CN117120070A - 包含突变型fgf-21肽peg化缀合物的液体制剂 - Google Patents

包含突变型fgf-21肽peg化缀合物的液体制剂 Download PDF

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CN117120070A
CN117120070A CN202280027650.8A CN202280027650A CN117120070A CN 117120070 A CN117120070 A CN 117120070A CN 202280027650 A CN202280027650 A CN 202280027650A CN 117120070 A CN117120070 A CN 117120070A
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B·希瓦茨布德
S·约瑟夫
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89 Biological Co
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89 Biological Co
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Abstract

公开文本涉及包含突变型成纤维细胞生长因子‑21(FGF‑21)肽缀合物的液体药物组合物以及包含含有突变型成纤维细胞生长因子‑21(FGF‑21)肽缀合物的液体药物组合物的预装填注射器或自动注射器。

Description

包含突变型FGF-21肽PEG化缀合物的液体制剂
相关申请
本申请要求2021年3月11日提交的美国临时申请第63/159,717号和2021年3月29日提交的美国临时申请第63/167,148号的权益和优先权，其各自的公开内容全文以引用方式并入本文。
序列表
本申请包括于此提交的序列表，该序列表包括具有以下大小43,360字节的文件180234-011502PCT_ST25.txt，该文件是在2022年3月3日创建的，其内容特此通过引用并入本文。
技术领域
公开文本涉及包含重组成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽PEG化缀合物的药物液体制剂以及包含液体药物组合物的预装填注射器或自动注射器，该液体药物组合物包含突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物。
背景技术
FGF-21是作为单体非糖基化蛋白自然发现的内分泌激素。与FGF-19和FGF-23一起，FGF-21属于内分泌作用亚家族，而剩余的18个哺乳动物FGF配体被分组为五个旁分泌作用亚家族。与旁分泌作用FGF相比，内分泌作用FGF对硫酸肝素仅表现出低亲和力，因此能够进入血液循环。因此，内分泌FGF能够调节代谢过程，诸如胆汁酸内稳态、肝葡萄糖和蛋白质代谢(FGF-19)、葡萄糖和脂质代谢(FGF-21)以及维生素D和磷酸盐内稳态(FGF-23)。
发明内容
公开文本的方面涉及包含液体药物组合物的预装填注射器或自动注射器，该液体药物组合物包含：(a)10mg/ml至48mg/ml的突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，该突变型成纤维细胞生长因子-21肽缀合物包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的突变型FGF-21肽、糖基部分和20kDa聚乙二醇(PEG)，其中，突变型FGF-21肽通过SEQ ID NO:2的氨基酸位置173处的苏氨酸与糖基部分的第一位点之间的共价键附接至糖基部分，并且其中，糖基部分通过糖基部分的第二位点与20kDa PEG之间的共价键附接至20kDa PEG；(b)150mM至500mM的精氨酸；(c)0.01％至0.1％(w/v)的聚山梨酯80(PS-80)或聚山梨酯20(PS-20)；(d)5至25mM缓冲液，pH 7-8；和(e)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，预装填注射器或自动注射器中的液体药物组合物包含约28mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约260mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中，pH为约7.1。在一些实施方案中，预装填注射器或自动注射器中的液体药物组合物包含约20mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约150mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中，pH为约7.5。在一些实施方案中，预装填注射器或自动注射器中的液体药物组合物包含约36mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约200mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中，pH为约7.1。在一些实施方案中，预装填注射器或自动注射器中的液体药物组合物包含约44mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约200mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中，pH为约7.1。在一些实施方案中，预装填注射器或自动注射器中的液体药物组合物包含约44mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约230mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中，pH为约7.1。
公开文本的方面涉及液体药物组合物，包含：(a)10mg/ml至48mg/ml的突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，该突变型成纤维细胞生长因子-21肽缀合物包含突变型FGF-21肽，该突变型FGF-21肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、糖基部分和20kDa聚乙二醇(PEG)，其中，突变型FGF-21肽通过SEQ ID NO:2的氨基酸位置173处的苏氨酸与糖基部分的第一位点之间的共价键附接至糖基部分，并且其中，糖基部分通过糖基部分的第二位点与20kDa PEG之间的共价键附接至20kDa PEG；(b)150mM至500mM的精氨酸；(c)0.01％至0.1％(w/v)的聚山梨酯80(PS-80)或聚山梨酯20(PS-20)；(d)5至25mM的缓冲液，pH 7-8；和(e)药学上可接受的载体。
公开文本的其他方面涉及液体药物组合物，包含：(a)10mg/ml至48mg/ml的突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，该突变型成纤维细胞生长因子-21肽缀合物包含突变型FGF-21肽，该突变型FGF-21肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、糖基部分和20kDa聚乙二醇(PEG)，其中，突变型FGF-21肽通过SEQ ID NO:2的氨基酸位置173处的苏氨酸与糖基部分的第一位点之间的共价键附接至糖基部分，并且其中，糖基部分通过糖基部分的第二位点与20kDa PEG之间的共价键附接至20kDa PEG；(b)150mM至500mM的精氨酸、50mM至250mM的丙氨酸、50mM至250mM的脯氨酸、50mM至250mM的甘氨酸、50mM至250mM的MgCl2、1至5％(v/v)的甘油、1至5％(v/v)的PEG 400或其组合；(c)0.01％至0.1％(w/v)的聚山梨酯80(PS-80)或聚山梨酯20(PS-20)；(d)pH 7-8的缓冲液；和(e)药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，液体制剂还包含表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵、葡萄糖酸钠或其组合。在一些实施方案中，液体制剂包含0.05％至0.1％(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵、0.05％至0.1％(w/v)的葡萄糖酸钠或其组合。
在一些实施方案中，缓冲液是Tris或磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，液体制剂包含20mM的Tris缓冲液。在一些实施方案中，液体制剂的pH为7.0至7.5。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含20至44mg/ml的突变型FGF-21肽缀合物。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含150mM至275mM的精氨酸。在一些实施方案中，液体药物组合物中的精氨酸包含精氨酸HCl、精氨酸硫酸盐或其组合。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物与精氨酸的重量比为0.6至0.9。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物与精氨酸的摩尔比为约0.006至约0.009。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含约28mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约260mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中，pH为约7.1。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含约20mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约150mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中，pH为约7.5。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含约36mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约200mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中，pH为约7.1。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含约44mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约200mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中，pH为约7.1。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含约44mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约230mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中，pH为约7.1。
在一些实施方案中，液体制剂具有约250mOsmol/kg至约550mOsmol/kg的重量渗透摩尔浓度(osmolality)。
在一些实施方案中，液体药物组合物在2℃至8℃范围内的温度下稳定长达12个月。在一些实施方案中，液体药物组合物在室温下稳定至少3个月。
在一些实施方案中，提供了包含液体药物组合物的容器。在一些实施方案中，容器是预装填注射器、小瓶或自动注射器。在一些实施方案中，提供了套装，该套装包括容器以及用于施用和使用液体药物组合物的标签或说明书。
附图说明
在已公开的益处和改进中，本发明的其他目的和优点将从以下结合附图的描述中变得显而易见。本文公开了本发明的详细实施方案；然而，应该理解，所公开的实施方案仅仅是对本发明的说明，可以以各种形式实施本发明。另外，结合本发明的各个实施方案给出的每个示例旨在是说明性的，而不是限制性的。
图1示出了本发明的具体实施方案的结构，即包含FGF-21(Thr)-GalNAc-Sia-Gly-PEG的示例性结构的突变型FGF-21肽缀合物的结构。选择n以给出所希望的PEG分子量。关于20kDa PEG，n在选自450至460的范围内。
图2示出了根据一些实施方案的非限制性示例性细胞扩增、生产和收获工艺流程图。
图3示出了根据一些实施方案的非限制性示例性重折叠和突变型FGF-21肽纯化工艺流程图。
图4示出了根据一些实施方案的非限制性示例性GlycoPEG化和最终纯化工艺流程图。
图5示出了根据一些实施方案的缓冲液类型的平均Z均直径(nm)结果。
图6示出了根据一些实施方案的缓冲液的平均多分散指数(PDI)结果。
图7示出了对于20mM的Tris、150mM的pH 8.0的精氨酸HC1获得的三种样品迹线的重叠，表明了根据一些实施方案的可接受的多分散性。
图8示出了根据一些实施方案的用于溶解度筛选的百分比单体PEG化DS。
图9示出了根据一些实施方案的用于溶解度筛选的百分比二聚体PEG化DS。
图10示出了根据一些实施方案的用于溶解度筛选的百分比总聚集体PEG化DS。
图11示出了对于20mM的Tris，150mM的pH 8.0的精氨酸HC1获得的三个样品迹线的重叠，其中线指示根据一些实施方案的每个一式三份的读数的Tm。
图12示出了根据一些实施方案的差分扫描荧光测定法(DSF)TO的3D表面图。
图13示出了根据一些实施方案的动态光散射(DLS)2W/5℃总体PDI。
图14A示出了根据一些实施方案通过尺寸排阻色谱法(SEC)在2W/5℃下的低分子量(LMW)。
图14B示出了根据一些实施方案通过SEC在2W/25℃下的LMW。
图15示出了根据一些实施方案的3D表面图-5℃的主峰百分比(MP)成像的毛细管等电聚焦(icIEF)。
图16示出了根据一些实施方案的SEC％MP 2W/25℃的3D表面。
图17示出了根据一些实施方案的SDS-PAGE还原凝胶-12M稳定性(TO)。
图18示出了根据一些实施方案的SDS-PAGE非还原凝胶-12M稳定性(T0)。
图19示出了根据一些实施方案的SDS-PAGE还原凝胶-12M稳定性(T12M)。
图20示出了根据一些实施方案的SDS-PAGE非还原凝胶-12M稳定性(T12M)。
图21示出了根据一些实施方案的精氨酸HCl对二聚化的影响。
图22A-图22C示出了根据一些实施方案来自DOE研究的用于优化PEG-FGF21制剂的响应表面图。
具体实施方式
在已公开的那些益处和改善中，根据以下描述并结合附图，公开文本的其它目标和优势将变得显而易见。本文公开了公开文本的详细实施方案；然而，应理解所公开的实施方案仅是对可以以多种形式体现的公开文本的说明。另外，对于旨在是说明性而非限制性的公开文本的多种实施方案，提供了每个实施例。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语采用本文明确关联的含义，除非上下文另有明确规定。本文使用的短语“在一个实施方案中”、“在实施方案中”和“在一些实施方案中”不一定指相同的实施方案，尽管可能指相同的实施方案。此外，本文使用的短语“在另一实施方案中”和“在一些其他实施方案中”不必指不同的实施方案，尽管可能指不同的实施方案。在不背离公开文本的范围或精神的情况下，公开文本的所有实施方案旨在是可组合的。
如本文所使用的，术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一种”、“一个”和“该”的含义包括复数引用。“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。
如本文所使用的，术语诸如“包含”、“包括”和“具有”不将具体权利要求的范围限制于权利要求所列举的材料或步骤。
如本文所使用的，术语“基本由……组成”将具体权利要求的范围限制在所指明的材料或步骤以及不实质影响具体权利要求的一项或多项基本和新特征的那些。
如本文所使用的，术语诸如“由……组成”和“由……构成”将具体权利要求的范围限制于该权利要求所列举的材料和步骤。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文或下文，均以引用方式全文并入本文。
定义
为了清楚和可读性，提供以下定义。对于这些定义提及的任何技术特征可以在本发明的每个和所有实施方案中阅读。附加的定义和解释可以在这些实施方案的上下文中具体地提供。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义通常与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本文使用的术语和细胞培养、分子遗传学、有机化学以及核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域熟知且常用的那些。使用标准技术用于核酸和肽合成。所述技术和方法通常根据本领域的常规方法和各种通用参考文献(例如Sambrook等人，1989，分子克隆实验指南，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)进行，其在本文件中提供。
酶：酶是进行生物化学反应，诸如糖基部分或改性的糖基部分从相应的糖基供体转移至FGF-21的氨基酸或转移至连接至肽的另一个糖基部分的催化活性生物分子。
蛋白质：蛋白质通常包含一种或多种肽或多肽。通常将蛋白质折叠成三维形式，这对于蛋白质发挥其生物学功能可能是需要的。蛋白质或肽的序列通常理解为以下顺序，即其氨基酸的连续序列。
重组蛋白：术语“重组蛋白”是指在异源系统中，即在非自然产生这样的蛋白质的生物体中，产生的蛋白或这样的蛋白的变体，即，蛋白或肽是“重组产生的”。典型地，本领域中用于产生重组蛋白的异源系统是细菌(例如大肠杆菌)、酵母(例如酿酒酵母)或某些哺乳动物细胞培养系。
表达宿主：表达宿主表示用于重组蛋白生产的生物体。通常的表达宿主是细菌诸如大肠杆菌，酵母诸如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母，或哺乳动物细胞诸如人类细胞。RNA，mRNA：RNA是核糖核酸的常见缩写。它是核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是腺苷-单磷酸、尿苷-单磷酸、鸟苷-单磷酸以及胞苷-单磷酸单体，这些单体沿着所谓的主链彼此连接。主链由第一相邻单体的糖(即核糖)和第二相邻单体的磷酸酯部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定连续序列称为RNA序列。
DNA：DNA是脱氧核糖核酸的常见缩写。它是核酸分子，即由核苷酸单体组成的聚合物。这些核苷酸通常是脱氧-腺苷-单磷酸、脱氧-胸苷-单磷酸、脱氧-鸟苷-单磷酸以及脱氧-胞苷-单磷酸单体，这些单体本身由糖部分(脱氧核糖)、碱基部分以及磷酸酯部分构成并且由特征性主链结构聚合。主链结构通常由核苷酸的糖部分，即第一相邻单体的脱氧核糖，和第二相邻单体的磷酸酯部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定顺序，即连接至糖/磷酸酯主链的碱基的顺序，称为DNA序列。DNA可以是单链或双链的。在双链形式中，第一链的核苷酸通常与第二链的核苷酸杂交，例如通过A/T碱基配对和G/C碱基配对。
核酸分子的序列/核酸序列：核酸分子的序列通常理解为特定和单独的顺序，即其核苷酸的连续序列。
氨基酸分子的序列/氨基酸序列：蛋白或肽的序列通常理解为按以下顺序，即其氨基酸的连续序列。
序列一致性：如果两个或更多个序列表现出相同的核苷酸或氨基酸的长度和顺序，则它们是相同的。一致性百分比通常描述两个序列相同的程度，即其典型地描述了在其序列位置中对应于参考序列(诸如天然或野生型序列)的相同核苷酸的核苷酸的百分比。为了测定一致性程度，认为待比较的序列表现出相同的长度，即待比较的序列中的最长序列的长度。这意味着由8个核苷酸/氨基酸组成的第一序列与由包含该第一序列的10个核苷酸/氨基酸组成的第二序列80％一致。换言之，在公开文本的上下文中，序列的一致性具体涉及在具有相同长度的两个或更多个序列中具有相同位置的序列的核苷酸/氨基酸的百分比。间隙通常被认为是不相同的位置，而不管它们在对准中的实际位置。
新引入的氨基酸：“新引入的氨基酸”表示与天然/野生型氨基酸序列相比新引入到氨基酸序列中的氨基酸。通常通过诱变，改变天然氨基酸序列，以便在氨基酸序列内的所需位置具有某些氨基酸侧链。在公开文本中，特别地，将氨基酸苏氨酸新引入邻近脯氨酸残基的C端侧上的氨基酸序列中。
官能团：该术语根据本领域技术人员的一般理解来理解，并且表示存在于分子上，特别是在肽或肽的氨基酸或连接至肽的糖基残基上，并且可以参与与另一个化学分子的共价或非共价键的化学部分(即，其允许例如糖基残基或PEG的连接)。
天然氨基酸序列：该术语根据本领域技术人员的一般理解来理解，并且表示氨基酸序列以其在自然界中出现的形式而没有任何突变或人工氨基酸修改。它还称为“野生型序列”。“天然FGF-21”或“野生型FGF-21”表示具有如其天然发生的氨基酸序列的FGF-21，诸如SEQ ID NO:1中所描绘的人FGF-21的(未突变的)氨基酸序列。N端甲硫氨酸的存在或不存在(取决于所使用的表达宿主)通常不改变被认为具有其自然或天然/野生型序列的蛋白质的状态。
突变：该术语根据本领域技术人员的一般理解来理解。如果与其自然或天然氨基酸序列相比，氨基酸序列在其氨基酸序列中包含至少一个另外的、缺失的或交换的氨基酸，即如果氨基酸序列包含氨基酸突变，则氨基酸序列被称为“突变的”。突变的蛋白质也称为突变体。在公开文本中，突变的FGF-21肽特别是具有与脯氨酸残基的C端侧上的脯氨酸残基相邻的氨基酸交换的肽。由此，将用于O-连接糖基化的共有序列引入FGF-21中，使得突变型FGF-21肽包含新引入的O-连接糖基化侧。氨基酸交换通常表示如下：S172T，这意味着在位置172处(诸如在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中)的氨基酸丝氨酸被氨基酸苏氨酸交换。
药物有效量：在公开文本的上下文中的药物有效量通常理解为足以诱导药物效果的量。
疗法/治疗：术语“疗法”是指疾病或病症的“处理”或“治疗”，抑制该疾病(减缓或阻止其发展)，缓解该疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)，以及减轻该疾病(引起该疾病的消退)。
治疗有效量：是足以治疗疾病或病症、抑制疾病或病症、缓解疾病的症状或副作用和/或引起疾病或病症消退的化合物的量。
半衰期：如本文在施用突变型FGF-21肽和/或其缀合物的背景下使用的术语“半衰期”定义为药物(即突变型FGF-21肽和/或缀合物)的血浆浓度在受试者中减半所需的时间。
O-连接的糖基化：“O-连接的糖基化”发生在丝氨酸或苏氨酸残基处(Tanner等人，生化与生物物理学报，906:81-91(1987)；和Hounsell等人，糖复合物杂志，13:19-26(1996))。在公开文本中，O-连接的糖基化位点(其是被糖基转移酶识别为糖基残基的连接点的肽的氨基酸序列中的氨基酸基序)包括不存在于天然/野生型氨基酸序列中的氨基酸基序脯氨酸-苏氨酸(PT)。特别地，苏氨酸残基被新引入脯氨酸附近和在脯氨酸残基的C端侧上。然后通过糖基转移酶将糖基部分连接至苏氨酸残基的-OH基团。
新引入的O-连接的糖基化侧：“新引入的O-连接的糖基化侧”表示O-连接的糖基化侧，其在引入如本文描述的脯氨酸残基的C端侧附近和其上的苏氨酸之前，不存在于天然或野生型FGF-21中。
邻近：邻近表示氨基酸序列中紧邻另一个氨基酸的氨基酸，在相应的氨基酸的N端侧上或在C端侧上。在公开文本中，例如，新引入的苏氨酸残基与脯氨酸残基的C端侧上的脯氨酸残基相邻。
糖基部分：糖基部分是由一个或多个相同或不同的糖基残基组成的部分，其将突变型FGF-21肽连接至聚乙二醇(PEG)，从而形成包含肽、糖基部分和PEG的缀合物。糖基部分可以是单、二、三或寡糖基部分。糖基部分可以包括一个或多个唾液酸残基、一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基、一个或多个半乳糖(Gal)残基等。糖基部分可以被改性，诸如被PEG或甲氧基-PEG(m-PEG)，PEG的烷基衍生物改性。
糖缀合：如本文使用的“糖缀合”是指PEG改性的糖基部分与(多)肽，例如公开文本的突变型FGF-21，的氨基酸或糖基残基的酶促介导的缀合。“糖缀合”的亚属是“糖基-PEG化”，其中改性的糖基部分的改性基团是PEG或m-PEG。PEG可以是直链或支链的。通常，支链PEG具有中心支链核心部分和连接至中心支链核心的多个直链聚合物链。PEG通常以支链形式使用，这些支链形式可以通过将环氧乙烷加成至不同的多元醇(诸如甘油、季戊四醇和山梨糖醇)来制备。中心支链部分还可以衍生自多种氨基酸，诸如赖氨酸。支链PEG可以表示为常见形式R(-PEG-OX)m，其中R表示核心部分诸如甘油或季戊四醇，X表示封端基团或端基，以及m表示臂的数目。术语“糖-PEG”和“糖基-PEG”可互换地使用，并且表示由PEG或甲氧基-PEG(mPEG或m-PEG)、一个或多个糖基残基(或糖基部分)以及任选地在PEG/甲氧基-PEG与糖基部分之间的接头(诸如氨基酸，例如甘氨酸)组成的化学部分。糖基-PEG/糖-PEG部分的实施例是PEG-唾液酸(PEG-Sia)。应注意，术语“糖-PEG”和“糖基-PEG”以及“PEG-唾液酸”和“PEG-Sia”连同用于糖-PEG部分的类似术语可以包括或可以不包括PEG与一个或多个糖基部分之间的接头，即“PEG-唾液酸”涵盖例如PEG-唾液酸以及PEG-Gly唾液酸以及mPEG-Gly-唾液酸。
序列基序：序列基序表示短氨基酸序列，诸如包含仅两个氨基酸的短氨基酸序列，其存在于较长氨基酸序列，诸如人FGF-21的氨基酸序列中的任何可能位置。序列基序例如表示为P172T，这意味着在位置172的脯氨酸在C端紧接着是苏氨酸残基。
唾液酸：术语“唾液酸”或“Sia”是指九碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙酰基-神经氨酸(2-酮基-5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳吡喃壬酮糖(galactononulopyranos)-l-酮酸(通常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。该家族的第二成员是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基被羟基化。第三唾液酸家族成员是2-酮基-3-脱氧-壬酮糖酸(nonulosonic acid)(KDN)(Nadano等人.(1986)生物化学杂志.261:11550-11557).还包括9-取代的唾液酸，诸如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac，如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。关于唾液酸家族的综述，参见例如Varki，糖生物学，2：25-40(1992))。
药学上可接受的赋形剂：“药学上可接受的”赋形剂包括当与公开文本的突变型FGF-21肽缀合物组合时保留缀合物的活性并且与受试者的免疫系统不反应的任何材料。实施例包括但不限于任何标准的药物赋形剂诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、Tris缓冲溶液、水、盐、乳液诸如油/水乳液和各种类型的润湿剂。
药物容器：“药物容器”是适合于携带液体药物组合物并且通常由惰性材料制成并且无菌的容器。
施用：术语“施用”是指口服施用、吸入、作为栓剂施用、局部接触、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鼻内或皮下施用，或将缓释装置(例如迷你渗透泵)植入受试者。施用是通过任何途径，包括肠胃外和经粘膜(例如口、鼻、阴道、直肠或经皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其他递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等。在一些实施方案中，施用是皮下注射。
糖尿病和糖尿病相关疾病：“糖尿病(diabetes)”是一种众所周知的并且良好表征的疾病，通常被称为糖尿病(diabetes mellitus)。该术语描述其中人具有高血糖水平(血糖)的一组代谢性疾病，这是因为胰岛素产生不充分，或因为身体的细胞对胰岛素反应不当，或两者。患有高血糖的患者将通常经历多尿(频繁排尿)，他们将变得越来越口渴(多饮)和饥饿(多食)。“糖尿病相关疾病”是特征为相同症状(诸如肥胖症、多尿症、多饮和多食)的疾病。
2型糖尿病：“2型糖尿病”是糖尿病(diabetes)/糖尿病(diabetes mellitus)的最常见形式。2型糖尿病最常见地在成年期发展，并且更可能发生在超重并且身体不活跃的人中。与目前不能预防的1型糖尿病不同，可以改善2型糖尿病的许多风险因素。国际糖尿病基金会列出了四种症状，它们标志着需要糖尿病测试：a)频繁排尿，b)体重减轻，c)缺乏能量和d)过度口渴。胰岛素抵抗通常是2型糖尿病(其中葡萄糖进入细胞需要比通常更多的胰岛素的病症)的前兆。肝脏中的胰岛素抵抗导致更多的葡萄糖产生，而外周组织中的抵抗意味着葡萄糖摄取受损。
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)：其中脂肪沉积在肝脏中，具有后续肝损害和炎症的一种病症。
代谢综合征：定义的与2型糖尿病和心血管疾病的发展相关的风险因子(生物化学和生理学变化)群。
如本文所使用的，“约”和“大约”通常是指在给定测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受误差程度。示例性误差程度在给定值范围的20百分比(％)内，通常在10％内，更通常在5％内。术语“基本上”是指大于50％、大于80％、或大于90％或95％。
FGF-21肽缀合物
重组FGF-21已经显示在一定范围的胰岛素抵抗动物模型中影响血浆葡萄糖和胰岛素水平，降低肝脏和循环甘油三酯和胆固醇水平，并且改进胰岛素敏感性、能量消耗、肝脏脂肪变性和肥胖症。出于这个原因，FGF-21是用于治疗人类2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和相关代谢疾病的令人感兴趣的靶标。
自然FGF-21在体内具有相对短的半衰期，报道的在啮齿类动物和非人灵长类动物中的循环半衰期范围为0.5至4小时，这限制了其临床适用性。重组人FGF-21的半衰期是1-2小时。为了改善FGF-21的药代动力学性能，已经开发了各种半衰期延长策略。
本文使用的缩写包括：PEG，聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；Ara、阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡糖基；GlcNAc，N-乙酰葡糖胺基；Man，甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖胺；Xyl，木糖基；NeuAc，唾液酸基或N-乙酰神经氨酰；Sia，唾液酸基或N-乙酰神经氨酰；及其衍生物和类似物。
PEG化
延长蛋白质的半衰期的一种方法是将一个或多个PEG部分连接至蛋白质，这种连接通常增加蛋白质的生物物理溶解度和稳定性。已经证明这种方法对于增加具有适合于治疗对其有需要的受试者的性能的蛋白质的治疗半衰期具有特别的价值。然而，天然FGF-21缺乏特异性蛋白质PEG化位点。缺乏特异性蛋白质PEG化位点的化学PEG化不是位点特异性的，并且通常导致产生不均匀的产物群体，该群体需要大量纯化以实现均匀且高纯度的产物-药物组合物的市场批准的先决条件。因此，FGF-21的位点特异性PEG化对于产生具有改善的半衰期和良好的生物活性的位点特异性PEG化的FGF-21肽是合乎需要的。
基于酶的合成具有区域选择性和立体选择性的优点。此外，可以用未受保护的底物进行酶合成。将PEG残基位点特异性地连接至蛋白质的一种可能的方法是糖基PEG化。在糖基PEG化中，可以使用糖基转移酶将PEG部分转移至连接至蛋白质或肽的氨基酸的氨基酸或糖基残基。通常的最终结构是蛋白质-糖基部分-可选的另外的接头-PEG。更具体的最终结构是蛋白质-蛋白质的(N-、C-或内部)氨基酸-一个或多个糖基残基-可选的接头(例如氨基酸接头)-具有不同长度的直链或支链PEG部分，其中糖基部分可包含一个或多个糖基残基。包含将蛋白质连接至PEG部分的结构的至少一部分的一个或多个糖基残基可以是任何可能的糖基残基。用于使蛋白质糖PEG化的多种方法在本领域中是已知的并且在下文详细描述。
在蛋白PEG化中，缀合的PEG部分越大，PEG缀合的蛋白质的预期半衰期越长。这是由于较大PEG部分保护缀合的蛋白质免受存在于血流中的蛋白酶的影响的能力相对增强。与较小的PEG部分相比，较大的PEG部分赋予PEG缀合的蛋白质较大的有效半径。较大的蛋白质也比较小的蛋白质更缓慢地降解到血流中和从血流中去除，因为它们更缓慢地进入肾脏或被完全阻止进入肾脏。因此，技术人员青睐PEG化方法，其要求将较高分子量(例如，≥30kDa PEG)的较长PEG残基、总计较高数目的PEG残基和/或更高度支链的PEG残基连接至蛋白质，以产生相对于与较短/较小PEG部分缀合的相同蛋白质而言具有优越性能的PEG化蛋白质。
然而，与PEG化相关的显著缺点是空间位阻的效力，由此缀合的PEG部分物理地阻断蛋白质的活性位点，该活性位点对于蛋白质活性是重要的或必需的。例如，PEG部分可以特异性阻断蛋白质对其受体的受体结合位点，这进而导致蛋白质活性的显著和有害损失。为了避免PEG化的此类潜在抑制作用，本领域的普通技术人员避免将PEG连接在涉及受体结合的氨基酸附近。对于FGF-21，C端对于β-克洛索(Klotho)结合是关键的，以及N端对于FGFR激活是重要的。此外，基于其他FGF-21家族蛋白的晶体结构的FGF-21的计算机模拟(insilico modeling)和体外效力测定证明了位于推定的受体结合结构域中的氨基酸残基的PEG化是无活性的，而远端位点处的PEG化产生最具活性的类似物。此外，当PEG部分被放置在FGF-21中的位置180时，在基于细胞的效力测定中观察到效力的大于100倍的损失。还评估了FGF-21与抗体的Fc部分的融合，在FGF-21的C端的融合比在N端的融合产生弱得多的类似物。相反，N端PEG化的FGF-21已经生成并显示是生物活性的。因此，基于本领域的知识，鉴于蛋白质的该区域在结合和信号传导中发挥的作用，技术人员将避免靠近FGF-21的C端的PEG化。
提供了多种突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物的产生，各自包含：
i)突变型FGF-21肽，其包含与所述至少一个脯氨酸残基的C端侧上的至少一个脯氨酸(P)残基相邻的至少一个苏氨酸(T)残基，从而形成不存在于相应的天然FGF-21中的至少一个O-连接的糖基化位点，其中相应的天然FGF-21具有与SEQ ID NO:1至少95％一致的氨基酸序列，和
ii)20kDa聚乙二醇(PEG)，其中所述20kDa PEG经由至少一个糖基部分在所述至少一个苏氨酸残基处共价连接至所述突变型FGF-21肽。
在一个具体实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含含氨基酸序列PT的突变型FGF-21肽。在一个具体实施方案中，突变型FGF-21肽包含选自由以下各项组成的组的至少一个氨基酸序列：P172T、P156T、P5T、P3T、P9T、P50T、P61T、P79T、P91T、P116T、P129T、P131T、P134T、P139T、P141T、P144T、P145T、P148T、P150T、P151T、P158T、P159T、P166T、P178T及其组合，其中脯氨酸和苏氨酸的位置是基于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含至少一个选自由P172T、P156T、P5T及其组合组成的组的氨基酸序列，具体地由P172T、P156T及其组合组成的组，其中脯氨酸和苏氨酸的位置是基于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在仍更具体的实施方案中，脯氨酸残基位于突变型FGF-21肽的氨基酸145和C端之间，其中氨基酸145的位置是基于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含氨基酸序列P172T，其中，脯氨酸和苏氨酸的位置是基于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变S173T和R176A，其中氨基酸S和R的位置是基于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，特别是突变型FGF-21肽包含SEQID NO:2中所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变Q157T，其中氨基酸Q的位置是基于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，特别是突变型FGF-21肽包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变D6T，其中氨基酸D的位置是基于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，特别是突变型FGF-21肽包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。
在其他具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含选自由SEQ ID NO:2至28组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽包含选自由SEQ ID NO:2至5组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽包含选自由SEQ ID NO:2至4组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在其他具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含至少一个糖基部分，其包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖(Gal)和/或唾液酸(Sia)。在其一个具体的实施方案中，至少一个糖基部分包括结构-GalNAc-Sia-。
在其他具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含20kDa PEG部分，其经由氨基酸残基，特别是甘氨酸(Gly)连接至至少一个糖基部分。在一个更加具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)。仍然更具体地，突变型FGF-21肽缀合物包含以下结构：
其中，n是选自450至460的整数。
在其他具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含20kDa PEG，其为直链或支链PEG，特别是直链PEG。仍更具体地，20kDa PEG是20kDa甲氧基-PEG(参见美国专利号10,407,479，通过引用以其全文结合在此)。
液体药物组合物
本文涵盖了包含至少一种突变型FGF-21肽缀合物和药学上可接受的载体的液体药物组合物。
在一些实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物以0.1mg/mL至50mg/mL范围内的浓度存在。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物以10mg/mL至48mg/mL范围内的浓度存在。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物以26±4mg/mL的浓度存在。例如，FGF-21肽缀合物以约22、26、28、30、32、36mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物以36±6mg/mL存在。例如，FGF-21肽缀合物以约30、32、34、36、38、40、42mg/mL的浓度存在。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含10-48mg/ml的FGF-21肽缀合物，例如18mg/ml、20mg/ml、28mg/ml、36mg/ml、42mg/ml、48mg/ml。
公开文本的方面涉及液体药物组合物，其包含约10mg/ml至约48mg/ml的突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物、约150mM至约500mM的精氨酸；约0.01％至约0.1％(w/v)的聚山梨酯80(PS-80)或聚山梨酯20(PS-20)；约20mM的缓冲液，pH 7-8；和药学上可接受的载体，或由其构成。在一些实施方案中，制剂具有在约250mOsmol/kg和约510mOsmol/kg之间的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，液体制剂包含以下各项或由其组成：10mg/ml至48mg/ml的突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，该突变型成纤维细胞生长因子-21肽缀合物包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的突变型FGF-21肽、糖基部分以及20kDa聚乙二醇(PEG)，其中突变型FGF-21肽通过SEQ ID NO:2的氨基酸位置173处的苏氨酸与糖基部分的第一位点之间的共价键附接至糖基部分，并且其中糖基部分通过糖基部分的第二位点与20kDa PEG之间的共价键附接至20kDa PEG；150mM至500mM精氨酸；0.01％至0.1％(w/v)的聚山梨酯80(PS-80)或聚山梨酯20(PS-20)；20mM的缓冲液，pH7-8；和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，制剂具有在约250mOsmol/kg和约550mOsmol/kg之间的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，液体药物组合物包含以下各项或由其组成：约10mg/ml至约48mg/ml的突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，该突变型成纤维细胞生长因子-21肽缀合物包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的突变型FGF-21肽、糖基部分和20kDa聚乙二醇(PEG)，其中突变型FGF-21肽通过SEQ ID NO:2的氨基酸位置173处的苏氨酸与糖基部分的第一位点之间的共价键附接至糖基部分，并且其中糖基部分通过糖基部分的第二位点与20kDa PEG之间的共价键附接至20kDa PEG；约150mM至约500mM的精氨酸、约50mM至约250mM的丙氨酸、约50mM至约250mM的脯氨酸、约50mM至约250mM的甘氨酸、约50mM至约250mM的MgCl2、约1％至约5％(v/v)的甘油、约1％至5％(v/v)的PEG 400或其组合；约0.01％至约0.1％(w/v)的聚山梨酯80(PS-80)或聚山梨酯20(PS-20)；约20mM的缓冲液，pH 7-8；和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，突变型FGF-21与精氨酸的重量比为约0.6至约0.7、约0.6至约0.8、约0.6至约0.9、约0.6至约1，例如约0.6、0.7、0.8、0.9、0.1。在一些实施方案中，突变型FGF-21与精氨酸的摩尔比是约0.006至约0.008、0.006至约0.009、0.006至约0.010、约0.007至约0.008、约0.007至约0.009、约0.007至约0.010，例如约0.006、0.007、0.008、0.009。
在一些实施方案中，液体制剂具有约250mOsmol/kg至约550mOsmol/kg的重量渗透摩尔浓度。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含在20mM的Tris中的20mg/mL的PEG-FGF21、150mM的精氨酸、0.02％(w/v)的PS-80(pH 7.5)。在一些实施方案中，液体药物制剂包含在20mM磷酸盐中的20mg/mL的PEG-FGF21、150mM的精氨酸、0.02％(w/v)的PS-80(pH7.5)。在一些实施方案中，组合物具有在约250mOsm/kg至约380mOsm/kg之间的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，组合物具有约300mOsm/kg的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，液体药物组合物包含在20mM Tris中的28mg/mL的PEG-FGF21、275mM的精氨酸、0.02％(w/v)的PS-80(pH 7-8)。在一些实施方案中，该组合物具有约505mOsm/kg的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，液体药物制剂包含在20mM的Tris中的18-44mg/mL的PEG-FGF21、200-350mM的精氨酸、0.02％(w/v)的PS-80(pH 7.0-pH7.5)。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约20mg/mL的PEG-FGF21、约150mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，其中pH为约7.5，并且具有约300mOsm/kg的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约28mg/mL的PEG-FGF21、约260mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、约0.02％(w/v)的PS80，其中pH为约7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约28mg/mL的PEG-FGF21、约260mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、约0.02％(w/v)的PS80，其中pH为约7.1，并且具有约505mOsm/kg的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约36mg/mL的PEG-FGF21、约270mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、约0.02％(w/v)的PS80，其中pH为约7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约36mg/mL的PEG-FGF21、约270mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、约0.02％(w/v)的PS80，其中pH为约7.1，并且具有约530mOsm/kg的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，液体药物组合物包含36mg/mL的PEG-FGF21、200mM的精氨酸HCl、20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS80，其中pH为约7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含36mg/mL的PEG-FGF21、200mM的精氨酸HCl、20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS80，其中pH为约7.1，并且具有约421mOsm/kg的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约42mg/mL的PEG-FGF21、约270mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、约0.02％(w/v)的PS80，其中pH为约7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约42mg/mL的PEG-FGF21、约270mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、约0.02％(w/v)的PS80，其中pH为约7.1，并且具有约528mOsm/kg的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，液体药物组合物包含44mg/mL的突变型FGF21、200mM的精氨酸HCl、20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS80，其中pH为7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含44mg/mL的PEG-FGF21、200mM的精氨酸HCl、20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS80，其中pH为7.1，并且具有约455mOsm/kg的重量渗透摩尔浓度。在一些实施方案中，液体药物组合物包含44mg/mL的PEG-FGF21、230mM的精氨酸HCl、20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS80，其中pH为7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含44mg/mL的PEG-FGF21、230mM的精氨酸HCl、20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS80，其中pH为7.1，并且具有约485mOsm/kg的重量渗透摩尔浓度。
在一些实施方案中，可以进行响应表面分析，其中可以评估精氨酸浓度、pH和蛋白浓度以优化液体药物组合物(参见图22A-图22C)。
在一些实施方案中，液体组合物还包含表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵、葡萄糖酸钠或其组合。在一些实施方案中，液体制剂包含约0.05％至约0.1％(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵、约0.05％至约0.1％(w/v)的葡萄糖酸钠或其组合。
在一些实施方案中，液体药物组合物还包含一种或多种活性剂。在一些实施方案中，将PEG-FGF21与一种或多种活性剂共配制。在一些实施方案中，一种或多种活性剂可以包括肽、小分子或其组合。在一些实施方案中，一种或多种活性剂可以包括激素。例如，一种或多种试剂可以包括胃泌酸调节素、胰岛素、瘦蛋白、胰高血糖素、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂、FXR(法尼酯X受体)激动剂、甲状腺激素受体-β(TRβ)激动剂、钠葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂、其类似物或其组合。如本文所使用的，“类似物”是当与野生型肽序列相比时，具有包括一个或多个氨基酸取代、缺失、倒位或添加的改性的分子。
缓冲剂可以以1mM至100mM的浓度存在。在一些实施方案中，缓冲剂以2mM至75mM、5mM至50mM、10mM至25mM、14至22mM范围内的浓度存在。在一些实施方案中，缓冲液以约14、16、18、20、22、24、26、30、32、34、36、38、40mM或更高的浓度存在。例如，缓冲液以约20mM的浓度存在。pH可以在6.0至8.5、6.5至8.0、6.75至8.0、7.1至8的范围内。缓冲剂可以是Tris磷酸盐缓冲液。例如，缓冲剂可以具有7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8的pH。
液体药物组合物可以还包含张力改性剂。合适的张力改性剂包括甘油、氨基酸、氯化钠、蛋白质或糖和糖醇。例如，改性剂包括精氨酸，诸如精氨酸HCl或精氨酸硫酸盐。张力改性剂以50mM至500mM的浓度存在。例如，改性剂(例如精氨酸HCL)包含150mM至500mM、150mM至275mM或245mM至275mM的精氨酸。在一些实施方案中，改性剂包括精氨酸，诸如精氨酸HCl或精氨酸硫酸盐，其以在31.6mg/ml(150mM)至54.8mg/ml(260mM)之间的浓度存在。
液体药物组合物可以还包含表面活性剂，特别是非离子表面活性剂。表面活性剂或非离子表面活性剂可以是基于聚山梨酯的非离子表面活性剂，特别是聚山梨酯20或聚山梨酯80，更特别是聚山梨酯80。
表面活性剂或非离子表面活性剂可以以0.01％(w/v)至1％(w/v)的浓度存在。例如，表面活性剂或非离子表面活性剂可以以0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％(w/v)的浓度存在。
在一些实施方案中，液体药物组合物可以还包含十六烷基三甲基溴化铵、葡萄糖酸钠或其组合。例如，组合物可以包含0.05％至0.1％(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵、0.05％至0.1％(w/v)的葡萄糖酸钠或其组合。
在一个实施方案中，液体药物组合物包含10mg/mL至50mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、1mM至100mM的缓冲剂(例如Tris缓冲液)、150mM至500mM的张力精氨酸和0.02％至1％(w/v)的基于聚山梨酯的非离子表面活性剂(特别是聚山梨酯80)，并且具有7.0至8.0的pH。
在一些实施方案中，液体制剂包含0.02％(w/v)的PS80(0.2mg/ml)。在一些实施方案中，缓冲液是Tris或磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，液体制剂包含20mM的Tris缓冲液。在一些实施方案中，液体制剂包含28mg/ml的突变型FGF-21。在一些实施方案中，液体制剂包含36mg/ml的突变型FGF-21。在一些实施方案中，液体制剂包含44mg/ml的突变型FGF-21。在一些实施方案中，液体制剂包含150mM至275mM的精氨酸。在一些实施方案中，精氨酸是精氨酸HCl或精氨酸硫酸盐。在一些实施方案中，pH是7.1。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含约20mg/mL的突变型FGF21、约150mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.5。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约28mg/mL的突变型FGF21、约260mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、约0.02％(w/v)的PS80，并且其中pH为约7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约36mg/mL的突变型FGF21、约270mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、约0.02％(w/v)的PS80，并且其中pH为约7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含36mg/mL的突变型FGF21、200mM的精氨酸HCl、20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS80，并且其中pH为约7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约42mg/mL的突变型FGF21、约270mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、约0.02％(w/v)的PS80，并且其中pH为约7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含44mg/mL的突变型FGF21、200mM的精氨酸HCl、20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS80，并且其中pH为7.1。在一些实施方案中，液体药物组合物包含44mg/mL的突变型FGF21、230mM的精氨酸HCl、20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS80，并且其中pH为7.1。在一些实施方案中，突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物包含突变型FGF-21肽，该突变型FGF-21肽包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列、糖基部分和20kDa聚乙二醇(PEG)，其中突变型FGF-21肽通过SEQ IDNO:2的氨基酸位置173处的苏氨酸与糖基部分的第一位点之间的共价键附接至糖基部分，并且其中糖基部分通过糖基部分的第二位点与20kDa PEG之间的共价键附接至20kDa PEG。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含以下结构：
其中，n是选自450至460的整数。
在一些实施方案中，液体药物组合物在2-8℃范围内的温度下持续12个月或更长时间是稳定的。在一个实施方案中，液体药物组合物在2-8℃范围内的温度下持续长达12个月是稳定的。在一个实施方案中，药物组合物在室温下稳定至少3个月。在一个实施方案中，药物组合物在25℃的温度稳定至少3个月。在一个实施方案中，液体药物组合物在约-20℃的温度下持续3个月、6个月、12个月或更长时间是稳定的。
本文还涵盖一种包含含有其的液体药物组合物的药物容器。适合的药物容器包括但不限于注射器、自动注射器、小瓶、输注瓶、安瓿瓶、卡普尔瓶(carpoule)、配备有针保护系统的注射器和注射笔内的卡普尔瓶(carpoule)。
在一些实施方案中，包含液体药物组合物的容器是预装填注射器、小瓶或自动注射器等。
本文还涵盖包括一个或多个容器的套装，该容器包含液体药物组合物。与套装相关的是通常包括在治疗、预防或诊断产品的商业包装中的说明书，其含有：关于例如适应症、用途、剂量、制造、施用、禁忌症和/或关于使用此类治疗、预防或诊断产品的警告的信息。套装还可以与标签相关联，该标签可以是包括信息的任何种类的数据载体(例如传单、贴纸、芯片、印刷体或条形码)。在某些实施方案中，上面列出的说明书等可包括在标签中或标签上。套装可以进一步包括用于施用制剂的装置，特别是含有该制剂的装置，即预装填装置，诸如但不限于预装填注射器或预装填自动注射器。套装还可以包括包含制剂的容器，即预装填的容器，诸如预装填的小瓶、卡座瓶(cartouche)、小药囊或安瓿。本文还涵盖了产生突变型FGF-21肽缀合物的方法，包括以下步骤：
(1)在表达宿主中重组产生突变型FGF-21肽；以及
(2)将PEG-糖基部分酶促连接至步骤(1)的突变型FGF-21肽，其中PEG具有20kDa，从而形成突变型FGF-21肽缀合物。在一个具体的实施方案中，表达宿主是大肠杆菌。在一个更具体的实施方案中，步骤(2)包括在适合于将GalNAc从GalNAc供体转移至突变型FGF-21肽的至少一个苏氨酸残基的条件下使突变型FGF-21肽与GalNAc供体和GalNAc转移酶接触的步骤(2a)。在仍更具体的实施方案中，GalNAc供体是UDP-GalNAc。在另一个具体的实施方案中，GalNAc转移酶是MBP-GalNAcT2。在另一个具体的实施方案中，步骤(2)进一步包括在适于将来自20kDa PEG-Sia供体的20kDa PEG-Sia转移至突变型FGF-21肽的至少一个苏氨酸残基或如果步骤(2a)存在的话转移至突变型FGF-21肽处的GalNAc的条件下，使步骤(1)或步骤(2a)的产物(如果存在)与20kDa PEG-Sia供体和唾液酸转移酶接触的步骤(2b)。在一个更具体的实施方案中，20kDa PEG-Sia供体是20kDa PEG-Sia-CMP。在更具体的实施方案中，唾液酸转移酶是ST6GalNAc1。在更进一步的具体实施方案中，20kDa PEG-Sia供体包含以下结构：
其中，n是选自450至460的整数。
FGF-21肽的糖基化和糖缀合方法
肽和蛋白质的表达后体外改性通常用于产生糖肽和糖蛋白。转移糖供体部分的多种酶是可用的，从而使得具有定制设计的糖基化模式和糖基结构的糖基缀合物的体外酶合成成为可能。参见例如美国专利号5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；以及公开的专利申请WO98/31826；WO01/88117；WO03/031464；WO03/046150；WO03/045980；WO03/093448；WO04/009838；WO05/089102；WO06/050247；WO12/016984；US2002/142370；US2003/040037；US2003/180835；US2004/063911；US2003/207406；和US2003/124645，其各自以引用方式并入本文。
由于可用于添加和/或改性肽上的糖基残基的酶和方法的多样性，糖基连接基团可以基本上具有任何结构。因此，糖基连接基团可以实际上包括任何单糖或寡糖。糖基连接基团可以通过侧链或通过肽主链连接至氨基酸。可替代地，糖基连接基团可以通过糖基部分连接至肽，该部分可以是肽上的O-连接的或N-连接的聚糖结构的一部分。
根据上文，提供了糖基化突变型FGF-21的缀合物，其具有不存在于相应的野生型FGF-21序列中的糖基化位点(参见美国专利号10,407,479，其整体通过引用并入本文)。此类缀合物通过将改性的糖酶促连接至糖基化的FGF-21肽而形成。当改性的糖插入在肽和糖上的改性基团之间时，在本文中可以将其称为“糖基连接基团”。利用酶(诸如糖基转移酶)的精密选择性，产生在一个或多个特定位置处具有期望基团的突变型FGF-21肽。更具体地，糖基转移酶用于将改性的糖连接至突变型FGF-21糖肽上的碳水化合物部分。
FGF-21缀合物
在另一方面，提供了改性的糖和突变型FGF-21肽的示例性缀合物。更具体地，制备包含突变型FGF肽和至少一种改性的糖的突变型FGF-21肽缀合物，其中至少一种改性的糖中的第一种通过糖基连接基团连接至肽的氨基酸。如本文所述，使糖基连接基团所连接的氨基酸突变以产生被糖基转移酶识别的位点。
在另一个示例性的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物可以包含突变型FGF-21肽和连接至突变型FGF-21肽的突变氨基酸残基的糖基基团。
在一个示例性的实施方案中，糖基是完整的糖基连接基团。在另一个示例性的实施方案中，糖基基团还包含改性基团。在另一个示例性的实施方案中，改性基团是一种非糖苷改性基团。在另一个示例性实施方案中，改性基团不包括天然存在的糖部分。
改性的糖
在一个示例性的实施方案中，突变型FGF-21肽与改性的糖反应，因此形成肽缀合物。改性的糖包含“糖供体部分”以及“糖转移部分”。糖供体部分是改性的糖的任何部分，其将通过糖基部分或氨基酸部分连接至肽(作为本文所述的缀合物)。糖供体部分包括在其从改性的糖向突变型FGF-21肽缀合物的糖基连接基团转化期间被化学改变的那些原子。糖转移部分是改性的糖的任何部分，该部分将不连接至肽(作为本文描述的缀合物)。
对于本文所述的改性的糖，糖基部分可以是糖、脱氧糖、氨基糖或N-酰基糖。术语“糖(saccharide)”及其等效物“糖基(saccharyl)”、“糖(sugar)”和“糖基(glycosyl)”是指单体、二聚体、低聚物和聚合物。糖部分还被改性基团官能化。改性基团通常通过与糖上的胺、巯基或羟基(例如伯羟基)部分缀合而与糖基部分缀合。在一个示例性的实施方案中，改性基团是通过糖上的胺部分(例如通过酰胺、氨基甲酸乙酯或脲)连接的，该酰胺、氨基甲酸乙酯或脲是通过胺与改性基团的反应性衍生物的反应形成的。
任何糖基部分可以用作改性的糖的糖供体部分。糖基部分可以是已知的糖，诸如甘露糖、半乳糖或葡萄糖，或具有已知糖的立体化学的种类。这些改性的糖的通式是：
可用于本文所述方法中的其他糖基部分包括但不限于岩藻糖和唾液酸，以及氨基糖诸如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-胺类似物等。糖基部分可以是在自然界中发现的结构，或者它可以被改性以提供用于缀合改性基团的位点。例如，在一个实施方案中，改性的糖提供了唾液酸衍生物，其中9-羟基部分被胺取代。胺易于被所选的改性基团的活化类似物衍生化。可用于本文所述方法中的改性的糖的实施例在PCT专利申请号PCT/US05/002522中呈现，其全部内容通过引用并入本文。
进一步示例性的实施方案利用其中6-羟基位置被转化为相应的胺部分的改性的糖，该胺部分带有接头改性基团盒，诸如上文所述的那些。可用作这些改性的糖的核心的示例性糖基基团包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。根据此实施方案的代表性改性的糖在以下列出：
其中，R11-R14是独立地选自H、OH、C(O)CH3、NH和NHC(O)CH3的成员。R10是与例如另一个糖基残基(-O-糖基)的连接。R14是OR1、NHR1或NH-L-R1.R1和NH-L-R1如本文中所述。
在更进一步的示例性实施方案中，用作改性的糖的核心的糖基基团(其中6-羟基位置被转化为相应的胺部分)包括Gal和/或GalNAc。
糖基连接基团
在示例性的实施方案中，呈现了包含本文描述的改性的糖和突变型FGF肽的突变型FGF-21肽缀合物。在这个实施方案中，改性的糖的糖供体部分(诸如糖基部分和改性基团)变成“糖基连接基团”。“糖基连接基团”可以可替代地是指插入在肽与改性基团之间的糖基部分。
在以下示例性的实施方案中，通过参考使用呋喃糖和吡喃糖的所选衍生物来说明公开文本。本领域技术人员将理解，所列的结构和组合物通常适用于糖基连接基团和改性的糖的属。因此，糖基连接基团可以实际上包括任何单糖或寡糖。
在一个示例性的实施方案中，本文描述的方法利用具有下式的糖基连接基团：
其中，J是糖基部分，L是键或接头，并且R1是改性基团，例如聚合物改性基团。示例性的键是在糖基部分上的NH2部分与在改性基团上具有互补反应性的基团之间形成的那些。例如，当R1包括羧酸部分时，可以将该部分活化并与糖基残基上的NH2部分偶联，从而提供具有结构NHC(O)R1的键。J可以是“完整的”糖基部分，没有通过暴露于切割吡喃糖或呋喃糖结构的条件，例如氧化条件，例如高碘酸钠，而被降解。
示例性的接头包括烷基和杂烷基部分。接头包括连接基团，例如基于酰基的连接基团，例如-C(O)NH-、-OC(O)NH-等。连接基团是在缀合物的组分之间形成的键，例如在糖基部分与接头(L)之间，或在接头与改性基团(R1)之间。其他示例性的连接基团是醚、硫醚以及胺。例如，在一个实施方案中，接头是氨基酸残基，诸如甘氨酸残基。甘氨酸的羧酸部分通过与糖基残基上的胺反应而转化成相应的酰胺，并且甘氨酸的胺通过与改性基团的活化的羧酸或碳酸酯反应而转化成相应的酰胺或氨基乙酸酯。
NH-L-R1的示例性物质具有下式：NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}iR1，其中指数s和t独立地是0或1。指数a、b和d独立地是0至20的整数，并且c是从1至2500的整数。其他类似的接头是基于其中-NH部分被另一基团(例如-S、-O或-CH2)替换的物质。如本领域所理解的，与指数s和t相对应的一个或多个括号部分可以被取代的或未取代的烷基或杂烷基部分替换。
更具体地，在本文中所描述的化合物可以包括NH-L-R′，其中NH-L-R′是：NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1，NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1，NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1，NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1，NHC(O)(CH2)aNHR1，NH(CH2)aNHR1和NHR1。在这些式中，指数a、b和d独立地选自0至20、例如1至5的整数。指数c是1至约2500的整数。
在一个示例性的实施方案中，选择c使得PEG部分是大约1kD、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD、40kD、45kD、50kD、55kD、60kD或65kD。
在一个更具体的实施方案中，选择c使得PEG部分范围为15-25kD、16-25kD、17-25kD、18-25kD、19-25kD、20-25kD、21-25kD、22-25kD、23-25kD、24-25kD、15-20kD、16-20kD、17-20kD、18-20kD、19-20kD、20-30kD、21-30kD、22-30kD、23-30kD、24-30kD、25-30kD、26-30kD、27-30kD、28-30kD、29-30kD。在更具体的实施方案中，选择c使得PEG部分为20kD、22kD、23kD、24kD、25kD、26kD、27kD、28kD、29kD或30kD。
为了清楚的目的，在该部分的剩余部分中的糖基连接基团是基于唾液酸部分。然而，本领域的技术人员将认识到，可以使用另一个糖基部分诸如甘露糖基、半乳糖基、葡糖基或岩藻糖基来代替唾液酸部分。
在一个示例性的实施方案中，糖基连接基团是完整的糖基连接基团，其中形成连接基团的一个或多个糖基部分不会被化学(例如偏高碘酸钠)或酶(例如氧化酶)过程降解。公开文本的选择的缀合物包括连接到氨基-糖的胺部分上的改性基团，例如甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等。在一个示例性的实施方案中，公开文本提供了包含具有选自下式的完整糖基连接基团的肽缀合物：
在式I中，R2是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7表示H、取代或未取代的烷基或取代或未取代的杂烷基。当COOR7是羧酸或羧酸酯时，两种形式通过单一结构COO-或COOH的名称来表示。在式I和II中，符号R3、R4、R5、R6和R6'独立地表示H、取代或未取代的烷基、OR8、NHC(O)R9。指数d是0或1。R8和R9独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、唾液酸或多唾液酸。R3、R4、R5、R6和R6'中的至少一个包括改性基团。这种改性基团可以是通过键或连接基团连接的聚合物改性部分，例如PEG。在示例性的实施方案中，R6和R6'连同它们所连接的碳是唾液酸的丙酮酸基(pyruvyl)侧链的组分。在另一个示例性的实施方案中，该丙酮酸基侧链是用聚合物改性基团官能化的。在另一个示例性的实施方案中，R6和R6'连同它们所连接的碳一起是唾液酸侧链的组分，并且该聚合物改性基团是R5的组分。
根据此基序的示例性改性基团-完整糖基连接基团盒是基于唾液酸结构，例如具有下式的那些：
在上述式中，R1和L如上所述。以下提供了关于示例性R1基团的结构的进一步细节。
在再一个示例性的实施方案中，缀合物是在肽与改性的糖之间形成，其中该改性基团通过接头连接在改性的糖的6-碳位置处。因此，根据该实施方案的说明性糖基连接基团具有下式：
其中基团如上所述。糖基连接基团包括但不限于葡萄糖、葡糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、甘露糖胺、N-乙酰基-甘露糖胺等。
在一个实施方案中，公开文本提供了突变型FGF-21肽缀合物，其包含以下糖基连接基团：
其中，D是选自-OH和R1-L-HN-的成员；G是选自H和R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成员；R1是包含直链或支链聚(乙二醇)残基的部分；并且L是接头，例如键(“零级”)、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。在示例性的实施方案中，当D是OH时，G是，并且当G是-C(O)(C1-C6)烷基时，D是R1-L-HN-。
公开文本提供了包含具有下式的糖基连接基团的肽缀合物：
在其他实施方案中，糖基连接基团具有下式：
其中，指数t是0或1。
在再一个示例性的实施方案中，糖基连接基团具有下式：
其中，指数t是0或1。
在又一个实施方案中，糖基连接基团具有下式：
其中指数p表示1至10的整数；并且a是0或1。
在一个示例性的实施方案中，糖PEG化的肽缀合物是选自以下给出的化学式：
/>
在上式中，指数t是0至1的整数，指数p是1至10的整数。符号R15'表示H、OH(例如Gal-OH)、唾液酸部分、唾液酸连接基团(即唾液酸连接基团-聚合物改性基团(Sia-L-R1))或与聚合物改性的唾液酸部分结合的唾液酸部分(例如Sia-Sia-L-R1)(“Sia-Siap”))。示例性的聚合物改性的糖基部分具有根据式I和II的结构。公开文本的示例性的肽缀合物将包括至少一种具有R15'的聚糖，该聚糖包括根据化学式I或II的结构。具有化学式I和II的氧(具有开放化合价)可以通过糖苷键附接至Gal或GalNAc部分的碳上。在另一个示例性的实施方案中，该氧在半乳糖残基的位置3处连接到该碳上。在一个示例性的实施方案中，改性的唾液酸在α2,3-上连接至半乳糖残基。在另一个示例性的实施方案中，唾液酸在α2,6-上连接至半乳糖残基。
在一个示例性的实施方案中，唾液酸连接基团是唾液酸部分，聚合物改性的唾液酸部分(例如，Sia-Sia-L-R1)(“Sia-Siap”)结合至其上。在此，糖基连接基团通过唾液酸部分连接至半乳糖基部分：
根据该基序的示例性物质是通过使用形成Sia-Sia键的酶(例如，CST-11、ST8Sia-II、ST8Sia-III和ST8Sia-IV)将Sia-L-R1缀合至聚糖的末端唾液酸来制备的。
在另一个示例性的实施方案中，肽缀合物上的聚糖具有选自下组的化学式：
及其组合。
在上述每个式中，R15'如上所述。此外，本文所述的示例性突变型FGF-21肽缀合物将包含至少一种具有R15部分的聚糖，该聚糖具有根据式I或II的结构。
在另一个示例性的实施方案中，糖基连接基团包括具有下式的至少一个糖基连接基团：
其中，R15是所述唾液酸基连接基团；并且指数p是选自1至10的整数。在一个示例性的实施方案中，糖基连接部分具有下式：
其中，b是0至1的整数。指数s表示1至10的整数；以及指数f表示1至2500的整数。
在一个示例性的实施方案中，聚合物改性基团是PEG。在另一个示例性的实施方案中，PEG部分具有20-30kDa的分子量。在示例性的实施方案中，PEG部分具有17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa或33kDa的分子量。在另一个示例性的实施方案中，PEG部分具有20kDa的分子量。在另一个示例性的实施方案中，PEG部分具有30kDa的分子量。在另一个示例性的实施方案中，PEG部分具有约5kDa的分子量。在另一个示例性的实施方案中，PEG部分具有约10kDa的分子量。在另一个示例性的实施方案中，PEG部分具有约40kDa的分子量。
在一个示例性的实施方案中，糖基连接基团是直链的10kDa-PEG-唾液酸基，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接至肽。
在一个示例性的实施方案中，糖基连接基团是直链的20kDa-PEG-唾液酸基，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接至肽。在一个示例性的实施方案中，糖基连接基团是直链的30kDa-PEG-唾液酸基，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接至肽。在一个示例性的实施方案中，糖基连接基团是直链的5kDa-PEG-唾液酸基，并且这些糖基连接基团中的一个、两个或三个共价连接至肽。在一个示例性的实施方案中，糖基连接基团是直链40kDa-PEG-唾液酸基，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接至肽。
在又一个示例性的实施方案中，突变型FGF-21肽根据本文所述的方法PEG化。在一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变S172T和R176A，其中氨基酸S和R的位置是基于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。更具体地，突变型FGF-21肽包含如SEQ ID NO:2中所描述的氨基酸序列。如上文详述的，与苏氨酸残基连接并将新引入的苏氨酸残基连接到PEG部分上的至少一个糖基部分实际上可以是任何可能的糖基部分。唯一的限制是它应该能够连接到苏氨酸上并且它应该能够连接到PEG或m-PEG上，更特别是通过接头，例如氨基酸残基，特别是甘氨酸。在一个具体的实施方案中，至少一个糖基部分包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖(Gal)和/或唾液酸(Sia)。在一个更具体的实施方案中，至少一个糖基部分包含结构-GalNAc-Sia-，即两个糖基部分，即GalNAc和Sia，其中PEG残基可以连接至GalNAc或Sia，特别是连接至Sia。未连接至PEG部分的糖基部分可以连接至新引入的苏氨酸残基。
在另一个具体的实施方案中，20kDa PEG部分通过接头连接于至少一个糖基接头，接头例如是氨基酸残基，特别是小氨基酸诸如丙氨酸或甘氨酸，更特别是通过甘氨酸(Gly)。因此，PEG或m-PEG部分连接至氨基酸并且氨基酸连接至糖基部分诸如Sia。糖基部分连接至氨基酸接头(如果存在)并且连接至突变型FGF-21氨基酸序列中新引入的苏氨酸残基。氨基酸残基是通过描述于WO03/031464中的方法连接至PEG和糖基残基，该专利通过引用结合在此。
在一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽(例如SEQ ID NO:2)缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)，其中GalNAc连接至例如新引入的苏氨酸残基和连接至Sia。Sia通过甘氨酸残基进一步连接至17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa或33kDa的PEG。
在一个更具体的实施方案中，突变型FGF-21肽(例如SEQ ID NO:2)缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)，其中GalNAc连接至例如新引入的苏氨酸残基和连接至Sia。Sia通过甘氨酸残基进一步连接至20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa或30kDa的PEG。
在仍更具体的实施方案中，突变型FGF-21肽(例如SEQ ID NO:2)缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)，其中GalNAc连接至例如新引入的苏氨酸残基和连接至Sia。Sia进一步经由甘氨酸残基连接至20kDa、25kDa或30kDa的PEG。
在另一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽(例如SEQ ID NO:2)缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)，其中GalNAc连接至例如新引入的苏氨酸残基和连接至Sia。Sia进一步经由甘氨酸残基连接至20kDa或30kDa的PEG。
在又一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽(例如SEQ ID NO:2)缀合物包含结构-GalNAc-Sia-Gly-PEG(20kDa)，其中GalNAc连接至例如新引入的苏氨酸残基和连接至Sia。Sia进一步经由甘氨酸残基连接至20kDa的PEG。
在一个非常具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含以下结构：
其中，n是选自450至460的整数，同样如图1所示。
20kDa PEG可以是直链或支链的，更具体地，20kDa PEG是直链的20kDa PEG。此外，20kDa PEG具体是20kDa甲氧基-PEG(mPEG，m-PEG)。不同分子量的PEG和mPEG可以从各种供应商获得，诸如从Jenkem Technology USA,Plano,TX,USA或Merckle Biotec,Ulm,Germany获得。本领域中应理解的是，PEG 20kDa是指PEG残基的大小平均是20kDa，并且大部分PEG残基的大小是20kDa。
突变型FGF-21肽及其缀合物
提供了具有出人意料的性能的成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的变体，包括具有异常长的半衰期的变体，这些变体是肽缀合物，该肽缀合物包含：
i)突变型FGF-21肽，包含在至少一个脯氨酸残基的C端侧上与至少一个脯氨酸(P)残基相邻的至少一个苏氨酸(T)残基，从而形成不存在于相应的天然FGF-21中的至少一个O-连接的糖基化位点，其中，相应的天然FGF-21具有与SEQ ID NO:1至少95％一致的氨基酸序列，以及
ii)20-30kDa聚乙二醇(PEG)，其中，所述20-30kDa PEG通过至少一个糖基部分在至少一个苏氨酸残基处共价连接至所述突变型FGF-21肽。
对于20-30kDa PEG残基的连接，将苏氨酸残基引入天然FGF-21的氨基酸序列中，该氨基酸序列邻近于已经存在于天然FGF-21的氨基酸序列中的脯氨酸残基(即是天然脯氨酸残基)的C端侧和在其上。为此目的，(i)可将另外的苏氨酸紧邻天然脯氨酸残基引入，或(ii)将存在于FGF-21的天然氨基酸序列中的天然氨基酸置换为苏氨酸残基，该FGF-21的天然氨基酸序列邻近并位于天然脯氨酸残基的C端侧。在公开文本中，选项(ii)是示例性的实施方案。如本文所述，可在已经存在的脯氨酸残基附近和C端引入一个以上的苏氨酸残基。因此，公开文本的突变型FGF-21可以包含已经被另外引入的苏氨酸残基和已经被引入代替天然氨基酸的苏氨酸残基两者。
通过在C端侧上和与脯氨酸残基相邻引入新的苏氨酸残基，形成了用于O-糖基化酶的共有序列。因为脯氨酸残基典型地被发现于蛋白质的表面上(在例如转弯、扭结和/或环中)，所以要求使用紧邻脯氨酸残基的PEG-糖基部分对其O-糖基化以及PEG化的设计受益于用于转移糖基或二醇-PEG部分的糖基转移酶的靶连接位点的相对可及性以及在不破坏蛋白质结构的情况下采用缀合的糖基和/或PEG结构的潜力。
为了将苏氨酸残基引入到FGF-21的天然氨基酸序列中，使用重组遗传学领域中的常规技术。公开了在公开文本中使用的一般方法的基本文本包括Sambrook和Russell，分子克隆实验指南(第3版，2001)；Kriegler，基因转移和表达:实验室手册(1990)；和Ausubel等人编著，分子生物学当代方案(Current Protocols in Molecular Biology)(1994)。
在一个具体的实施方案中，天然FGF-21氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1中所描绘的人FGF-21的天然氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含氨基酸序列PT，即与脯氨酸残基C端相邻的苏氨酸残基。序列PT不存在于天然FGF-21氨基酸序列中。
任选地，突变型FGF-21肽包含选自由以下各项组成的组的至少一个氨基酸序列：P172T(例如SEQ ID NO:2或3)、P156T(例如SEQ ID NO:4)、P5T(例如SEQ ID NO:5)、P3T(例如SEQ ID NO:6)、P9T(例如SEQ ID NO:7)、P50T(例如SEQ ID NO:8)、P61T(例如SEQ ID NO:9)、P79T(例如SEQ ID NO:10)、P91T(例如SEQ ID NO:11)、P116T(例如SEQ ID NO:12)、P120T(例如SEQ ID NO:13)、P125T(例如SEQ ID NO:14)，P129T(例如SEQ ID NO:15)、P131T(例如SEQ IDNO:16)、P134T(例如SEQ ID NO:17)、P139T(例如SEQ ID NO:18)、P141T(例如SEQ ID NO:19)、P144T(例如SEQ ID NO:20，P145T(例如SEQ ID NO:21)、P148T(例如SEQ ID NO:22)、P150T(例如SEQ ID NO:23)、P151T(例如SEQ ID NO:24)、P158T(例如SEQ ID NO:25)，P159T(例如SEQ IDNO:26)、P166T(例如SEQ ID NO:27)、P178T(例如SEQ ID NO:28)及其组合，其中脯氨酸和苏氨酸的位置是基于如SEQ ID NO:1中所述的FGF-21的天然氨基酸序列，具体地该突变型FGF-21肽包括选自由以下各项组成的组的至少一个氨基酸序列：P172T、P156T、P5T及其组合，更具体地由P172T、P156T及其组合组成，甚至更具体地该突变型FGF-21肽包含基于如SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列的序列基序P172T，其中，脯氨酸和苏氨酸的位置是基于SEQ ID NO:1中所描述的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，脯氨酸残基位于突变型FGF-21肽的氨基酸145与C端之间，其中氨基酸145的位置是基于SEQ ID NO:1所描述的氨基酸序列。如通过本文呈现的结果证明的，FGF-21的C端令人惊讶地耐受PEG和特别是糖基-PEG部分的连接。这是出乎意料的，因为文献报道完整的C端对于FGF-21的β-克洛索(Klotho)结合是必需的。
在一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变S172T和R176A，其中氨基酸S和R的位置是基于SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列，特别是突变型FGF-21肽包含SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列。已经发现突变R176A在苏氨酸173处引入O-连接的糖基化位点之后有益于蛋白质的总体稳定性。通过这种突变，去除相对大的精氨酸侧链并且用丙氨酸的小侧链替换。假定丙氨酸的较小侧链较少干扰待连接至所指示(thindicae)突变型FGF-21肽的大量糖基-PEG部分。在一个替代的实施方案中，突变型FGF-21肽包含突变Q157T，其中氨基酸Q的位置是基于SEQ ID NO:1所描述的氨基酸序列，特别是突变型FGF-21肽包含SEQ ID NO:4中所描述的氨基酸序列，或突变D6T，其中氨基酸D的位置是基于SEQ ID NO:1中所描述的氨基酸序列，特别是突变型FGF-21肽包含SEQ ID NO:5中所描述的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，突变型FGF-21肽缀合物包含选自由SEQ ID NO:2至28组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽包含选自由SEQ ID NO:2至5组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽包含选自由SEQ ID NO:2至4组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，突变型FGF-21肽包含SEQ ID NO:2中所描述的氨基酸序列。
进一步提供了液体药物组合物，其包含突变型FGF-21肽缀合物和药学上可接受的载体诸如水或生理相容性缓冲液。液体药物组合物通常包含治疗有效量或药物活性量的突变型FGF-21肽缀合物作为活性剂。
在一些实施方案中，液体药物组合物还包含一种或多种活性剂。在一些实施方案中，一种或多种试剂可以包括肽、小分子或其组合。在一些实施方案中，一种或多种试剂可以包括激素。例如，一种或多种试剂可以包括胃泌酸调节素、胰岛素、瘦蛋白、胰高血糖素、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂、FXR(法尼酯X受体)激动剂、甲状腺激素受体-β(TKβ)激动剂、钠葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂、其类似物或其组合。
公开文本的液体药物组合物适合用于多种药物递送系统中。在Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,费城，宾夕法尼亚，第17版(1985)中找到用于公开文本的合适的制剂。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。药物组合物旨在用于肠胃外、鼻内、局部(topical)、口服或局部施用，诸如通过皮下注射、气雾剂吸入或透皮吸附，用于预防性和/或治疗性治疗。在一些实施方案中，通过注射施用液体药物组合物。在一些实施方案中，液体药物组合物是胃肠外(例如皮下或静脉内)施用的。根据公开文本的多个方面，液体药物组合物是通过皮下注射施用的。因此，公开文本的方面提供了用于肠胃外施用(例如皮下注射)的组合物，其包含溶解或悬浮在可接受的载体中的突变型FGF-21肽缀合物。载体可以是水性载体，例如水、缓冲水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)等。组合物还可含有去污剂诸如吐温20和吐温80；稳定剂诸如甘露醇、山梨醇、蔗糖和海藻糖；和防腐剂诸如EDTA和间甲酚。组合物可以含有需要接近生理条件的可药用的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。
公开文本的液体药物组合物可以通过常规灭菌技术进行灭菌，或可以无菌过滤。所得水溶液可以原样包装使用，或冻干，冻干制剂在给药前与无菌水性载体组合。可以施用包含FGF肽缀合物的组合物用于预防性和/或治疗性治疗，特别是用于治疗糖尿病或糖尿病相关疾病，特别是用于治疗2型糖尿病、NASH和代谢综合征。在治疗应用中，组合物是以足以治愈或至少部分地阻止疾病的症状及其并发症的量向已经患有与糖尿病相关的疾病或病症的受试者施用。足以实现这个的量被定义为“治疗有效量”并且通常取决于患者的健康状况和体重。
公开文本提供了用于治疗疾病和/或病症或其症状的方法，该方法包括将包含它们的液体药物组合物施用受试者(例如哺乳动物，诸如人)。因此，一个实施方案是用于治疗患有糖尿病或糖尿病相关疾病(例如2型糖尿病、NASH或代谢综合征)或其症状的受试者的方法。该方法包括以下步骤：在治疗疾病或病症的条件下向哺乳动物施用一定量的本文描述的化合物或包含该化合物的组合物，该量是足以治疗疾病或病症或其症状的量。
液体组合物的单次或多次施用可以用由治疗医师选择的剂量水平和模式来进行。在任何情况下，液体药物组合物应提供足以有效治疗需要这种治疗的受试者的一定量的公开文本的突变型FGF-21肽缀合物。
在另一个方面，提供了用于治疗糖尿病和相关疾病，特别是2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或代谢综合征的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用液体药物组合物，该液体药物组合物包含本文描述的突变型FGF-21肽缀合物中的至少一种。在一个具体的实施方案中，对其有需要的受试者是人受试者。
在液体药物组合物中，突变型FGF-21肽缀合物通常以约0.1mg/mL至约50mg/mL的范围内，例如约10mg/mL至约48mg/mL，约20mg/mL至约44mg/mL，例如约20mg/mL、约28mg/mL、约36mg/mL、约44mg/mL的浓度存在。
在测试了非常多的不同的条件、化合物及其浓度之后已经仔细地选择了液体药物组合物的所有组分以及组分的具体浓度。因此，本文公开的药物组合物不是化合物和化合物浓度的任意选择，而是条件的特定和合理的选择，发现这些条件对于用作药物的根据公开文本的包含突变型FGF-21肽缀合物或突变型FGF-21肽的水性药物组合物是最佳的。
在一些实施方案中，液体药物组合物包含缓冲剂，特别是磷酸盐或Tris缓冲液，例如三(羟甲基)氨基甲烷(THAM)。任选地，该缓冲剂是以1mM至100mM、2mM至75mM、5mM至50mM、10mM至25mM的浓度存在的。选择5至25mM的Tris缓冲液，因为发现蛋白质的溶解度优于其他缓冲系统，并且适于将pH保持在7-8，例如pH 7.5+/-0.4(例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8或7.9)。在一些实施方案中，液体药物组合物包含约20mM的Tris缓冲剂。对于PEG化的突变型FGF-21肽缀合物的延长储存，该pH似乎是最佳的。此外，Tris在较低温度下结晶的概率低于基于磷酸盐的缓冲剂的概率。
在一些实施方案中，药物组合物的pH在6.0至8.5、6.5至8.0、6.75至8.0、7.0至8.0、7.0至8.0、例如7.5±0.5的范围内，因为如果pH在7-8的范围内，观察到SDS-PAGE的最低片段化和SEC的最少聚集。也认为该pH相对于粘度是任选的。因为溶液的pH可以取决于溶液的温度，所以pH应当特别地在25±2℃下调试和测量。可用HCl调节pH。
药物组合物可以还包含张力改性剂。张力改性剂可选自由甘油、氨基酸、氯化钠、蛋白质、糖和糖醇组成的组。发现张力改性剂，特别是精氨酸，对药物组合物具有有利作用，因为它减少活性剂，即突变型FGF-21肽(缀合物)的聚集。
张力改性剂(例如精氨酸)可以以约150mM至约500mM、约150mM至约275mM、约220mM至约270mM、约200mM至约260mM、约200mM至约230mM的浓度存在。例如，精氨酸HCl可以以约150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270mM的浓度存在
此外，药物组合物可以包含表面活性剂，特别是非离子型表面活性剂。表面活性剂或非离子表面活性剂特别是基于聚山梨酯的非离子表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯20或聚山梨酯80。该表面活性剂或非离子表面活性剂(例如聚山梨酯20或80)任选地以0.01mg/mL至1mg/mL、0.05至0.5mg/mL或0.2±0.02mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。在一些实施方案中，表面活性剂以0.2±0.02mg/mL的浓度存在。例如，表面活性剂可以以约0.18、0.19、0.2、0.21、0.22mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，表面活性剂，诸如基于聚山梨酯的非离子表面活性剂，防止可导致聚集的剪切力。
本文还提供了包含公开文本的液体药物组合物的药物容器。在一些实施方案中，药物容器是注射器、自动注射器、小瓶、输注瓶、安瓿瓶、卡普尔瓶(carpoule)、配备有针保护系统的注射器或注射笔内的卡普尔瓶(carpoule)。
制造
在一些实施方案中，方法如下：首先，将邻近脯氨酸残基的C端侧和在其上引入苏氨酸的突变以及任选地一个或多个另外的突变引入到编码天然或突变的FGF-21(诸如SEQID NO:1中所示的人FGF-21)的核酸序列中。将编码突变的FGF-21肽的核酸序列引入适于在表达宿主中表达蛋白质的表达载体中。用于将突变引入核酸序列的方法诸如定点诱变以及将突变的核酸序列结合到表达载体中是技术人员熟知的(参见例如R.B.Corley的“A Guideto Methods in the Biomedical Sciences”，Springer Science&Business Media，2006)。
在蛋白表达，可选的纯化之后，PEG残基经由至少一个糖基部分并且可选地经由存在于PEG与糖基残基之间的至少一个氨基酸残基连接至突变型FGF-21肽，具体地在新引入的苏氨酸残基处。
为了获得编码公开文本的突变型FGF-21的核酸的高产量表达，典型地将编码突变型成纤维细胞生长因子的多核苷酸亚克隆到表达载体中，该表达载体包含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域熟知的，并描述于例如Sambrook和Russell(见上文)和Ausubel等人(见上文)中。用于表达天然或突变型FGF-21的细菌表达系统可在例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、沙门氏菌(Salmonella)和杆菌(Caulobacter)中获得。用于这类表达系统的套装是可商购的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统在本领域中是熟知的并且也是可商购的。在一个实施方案中，真核表达载体是腺病毒载体、腺相关载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，突变型FGF-21肽在大肠杆菌细胞中重组产生，即表达宿主是大肠杆菌。
该段中描述了示例性的生产方法：突变型FGF-21肽作为包涵体在大肠杆菌中表达。通过离心从收获物中回收细胞，破碎，并且洗涤包涵体并通过离心回收。非PEG化的突变型FGF-21肽的纯化开始于溶解来自包涵体的突变型FGF-21肽并重折叠该肽。将重折叠的突变型FGF-21肽过滤并且通过两次阴离子交换色谱操作纯化，两者都利用Eshmuno Q色谱树脂并且以结合和洗脱模式操作。如果必要，纯化的突变型FGF-21肽可以通过使用Pellicon2(5kD MWCO)膜的超滤进行浓缩。将纯化的突变型FGF-21肽分配到无菌PETG瓶中，并且可以在≤70℃下储存。参见图2和图3。
突变型FGF-21肽的糖基PEG化可通过串联或同时进行的两个酶促反应来进行。在酶促步骤是串联的过程中，可以在两个连续的酶促步骤之间进行阴离子交换层析步骤(例如一个阴离子交换层析步骤)。这个步骤之后可以是0.2μm过滤和两次阴离子交换色谱操作，两者都利用Q Sepharose Fast Flow色谱树脂并且以结合和洗脱模式操作。可以使用Pellicon XL Biomax(10kDa MWCO)通过超滤进行最终的浓缩步骤。图2至图4示出了非限制性的示例性生产方法。参见图4。在碳水化合物的合成中使用两个主要类别的酶，糖基转移酶(例如唾液酸转移酶、寡糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶)以及糖苷酶。糖苷酶进一步分类为外切糖苷酶(例如β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶)和内切糖苷酶(例如内切糖苷酶-A、内切糖苷酶-M)。这些类别的酶中的每一种已经成功地合成用于制备碳水化合物。关于一般性综述，参见Crout et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.2:98-111(1998)。还参见PCT公开号WO2003/031464；WO2005/089102；WO2006/050247；和WO2012/016984，其各自的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，20kDa PEG-Sia供体包含以下结构
其中，n是选自450至460的整数，其产生20kDa的分子量。该结构包括Gly接头。技术人员理解可以使用用于生产其的任何方法，例如在PCT公开号WO2003/031464中描述的方法，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，使用0.22微米过滤器过滤FGF-21肽缀合物。此外，可以无菌过滤突变型FGF-21肽缀合物。
还提供了可通过公开文本的方法获得的突变型FGF-21肽缀合物。
在一些实施方案中，将浓缩的蛋白溶液(PEG FGF-21)从-80C解冻直至液体。在一些实施方案中，缓冲液交换是通过渗滤过程进行的，其中用配制缓冲液、20mM的Tris、150mM的精氨酸HCl，pH7.5交换大约7体积。在一些实施方案中，使用渗滤缓冲液将蛋白浓度调节至约20mg/mL。在一些实施方案中，然后添加聚山梨酯80(PS80)至0.02％。在一些实施方案中，使用0.22μm过滤器无菌过滤溶液并且填充到无菌小瓶中。
应用
公开文本提供了液体药物组合物，该液体药物组合物用作药物并且用于治疗糖尿病和相关疾病，特别是2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或代谢综合征。公开文本还提供了液体药物组合物用于治疗糖尿病和相关疾病、特别是2型糖尿病、NASH和/或代谢综合征的应用。
进一步提供了治疗糖尿病和相关疾病、特别是2型糖尿病、NASH、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和/或代谢综合征的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用根据公开文本的液体药物组合物。在一个具体的实施方案中，受试者是人类受试者。
NAFLD是西方国家常见的慢性肝病，其可以发展为肝硬化，并且通常与增加的死亡率风险相关，特别地与增加的心血管疾病死亡率风险相关。当前NAFLD的药理学治疗具有有限的功效，因此迫切需要开发针对这种常见和威胁生命的疾病的更有效和安全的试剂。奥贝胆酸(OCA)，法尼酯X受体的选择性激动剂，似乎有希望作为管理NAFLD的治疗剂。在患有NASH的患者的NASH治疗(FLINT)试验中的法尼酯X受体配体奥贝胆酸揭示OCA施用与肝脏组织学的改进以及体重减轻和血压的降低相关。虽然OCA对脂质谱和胰岛素敏感性的不利影响是值得注意的，但在所选择的患有NAFLD/NASH的患者中，特别是那些充分控制葡萄糖和脂质水平的患者中可以考虑OCA。
关于证明本文描述的化合物和组合物的临床功效的指标，多种示例性指标是本领域已知的并且在本文描述了的，包括但不限于HbAlc、葡萄糖和胰岛素、体重、血清脂质(总胆固醇、LDL、甘油三酯)、肝酶(ALT、AST)、肝重量、相对肝重量(％体重)、NAFLD活性分数(NAS)、纤维化分数(例如肝纤维化)、促炎细胞因子(例如IL1β、MCP-1)、纤维化生物标志物(αSMA、胶原蛋白1α)、肝胆固醇、肝甘油三酯以及肝脂肪酸的下降。高分子量(HMW)脂连蛋白或HDL中的至少一种的增加也是本文所述化合物和组合物的临床功效的指标。因此，至少一个指标的变化(如上所指出的)反映了本文所述的化合物或组合物的临床功效。
在一些实施方案中，本文所述的化合物或组合物的治疗功效是基于血清甘油三酯水平或血清胰岛素水平中的至少一者的下降来确定的。
例如，HOMA-IR是在受试者中胰岛素抵抗的存在和程度的指标。它是基线(空腹)血糖与对其响应的胰岛素水平之间的动态的准确指标。它被称为胰岛素抵抗计算器。对于人类，健康范围是1.0(0.5-1.4)。小于1.0表示受试者是胰岛素敏感的，这是理想的；高于1.9表示受试者表现出早期胰岛素抵抗；高于2.9表示受试者表现出显著的胰岛素抵抗。HOMA-IR血码计算确定如下：胰岛素uIU/mL(mU/L)X葡萄糖(mg/dL)＝HOMA-IR。该计算需要美国标准单位。为了从国际SI单位转化：对于胰岛素：pmol/L至uIU/mL，除以(÷)6；对于葡萄糖：mmol/L至mg/dL，乘以(X)8。
本文还呈现了治疗方案，由此每天两次、每天一次、每两天、每周三次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用包含治疗有效量的突变型FGF-21肽缀合物的液体药物组合物。例如，可以将包含约10mg至最高达45mg、约20mg至约44mg、约28mg至约44g、约36mg至约44mg、约20mg至约36mg、约28mg至约36mg、约20mg至约28mg的突变型FGF-21肽缀合物(例如约10mg、18mg、20mg、25mg、28mg、30mg、36mg、42mg或44mg)的液体药物组合物每天两次、每天一次、每两天、每周三次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用对其有需要的受试者。在一些实施方案中，将包含高达44mg/ml的突变型FGF-21肽缀合物的液体药物组合物每周一次或每两周一次施用对其有需要的受试者。本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的长持续时间功效通过对这些缀合物在动物模型系统中测定的出乎意料的长半衰期来证明。本文所述的突变型FGF-21肽缀合物的长持续时间功效进而使得可以较不频繁地施用突变型FGF-21肽缀合物。因此，在一些实施方案中，本文所述的突变型FGF-21肽缀合物或包含其的组合物以等于或大于每周一次的频率施用对其有需要的受试者。例如，本文所述的突变型FGF-21肽缀合物或包含其的组合物可以每7天一次、每8天一次、每9天一次、每10天一次、每11天一次、每12天一次、每13天一次、每14天一次、每15天一次、每16天一次、每17天一次、每18天一次、每19天一次、每20天一次、每21天一次、每22天一次、每22天一次、每23天一次、每24天一次、每25天一次、每26天一次、每27天一次、每28天一次、每29天一次、每30天一次或每31天一次施用对其有需要的受试者。
在另一个示例性的治疗方案中，本文所述的化合物和包含其的组合物遵循“诱导”疗程，其需要更频繁地施用，如在治疗方案开始时每周两次或每周一次，接着是维持疗法，可能涉及两每周一次或每月一次施用。这样的方案是有效的，因为初始诱导疗法将受试者的病症改善至可管理水平，该可管理水平对于实现临床状态是可接受，该临床状态对于疾病/病症的维持是可接受的。此后，维持疗法用于将健康水平维持在维持水平。
用于治疗糖尿病和相关疾病，特别是2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或代谢综合征的化合物和/或组合物的治疗功效可以使用本领域技术人员已知并且本文描述的多种参数和测定法来评估。测量血红蛋白Alc(HbAlC)被认为是用于测量受试者在长持续时间内的血糖指数的标准测定法。因此，它是血糖指数的稳定指标，反映了在大约近3-4个月的过程中的葡萄糖水平。因此，可以通过在适合的测定中确定的百分比HbAlC来限定患有糖尿病(例如2型糖尿病)的受试者。
对于没有糖尿病的健康人来说，血红蛋白Alc水平的正常范围是在4％与5.6％之间。在5.7％与6.4％之间的血红蛋白Alc水平指示人具有更高的发展糖尿病的机会。6.5％或更高的水平指示人患有糖尿病。
在一些实施方案中，通过使用糖化血红蛋白测试系统(BIO-RAD，Hercules，加利福尼亚州，美国)用HPLC测量HbAlC。可以将血液样品(例如1.0mL/次)从头静脉或隐静脉收集至BDK2-EDTA管中。可以将样品立即储存在4℃或保持在湿冰上，并在收集血液的同一天进行分析。可由本领域技术人员通过使用糖化血红蛋白测试系统(BIO-RAD，Hercules，加利福尼亚州，美国)用HPLC测量血液中的HbAlc水平。
关于NASH，目前仅通过活组织检查诊断这种病症。然而，存在一些被认为是NASH预测物的异常生物标志物，诸如肝脏脂肪(通过MRI确定)、肝酶(ALT和ALT/AST比率)和纤维化生物标志物(诸如pro-C3)。
实施例
以下实施例示出了公开文本的具体实施方案。仅出于说明性目的阐述它们，并且它们不应被视为限制公开文本。
液体制剂
开发了糖PEG化的FGF-21突变体(PEG-FGF21，本文中也称为突变型FGF-21肽缀合物)的液体制剂。该制剂由以下各项支持：在2-8℃储存最高达12个月的稳定性数据，并且适合于临床或家庭施用。进行另外的优化，产生具有更高PEG-FGF21浓度的改进的制剂。
进行PEG-FGF21的制剂前开发研究以建立将为蛋白质提供优化的物理、化学和结构稳定性的制剂组合物。筛选各种缓冲液、赋形剂、表面活性剂和pH以在大约20mg/mL的目标浓度下优化蛋白质稳定性。
基于基线生物物理筛选I(BBSI)，筛选具有不同pH的一系列缓冲液以测试十六(16)个独特制剂，以通过以2mg/mL测试PEG化的和非PEG-FGF21来鉴定适合的pH/缓冲液组合。通过静态光散射(SLS)和动态光散射(DLS)测试样品。对于非PEG-FGF21的DSF结果和对于PEG化的和非PEG化的材料两者的DLS和SLS结果表明6.5至8.5的pH范围适合于蛋白质溶解度。在第二研究中，评估了基线生物物理筛选II(BBSII)，150mM的NaCl、150mM的精氨酸-HCl、250mM的蔗糖和250mM的山梨醇作为赋形剂在pH 6.5至8.0范围内的缓冲液中的作用。SLS、DLS和DSF是以2mg/mL在PEG化的以及非PEG-FGF21上进行的。提供pH 8.0的Tris和pH7.5的磷酸盐与精氨酸、蔗糖和山梨醇最适合于PEG-FGF21和非PEG-FGF21稳定性(图5-图11)。
在第三研究-溶解度研究中，在BBSII中建立的pH、缓冲液以及赋形剂的最佳组合用于确定在高浓度(约50mg/mL)下向PEG-FGF21提供稳定性的制剂。对样品进行DLS和SEC测试，并且确定磷酸盐/精氨酸-HCl和磷酸盐/蔗糖制剂作为低聚集体产生制剂/SEC分析，并且还表现出对于大聚集体具有较低强度的DLS曲线。选择Tris/蔗糖是因为它通过SEC具有最低百分比的总聚集体，并且由于具有如通过SEC和DLS指示的低聚集体而选择Tris/山梨醇和Tris/精氨酸-HCl。第四项研究确定了表面活性剂对产品稳定性的影响并且发现对产品无害。
将前四个研究获得的结果用于从实验研究设计(DOE)中选择设计空间。使用具有两个数值因子(pH和蛋白浓度)、两个分类因子(缓冲液和赋形剂类型)的随机化响应表面设计来开发具有六个中心点的设计。选择总计36种制剂(表1和2)来筛选PEG-FGF21并且添加另外的四种非DOE(off-DOE)制剂来筛选精氨酸和葡糖酸盐以及十六烷基三甲基溴化铵的组合。
表1.选择的制剂(实验研究的DS设计)来自第1回合和第2回合的优化方案
/>
/>
将所得样品在5℃下储存8周，在25℃下储存2周，并且通过UV、SEC、RP-HPLC和DLS进行测试。粘度。仅在初始时间点(T＝0)进行微流成像(MFI)、DSF和pH测试。DLS测试仅在第2周(2W)进行。数据显示通过增加精氨酸浓度有效地控制二聚体(图21)。图11-图16中呈现了DOE的关键结果。结果提供了在pH 7.5下的制剂，该制剂包含150mM的精氨酸，其中20mg/mL的PEG-FGF21可维持与二聚体、聚集和降解相关的所有质量属性。
在持续12个月的长期稳定性下监测具有或不具有PS80的制剂。见图17-图20。长期稳定性证明，通过控制酸变体、二聚体、微粒等，PEG-FGF21维持所有质量属性，同时维持活性，由此证明了作为液体制剂储存的适合性。
表2
表3稳定性研究的测试方法
表4外观结果-12个月稳定性
/>
表5 pH结果-12个月稳定性
表6蛋白质浓度结果-12个月稳定性
表7重量渗透摩尔浓度结果T0数据
制剂编码 mOsm/kg
1 317
2 302
3 303
表8 SEC-HPLC结果-12个月稳定性
表9 icIEF结果-12个月稳定性
表10 RP-HPLC结果-12个月稳定性
表11MFI结果-12个月稳定性
制剂2的稳定性数据示于表12和13中。
表12：在5±3℃下液体制剂的长期稳定性数据
NT＝未测试或未计划测试；ND＝未检测到。HOA＝较高级别聚集体。
a＝添加测试
表13：在25±2℃下液体制剂的加速稳定性数据
NT＝未测试或未计划测试；ND＝未检测到。HOA＝较高级别聚集体。
表14示出制剂的加速曲线，该制剂包含28mg/mL的突变型FGF21肽缀合物、260mM精氨酸HCl、20mM的Tris、0.2mg/ml的PS80，pH 7.1。
表14
下表15提供了基于另外的赋形剂筛选用于进一步优化的分级。
表15
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本文提及的所有公开均通过引用整体并入本文。尽管为了清楚和理解的目的已经详细描述了上述发明，但本领域技术人员通过阅读公开文本将会理解，在不脱离所附权利要求中本发明的真实范围的情况下，可以做出形式和细节上的各种改变。
为了说明的目的，已经在本文中描述了方法和套装的具体实施例。这些仅是实施例。本文提供的技术可应用于除了上述示例系统之外的系统。在本发明的实践中许多改变、修改、添加、省略和置换是可能的。本发明包括对所描述的实施方案的变化，这些变化对技术人员将是显而易见的，这些变化包括通过以下方式获得的变化：用等效特征、元件和/或动作替换特征、元件和/或动作；对来自不同实施方案的特征、元件和/或动作进行混合和匹配；将来自如本文描述的实施方案的特征、元件和/或动作与其他技术的特征、元件和/或动作组合；和/或省略组合来自所述实施方案的特征、元件和/或动作。
上述本发明的实施方案仅旨在是示例性的。本领域技术人员将理解，可以对这些实施方案进行细节的各种修改，所有这些修改都在本发明的范围内。
序列表
<110> 89生物公司
<120> 包含突变型FGF-21肽PEG化缀合物的液体制剂
<130> 180234-011502PCT
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<151> 2021-03-11
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<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
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Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Thr Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 17
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 17
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
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Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Thr Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
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Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 18
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 18
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Thr Pro Gly Leu Pro
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Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 19
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 19
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1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
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His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
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Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
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115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 20
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 20
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
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Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
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Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Thr Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro
145 150 155 160
Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly
165 170 175
Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 21
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 21
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Thr Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 22
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 22
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Thr Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 23
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 23
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Thr Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro
145 150 155 160
Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly
165 170 175
Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 24
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 24
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Thr Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 25
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 25
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Thr Pro
145 150 155 160
Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly
165 170 175
Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 26
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 26
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Thr
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 27
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 27
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Thr Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 28
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 突变体
<400> 28
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Thr Tyr Ala Ser
180

Claims (30)

1.一种包含液体药物组合物的预装填注射器或自动注射器，所述液体药物组合物包含：
(a)10mg/ml至48mg/ml的突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，所述突变型FGF-21肽缀合物包含：
i)突变型FGF-21肽，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，
ii)糖基部分，以及
iii)20kDa聚乙二醇(PEG)，
其中所述突变型FGF-21肽通过在SEQ ID NO:2的氨基酸位置173处的苏氨酸与所述糖基部分的第一位点之间的共价键附接至所述糖基部分，并且其中所述糖基部分通过在所述糖基部分的第二位点与所述20kDa PEG之间的共价键附接至所述20kDaPEG；
(b)150mM至500mM的精氨酸；
(c)0.01％至0.1％(w/v)的聚山梨酯80(PS-80)或聚山梨酯20(PS-20)；
(d)5至25mM的缓冲液，pH 7-8；和
(e)药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的预装填注射器或自动注射器，其中所述液体药物组合物包含约28mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约260mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.1。
3.根据权利要求1所述的预装填注射器或自动注射器，其中所述液体药物组合物包含约20mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约150mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.5。
4.根据权利要求1所述的预装填注射器或自动注射器，其中所述液体药物组合物包含约36mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约200mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.1。
5.根据权利要求1所述的预装填注射器或自动注射器，其中所述液体药物组合物包含约44mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约200mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.1。
6.根据权利要求1所述的预装填注射器或自动注射器，其中所述液体药物组合物包含约44mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约230mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.1。
7.一种液体药物组合物，其包含：
(a)10mg/ml至48mg/ml的突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，所述突变型FGF-21肽缀合物包含：
i)突变型FGF-21肽，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，
ii)糖基部分，以及
iii)20kDa聚乙二醇(PEG)，
其中所述突变型FGF-21肽通过在SEQ ID NO:2的氨基酸位置173处的苏氨酸与所述糖基部分的第一位点之间的共价键附接至所述糖基部分，并且其中所述糖基部分通过在所述糖基部分的第二位点与所述20kDa PEG之间的共价键附接至所述20kDaPEG；
(b)150mM至500mM的精氨酸；
(c)0.01％至0.1％(w/v)的聚山梨酯80(PS-80)或聚山梨酯20(PS-20)；
(d)5至25mM的缓冲液，pH 7-8；和
(e)药学上可接受的载体。
8.一种液体药物组合物，其包含：
(a)10mg/ml至48mg/ml的突变型成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)肽缀合物，所述突变型FGF-21肽缀合物包含：
i)突变型FGF-21肽，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，
ii)糖基部分，以及
iii)20kDa聚乙二醇(PEG)，
其中所述突变型FGF-21肽通过在SEQ ID NO:2的氨基酸位置173处的苏氨酸与所述糖基部分的第一位点之间的共价键附接至所述糖基部分，并且其中所述糖基部分通过在所述糖基部分的第二位点与所述20kDa PEG之间的共价键附接至所述20kDaPEG；
(b)150mM至500mM的精氨酸、50mM至250mM的丙氨酸、50mM至250mM的脯氨酸、50mM至250mM的甘氨酸、50mM至250mM的MgCl2、1至5％(v/v)的甘油、1至5％(v/v)的PEG 400或其组合；
(c)0.01％至0.1(w/v)的聚山梨酯80(PS-80)或聚山梨酯20(PS-20)；
(d)pH 7-8的缓冲液；和
(e)药学上可接受的载体。
9.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，还包含表面活性剂。
10.根据权利要求9所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵、葡萄糖酸钠或其组合。
11.根据权利要求9所述的液体药物组合物，其包含0.05％至0.1％(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵、0.05％至0.1％(w/v)的葡萄糖酸钠或其组合。
12.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，其中所述缓冲液是Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液。
13.根据权利要求12所述的液体药物组合物，其包含20mM的Tris缓冲液。
14.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，其包含20至44mg/ml的突变型FGF-21。
15.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，其包含150mM至275mM的精氨酸。
16.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，其中pH为7.0至7.5。
17.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，其中精氨酸是精氨酸HCl或精氨酸硫酸盐。
18.根据权利要求7所述的液体药物组合物，其包含约28mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约260mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.1。
19.根据权利要求7所述的液体药物组合物，其包含约20mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约150mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.5。
20.根据权利要求7所述的液体药物组合物，其包含约36mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约200mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.1。
21.根据权利要求7所述的液体药物组合物，其包含约44mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约200mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.1。
22.根据权利要求7所述的液体药物组合物，其包含约44mg/mL的突变型FGF-21肽缀合物、约230mM的精氨酸HCl、约20mM的Tris、0.02％(w/v)的PS-80，并且其中pH为约7.1。
23.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，其中所述组合物在2℃至8℃范围内的温度下稳定长达12个月。
24.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，其中所述组合物在室温下稳定至少3个月。
25.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，其中突变型FGF-21肽缀合物与精氨酸的重量比为0.6至0.9。
26.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，其中突变型FGF-21肽缀合物与精氨酸的摩尔比为约0.006至约0.009。
27.根据权利要求7或8所述的液体药物组合物，其具有约250mOsmol/kg至约550mOsmol/kg的重量渗透摩尔浓度。
28.一种容器，其包含权利要求7-27中任一项所述的液体药物组合物。
29.根据权利要求28所述的容器，其中所述容器是预装填注射器、小瓶或自动注射器。
30.一种套装，其包括权利要求28或29所述的容器和用于施用和使用所述液体药物组合物的标签或说明书。
CN202280027650.8A 2021-03-11 2022-03-10 包含突变型fgf-21肽peg化缀合物的液体制剂 Pending CN117120070A (zh)

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