，用作药剂以及用于治疗糖尿病和相关疾病，特别是2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或代谢综合征。本发明还提供了用于治疗糖尿病和相关疾病，特别是2型糖尿病、NASH和/或代谢综合征的本发明的突变型FGF-21肽缀合物的用途和/或本发明的药物组合物的用途。
进一步提供了一种治疗糖尿病和相关疾病，特别是2型糖尿病、NASH、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和/或代谢综合征的方法，其包括向有需要的受试者施用一定量的根据本发明的突变型FGF-21肽缀合物或根据本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，受试者是人类受试者。
NAFLD是西方国家常见的慢性肝病，其可能进展为肝硬化，并且通常与增加的死亡风险、特别是增加的心血管疾病死亡风险相关。NAFLD的目前药物治疗具有有限的功效，因此迫切需要开发针对这种常见并且威胁生命的疾病的更有效并且安全的药剂。奥贝胆酸(obeticholic acid)(OCA)(法尼酯X受体的选择性激动剂)似乎有望作为用于NAFLD的管理的治疗剂。在患有NASH的患者中进行的法尼酯X受体配体奥贝胆酸在NASH中的治疗(Farnesoid X Receptor Ligand Obeticholic Acid in NASH Treatment，FLINT)试验揭示，OCA施用与肝脏组织学改善以及体重减轻和血压降低相关。尽管它对血脂谱和胰岛素敏感性的不良反应是值得注意的，但是在所选的患有NAFLD/NASH的患者中、特别是具有适当控制的血糖和血脂水平的患者中，可以考虑使用OCA。
关于证明本文所述的化合物和组合物的临床功效的指标，本领域已知并且本文描述了多种示例性指标，包括但不限于HbA1c、葡萄糖和胰岛素、体重、血清脂质(总胆固醇、LDL、甘油三酯)、肝酶(ALT、AST)、肝重、相对肝重(％体重)、NAFLD活动评分(NAS)、纤维化评分(例如，肝纤维化)、促炎性细胞因子(例如，IL1β、MCP-1)、纤维化生物标志物(αSMA、胶原1α)、肝胆固醇、肝甘油三酯和肝脂肪酸降低。高分子量(HMW)脂联素或HDL中的至少一种的增加也是本文所述化合物和组合物的临床功效的指标。参见例如，图8-20及其描述。因此，至少一种指标的变化(如上所述)反映了本文所述的化合物或组合物的临床功效。
在具体的实施方案中，基于血清甘油三酯水平或血清胰岛素水平中的至少一种的降低来确定本文所述的化合物或组合物的治疗功效。参见例如，表5。
HOMA-IR例如是受试者中胰岛素抵抗的存在和程度的指标。它是在基线(空腹)血糖和对其作出反应的胰岛素水平之间的动态的准确指标。它被称为胰岛素抵抗计算器。对于人类，健康范围是1.0(0.5-1.4)。小于1.0表示受试者是胰岛素敏感的，这是理想的；高于1.9表示受试者表现出早期胰岛素抵抗；高于2.9表示受试者表现出显著的胰岛素抵抗。如下确定HOMA-IR血液代码计算：胰岛素uIU/mL(mU/L)×葡萄糖(mg/dL)＝HOMA-IR。计算需要美国标准单位。为了从国际SI单位转换：对于胰岛素：pmol/L到uIU/mL，除以(÷)6；对于葡萄糖：mmol/L到mg/dL，乘以(×)8。
本文还提出了治疗方案，其中每天两次、每天一次、每两天、每周三次、每周一天、每两周一次、每三周一次或每月一次施用治疗有效量的本文所述的突变型FGF-21肽缀合物或包含治疗有效量的突变型FGF-21肽缀合物的药物组合物。本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的长期功效是通过在动物模型系统中为这些缀合物确定的出人意料地长的半衰期证明的。参见例如，本文的实施例11、12和13。本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的长期功效进而使得较不频繁地施用突变型FGF-21肽缀合物成为可能。因此，在具体的实施方案中，以等于或大于每周一次的频率向有需要的受试者施用本文所述的突变型FGF-21肽缀合物或包含本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的组合物。例如，可以向有需要的受试者每7天一次、每8天一次、每9天一次、每10天一次、每11天一次、每12天一次、每13天一次、每14天一次、每15天一次、每16天一次、每17天一次、每18天一次、每19天一次、每20天一次、每21天一次、每22天一次、每22天一次、每23天一次、每24天一次、每25天一次、每26天一次、每27天一次、每28天一次、每29天一次、每30天一次或每31天一次施用本文所述的突变型FGF-21肽缀合物或包含本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的组合物。
在另一种示例性治疗方案中，本文所述的化合物和包含本文所述的化合物的组合物遵循“诱导”疗法的过程，其要求更频繁的施用，如在治疗方案开始时一周两次或每周，然后是维持疗法(其可以涉及每周两次或每月一次施用)。这样的方案是有效的，因为初始诱导疗法将受试者的病症改善到可管理的水平，关于达到维持疾病/病症可接受的临床状态这是可接受的。之后，使用维持疗法将健康水平保持在维持水平。
可以使用本领域技术人员已知并且本文所述的多种参数和测定来评价化合物和/或组合物用于治疗糖尿病和相关疾病(特别是2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或代谢综合征)的治疗功效。测量HbA1C被认为是用于长期测量受试者血糖指数的标准测定。因此，它是血糖指数的稳定指标，反映了大约过去3-4个月内的葡萄糖水平。因此，患有糖尿病(例如，2型糖尿病)的受试者可以通过在合适的测定中确定的HbA1C百分比来定义。
对于没有糖尿病的健康人，血红蛋白A1c水平的正常范围在4％与5.6％之间。在5.7％与6.4％之间的血红蛋白A1c水平表示某人具有更高的机会患上糖尿病。6.5％或更高的水平表示某人患有糖尿病。
在具体的实施方案中，通过使用糖化血红蛋白测试系统(伯乐公司(BIO-RAD)，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)用HPLC测量HbA1C。从头静脉或隐静脉收集血液样品(例如，1.0mL/次)到BD
Figure BDA0003549953810000531
K2-EDTA管中。样品可以立即在4℃下储存或维持在湿冰上，并且在收集血液的同一天进行分析。本领域技术人员可以通过使用糖化血红蛋白测试系统(伯乐公司，美国加利福尼亚州赫拉克勒)用HPLC来测量血液中的HbA1c水平。
关于NASH，目前仅通过活检诊断该病症。然而，有一些被认为可预测NASH的替代生物标志物，如肝脂肪(由MRI确定)、肝酶(ALT和ALT/AST比)和纤维化生物标志物(如pro-C3)。
实施例
实施例1：FGF-21突变体的制备
1.1FGF-21的表达载体和cDNA
用于此项目的表达载体称为pCWM3。该载体具有强TAC启动子，以驱动使用GT10翻译增强子的表达。选择用于掺入cDNA的位点是NdeI和XhoI。针对大肠杆菌表达对编码人FGF21基因全长成熟形式的cDNA进行了密码子优化，并且由蓝鹭公司(BlueHeron)基于公开的序列(NCBI登录号NM_019113)合成。使用2组寡核苷酸PCR扩增基因，该2组寡核苷酸将掺入用于构建表达载体的所需的突变和限制性位点。
1.2生成突变型FGF-21构建体的重叠PCR反应。
具有加下划线的限制性位点的寡核苷酸序列(分别是NdeI和XhoI)。
5’寡核苷酸5’GAGGTCATATGCATCCAATTCCAGATTC3’(两阶段PCR，SEQ ID NO：29)。
3’寡核苷酸5’ATTCCTCGAGTTATTAAGAGGCGTAG3’(两阶段PCR，SEQ ID NO：30)。
由蓝鹭公司提供在200μL水中的天然人FGF-21基因(5μg)(75ng/μL)。
Figure BDA0003549953810000541
使用无菌气溶胶抗性移液管吸头将混合物组装在无菌的0.2mL薄壁PCR 96孔板中。
在加样琼脂糖凝胶之前，将PCR反应物(20μL)与5μL的6×加样染料在96孔板中混合。使用TAE缓冲液，使1.5％的琼脂糖凝胶在100V下经受电泳。将凝胶内PCR产物的凝胶切片(gel slice)分离并且按照制造商的说明使用Qiaquick Gel提取试剂盒加工，并且用50μL的H2O洗脱。为了节省空间，在试剂盒的提取孔中，将为了生成全长突变体的要用于第二阶段PCR的每个对应对的初级PCR产物的条带合并。如以上针对第一阶段PCR产物所述，还产生了作为单步PCR反应产物的突变体。
如下进行PCR反应的第二步：
Figure BDA0003549953810000542
Figure BDA0003549953810000551
根据制造商的说明，通过Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并且用50μL的水洗脱。如下在纯化的PCR产物和pCWM3载体上，在高压灭菌的0.5mL离心管中进行限制性消化：
Figure BDA0003549953810000552
将反应在37℃下孵育2小时。然后，在加样含SYBR Green的1.5％琼脂糖凝胶之前，添加4μL的6×DNA加样缓冲液，并且在100V下在TAE缓冲液中电泳60分钟。
将凝胶PCR产物的切片分离并且按照制造商的说明用Qiaquick Gel提取试剂盒加工，并且用50μL的H2O洗脱。
1.3将突变型FGF21基因插入表达载体pcMW3中的连接反应
在高压灭菌的0.5mL埃彭道夫(eppendorf)管中，通过将以下列出的试剂合并进行连接：
0.2μL pCWM3(用Nde1和Xho1消化并且分离琼脂糖凝胶)
1μL PCR产物(用Nde1和Xho1消化并且分离琼脂糖凝胶)
1μL 10×NEB连接酶缓冲液
0.5μL NEB T4 DNA连接酶
7.3μL水
在室温下孵育1小时。
1.4用连接反应物转化感受态TOP10大肠杆菌。
在高压灭菌的1.5μL微量离心管中，将1μL的每种连接反应物添加到25μL解冻的Top10化学感受态细胞中。通过在42℃下孵育1分钟来热激细胞。将细胞转移到冰桶中持续2分钟。接下来添加175μL的预热的SOC，并且将管在设定为250rpm的旋转平台上在37℃下孵育60分钟。转化体的选择是通过将转化反应物铺在含有50mcg/mL的硫酸卡那霉素的Martone琼脂板上来完成的。将板在37℃下孵育过夜。将每种FGF21突变体的3个菌落重新划线到两个Martone琼脂-Kan50板上，将其中一个送至吉纳维易公司(Genewiz)进行菌落扩增和测序。鉴定了所有46种突变体的正确序列。
实施例2：微量制备DNA的制备和甘油储液的生成
在补充有50mcg/ml硫酸卡那霉素的3mL的Martone L肉汤中，将通过测序鉴定出的正确菌落扩增过夜。根据制造商的说明，使用Qiagen微量制备试剂盒从1.5mL的培养物中分离DNA。在-20℃下，将微量制备的DNA储存在1.5mL埃彭道夫管中。120μL的培养物还与80μl的50％甘油溶液一起冷冻以产生20％的甘油终浓度。将储液在96孔板中在-80℃下冷冻。
如上所述使用来自构建体的1μL的微量制备DNA转化化学感受态Origami2(25μL)，并且还如上所述在Martone琼脂Kan50板上完成转化体的选择。通过以下方式使过夜培养物生长：刮下几个菌落到2mL的补充有50μg/mL硫酸卡那霉素的Martone L肉汤中，然后在设定为250rpm的振荡平台上在37℃下过夜生长。第二天，将120μL的培养物与80μL的50％甘油混合，以产生20％的甘油终浓度。将甘油储液在96孔板中在-80℃下冷冻。
实施例3：FGF-21表达细胞系的产生
编码FG-21(野生型，SEQ ID NO：1)和每种FGF-21突变体的质粒DNA获自梯瓦公司(Teva)(以色列佩塔提科瓦)。实施例1中描述了使用pCWM3载体制备质粒DNA。根据以下程序制备所有大肠杆菌细胞系。将化学感受态Origami-2细胞(诺瓦根公司(Novagen))在冰上解冻，并且将10μL的细胞悬浮液置于在4℃下(冰)的高压灭菌的1.7mL微量离心管中。用无菌水将质粒DNA(1μL)以1∶10稀释，添加到细胞中，然后通过轻弹管轻轻混合。在冰上的同时将管孵育30分钟。然后将微量离心管置于设定为42℃的水浴中，并且孵育45秒。然后将管在冰上冷却两分钟。然后将300微升的SOC培养基(天惠华公司(TekNova)，美国加利福尼亚州霍利斯特)添加到管中，并且将管在37℃下孵育一小时。然后将此反应混合物(100μL)铺在预热(37℃)的琼脂板上，该琼脂板含有50μg/mL的硫酸卡那霉素。将这些琼脂板倒置放置在37℃培养箱中，并且孵育16-24小时。然后将板封口并且在4℃下储存。使用此方法，可以将板储存几天。
基于大小和形状从琼脂板上选择三个单独的菌落，并且接种(细菌环)到2mL的含有25μg/mL的硫酸卡那霉素的LB肉汤(天惠华公司，美国加利福尼亚州霍利斯特)中。将孵育的管在设定为在250rpm下搅动和37℃的振荡培养箱中孵育6-8小时。然后通过将培养物的等分试样(50μL)离心(10,000×g持续2分钟)来收获细胞。将细胞沉淀物冷冻并且通过SDS-PAGE分析进行分析(指定为未诱导的细胞沉淀物)。通过将200μL的50％甘油溶液与300μL的细胞培养物合并在标记的无菌Nalgene冷冻小瓶中，在层流净化罩(1aminar folw hood)中产生甘油储液。将小瓶涡旋并且储存在-80℃下。
将剩余的培养物转移到设定为20℃和250转/分钟(rpm)的振荡培养箱中，并且孵育30分钟。将IPTG(1M溶液)添加到培养物中，以产生0.5mM的终浓度，然后将培养物在振荡培养箱(20℃和250rpm)中孵育另外的12-16小时。然后从发酵管中取出50μL的等分试样，离心(10,000×g持续2分钟)，并且将细胞沉淀物指定为诱导的细胞沉淀物。根据制造商的说明(赛默科技公司((Thermo Scientific)，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)，将未诱导和诱导的细胞沉淀物重悬于50μL的补充有DNA酶和溶菌酶的B-PER细菌蛋白质提取试剂中。将细胞悬浮液在室温下孵育1小时。将来自诱导的培养物的细胞裂解物在20,000×g下离心2分钟。将上清液转移到新的管中，并且指定为诱导的细胞裂解物(凝胶上的S)。将剩余的沉淀物指定为诱导的细胞沉淀物(凝胶上的P)。将未诱导的总细胞裂解物指定为在凝胶上的UI。如下所述通过SDS-PAGE分析这些样品，以确定FGF-21表达水平。选择产生最高水平的可溶性FGF-21(野生型和/或突变型)表达的菌落来产生此研究中的目的蛋白质。
实施例4：FGF-21(野生型)和FGF-21突变体的表达
基于来自实施例3中所述的诱导的2毫升培养物的FGF-21条带的染色强度，选择产生最高水平的FGF-21突变体表达的菌落。将含有培养基的管(3mL的补充有25μg/mL硫酸卡那霉素的含无动物成分的大豆蛋白胨的LB肉汤)与来自对应于最高生产者的甘油储液的刮取物一起孵育。使培养物在37℃和250rpm下生长过夜(12-16小时)。将这些起始(starter)培养物(1mL)用于接种1L的含有25μg/mL硫酸卡那霉素的LB肉汤。孵育烧瓶(37℃，在250rpm下)，直到发酵培养物的OD600达到0.6-0.8。此时，将烧瓶转移到设定为20℃和250rpm的另一个振荡培养箱中，并且孵育45至60分钟。然后测量OD600，并且将500μL的1M IPTG溶液添加到每个烧瓶中，并且在20℃和250rpm下继续发酵12-16小时。正好在收获之前，获得每个烧瓶的OD600。然后将烧瓶转移到1L离心瓶中，并且通过在4,657×g和4℃下旋转30分钟在Sorvall RC-3B-PLUS中沉淀细胞。将上清液小心地滗析入漂白剂中并且丢弃。将细胞重悬于30至50mL的蒸馏水中，并且转移到预先称重的50mL锥形离心管中。通过在3220×g和4℃下离心15分钟沉淀细胞，去除(滗析)上清液，并且称量单独的湿细胞沉淀物并且在-80℃下冷冻。
基于纯化和配制后计算的分离产率，所有FGF-21野生型和突变体的表达都导致在11与70mg/L之间的发酵物的足够产率(图2)。
实施例5：FGF-21(野生型)和FGF-21突变体的裂解和纯化
使用IEX色谱(Source 15Q)、亲和色谱(Blue琼脂糖凝胶)和通过Mustang Q膜过滤的组合纯化FGF-21和FGF-21突变体(方法1)。还开发了可替代的纯化策略，其中使用Source15Q色谱重新纯化FGF-21突变体，直到去除大肠杆菌蛋白酶(方法2)。使用后面的方法，两个IEX纯化步骤通常去除了所有残余的蛋白酶；然而，如有需要，也可以进行三个或四个IEX色谱步骤。
两种方法均去除了所有剩余的蛋白酶，并且提供了大于98％纯度的产物。
5.1方法1
5.1.1IEX色谱
将来自实施例4的细胞沉淀物(5克)解冻，并且添加20mL的缓冲液(50mM Tris，pH7.5)。通过来回旋转将沉淀物重新悬浮。然后使细胞悬浮液在25,000psi的压力下通过Avestin乳化器(加拿大安大略省渥太华)三次以裂解细胞，并且将悬浮液离心(14,502×g)25分钟。将上清液通过滗析去除，并且通过0.2μm过滤器(TPP 150mL真空过滤系统)过滤，并且将滤液(电导率≤5μS)直接加样到用缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)平衡的离子交换柱(Source 15Q；1.0cm×30cm；24mL)上。使用3个柱体积的加样缓冲液洗涤柱，并且将FGF-21以2.0mL/min的流速经20个柱体积使用线性梯度的缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)、0至200mM氯化钠)洗脱。将洗脱的产物立即冷冻并且储存在-80℃下以防止蛋白水解，或者立即通过下一个色谱步骤加工。
5.1.2活性蓝(Cibacron Blue)色谱
将含有FGF-21的级分合并，并且用缓冲液(50mM HEPES pH7.4)稀释十倍，并且立即加样到TosoGel Blue柱(2cm×12cm；25mL)上。然后将柱以3.0mL/min的流速用约100mL(直到获得基线)的缓冲液洗涤，以去除未结合的材料。将产物以3mL/min使用缓冲液(50mMHEPES(pH 7.4)、200mM NaCl、400mM精氨酸)在洗脱步骤进行洗脱。然后将适当的柱级分合并，缓冲液交换到新的缓冲液(20mM HEPES，pH 6.8，100mM NaCl)中，并且通过Mustang Q膜滤器(颇尔公司(Pall)，美国纽约华盛顿港)过滤。然后配制滤液并且将其在-80℃下储存。针对大部分FGF-21蛋白，此加工步骤去除了蛋白酶。
5.2方法2
5.2.1IEX色谱-步骤一
将来自实施例4的细胞沉淀物(5克)解冻，并且添加20mL的缓冲液(50mM Tris，pH7.5)。通过来回旋转将沉淀物重新悬浮。然后使细胞悬浮液在25,000psi的压力下通过Avestin(加拿大安大略省渥太华)乳化器三次以裂解细胞，并且将悬浮液离心(14,502×g)25分钟。将上清液通过滗析去除，并且通过0.2μm过滤器(TPP 150mL真空过滤系统)过滤，并且将滤液(电导率≤5μS)直接加样到用缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)平衡的离子交换柱(Source 15Q；1.0cm×30cm；24mL)上。使用3个柱体积的加样缓冲液洗涤柱，并且将FGF-21以2.0mL/min的流速经20个柱体积使用线性梯度的缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)、0至200mM氯化钠)洗脱。将洗脱的产物立即冷冻并且储存在-80℃下以防止蛋白水解，或者立即通过下一个色谱步骤加工。
5.2.2IEX色谱法-步骤二
将含有FGF-21的级分合并，并且用缓冲液(50mM HEPES pH7.5)稀释四倍，并且立即加样到用缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)平衡的IEX柱(Source 15Q；1.0×30em；25mL)上。使用3个柱体积的加样缓冲液洗涤柱，并且将FGF-21以2.0mL/min的流速经20个柱体积使用线性梯度的缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)、0至200mM氯化钠)洗脱。立即将含有洗脱的产物的级分冷冻，并且储存在-80℃下以防止蛋白水解(如果还有的话)。然后使用来自每个柱级分的少量样品进行蛋白酶测定，以确定是否存在蛋白酶。如果仍然存在蛋白酶，如上所述使用另一个IEX色谱步骤(Source 15Q)再次纯化产物。然后将柱级分合并并且配制。
5.3大规模生产
图3、4和5说明了本发明的突变型FGF-21肽缀合物的大规模生产和纯化。图3总结了发酵、细胞收获和包涵体的获得。图4说明了包涵体的溶解和纯化步骤，其可以有利地用于纯化突变型FGF-21肽。在许多其他纯化方案(比如使用DAE和SP琼脂糖凝胶树脂)中鉴定了所示的包括两个阴离子交换色谱步骤的纯化方法，以从大规模表达中给出突变型FGF-21肽的最高产率和最佳纯度。图5说明了糖PEG化程序和随后的纯化方案，该方案包括两个阴离子交换色谱步骤，该步骤导致突变型FGF-21肽缀合物的最高产率和最佳纯度。
实施例6：蛋白酶的去除，未PEG化的FGF-21的配制和进一步表征
在使用来自纯化过程的缓冲液或配制缓冲液在4℃下储存后，所有使用此大肠杆菌表达系统产生的FGF-21都被内源性蛋白酶快速降解。因此，在加工期间，立即加工所有部分纯化的样品，或者将中间级分冷冻储存(-80℃)，直到可以进行进一步加工。通过向缓冲液中添加高浓度的精氨酸(≥400mM)也可以抑制蛋白水解。
通过在30℃下孵育三天，测试所有纯化的FGF-21的蛋白酶去除(稳定性)。对于初始纯化后仍含有蛋白酶的FGF-21突变体，使用纯化方法、第二、第三或第四次IEX色谱步骤(Source 15Q)以去除剩余的蛋白酶。从所有FGF-21样品中完全去除蛋白酶是必需的，因为糖PEG化反应需要在30℃下孵育过夜。使用高盐浓度(例如，精氨酸、氯化钠等)在糖PEG化过程期间抑制蛋白水解是不合适的，因为这些条件抑制糖PEG化反应。
通过将含有FGF-21和潜在蛋白酶的样品或柱级分(10-50μL)在30℃下孵育1-3天来确定蛋白酶的去除。如果3天后没有发生FGF-21的蛋白水解，则认为蛋白酶已经完全去除。将SDS-PAGE用于确定蛋白水解的程度。使用活性蓝色谱纯化IEX级分后，观察到完全的蛋白酶去除。
对于SDS PAGE分析，使用12％或4％-12％的Bis-Tris NuPAGE预浇注聚丙烯酰胺梯度平板凝胶。除非另外说明，否则将样品与含有0.1M DTT的LDS样品缓冲液以1∶1混合，并且在95℃下加热3分钟。将凝胶在MES缓冲液中在200V的恒定电压下跑胶(run)40分钟。电泳后，如制造商所述，如使蛋白质可视所必需的，将蛋白质用Simply Blue安全染色(生命科技公司(Life Technologies)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)溶液染色2-24小时同时在室温下在50rpm下振荡。标准蛋白质包括188、98、62、49、38、28、17、14和6kDa的质量(英杰公司(Invitrogen)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，
Figure BDA0003549953810000621
Plus-2标准品，目录号LC5925)或者220、150、120、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15和10kDa的质量(英杰公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，
Figure BDA0003549953810000622
Sharp预染蛋白质标准品)。将凝胶用水脱色后，使蛋白质条带可视并且在Li-Cor
Figure BDA0003549953810000623
红外成像仪上扫描并且记录(利康公司(LI-CORInc.)，美国内布拉斯加州林肯)。(图6)
在缓冲液(HEPES，20mM，pH 6.8；NaCl，100mM)中，将每种FGF-21(野生型)和突变体(未PEG化)配制为约1mg蛋白质/mL，并且冷冻储存(-80℃)。使用内毒素去除滤盘(filterdisc)单元(Mustang E，0.2微米过滤器)进行内毒素去除和无菌过滤。将小瓶密封并且在-80℃下储存。使用包括ID(SDS PAGE)、蛋白质浓度(BCA)、聚集(SEC)和内毒素的测试，测试并且放行(release)所有样品。
详细地，合并在IEX色谱后收集的FGF-21，测定蛋白质浓度(BCA)，并且使用旋转过滤器(颇尔公司，美国纽约州，
Figure BDA0003549953810000624
高级离心设备；3K MWCO或Amicon Ultracel-3K旋转过滤器)浓缩，并且在3220×g下离心约45分钟，或者直到渗余物(retentate)蛋白质浓度达到1-2mg/mL。用于未修饰的FGF-21蛋白的配制缓冲液是20mM HEPES(pH 6.8)、100mMNaCl。然后将配制缓冲液添加到渗余物中，并且如上所述将样品离心，直到渗余物蛋白质浓度是1-2mg/mL。将此方法重复另外的两次。然后将配制缓冲液添加到渗余物中以使蛋白质浓度达到约1mg/mL。
在保持无菌环境的Labconco柜(cabinet)中进行所有FGF-21蛋白质的配制。按照制造商的建议，使用1mL无菌、无内毒素的水，以受控速率通过1-4mL/min的流速手动过滤，对0.2μm
Figure BDA0003549953810000631
Figure BDA0003549953810000632
-E注射器式过滤器(颇尔公司(PALL Corporation)，美国纽约州)进行预处理。然后使用注射器使溶液以1-4mL/min的流速通过
Figure BDA0003549953810000633
E柱体过滤。将滤液轻轻混合，然后等分到1.2mL无热原的冷冻小瓶中，直至所需体积。将所有产物在-80℃下冷冻储存。
使用鲎变形细胞溶解物(LAL)测定(金斯瑞公司(Genscript)，美国新泽西州皮斯卡塔韦，ToxinSensorTM发色LAL内毒素测定试剂盒；目录号L00350)确定内毒素污染。LAL反应是一种定量的体外终点测定，其使用修饰的LAL和合成的生色底物在发色测定中检测内毒素。通过与含有已知量的内毒素标准品的溶液的吸光度(405nm)比较，从其吸光度计算样品中内毒素的浓度。
使用Pierce Micro BCATM蛋白质测定试剂盒零件编号23235(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)确定蛋白质浓度。将BSA用于制备标准曲线。在37℃下孵育30分钟后，将板在562nm下在酶标仪上读数。通过参考BSA标准曲线计算样品蛋白质浓度。PEG化的蛋白质不干扰此测定。
将东曹生物科学公司(Tosoh Biosciences)(日本东京)柱(TSK凝胶G3000SW XL，7.8mm×30cm，目录号S7165-06R)尺寸排阻色谱(SEC)用于确定蛋白质纯度和聚集体的量。使用跑胶缓冲液(50mM磷酸钠，pH 6.8)平衡柱并且注入在20-50μL之间的样品(15-40μg的蛋白质)。该方法使用0.5mL/min的流速并且监测在A280下的吸光度。
将所有FGF-21蛋白与Bio-Rad蛋白质参考标准混合物(伯乐公司，目录号151-19010)相比较，参考标准混合物含有牛甲状腺球蛋白(670,000)、牛下-球蛋白(158,000)、鸡卵白蛋白(44,000)、马肌红蛋白(17,000)、维生素B12(1,350)。将参考标准品作为纯溶液或含跑胶缓冲液的稀释溶液注入(约25μL)。
实施例7：突变型FGF21-GalNAc-SA-PEG-20/30kDa的产生
使用由MBP-GalNAcT2和UDP-GalNAc组成的酶反应和通过MALDI质谱监测的GalNAc增加来评价每种突变体的糖基化。
在使用MBP-GalNAcT2、ST6GalNAc1、UDP-GalNAc和CMP-SA-PEG-20/30kDa(用20kDaPEG或用30kDa PEG)的单个步骤一锅(one pot)反应中进行突变型FGF-21的糖PEG化。使用
Figure BDA0003549953810000641
高级离心设备(颇尔公司，美国纽约州，浓缩仪，目录号MAP003C37，20mL，3KMWCO)，将纯化的FGF-21突变体缓冲交换到反应缓冲液(20mM Bis-Tris，50mM NaCl，pH6.7)中。缓冲液交换并且浓缩后，FGF-21突变体蛋白质浓度在3-5mg/mL之间(BCA)。将CMP-SA-PEG-20/30kDa(3mol当量)溶解于FGF-21突变体(1摩尔当量)的溶液中。将MBP-GalNAcT2(14-15mU/mg FGF-21)、UDP-GalNAc(1.1mol当量)、ST6GalNAc1(100mU/mg FGF-21)和MnCl2溶液(10mM终浓度)直接添加到反应管中并且轻轻混合。最终FGF-21蛋白质浓度应当在2-4mg/mL反应混合物之间。然后将反应混合物在32℃下孵育过夜(约16小时)。还参见PCT公开号：WO 2003/031464；WO 2005/089102；WO 2006/050247；和WO 2012/016984，将其中每个的整体内容通过引用并入本文。
使用IEX色谱(Source 15Q；1cm×24cm柱)纯化FGF-21突变体-GalNAc-SA-PEG-20/30kDa产物，并且将产物以2mL/min的流速用氯化钠梯度[50mM Tris缓冲液(pH 7.5)，0至100mM氯化钠梯度，经20个柱体积]洗脱。通过SDS-PAGE(4％-12％)分析级分，将其合并、浓缩并且配制。分析所有产物的含量(BCA)、纯度(SDS-PAGE)、聚集(SEC)和内毒素。
如通过SDS PAGE确定的，此方法的转化产率在25％至90％之间。将PEG化反应混合物使用IEX色谱(Source 15Q)纯化。配制每种PEG化的产物并且进行放行测试。放行测试包括ID(SDS PAGE)、蛋白质浓度(BCA)、聚集(SEC)和内毒素。每种PEG化的产物的纯度都大于98％，无可检测的聚集体。基于起始FGF21蛋白，总分离产率是15％-44％(单PEG)。
通过以下方式配制所有糖PEG化的FGF-21突变体：使用旋转过滤器缓冲液交换样品，然后调节配制缓冲液的体积以提供约1.0mg/mL的所需蛋白质浓度。在浓缩期间，决不允许蛋白质浓度超过5mg/mL，以防止蛋白质聚集。在此研究中使用的配制缓冲液是磷酸钠(50mM，pH 7.0)、100mM NaCl。使用内毒素去除滤盘单元(0.2微米过滤器)进行内毒素去除(Mustan E)和无菌过滤。将小瓶密封并且在-80℃下储存。观察到，
Figure BDA0003549953810000651
E过滤器通过结合FGF21显著降低了产物的总分离产率。
实施例8：用于分析亚可见颗粒的微流成像
为了评价四种赋形剂(蔗糖、聚山梨酯20、EDTA和L-甲硫氨酸)对反复冻融和振荡应激(stress)后突变型FGF-21缀合物质量属性的影响，将缀合物样品通过超滤(UF)从大约1.0mg/mL浓缩到36mg/mL，并且稀释到25mg/mL。制备了十一种TEV-47948配制品(表1)，将其以1.6mL填充体积填充到2cc玻璃小瓶中，并且在-20℃下冷冻。使所有配制品经受四个应激循环：在室温下解冻：在室温下在500rpm下振荡6小时，并且在-20℃下冷冻。解冻后，通过微流成像(MFI)计数≥2μm、≥5μm、≥10μm和≥25μm的亚可见颗粒，对配制品进行分析。使用配备有100μm流动池的ProteinSimple(加利福尼亚州圣何塞)的MFI5200系统测量亚可见颗粒。将0.9mL等分试样中的样品加样到96孔板上，并且转移到自动进样器Bot1中。在每种样品之前进行照明优化。用0.2mL吹扫体积、0.6mL成像体积、0.17ml/min流速和标准5×放大倍率一式两份地分析TEV-47948样品。在分析之前，通过用移液管吸头自动混合在孔中使样品均质化。将在MFI View系统软件(MVSS)中应用的图像过滤器用于从蛋白质颗粒中分离出气泡图像。
Figure BDA0003549953810000661
表1：突变型FGF-21肽缀合物配制品的组成
MFI结果显示出在没有聚山梨酯20的配制品(F1、F2、F8、F9)中有明显更多的亚可见颗粒，即聚山梨酯20降低了亚可见颗粒的浓度(图7)。因此，通过MFI，推荐突变型FGF-21肽缀合物药物产品的以下配制品组成以最小化亚可见颗粒：26mg/mL突变型FGF-21肽缀合物、16mM Tris、56mM NaCl、0.15M蔗糖和0.2mg/mL聚山梨酯20；pH 7.5。
实施例9：FGF-21突变体和糖PEG化的缀合物的体外测试
在基于细胞的测定中筛选FGF-21突变体和糖PEG化的FGF-21缀合物，该测定测量了小鼠脂肪细胞中的葡萄糖摄取。已经报道了FGF-21的如下功能：经由增加葡萄糖转运蛋白表达，在小鼠脂肪细胞中增加葡萄糖摄取(Kharitonenkov et al.，2005，Journal ofClin Invest，115(6)：1627-1635)。在此测定中，将测试化合物的效价表示为EC50值，该值是给出一半最大反应的突变体或缀合物的浓度。具有较低EC50的测试样品更具活性。
出于此目的，按照相似的描述(Kharitonenkov et al.，2005，Journal of ClinInvest，115(6)：1627-1635)，使小鼠3T3-L1前脂肪细胞在96孔板中分化21天，以准备进行测试。制备FGF-21突变体和糖PEG化的缀合物的系列稀释液，并且将其添加到脂肪细胞中孵育72小时。在孵育的最后4小时期间，将细胞换到含有降低的葡萄糖浓度的培养基中，然后用[3H]-2-脱氧葡萄糖(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)标记1小时。洗涤细胞以停止摄取并且以去除未掺入的葡萄糖。将脂肪细胞用0.1N NaOH和闪烁混合物(scintillation cocktail)(Ultima GoldTM，珀金埃尔默公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)裂解。在50μM细胞松弛素的存在下确定[3H]-2-脱氧葡萄糖的非特异性摄取。将板在
Figure BDA0003549953810000672
LSC计数器(珀金埃尔默公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)上读数。
表2中总结了非糖PEG化的FGF-21突变体的效价，并且进行了评价以确定突变是否单独影响FGF-21活性。与野生型FGF-21的2.0nM的效价相比，效价值的范围是从0.4-4.3nM。这些数据证明，为了产生糖基化共有位点，在某些位置处突变FGF-21序列是良好耐受的。约30nM或更高的值将被视为无活性。
Figure BDA0003549953810000671
Figure BDA0003549953810000681
表2：通过小鼠脂肪细胞中的葡萄糖摄取评价FGF-21突变体的效价。括号中给出了在根据SEQ ID NO：1的FGF-21氨基酸序列中脯氨酸残基的位置。1在单个测定中筛选。
糖PEG化的FGF-21突变体缀合物的效价的范围是从9nM至20nM(表3)。最有效力的糖PEG化的类似物(EC50约10nM)表现出比野生型FGF21(2nM)更低的效价，可能反映了由于掺入大PEG部分引起的一些障碍。一系列附接位点(从N末端附近到脯氨酸172)表明，将糖PEG添加到分子的任一端都是良好耐受的。此数据与报道一致，该报道显示在N末端PEG化的替代方法也是耐受的，如通过在小鼠脂肪细胞中增加的葡萄糖摄取所证明的(Huang et al.，2011，PLoS One，6(6)：e20669)。然而，没有预料到糖PEG部分与C末端区域附近的残基的附接也是耐受的观察结果。几篇报道已经证明，与β-Klotho的结合需要FGF-21的C末端，并且对于结合和效价，C末端氨基酸的缺失不是良好耐受的(Yie et al.，2008，FEBS Letters，583：19-24；Goetz et al.，2012，Molecular and Cellular Biol，32(10)：1944-54)。
Figure BDA0003549953810000682
Figure BDA0003549953810000691
表3：通过小鼠脂肪细胞中的葡萄糖摄取评价使用30kDa PEG进行PEG化的糖PEG化的FGF-21缀合物的效价。括号中给出了在根据SEQ ID NO：1的FGF-21氨基酸序列中脯氨酸残基的位置。1数据代表在2和5个独立测定之间的平均值。
最初，仅测试了30kDa PEG化的突变型缀合物，因为预期它们将是进一步开发的最有希望的候选物。然而，如上文和下文所解释的，基于可获得的实验数据，具有20kDa PEG的突变型缀合物表现出出人意料的特性。
实施例10：在小鼠葡萄糖摄取测定和人细胞细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化测定中测试20kDa与30kDa糖PEG化的FGF-21突变型缀合物
使用20kDa或30kDa PEG部分制备所选的FGF-21突变体，并且在小鼠和人细胞系中测试其效价(表4)。如实施例9所述，使用小鼠3T3-L1脂肪细胞评价在葡萄糖摄取测定中的效价。
为了评价在人细胞系中的突变型缀合物活性，使用人β-Klotho(FGF-21的共受体)瞬时转染人胚肾(HEK-293)细胞。使用检测细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化的测定评价受体活化。将细胞铺板在96孔板中，孵育过夜，并且施加FGF-21突变型缀合物的系列稀释液20分钟。将细胞裂解并且通过ELISA测量磷酸化ERK(R&DSystems目录号DYC1018B；R&D系统公司(R&D Systems，Inc.)，美国明尼苏达州明尼阿波利斯)。在
Figure BDA0003549953810000692
酶标仪(分子设备公司(Molecular Devices)，美国加利福尼亚州森尼韦尔)上读取所得的荧光。
出人意料地，包含20kDa PEG部分的缀合物比30kDa PEG缀合物更具活性。
另外，观察到所使用的两种测定对修饰具有不同的敏感性。在人磷酸化ERK测定中，在N末端附近被糖PEG化的缀合物P(5)TSSP显示出可接受的活性，而在小鼠葡萄糖摄取测定中显示出良好的活性。然而，在人和小鼠细胞系中在C末端附近修饰的缀合物都保持了很高的效价(参见表3中P(156)TP和P(172)TQGAS的数据)。
Figure BDA0003549953810000701
表4。包含20kDa或30kDa PEG部分的FGF-21突变型缀合物的比较。括号中给出了在根据SEQ ID NO：1的根据天然FGF-21序列的FGF-21氨基酸序列中脯氨酸残基的位置。1HEK-293细胞瞬时表达FGF-21的β-Klotho共受体。
实施例11：实施例10的具有20kDa和30kDa PEG部分的缀合物的体内测试。
选择各自具有20kDa或30kDa PEG部分的实施例10的缀合物用于体内的更详细的研究(结果在表4中给出)。所选的缀合物在体外细胞测定中具有良好的活性，并且以合适的量表达用于体内测试。
将在正常Sprague Dawley大鼠中的药代动力学(PK)半衰期延长和暴露以及在db/db糖尿病小鼠模型中的功效用作鉴定最有效力的缀合物的标准。
为了确定在Sprague Dawley大鼠中的PK半衰期延长，将FGF-21缀合物稀释于无菌磷酸盐缓冲盐水中，并且以0.25mg/kg向雄性Sprague Dawley(约0.3kg)大鼠皮下施用。施用后1、2、4、6、24、30、48、54、72、78和96小时从侧尾静脉抽血。将血液样品在室温下放置20分钟，然后离心以分离血清。将血清级分转移到干净的管中，在干冰上冷冻，并且在-80℃下储存以备分析。根据制造商的指示(百奥文德尔公司(BioVendor)，捷克共和国布尔诺，人FGF-21ELISA，目录号RD191108200R)，通过ELISA在血清中检测FGF-21缀合物，不同之处在于每种缀合物均用于制备标准曲线。使用WinNonlin软件(专业版5.2，法赛特公司(Pharsight Corporation)，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托)，通过血清浓度与时间数据的非房室分析(non-compartmental analysis)来估计复合药物动力学参数。
当与野生型FGF-21(2小时)相比时，糖PEG化的缀合物的循环半衰期延长(范围15-30小时)。20kDa和30kDa PEG化对缀合物半衰期和暴露都有相似的影响，这证明了PEG化对于FGF-21半衰期延长的价值。
Figure BDA0003549953810000711
表5。糖PEG化的FGF-21缀合物的体内功效。括号中给出了在根据SEQ ID NO：1的FGF-21氨基酸序列中脯氨酸残基的位置。PK＝药代动力学，WT＝野生型，AUC＝曲线下面积。1使用0.25mg/kg的每种缀合物或野生型FGF-21向Sprague Dawley大鼠皮下给药。2对于每个参数，显示出显著改善的剂量范围。在第1天和第4天给药缀合物，在第6天收集数据。3以3mg/kg每天给药FGF-21持续14天。4通过方差分析，数据呈趋势但是未达到显著。
db/db糖尿病小鼠是具有瘦素受体突变的遗传模型，该突变导致高血糖和血脂异常。在db/db小鼠模型中确定药效学作用是在辉源生物科技公司(HD Biosciences)(中国上海)进行的。雄性db/db小鼠(BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J)和年龄匹配的同窝小鼠(非糖尿病对照)购自中国南京大学的模式动物研究中心(Model Animal Research Center ofNanjing University)。在21℃-23℃下的室温、30％-70％相对湿度和12小时：12小时光照：黑暗循环的标准条件下，使动物在到达后适应环境一周。饮食和水可随意获得。所有实验程序都得到了辉源生物科技公司的机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。为了筛选缀合物，在第1天和第4天，以0、0.125、0.25、1、2.5mg/kg向小鼠给药。在研究期间使用血糖仪确定血糖。在第6天，处死动物，并且评价血清甘油三酯(EnzyChromTM测定，目录号ETGA-200，生物测定系统公司(Bioassay Systems)，美国加利福尼亚州海沃德)和胰岛素水平(小鼠胰岛素试剂盒，中尺度发现公司(MesoScale Discovery)，美国马里兰州罗克维尔)。
在db/db小鼠中检查糖PEG化的缀合物对血糖、血清甘油三酯和胰岛素水平的影响(表5)。显著改善这些参数的剂量示于表5中。尽管20kDa和30kDa糖PEG化的缀合物在降低血糖水平上均具有相似的功效，但是通过在更低的剂量和更宽的剂量范围内改善甘油三酯，20kDa PEG化的缀合物通常优于30kDa缀合物。
下表6证明，当将每个数据集与其媒介物对照组(媒介物对照组的值被认为是100％)相比时，每种突变体的20kDa缀合物比30kDa缀合物更大程度地降低了甘油三酯水平(因此，结果越低，性能越好)。
Figure BDA0003549953810000721
Figure BDA0003549953810000731
表6。甘油三酯降低(媒介物对照％)。在第1天和第4天施用0.125mg/kg剂量，在第6天测定甘油三酯。
通过施用糖PEG化的FGF-21缀合物，血清胰岛素水平在宽范围内变化(表7)。预期因为FGF-21缀合物改善了胰岛素抵抗，血清高胰岛素血症将得到解决。与非糖尿病同窝小鼠对照相比，所有db/db小鼠都显示出显著的高胰岛素血症。P(172)-20的施用导致了胰岛素的最大降低，在2.5mg/kg下降低73％。此外，P(172)-20证明了在0.25-1.0mg/kg剂量下血清胰岛素降低的趋势。
Figure BDA0003549953810000732
表7。对于db/db小鼠模型中的糖PEG化的缀合物，血清胰岛素水平的降低。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，如通过单向方差分析确定的。
总之，所有突变体和突变型缀合物都以合适的量表达并且具有生物活性。在体外葡萄糖摄取和ERK磷酸化测定中以及在体内实验中，20kDa-PEG缀合物显示出更好的性能，而在20kDa-PEG和30kDa PEG突变型缀合物种类中，半衰期得到相似的改善。因此，由于与较小的20kDa PEG残基相比，当将较大的30kDa PEG残基与突变型FGF-21附接时，显然没有实现半衰期的进一步增加，因此附接较小的20kDa PEG是有益的，因为较小的PEG残基不太可能造成受体结合或屏蔽FGF-21突变型蛋白质部分的障碍，这是预期发生的天然生物相互作用(其将导致生物活性降低)所需的。此外，通过在更低的剂量和更宽的剂量范围内改善甘油三酯，20kDa PEG化的缀合物通常优于30kDa缀合物。
实施例12：向糖尿病食蟹猴施用多个剂量的20kDa PEG-FGF-21P(172)TQGAS(在此实施例12中称为“突变型FGF-21肽缀合物”)的功效
在实验开始时，基于食蟹猴(年龄范围6-28岁)的内源性FGF21水平将其随机分组(n＝6)。组间的平均FGF-21血清水平的范围是从229±58pg/mL至312±88pg/mL。在适应阶段和2周基线收集阶段之后，每周一次用媒介物、0.1mg/kg、0.3mg/kg或1mg/kg突变型FGF-21肽缀合物向猴组皮下地给药，历时8周。在研究的清除(washout)阶段期间，评价猴持续另外的10周。研究终点包括体重、食物消耗、空腹血糖、HbA1c水平、ALT和血清脂质。
12.1突变型FGF-21肽缀合物对体重和食物摄取的影响
在所有剂量水平下，糖尿病食蟹猴都展现出减少的食物摄取(表8)。然而，在治疗阶段结束时，只有使用最高剂量的突变型FGF-21肽缀合物(1.0mg/kg)治疗的动物才显示出体重百分比的显著降低，具有大约10％的最大影响(表8)。在治疗结束前该影响并未达到稳态，并且在最后一次治疗后约4周，动物的体重恢复至基线水平(数据未显示)。
Figure BDA0003549953810000741
Figure BDA0003549953810000751
表8：突变型FGF-21肽缀合物对糖尿病食蟹猴的体重和食物摄取的影响
ap＜0.05；kg＝千克；SEM＝平均值的标准误差
12.2突变型FGF-21肽缀合物对糖尿病食蟹猴的血糖控制的影响
在血糖控制的几个参数(包括空腹血糖、糖基化血红蛋白A1c(HbA1c)、血清胰岛素水平和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的耐量)上评价了突变型FGF-21肽缀合物的功效。先前的报道表明FGF-21类似物可能不会影响NHP或人类的血糖控制(Talakdar et al.，2016；Gaich et al.，2014)。向肥胖的2型糖尿病患者施用短效FGF-21类似物LY2405319展现了体重、胰岛素和甘油三酯的降低，但是并未显著降低血糖(Gaich et al.，2014)。类似地，在肥胖的食蟹猴中，长效FGF-21类似物PF-05231023降低了体重和甘油三酯，但是显示对葡萄糖耐量没有影响(Talakdar et al.，2016)。未观察到2型糖尿病患者的空腹血糖和胰岛素水平的变化(Talakdar et al.，2016)。研究人员在120名患有2型糖尿病的患者中评估了BMS-986036(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))的12周试验的功效。接受BMS-986036的患者显示出改善的N末端III型胶原前肽，但是未显示出HbA1c或体重的改善(Charles EDet al.Abstract 33。提出于The Liver Meeting；2016年11月11-15日；波士顿；Charles EDet al.Abstract1082。提出于：The Liver Meeting；2016年11月11-15日；波士顿)。
向糖尿病猴每周一次施用测试的突变型FGF-21肽缀合物以剂量依赖的方式改善了空腹血糖水平(表9)。在研究开始时，组间的胰岛素水平是多变的，但是在最高剂量下观察到与基线相比的显著降低(表9)。
与空腹血糖变化一致的是HbA1c水平的同时改善(图8)，这是评价随时间的血糖水平的可靠指数。值得注意的是，迄今为止，对于任何其他FGF-21类似物或突变体，本领域中尚未报道改善的HbA1c。具体而言，对于基于FGF-21的候选产品(也就是百时美施贵宝公司(BMS)的BMS-986036或辉瑞公司(Pfizer)的PF-05231023或礼来公司(Lilly)的LY2405319)，尚未报道改善的HbA1c。
Figure BDA0003549953810000761
表9：突变型FGF-21肽缀合物对糖尿病食蟹猴的空腹血糖的影响ap＜0.05，bp＜0.01；kg＝千克；mIU＝毫国际单位；SEM＝平均值的标准误差
在指定的时间点从头静脉或隐静脉收集血液样品(1.0mL/次)到BD
Figure BDA0003549953810000762
K2-EDTA管中。立即将样品储存在4℃的冰箱或湿冰中。在收集血液的同一天分析样品。
通过使用糖化血红蛋白测试系统(伯乐公司，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)以HPLC测量HbA1c。
在第-11天(基线)以及给药后第31天和第52天进行OGTT(图9)。在第31天和第52天，并且在所有测试剂量下，突变型FGF-21肽缀合物都改善了口服葡萄糖耐量。似乎到第31天并且在最低剂量下出人意料地达到了突变型FGF-21肽缀合物对葡萄糖耐量的最大作用，因为在第31天和第52天每个治疗组内的葡萄糖耐量的差异相似。已经观察到在NHP中FGF21类似物对OGTT的不同作用，并且这些不同作用可能反映了FGF21类似物的药理学变化。在肥胖的食蟹猴中未观察到长效FGF21对OGTT的改善(Talakdar et al.，2016)，但是报道了在肥胖的恒河猴中长效FGF21类似物对OGTT的改善(Murielle M.Véniant，ReneeKomorowski，Ping Chen，Shanaka Stanislaus，Katherine Winters，Todd Hager，LeiZhou，Russell Wada，Randy Hecht，and Jing Xu(2012)Endocrinology 153：4192-4203)。
通过放置1.0g/kg葡萄糖+10g/kg香蕉向动物施用葡萄糖：将葡萄糖埋在香蕉中间，然后饲喂给动物。经由尾静脉穿刺获得血液用于通过血糖仪(
Figure BDA0003549953810000771
Performa，罗氏公司(Roche))测量血糖。每种处理的数据显示为曲线下面积(AUC)。*p＜0.05，**p＜0.01(图9)。
12.3使用突变型FGF-21肽缀合物治疗的糖尿病食蟹猴中的血清ALT水平
在研究过程期间每周一次测量血清ALT水平。在第7天和第14天，在0.3mg/kg和1.0mg/kg剂量组中，ALT水平分别降低。对于0.3mg/kg剂量组，直至第14天观察到ALT水平降低的趋势(p＝0.056)，而在1.0mg/kg组中，直至第28天观察到ALT水平降低的趋势(p＝0.073)。相比之下，到治疗期结束，媒介物组中的ALT浓度适度上升(图10)。
通过使用
Figure BDA0003549953810000772
R2400(西门子公司(SIEMENS))系统测量血清化学参数(TG、TC、HDL、LDL、ALT、葡萄糖)。
12.4使用突变型FGF-21肽缀合物治疗的糖尿病食蟹猴中的血清脂质浓度
在研究过程期间每周一次测量血清脂质水平(甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度胆固醇(HDL)和低密度胆固醇(LDL))。使用突变型FGF-21肽缀合物治疗动物持续4天导致在所有测试剂量下血清TG水平显著降低，该血清TG水平在治疗阶段期间保持稳定。血清TG水平在清除阶段期间恢复到其基线水平(图11)。相比之下，在使用媒介物治疗的动物中仅观察到TG水平的不显著的增加。
对于每个个体，将TG水平相对于基线值归一化(图11)。通过使用
Figure BDA0003549953810000781
R2400(西门子公司)系统测量血清化学参数(TG、TC、HDL、LDL、ALT、葡萄糖)。
在突变型FGF-21肽缀合物的最高剂量下，总胆固醇水平和LDL胆固醇分别适度降低了29％和39％。通过使用突变型FGF-21肽治疗，HDL胆固醇水平显著升高，并且在清除阶段期间恢复到基线(图12)。
通过使用ADVIA
Figure BDA0003549953810000782
(西门子公司)系统测量血清化学参数(TC、HDL、LDL)。对于每个个体，将HDL胆固醇水平相对于基线值归一化。
12.5使用突变型肽FGF-21肽缀合物治疗的糖尿病食蟹猴中的脂联素生物标志物评价
在0.1mg/kg和0.3mg/kg组中，高分子量(HMW)脂联素水平呈上升趋势，并且到第21天在1.0mg/kg剂量下显著上升(图13)。
使用用于人类HMW脂联素/Acrp30免疫测定的商业试剂盒目录号DHWAD0(R&D系统公司)检测猴血清中的脂联素。
实施例13：施用20kDa PEG-FGF-21P(172)TQGAS(在此实施例13中称为“TEV-47948”)在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型中的功效。
13.1在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型中的功效
Stelic动物模型(STAM)小鼠患上NASH、纤维化，最终患上肝细胞癌。此模型展现了与人类疾病非常相似的病理进展；具体而言，STAM小鼠在8周时出现NASH，在12周时进展为纤维化，最终患上肝细胞癌(Saito et al.，2015)。在STAM小鼠中评价了突变型FGF-21肽缀合物，并且评价了其对体重、肝体重比、肝脂肪变性、炎症、纤维化和复合NAFLD活动评分(NAS)的影响。
通过在出生后2天单次皮下注射200μg链脲佐菌素(STZ，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，美国)并且在4周龄后使用高脂饮食(HFD，57kcal％脂肪，目录号：HFD32，日本科力亚株式会社(CLEA Japan)，日本)饲喂，在40只C57BL/6雄性小鼠中诱导NASH。在6周龄时将小鼠随机分为5组，每组8只。将磷酸盐缓冲盐水(PBS)用作媒介物。将使用正常饮食饲喂而未经STZ处理的八只雄性小鼠用于正常组。从6-9周龄开始，以0.1、0.5、2.0和6.0mg/kg的剂量，每72小时一次皮下施用突变型FGF-21肽缀合物。
在研究过程中，突变型FGF-21肽缀合物显著改善了肝重和肝体重比(表10)。与媒介物组相比，在突变型FGF-21肽缀合物-0.5mg/kg、-2.0mg/kg和-6.0mg/kg组中，处死当天的平均体重、肝重和肝体重比显著降低。
Figure BDA0003549953810000791
表10：在突变型FGF-21肽缀合物治疗后，在STAM模型中的体重与肝重。显示的数据是研究结束时每组(n＝8只动物/组)的平均值±标准偏差。1＝p＜0.001，与媒介物组相比；2＝p＜0.05，与媒介物组相比；3＝p＜0.01，与媒介物组相比。
在STAM模型中，突变型FGF-21肽缀合物改善了生物化学参数(表11)。在第7天和第16天，与正常组相比，在媒介物组中，非空腹血糖水平显著增加。在第16天，与媒介物组相比，在突变型FGF-21肽缀合物-6.0mg/kg组中，非空腹血糖水平显著降低。在第22天，与媒介物组相比，在突变型FGF-21肽缀合物-6.0mg/kg组中，空腹血糖水平显著降低，并且在突变型FGF-21肽缀合物-0.1mg/kg和-2.0mg/kg组中，空腹血糖水平倾向于降低。在媒介物组与突变型FGF-21肽缀合物-0.5mg/kg组之间，4小时空腹血糖水平没有显著差异。
血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平作为肝损伤的标志物，并且在STAM模型中，与正常组相比，媒介物组中的血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平显著增加。与媒介物组相比，在突变型FGF-21肽缀合物-2.0mg/kg和-6.0mg/kg组中，血清ALT水平显著降低，并且在突变型FGF-21肽缀合物-0.5mg/kg组中，血清ALT水平倾向于降低。在媒介物组与突变型FGF-21肽缀合物-0.1mg/kg组之间，血清ALT水平没有显著差异。
Figure BDA0003549953810000801
Figure BDA0003549953810000811
表11：在突变型FGF-21肽缀合物治疗后，在STAM模型中的生物化学参数。显示的数据是研究结束时每组(n＝8只动物/组)的平均值±标准偏差。ALT＝血清丙氨酸转氨酶。AST＝天冬氨酸转氨酶。1＝p＜0.05，与媒介物组相比；2＝p＜0.01，与媒介物组相比。
NAFLD活动评分(NAS)是脂肪变性(油红O染色)、凋亡肝细胞的球囊化(ballooning)(HE染色)和炎症(F4/80免疫染色)的量度，并且被开发为用于测量在治疗试验期间的NAFLD变化的工具。在当前研究中，来自媒介物组的肝切片表现出严重的微泡和大泡脂肪沉积、肝细胞球囊化和炎性细胞浸润。与这些观察结果一致，与正常组相比，媒介物组中的NAS显著增加。与媒介物组相比，所有剂量的TEV-47948组都显示出脂肪变性、肝细胞球囊化和炎性细胞浸润的显著改善以及NAS的显著降低(图14)。
13.2.在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的DIN(饮食诱导的NASH)小鼠模型中的功效
在可替代的动物模型中，DIN模型使用饮食的改变来诱导NASH，如本领域中所理解的和以下所述的。DIN Nash模型是公认的II型糖尿病动物模型。因此，它与上述的STAMNASH模型不同，在该STAM NASH模型中，通过注射链脲佐菌素、然后是高脂饮食在小鼠中诱导NASH(STAM NASH)。STAM NASH是公认的I型糖尿病动物。
在此实施例所述的DIN模型中，适应阶段包括随意提供的标准饮食(RM1(E)801492，SDS)和正常饮用水。然后向小鼠饲喂60％高脂肪/2％胆固醇饮食(研究饮食公司(Research Diets Inc.)，美国新泽西州)和10％果糖的饮用水(DIN饮食)。该饮食的脂肪含量是来自脂肪的60％kcal。在％g的基础上，脂肪代表35％g，其中3％来自大豆油，32％来自猪油。
方法：
适应期之后，向小鼠饲喂DIN饮食持续25周。每周测量小鼠体重，直到25周饮食期结束。在饮食期6周，在09：00AM将小鼠称重并且禁食4小时(10％果糖被正常水替代)。然后在1：00PM收集血液，以测量血糖和血浆胰岛素以及血浆ALT和AST水平。从血糖和血浆胰岛素值计算HOMA-IR。排除具有最低HOMA-IR和ALT/AST值的15只小鼠。根据它们的HOMA-IR、ALT/AST和体重，将小鼠分为5个相同的组，并且每3天用媒介物或3种不同剂量的TEV-47498注射液皮下治疗。在饮食中给出了OCA。
在治疗的第6周、第10周、第15周和第19周，将小鼠在9：00AM禁食4小时(10％果糖被正常水替代)，并且收集血液以测量血糖、血浆胰岛素、ALT和AST、总胆固醇和甘油三酯水平。在治疗的第19周，在最后一次给药后的4个不同时间点(0、6、24、48小时)，对所有小鼠放血(约100μL血液)，以分离血清，将分离的血清在干冰中运送用于分析之前储存在-80℃下。在给药后第0小时和第24小时，对每组5只小鼠放血，并且在给药后第6小时和第48小时，对另外5只小鼠放血。最后一次血液收集后，在4％异氟烷麻醉下通过颈脱位法处死小鼠，并且用无菌盐水放血。
结果：
在此研究中，如上文所述，在DIN小鼠模型中评价了TE-47948的作用，具有以下细节。在饮食诱导NASH的6周后，每3天经由皮下施用用三种不同剂量(20μg/kg、100μg/kg和500μg/kg)的TE-47948治疗C57B16小鼠亚组，持续19周。为了将TE-47948对NASH进展的功效与相对对照进行比较，用媒介物对照治疗被诱导患有NASH的C57B16小鼠亚组，并且用FXR激动剂奥贝胆酸(OCA)治疗被诱导患有NASH的C57B16小鼠亚组，将奥贝胆酸混入饮食中(25mg/kg)，并且平行地评估这些亚组。由于其抗NASH特性，将OCA用作参考。
TEV-47948以剂量依赖的方式显著降低了在DIN小鼠模型中诱导的肝损伤。观察结果是通过组织学NAS评分的显著降低以及肝转氨酶、肝脂质以及炎性和纤维化标志物的强烈降低证明的。参见例如，图15和16。
除对肝脏的有益作用外，TE-47948还显示了显著的抗糖尿病和抗肥胖特性。参见例如，图17-20。
综上所述，这些观察结果证实了TE-47948在饮食诱导的NASH的治疗中的有益作用。
实施例14：不同治疗方案及其对向糖尿病食蟹猴施用20kDaPEG-FGF-21 P(172)TQGAS(在此实施例14中称为“糖-PEG-FGF-21”)的功效的影响
此实施例的目的是研究当使用不同治疗方案施用时，在自发性糖尿病食蟹猴中，糖-PEG-FGF21的药理作用及其全身性暴露。更具体地，该实验旨在检查当通过皮下注射每周一次或每2周一次施用时，糖-PEG-FGF21的药理作用。
实验设计
14.1.动物圈养
根据实验室动物护理评估和认证协会(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)批准的指南，圈养和维护自发性糖尿病猴。动物生存环境和光周期的目标条件如下：
温度：23℃±3℃
湿度：50％±20％
光照周期：12小时光照，12小时黑暗
14.2.猴食谱
所有动物都可以自由饮水，并且使用富含时令水果的完全营养均衡饮食每天饲喂两次。
饮食组成(％)
Figure BDA0003549953810000841
14.3.化合物、配制品和供应品
配制的化合物包含在20mM Tris HCL、70mM氯化钠(pH 7.5)中的25mg/mL糖-PEG-FGF21。
14.4分组、实验程序和治疗
14.4.1.分组
将筛选三十只自发性糖尿病食蟹猴，以选择24只符合研究纳入标准的糖尿病猴受试者。将收集来自至少三十(30)只动物的血清，并且将测量几个参数，比如葡萄糖、胰岛素、脂质、肝酶等。将招募所选的动物(n＝24)进入研究，并且相对于其体重、葡萄糖、脂质和胰岛素水平在实验组中平均分配。
如表12所述，将用媒介物或用测试制品(article)治疗用于研究的所选的糖尿病动物。
Figure BDA0003549953810000851
表12：组设计、施用剂量、频率和途径
14.4.2.使用糖-PEG-FGF-21的实验程序和治疗方案
以下提出了实施例14的实验设计和数据收集的流程图。
Figure BDA0003549953810000852
该研究包括两个阶段：预处理阶段和治疗阶段。在媒介物或糖-PEG-FGF21配制的化合物的皮下(sc)施用后将观察效果。观察、数据收集和治疗的时间过程示于流程图中(以上)，并且在表13中进行了总结。
预处理---所有实验动物都将有1周的适应时间，然后是2周的收集口服葡萄糖耐量试验(GTT)、生物化学(甘油三酯、HDL、LDL、ALT、葡萄糖)体重(BW)、FGF-21和食物摄取量的基线数据。使动物空腹过夜用于BW测量，并且收集血液样品用于脂质测量和血糖。在第0天将进行口服葡萄糖-香蕉GTT(1.0g/kg葡萄糖+10g/kg香蕉：将葡萄糖埋在香蕉中间，然后饲喂给动物)(0、15、30、60、120、180分钟)作为基线。
治疗---将根据表12通过用媒介物(PBS)或糖-PEG-FGF21皮下施用治疗动物。治疗前使动物空腹过夜。在第一个和最后一个(第28天)皮下给药后，在给药前、给药后6、24、48、72、120和168小时，将收集一系列血液样品用于药代动力学(PK)。在第14天，在下一次给药之前，将所有动物放血用于PK。将用于PK生物分析的血液(2ml/次)从隐静脉或头静脉抽入合适的管中，该隐静脉或头静脉插入蝶形针用于药效学(PD)测定。将允许所有样品在室温下短暂凝结，然后在4℃下在3500rpm下离心10分钟。将血清转移到预先标记的聚丙烯螺帽小瓶中，并且立即储存于-80℃的冰箱中直至分析。将每周进行食物消耗；口服葡萄糖-香蕉GTT将在第4周进行。
清除---在为期2周的清除期间，将每周进行BW、食物摄取量，并且将在清除期结束时收集血液收集用于生物化学和PK(第42天、第43天和第44天)。将在第6周进行口服葡萄糖-香蕉GTT。
在研究期间将进行临床观察，如动物活动、行为、食欲和腹泻。将记录并且报告任何异常变化。
14.5.血液取样和血清收获
Figure BDA0003549953810000861
表13：PK/PD研究的时间点和血液体积
14.5.1.用于PK和脂联素测定的样品
在给药前立刻和在一系列时间点(给药前、给药后6、24、48、72、120和168小时)，从头静脉或隐静脉将血液样品(2mL/次)收集到BD血清分离器
Figure BDA0003549953810000871
管中。将允许所有样品在室温下凝结最少30分钟，然后在冷藏离心机(4℃)中在3,500rpm下离心10分钟。将血清转移到预先标记的聚丙烯螺帽小瓶中，并且立即储存于-80℃的冰箱中直至分析，如上文所述。
在此样品分析研究(联合制药公司(Alliance Pharma))中，将小鼠抗人FGF21IgG1单克隆抗体(捕获抗体)包被在96孔微孔板上。存在于标准品、质量控制(QC)和测试动物血清测试样品中的分析物(TEV-47948)与板上的捕获抗体结合。TEV-47948进一步与用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗PEG IgM单克隆抗体结合，该辣根过氧化物酶催化发色HRP底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)，从而产生蓝色。然后经由添加含硫酸的终止溶液使蓝色变为黄色，在450nm处产生最大吸光度。450nm处的吸光度减去562nm处的背景读数与校准标准品、QC样品和测试样品中TEV-47948的量成比例。
14.5.2.用于PD和脂联素测定的样品
按照上表13，从头静脉或隐静脉收集血液样品(2.5mL/次)到BD血清分离器
Figure BDA0003549953810000872
管中。将允许所有样品在室温下凝结最少30分钟，然后在冷藏离心机(4℃)中在3，500rpm下离心10分钟。将血清转移到预先标记的聚丙烯螺帽小瓶中，并且立即储存于-80℃的冰箱中直至分析。
将通过使用
Figure BDA0003549953810000873
R2400(西门子公司)系统测量血清化学参数(甘油三酯、HDL、LDL、ALT、葡萄糖)。将通过使用ADVIA
Figure BDA0003549953810000874
R XP免疫测定系统(西门子公司)用化学发光测量血清胰岛素。
对于脂联素，将从每只动物的适当静脉中收集静脉血(1mL/次)到血清收集管中。在冷藏条件下(设置为保持+4℃)，将血液以2400g离心10分钟。将所得的血清分成2个等份试样(第一等分试样200μL；第二等分试样：要标注的大约100μL的剩余体积)，并且将保持在湿冰上，直到转移到单独的管中，并且储存在-80℃下。将2个等分试样保持在-80℃下，直到测定调度(用温度记录仪)。
在此样品分析研究(联合制药公司)中，在测定校准标准品、基质质量控制(mQC)样品和测试动物血清测试样品中的HMW脂联素与微孔板上的小鼠单克隆抗体(MoAb)结合并且固定。洗去任何未结合的物质后，将对HMW脂联素具特异性的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的MoAb添加到与HMW脂联素进一步结合的孔中。HRP缀合的MoAb催化发色HRP底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，从而产生蓝色。添加终止溶液使HRP和TMB反应停止，并且颜色从蓝色变为黄色，在450nm处具有最大吸光度。450nm处的吸光度减去562nm处的背景读数与校准标准品、mQC样品和测试样品中HMW脂联素的量成比例。
14.5.2用于HbA1c测定的样品
按照上表13，从头静脉或隐静脉收集血液样品(1.0mL/次)到BD
Figure BDA0003549953810000881
K2-EDTA管中。将样品立即转移到4℃的冰箱中储存或放置在湿冰上，并且送出用于同一天分析。将通过使用标准测定(例如像可从伯乐公司获得的糖化血红蛋白测试系统)用HPLC测量HbA1c。
14.5.3.用于口服葡萄糖-香蕉GTTA测定的样品
将经由尾静脉穿刺获得一滴血，用于通过血糖仪测量血糖。
14.5.4.用于内源性FGF21的样品
将收集样品用于内源性FGF-21的潜在分析。用于测量FGF-21的测定是可商购获得的，可以使用例如由美国北卡罗来纳州的百奥文德尔公司(BioVendor LLC)销售的抗FGF-21试剂盒(目录号：RD191108200R)根据制造商的方案来进行。
将本文提及的所有出版物都通过引用以其整体特此并入。尽管出于清楚和理解的目的已经比较详细地描述了前述发明，但是本领域技术人员通过阅读本公开内容将理解，可以在不背离本发明的所附权利要求的真实范围的情况下在形式和细节上做出各种变化。
出于说明的目的，本文已经描述了方法和试剂盒的具体实例。这些仅是实例。本文提供的技术可以应用于除上述示例性系统之外的系统。在本发明的实践中，许多改变、修改、添加、省略和置换是可能的。本发明包括对所述的实施方案的改变，这些改变对于技术人员来说将是明显的，包括通过以下获得的改变：用等同的特征、要素和/或动作替代特征、要素和/或动作；将来自不同实施方案的特征、要素和/或动作混合和匹配；将来自如本文所述的实施方案的特征、要素和/或动作与其他技术的特征、要素和/或动作组合；和/或省略组合来自所述的实施方案的特征、要素和/或动作。
以上描述的本发明的实施方案仅旨在是示例性的。本领域技术人员将理解，可以对这些实施方案进行各种细节的修改，所有这些修改都在本发明的范围内。
序列表
<120> 突变型FGF-21肽缀合物及其用途
<130> 730762
<140>
<141>
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 182
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 2
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 2
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
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65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
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<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
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<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 6
Met His Pro Thr Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
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35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
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Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
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Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
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Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
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Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
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Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
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Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 7
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<220>
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<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 23
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Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
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<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
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<400> 24
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<213> 人工的
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<400> 25
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<210> 26
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<213> 人工的
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<400> 26
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Thr
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 27
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 27
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Thr Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 28
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 28
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Thr Tyr Ala Ser
180
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 29
gaggtcatat gcatccaatt ccagattc 28
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 30
attcctcgag ttattaagag gcgtag 26

Claims (28)

1.一种突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，其包含
i)氨基酸序列为SEQ ID NO:2的突变型FGF-21肽，
ii)糖基部分，和
iii)20kDa聚乙二醇(PEG)，
其中所述突变型FGF-21肽通过在SEQ ID NO:2的氨基酸位置173处的苏氨酸和所述糖基部分的第一位点之间的共价键附接至所述糖基部分，并且其中所述糖基部分通过在所述糖基部分的第二位点和所述20kDa PEG之间的共价键附接至所述20kDa PEG。
2.根据权利要求1所述的突变型FGF-21肽缀合物，其中所述糖基部分包含以下中的至少一种：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基、半乳糖(Gal)残基、唾液酸(Sia)残基、Sia残基的5-胺类似物、甘露糖(Man)残基、甘露糖胺、葡萄糖(Glc)残基、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基、岩藻糖残基、木糖残基或其组合。
3.根据权利要求1所述的突变型FGF-21肽缀合物，其中所述糖基部分包含以下中的至少一种：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基、半乳糖(Gal)残基、唾液酸(Sia)或其组合。
4.根据权利要求3所述的突变型FGF-21肽缀合物，其中至少一个Sia残基是九碳羧化糖。
5.根据权利要求4所述的突变型FGF-21肽缀合物，其中所述至少一个Sia残基是N-乙酰基-神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺基-3,5-双脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮吡喃-1-糖酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)、2-酮-3-脱氧-壬酮糖酸(KDN)或9-取代的唾液酸。
6.根据权利要求5所述的突变型FGF-21肽缀合物，其中所述9-取代的唾液酸是9-O-乳酰基-Neu5Ac、9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac或9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。
7.根据权利要求1所述的突变型FGF-21肽缀合物，其中所述糖基部分包含结构-GalNAc-Sia-。
8.根据权利要求1所述的突变型FGF-21肽缀合物，其中所述20kDa PEG部分通过共价键至接头附接至所述糖基部分，其中所述接头包含至少一个氨基酸残基。
9.根据权利要求8所述的突变型FGF-21肽缀合物，其中所述至少一个氨基酸残基是甘氨酸(Gly)。
10.根据权利要求1所述的突变型FGF-21肽缀合物，其包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)。
11.根据权利要求1所述的突变型FGF-21肽缀合物，其包含以下结构：
Figure FDA0003549953800000021
其中n是选自450至460的整数。
12.根据权利要求1所述的突变型FGF-21肽缀合物，其中所述20kDa PEG是线性或支化PEG。
13.根据权利要求1所述的突变型FGF-21肽缀合物，其中所述20kDa PEG是20kDa甲氧基-PEG。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的突变型FGF-21肽缀合物和药学上可接受的运载体。
15.一种产生根据权利要求1至13中任一项所述的突变型FGF-21肽缀合物的方法，其包括以下步骤：
(1)在表达宿主中重组产生所述突变型FGF-21肽；和
(2)将PEG-糖基部分酶促地附接至步骤(1)的所述突变型FGF-21肽，其中所述PEG具有20kDa，从而形成所述突变型FGF-21肽缀合物。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的突变型FGF-21肽缀合物或根据权利要求14所述的药物组合物在制备用于降低有需要的受试者的血糖的药剂中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述有需要的受试者患有包含如下中的至少一种的疾病：2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或代谢综合征。
18.根据权利要求16所述的用途，其中所述受试者是人类受试者。
19.根据权利要求16所述的用途，其中所述突变型FGF-21肽缀合物或所述药物组合物的施用降低了HbA1C水平，其中降低HbA1C水平指示血糖水平随时间持续降低。
20.根据权利要求16所述的用途，其中每周一次或每两周一次施用所述突变型FGF-21肽缀合物。
21.根据权利要求1至13中任一项所述的突变型FGF-21肽缀合物或根据权利要求14所述的药物组合物在制备用于降低有需要的受试者的HbA1C的药剂中的用途。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述有需要的受试者患有包含如下中的至少一种的疾病：2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或代谢综合征。
23.根据权利要求21所述的用途，其中所述受试者是人类受试者。
24.根据权利要求21所述的用途，其中所述突变型FGF-21肽缀合物或所述药物组合物的施用降低了HbA1C水平，其中降低HbA1C水平指示血糖水平随时间持续降低。
25.根据权利要求21所述的用途，其中每周一次或每两周一次施用所述突变型FGF-21肽缀合物。
26.根据权利要求1至13中任一项所述的突变型FGF-21肽缀合物或根据权利要求14所述的药物组合物在制备用于治疗有需要的受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或代谢综合征的药剂中的用途。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述受试者是人类受试者。
28.根据权利要求26所述的用途，其中每周一次或每两周一次施用所述突变型FGF-21肽缀合物。
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