KR20190003546A - 컨쥬게이트 c1 에스테라제 억제제 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 무엇보다도 유전성 혈관부종(HAE)을 포함하는 보체-매개성 질병의 개선된 치료를 위한 컨쥬게이트 C1-INH를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 C1-INH는 페길화된 C1-INH이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 C1-INH는 폴리시알산(PSA) 컨쥬게이트된 C1-INH이다.

Description

컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제 및 그의 용도
관련 출원
본 출원은 2016년 4월 4일에 제출된 미국 가출원 번호 제62/318,003호의 우선권 및 이익을 청구하며, 그의 내용이 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
C1-에스테라제 억제제로도 알려진 C1-억제제(C1-INH)는 세르핀 단백질 슈퍼패밀리(superfamily)의 가장 큰 구성원이다. 이는 보체계의 자발적 활성화를 억제하는 주요 기능을 갖는 상당히 당화된 세린 단백분해효소(proteinase) 억제제이다. C1-INH는 보체 다단계 시스템을 조절하고, 접촉(칼리크레인-키닌(kallikrein-kinin)) 증폭 다단계의 조절에서 중요한 역할을 하며, 응고 및 섬유소 용해계의 조절에 참여한다. Karnaukhova, E., C1-Esterase Inhibitor: Biological Activities and Therapeutic Applications. J Hematol Thromb Dis, 1: 113 (2013).
대상에서 C1-INH의 기능 장애 및/또는 결핍은 보체계의 활성을 억제하는 C1-INH의 실패로 인한 다양한 자가 면역 질환과 관련이 있었다. 이러한 질환의 한 예시는 유전성 혈관부종(hereditary angioedema, HAE)으로, 예측하지 못한 반복되는 염증의 발생으로 특징 지어지는 드물지만 생명을 위협할 가능성이 있는 질병이다. HAE의 증상은 가벼운 외상에 의해 촉발되거나 저절로 일어나는 얼굴, 입 및/또는 기도의 부종을 포함한다. 이러한 부종은 신체의 어떤 부위에서도 일어날 수 있다. 일부 경우에, HAE는 C1-억제제의 낮은 혈장 수준과 연관이 있는 한편, 다른 경우에는 이 단백질이 보통의 양 또는 높은 양으로 순환하지만 기능 장애가 있다. 염증의 발현에 추가하여, 이는 또한 보다 심각하거나 생명을 위협하는 징후, 예컨대 자가 면역 질환 또는 홍반성 루푸스(lupus erythematosus)를 일으킬 수 있다.
인간 혈장 유래 C1 에스테라제 억제제인 CINRYZE®는 HAE의 급성 발작의 치료 및 예방적 용도로 승인되었다. Berinert®(역시 혈장-유래 인간 C1-INH, CSL Behring)는 급성 HAE 발작의 치료용으로 권고된다. Ruconest®(코네스타트 알파(conestat alfa), Pharming N.V.)는 유전자 조작 토끼에서 발현된 재조합 C1-INH이고 급성 HAE 발작의 치료를 위해 정맥내(IV) 투여용으로 권고된다. Ruconest®는 인간 혈장 유래 C1-INH와 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 유전자 이식 토끼에서 제조된다. Ruconest는 약 2.4~2.7 시간의 매우 짧은 반감기를 갖는다. Ruconest ® FDA 라벨 및 처방 정보 참조.
다양한 C1 에스테라제 매개 징후들의 치료 및 예방을 위한 개선된 C1 에스테라제 억제제에 대한 필요가 여전히 있다.
본 발명은 무엇보다도 HAE를 포함하여 다양한 보체-매개성 질병을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있는 개선된 지속성 C1 에스테라제 억제제를 제공한다.
특히, 본 발명은 혈장 유래 C1-INH와 유사하거나 훨씬 긴 반감기를 보이는 C1 에스테라제 억제제 컨쥬게이트("컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제"라고도 지칭됨)를 제공한다. 본 발명은 페길화(PEGylated)되고 폴리시아릴화된 C1-INH가 예컨대, 적어도 4일의 연장된 혈청 반감기를 가질 수 있다는 놀라운 발견에 어느 정도 기초한다. 컨쥬게이트 C1-INH의 긴 혈청 반감기는 우수한 생체내 효능을 가져오고, 보다 좋은 투여 요법 및 투여 경로를 가능하게 한다고 여겨진다. 예를 들어, 본원에 기재된 컨쥬게이트 C1-INH는 여전히 원하는 효능(예컨대, 예방)을 달성하면서도, 현재 승인된 C1-INH 치료제와 비교하여 감소된 빈도로 피하 또는 정맥내 투여될 수 있다. 본원에 기재된 컨쥬게이트 C1 억제제 단백질은 혈장 유래 또는 재조합 생산 C1-INH를 이용하여 생산될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 컨쥬게이트 C1-INH는 비용 효율적인 방식으로 혈액 공급에 의존하지 않고 제조될 수 있다. 이들은 배양된 세포에서 재조합하여 생산될 수 있으므로, 인간 혈액, 인간 혈액 성분(예컨대, 혈장) 또는 동물의 젖으로부터 정제된 산물보다 생산 및 최종 산물에서 보다 나은 일관성을 제공한다. 따라서, 본 발명은 HAE 및 다른 보체-매개성 질병의 치료에 있어서 보다 안전하고 보다 효율적인 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 C1-INH 단백질과 C1-INH 단백질에 공유 결합된 적어도 하나의 PEG 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트 C1-INH를 제공한다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 적어도 하나의 글리칸 잔기를 포함하고, 적어도 하나의 PEG 모이어티는 적어도 하나의 글리칸 잔기와 공유 결합한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 PEG 모이어티는 옥심 결합을 통해 C1-INH 단백질에 공유 결합한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 PEG 모이어티는 글리칸 잔기 또는 C1-INH의 아민기에 공유 옥심 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 PEG 모이어티는 글리칸 잔기에 공유 옥심 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 PEG 모이어티는 C1-INH의 아민기에 공유 옥심 결합을 형성한다.
일부 구현예에서, 글리칸 잔기는 시알산 잔기 또는 C1-INH의 갈락토스 잔기이다. 일부 구현예에서, 글리칸 잔기는 시알산 잔기이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 C1-INH 단백질은 재조합하여 생산되거나 혈장 유래된다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 37 또는 서열번호 38과 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 C1-INH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 C1-INH 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른 L234A 및 L235A에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른 IgG1의 Thr250, Met252, Ser254, Thr256, Thr307, Glu380, Met428, His433, 및/또는 Asn434에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 C1-INH 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된 알부민 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 약 50% 이하(예컨대, 45% 이하, 40% 이하, 35 % 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15 % 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하)의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는 C1-INH 단백질을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 약 5% 내지 약 25%의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는 C1-INH 단백질을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 평균적으로 분자당 적어도 약 30%(예컨대, 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 하전된 글리칸을 포함하는 C1-INH 단백질을 제공한다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 만노스, α-갈락토스, NGNA, 또는 올리고만노스형 당화 중 하나 이상을 약 20% 미만(예컨대, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만)으로 함유한다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 하기 중 하나 이상을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다: 약 5% 내지 약 30%의 중성 글리칸 종; 약 10% 내지 약 30%의 모노-시알화 글리칸 종; 약 30% 내지 약 50%의 디-시알화 글리칸 종; 약 15% 내지 약 35%의 트리-시알화 글리칸 종; 및/또는 약 5% 내지 약 15%의 테트라-시알화 글리칸 종.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 다음을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다: 30% 이하의 중성 글리칸 종; 약 20% 내지 약 30%의 모노-시알화 글리칸 종; 약 30% 내지 약 40%의 디-시알화 글리칸 종; 약 10% 내지 약 20%의 트리-시알화 글리칸 종; 및 약 5% 내지 약 10%의 테트라-시알화 글리칸 종.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 평균적으로 분자당 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 시알화 글리칸 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 평균적으로 단백질의 몰당 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 몰의 시알산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 당화 프로파일을 갖는 C1-INH 단백질은 융합 단백질이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 당화 프로파일을 갖는 C1-INH 단백질은 비컨쥬게이트(unconjugated) 단백질이다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질에 컨쥬게이트된 PEG는 분자량이 약 1 KDa 내지 50 KDa, 약 1 KDa 내지 40 KDa, 약 5 KDa 내지 40 KDa, 약 1 KDa 내지 30 KDa, 약 1 KDa 내지 25 KDa, 약 1 KDa 내지 20 KDa, 약 1 KDa 내지 15 KDa, 약 1 KDa 내지 10 KDa, 또는 약 1 KDa 내지 5 KDa이다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질에 컨쥬게이트된 PEG는 분자량이 약 1 KDa, 2 KDa, 3 KDa, 4 KDa, 5 KDa, 10 KDa, 15 KDa, 20 KDa, 25 KDa, 30 KDa, 35 KDa, 40 KDa, 45 KDa, 또는 50 KDa이다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질에 컨쥬게이트된 PEG는 선형 또는 가지형 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 가지형 PEG 모이어티는 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 팔(arm) 가지를 갖는다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH는 PEG/C1-INH 비율이 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5이다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 인간 C1-INH 단백질의 반감기보다 크거나 그와 유사한 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH의 반감기는 혈장 유래 C1-INH의 반감기의 100%~500% 범위이다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH 단백질이 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 또는 170 시간의 반감기를 갖는다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH가 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일의 반감기를 갖는다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 인간 C1-INH 단백질의 고유 활성(specifc activity)의 50%~150% 범위의 고유 활성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 제조하는 방법으로서, 적어도 하나의 글리칸 잔기 및/또는 적어도 하나의 아민기를 포함하는 C1-INH 단백질을 공급하는 단계, 및 PEG 모이어티가 적어도 하나의 글리칸 잔기 및/또는 적어도 하나의 아민기와 반응하여 결합을 형성할 수 있는 조건 하에서 PEG 모이어티를 공급하여 컨쥬게이트 C1-INH를 제조하는 단계;를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, PEG 모이어티는 PEG-CH2-O-NH2를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 글리칸 잔기는 시알산 잔기이다. 추가 구현예에서, 적어도 하나의 글리칸 잔기는 갈락토스 잔기이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 하나의 글리칸 잔기를 PEG 모이어티와 반응하기 전에 산화시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 산화 단계는 과요오드 산화를 포함한다. 일부 구현예에서, 과요오드 산화는 과요오드산염 대 C1-INH의 몰비가 약 20:1 내지 약 50:1로 수행된다. 일부 구현예에서, 과요오드산염 대 PEG의 몰비가 약 2.5 내지 약 40이다. 일부 구현예에서, PEG 대 C1-INH의 몰비가 약 25:1 내지 100:1이다.
추가 구현예에서, 본 방법은 컨쥬게이트 C1-INH를 정제하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 단계는 음이온 교환, 접선 유동 여과 투석 여과(tangential flow filtration diafiltration), 및 투석 중 하나 이상을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH를 포함하는 약학적 조성물은 액체이다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH를 포함하는 약학적 조성물은 동결건조된 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 컨쥬게이트 C1-INH(예컨대, 액상 및 동결건조 형태)를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 주사기를 함유한다. 일부 구현예에서, 주사기에 컨쥬게이트 C1-INH를 포함하는 약학적 조성물이 미리 담겨 있다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 동결건조되어 있고, 키트는 재구성 버퍼를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상에게 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 보체-매개성 질병 치료 방법을 제공한다.
관련된 양태에서, 본 발명은 보체-매개성 질병을 치료하기 위한 의약품의 제조에 있어서, 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 보체-매개성 질병은 유전성 혈관부종, 항체 매개성 거부 반응, 시신경 척수염 범주 질환, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 뇌허혈 손상, 화상, 독성 표피 괴사용해, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 뇌졸중, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 중증 근무력증, 및/또는 다초점성 운동 신경병증으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 조성물로서, 적어도 하나의 글리칸 잔기를 포함하는 C1-INH 단백질; 및 적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 모이어티를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 모이어티는 적어도 하나의 글리칸 잔기와 공유 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 조성물로서, 적어도 하나의 글리칸 잔기를 포함하는 C1-INH 단백질; 및 적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 모이어티를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 모이어티는 옥심 결합 또는 히드라존 결합을 통해 C1-INH 단백질에 공유 결합한다. 일부 구현예에서, 폴리시알산(PSA) 모이어티는 옥심 결합을 통해 C1-INH 단백질에 공유 결합한다. 일부 구현예에서, 폴리시알산(PSA) 모이어티는 옥심 결합을 통해 C1-INH 단백질에 공유 결합한다. 일부 구현예에서, 옥심 결합은 PSA 모이어티와 C1-INH의 글리칸 잔기 또는 아민기 사이에 있다.
일부 구현예에서, 글리칸 잔기는 시알산 잔기이다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 재조합하여 생산되거나 혈장 유래된다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 37 또는 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 C1-INH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 C1-INH 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른 L234A 및 L235A에 상응하는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 C1-INH 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된 알부민 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 페길화 이전에 약 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35 % 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15 % 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 페길화 이전에 약 5% 내지 약 25%의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 평균적으로 분자당 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 하전된 글리칸을 포함한다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 PSA와 컨쥬게이션하기 이전에, 만노스, α-갈락토스, NGNA, 또는 올리고만노스형 당화 중 하나 이상을 약 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만으로 함유한다.
일부 구현예에서, PSA와 컨쥬게이션하기 이전에, C1-INH 단백질이 하기 중 하나 이상을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다: 약 5% 내지 약 30%의 중성 글리칸 종; 약 10% 내지 약 30%의 모노-시알화 글리칸 종; 약 30% 내지 약 50%의 디-시알화 글리칸 종; 약 15% 내지 약 35%의 트리-시알화 글리칸 종; 또는 약 5% 내지 약 15%의 테트라-시알화 글리칸 종.
일부 구현예에서, PSA와 컨쥬게이션하기 이전에, C1-INH 단백질이 다음을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다: 30% 이하의 중성 글리칸 종; 약 20% 내지 약 30%의 모노-시알화 글리칸 종; 약 30% 내지 약 40%의 디-시알화 글리칸 종; 약 10% 내지 약 20%의 트리-시알화 글리칸 종; 및 약 5% 내지 약 10%의 테트라-시알화 글리칸 종.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 평균적으로 분자당 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 시알화 글리칸 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 평균적으로 단백질의 몰당 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 몰의 시알산을 포함한다.
일부 구현예에서, PSA는 분자량이 약 1 KDa 내지 50 KDa, 약 1 KDa 내지 40 KDa, 약 5 KDa 내지 40 KDa, 약 1 KDa 내지 30 KDa, 약 1 KDa 내지 25 KDa, 약 1 KDa 내지 20 KDa, 약 1 KDa 내지 15 KDa, 약 1 KDa 내지 10 KDa, 또는 약 1 KDa 내지 5 KDa이다.
일부 구현예에서, PSA는 분자량이 약 1 KDa, 5 KDa, 10 KDa, 15 KDa, 20 KDa, 25 KDa, 30 KDa, 35 KDa, 40 KDa, 45 KDa, 또는 50 KDa이다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH는 PSA/C1-INH 비율이 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5이다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 인간 C1-INH의 반감기보다 크거나 그와 유사한 반감기를 갖는다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 C1-INH의 반감기의 100%~500% 범위의 반감기를 갖는다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH가 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 또는 170 시간의 반감기를 갖는다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH가 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일의 반감기를 갖는다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 인간 C1-INH의 고유 활성의 50%~150% 범위의 고유 활성을 갖는다.
추가 양태에서, 본 발명은 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 글리칸 잔기 및/또는 적어도 하나의 아민기를 포함하는 C1-INH 단백질을 공급하는 단계, 및 폴리시알산(PSA) 모이어티가 적어도 하나의 글리칸 잔기 및/또는 적어도 하나의 아민기와 반응하여 결합을 형성할 수 있는 조건 하에서 PSA 모이어티를 공급하여 컨쥬게이트 C1-INH를 제조하는 단계;를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 글리칸 잔기는 시알산 잔기이다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 글리칸 잔기를 PSA 모이어티와 반응하기 전에 산화시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 산화 단계는 과요오드 산화를 포함한다. 일부 구현예에서, 과요오드 산화는 과요오드산염 대 C1-INH의 몰비가 약 20:1 내지 약 50:1로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 과요오드산염 대 PEG의 몰비가 약 2.5 내지 약 40일 수 있다.
일부 구현예에서, PSA 대 C1-INH의 몰비가 약 25:1 내지 100:1이다.
일부 구현예에서, 방법은 컨쥬게이트 C1-INH를 정제하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 정제 단계는 음이온 교환, 접선 유동 여과 투석 여과, 및 투석 중 하나 이상을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태 또는 구현예의 방법에 의해 생산된 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태 또는 구현예의 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 약학적 조성물의 조성물은 액체이다. 일부 구현예에서, 상기 약학적 조성물의 조성물은 동결건조된 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 상기 양태 또는 구현예의 약학적 조성물 및 주사기를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 주사기는 약학적 조성물이 미리 담겨져 있다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물이 동결건조되어 있고, 키트는 재구성 버퍼를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상에게 상기 양태 또는 구현예의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 보체-매개성 질병 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 보체-매개성 질병은 유전성 혈관부종, 항체 매개성 거부 반응, 시신경 척수염 범주 질환, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 뇌허혈 손상, 화상, 독성 표피 괴사용해, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 뇌졸중, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 중증 근무력증, 다초점성 운동 신경병증으로부터 선택된다.
추가 양태에서, 본 발명은 보체-매개성 질병을 치료하기 위한 의약품의 제조에 있어서, 상기 양태 또는 구현예의 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 보체-매개성 질병은 유전성 혈관부종, 항체 매개성 거부 반응, 시신경 척수염 범주 질환, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 뇌허혈 손상, 화상, 독성 표피 괴사용해, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 뇌졸중, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 중증 근무력증, 및/또는 다초점성 운동 신경병증으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 하기의 상세한 설명에서 명백하다. 하지만, 본 발명의 구현예를 명시하는 상세한 설명은 단지 예시를 위한 것일 뿐 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형 및 수정 사항이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
도면은 단지 예시적인 목적이며 제한하고자 하는 것이 아니다.
도 1은 C1-INH의 개략적인 표현이다. 오른쪽에서 왼쪽으로 세개의 도메인은 신호 펩티드, N-말단 도메인이라고도 하는 N-말단, 및 세르핀 도메인이다. N-결합 글리칸은 마름모꼴 머리를 가진 긴 수직선으로 나타내고, O-결합 글리칸은 짧은 수직선으로 나타낸다.
도 2는 성숙 C1-INH 아미노산 서열 및 페길화를 위한 잠재 부위를 도시한다.
도 3은 예시적인 아민 매개 페길화를 도시하는 화학식의 개략을 도시한다.
도 4a는 예시적인 글리칸 매개 아미녹시(aminoxy) 페길화를 도시하는 화학식의 개략도이다. 도 4b는 예시적인 시알산 매개(SAM) 아미녹시 페길화를 도시하는 화학식의 개략도이다.
도 5는 예시적인 갈락토스 매개(GAM) 페길화를 도시하는 화학식의 개략도이다.
도 6의 패널 A 및 B는 시알산과 비교하여 아미노기를 통한 C1-INH 페길화(5 KDa 또는 40 KDa 둘 중 하나)의 예비 랫 연구의 결과를 도시한다. rhC1-INH 및 Cinryze가 비교대상으로 제공된다. 패널 C는 5 KDa 또는 40 KDa PEG로 페길화된 C1-INH의 SDS-PAGE 겔을 도시한다.
도 7은 예시적인 페길화 공정 A의 개략을 도시한다.
도 8은 예시적인 페길화 공정 B의 개략을 도시한다.
도 9의 A-E는 페길화 C1-INH를 위해 적합한 몇 가지 예시적 페길화 프로토콜을 요약하는 개략도를 도시한다.
도 10a는 5KSAM KHR5 옥틸 로드 샘플의 C1-INH-PEG IC50을 도시한다. 도 10b는 TFF로 자유 PEG를 제거하기 전과 후의 C1-INH-PEG IC50을 도시한다.
도 11은 자유 PEG 및 다른 오염물질로부터 정제한 예시적인 40 KDa 페길화된 C1-INH의 크로마토그래피 결과를 도시한다.
도 12는 자유 PEG 및 다른 오염물질로부터 정제한 예시적인 20 KDa 페길화된 C1-INH의 크로마토그래피 결과를 도시한다.
도 13은 자유 PEG 및 다른 오염물질로부터 정제한 예시적인 5 KDa 페길화된 C1-INH의 크로마토그래피 결과를 도시한다.
도 14는 페길화된 rhC1 INH 대 rhC1 INH의 정맥내 투여의 비-인간 영장류(NHP) PK 시험의 결과를 도시한다.
도 15는 변화된 C1-INH-PEG 로드를 NHP에 투여한 NHP PK 시험의 결과를 도시한다.
도 16은 페길화된 rhC1-INH의 정맥내 대 피하 NHP 시험의 결과를 도시한다.
도 17은 변화된 5KPEG 로딩으로 C1-INH-PEG 샘플 상의 랫 PK 역가 분석의 결과를 도시한다.
도 18의 패널 A-E는 C1-INH-PEG의 순도를 도시하는 일련의 그래프와 겔을 도시한다. 패널 A 및 B는 C1-INH-PEG 샘플에서 자유 PEG를 탐지하는 데 사용된 바륨-아이오딘 염색 SDS-PAGE 겔이다. 패널 C 및 D는 C1-INH-PEG 샘플에서 자유 PEG 1K 및 2K를 탐지하는 데 사용된 RP-HPLC 그래프이다. 패널 E는 C1-INH 샘플이 로딩된 두 개의 SDS-PAGE 겔을 도시한다.
도 19의 패널 A-C는 SAM 공정으로 컨쥬게이트된 C1-INH-PEG 샘플의 순도, IC50, 및 PK 데이터를 도시하는 일련의 그래프 및 겔을 도시한다. 패널 A는 다양한 C1-INH 샘플의 IC50 그래프이다. 패널 B는 C1-INH 샘플 순도 및 연관된 C1-INH 샘플 IC50 값을 도시하는 SDS-PAGE 겔이다. 패널 C는 랫이 C1-INH-PEG 및 비페길화 C1-INH를 정맥내 투여받은 랫 시험으로부터 PK 값을 도시하는 그래프이다.
도 20의 패널 A, B, 및 C는 C1-INH IC50 값을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 21은 C1-INH에 대한 예시적인 아민 커플링 페길화 공정에 대한 개략도를 도시한다.
도 22의 패널 A-D는 C1-INH-PEG의 순도를 도시하는 일련의 그래프와 겔을 도시한다. 패널 A는 C1-INH-PEG 샘플에서 자유 PEG를 탐지하는 데 사용된 바륨 아이오딘 염색 SDS-PAGE 겔이다. 패널 B는 자유 PEG 1K 및 2K의 탐지에 대한 RP-HPLC 그래프를 도시한다. 패널 C 및 D는 자유 NHS-PEG20K(패널 C) 및 NHS-PEG40K(패널 D)에 대한 정제 크로마토그램을 도시한다.
도 23의 패널 A-C는 C1-INH 샘플의 순도, IC50, 및 PK 데이터를 도시하는 일련의 그래프 및 겔을 도시한다. 패널 A는 다양한 C1-INH 샘플의 IC50 그래프이다. 패널 B는 랫이 C1-INH-PEG 및 비페길화 C1-INH를 정맥내 투여받은 랫 시험으로부터 PK 값을 도시하는 그래프이다. 패널 C는 C1-INH 샘플 순도 및 연관된 C1-INH 샘플 IC50 값을 도시하는 SDS-PAGE 겔이다.
도 24의 패널 A 및 B는 시알산 매개(SAM) 공정으로 생산된 C1-INH-PSA의 순도를 도시하는 겔 및 그래프를 도시한다. 패널 A는 SDS 겔이고, 패널 B는 C1-INH-PSA의 IC50 그래프이다.
도 25의 패널 A, B, 및 C는 랫이 C1-INH-PEG, C1-INH-PSA, Cinryze-PEG, C1-INH, 또는 Cinryze를 정맥내 투여받은 랫 시험으로부터 PK 값을 나타내는 일련의 그래프를 도시한다.
정의
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여, 특정 용어를 아래와 같이 정의한다. 다음의 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가적인 정의가 본 명세서 전체를 통하여 설명된다.
동물: 본원에서 사용되는 바, 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 말한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 인간을 말한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 비인간 동물을 말한다. 특정 구현예에서, 비인간 동물은 포유류(예컨대, 설치류, 마우스, 랫, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 동물은 이에 제한되지는 않지만, 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및/또는 벌레를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 유전자 도입 동물, 유전 공학으로 생성된 동물(genetically-engineered animal) 및/또는 복제 동물일 수 있다.
대략(Approximately) 또는 약(about): 본원에서 사용되는 바, 용어 "약" 및 "대략"은 동등하게 사용된다. 본원에서 사용된 약/대략이 있거나 없는 임의의 수치들은 당업자에게 이해되는 임의의 보통의 변동을 포함시키는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 '대략' 또는 '약'은 관심있는 하나 이상의 수치들에 적용되는 경우, 진술된 기준 수치와 유사한 수치를 말한다. 특정 구현예에서, 용어 '대략' 또는 '약'은, 달리 진술되거나 달리 내용으로부터 분명한 경우가 아닌 한(이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함), 진술된 기준 수치의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 말한다.
생체 이용률(Bioavailability): 본원에서 사용되는 바, 용어 "생체 이용률"은 일반적으로 대상의 혈류에 도달하는 투여된 용량의 백분율을 말한다.
생물학적으로 활성이 있는(Biologically active): 본원에서 사용되는 바, 용어구 "생물학적으로 활성이 있는"은 생물학적 체계(biological system)에서, 특히 유기체에서 활성을 가지는 임의의 제제의 특성을 나타낸다. 예를 들어, 유기체에 투여될 때 본 유기체에 미치는 생물학적 효과를 가지는 제제는 생물학적으로 활성이 있는 것으로 여겨진다. 상세한 구현예에서, 폴리펩티드가 생물학적으로 활성이 있는 경우, 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 공유하는 폴리펩티드의 부분은 전형적으로 "생물학적으로 활성이 있는" 부분으로서 지칭된다.
담체(carrier) 또는 희석제(diluent): 본원에서 사용되는 바, 용어 "담체" 또는 "희석제"는 약학적 제형물의 제조에 유용한 약학적으로 허용가능한(예컨대, 인간에게 투여 시 안전하고 비-독성인) 담체 또는 희석 물질을 말한다. 대표적인 희석제는 멸균수(sterile water), 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection, BWFI), pH 완충용액(예로, 인산염-완충 식염수), 멸균 식염수 용액, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
C-1 억제제 또는 C1 에스테라제 억제제 또는 C1-INH: 본원에서 사용되는 바, 용어 "C1-억제제" 도는 "C1 에스테라제 억제제" 또는 "C1-INH"는 모두 상호 교환적으로 사용될 수 있고 달리 특정하지 않는 한, 실질적인 C1-INH 생물학적 활성을 보유하는 임의의 야생형, 토착형, 자연 발생, 재조합 생산, 및/또는 변형 C1-INH 단백질(예컨대, 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 결실, 절단, 삽입 및/또는 융합 단백질을 갖는 C1-INH 단백질)을 지칭할 수 있다. "C1-억제제" 또는 "C1 에스테라제 억제제" 또는 "C1-INH"는 융합 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, C1-INH 융합 단백질은 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, C1-INH 융합 단백질은 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인 및 알부민 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 링커를 더 포함한다. C1-INH 단백질은 재조합 세포에서 재조합형으로 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, C1-INH는 포유류 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 또는 인간 세포, 바람직하게는 HT1080 또는 HEK 세포에서 발현된다.
컨쥬게이트: 본원에서 사용되는 바, 용어 "컨쥬게이트"는 단백질에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 모이어티를 지칭할 수 있다. 전형적으로, 단백질이 컨쥬게이트에 결합되는 경우, 이를 컨쥬게이트 단백질 또는 단백질 컨쥬게이트라고 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 컨쥬게이트는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 단백질이 PEG 모이어티에 결합되는 경우, 이를 페길화된 단백질이라고 지칭할 수 있다.
기능적 동등물 또는 유도체(Functional equivalent or derivative): 본원에서 사용되는 바, 용어 "기능적 등가물" 또는 "기능적 유도체"는 아미노산 서열의 기능적 유도체의 환경에서, 본래 서열과 상당히 유사한 생물학적 활성(기능 또는 구조 둘 중 하나)을 유지하는 분자를 나타낸다. 기능적 유도체 또는 동등물은 천연 유도체일 수 있거나 합성하여 제조된다. 대표적인 기능적 유도체는 단백질의 활성이 보존된다면, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 또는 첨가를 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 치환 아미노산은 바람직하게는 치환 아미노산의 특성과 유사한 물리화학적 특성을 갖는다. 바람직한 유사한 물리화학적 특성은 전하, 부피가 큼(bulkiness), 소수성, 친수성 등의 유사성을 포함한다.
융합 단백질: 본원에서 사용되는 바, 용어 "융합 단백질" 또는 "키메라 단백질(chimeric protein)"은 둘 이상의 본래 별개의 단백질들 또는 그의 부분들의 연결을 통해 생성된 단백질을 말한다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서(spacer)는 각각의 단백질 사이에 존재할 것이다.
반감기: 본원에서 사용되는 바, 용어 "반감기"는 단백질 농도나 활성과 같은 양이 시작 시점에 측정된 수치의 절반으로 떨어지는 데 필요한 시간이다.
유전성 혈관부종 또는 HAE: 본원에서 사용되는 바, 용어 "유전성 혈관부종" 또는 "HAE"는 예측하지 못한 반복되는 염증의 발생으로 특징 지어지는 혈관 장애를 지칭한다. HAE는 전형적으로 C1-INH 결핍과 연관되고, 이는 손상된 또는 감소된 활성을 갖는 C1-INH 또는 C1-INH의 낮은 레벨의 결과일 수 있다. 증상은 이에 제한되지 않지만, 예컨대 얼굴, 사지, 생식기, 위장관, 및 상기도와 같은 신체의 임의의 부분에서 발생하는 부종을 포함한다.
개선하다(Improve), 증가하다(increase) 또는 감소하다(reduce): 본원에서 사용되는 바, 용어 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다" 또는 문법적으로 동등한 용어는 본원에 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정 또는 본원에 기술된 치료의 부재 시 대조군 대상(또는 다수의 대조군 대상들)에서의 측정과 같은 기준 측정(baseline measurement)과 관련된 수치들을 나타낸다. "대조군 대상"은 치료 받는 대상과 동일한 형태의 질환에 걸린, 치료 받는 대상과 거의 동일한 연령인 대상이다.
생체외(In Vitro): 본원에서 사용되는 바, 용어 "생체외"는 다세포 유기체 내 보다는 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등과 같은 인공적인 환경에서 발생하는 사건을 말한다.
생체내(In Vivo): 본원에서 사용되는 바, 용어 "생체내"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 말한다. 세포-기반 시스템의 상황에서, 상기 용어는 (예를 들어, 생체외 시스템에 반대되는) 살아있는 세포 내에서 발생하는 사건을 말하는 데 사용될 수 있다.
링커: 본원에서 사용되는 바, 용어 "링커"는 천연 단백질에서 특정한 위치에서 나타나는 것 이외의 융합 단백질에서의 아미노산 서열을 말하고, 일반적으로 두 개의 단백질 모이어티 사이에 α-헬릭스와 같은 구조를 삽입하거나 유연하도록 설계된다. 링커는 또한 스페이서(spacer)로도 지칭된다. 링커 또는 스페이서는 일반적으로 그 자체의 생물학적 기능은 가지지 않는다.
폴리펩티드(Polypeptide): 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합으로 서로 연결된 아미노산의 연속적인 사슬을 말한다. 본 용어는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 지칭하는 데 사용되지만, 당업자라면 본 용어가 긴 사슬에 제한되지 않고 펩티드 결합을 통해 함께 연결되는 2개의 아미노산을 포함하는 최소한의 사슬을 지칭할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 폴리펩티드는 가공되고/되거나 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 상호교환적으로 사용된다.
예방하다(Prevent): 본원에서 사용되는 바, 질환, 장애, 및/또는 질병의 발생과 연관되어 사용될 때, 용어 "예방하다" 또는 "예방"은 질환, 장애, 및/또는 질병이 발병할 위험을 줄이는 것을 말한다. "위험"의 정의 참조
단백질: 본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 별개의 단위로서 기능하는 하나 이상의 폴리펩티드를 말한다. 단일 폴리펩티드가 별개의 기능 단위이고 별개의 기능 단위를 구성하기 위하여 다른 폴리펩티드와의 영구적인 또는 일시적인 물리적 결합을 필요로 하지 않는 경우, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 별개의 기능 단위가 서로 물리적으로 결합하는 하나를 초과하는 폴리펩티드로 구성되는 경우, 용어 "단백질"은 물리적으로 결합되고 별개의 단위로서 함께 기능하는 다중 폴리펩티드를 말한다.
위험: 문맥으로부터 이해될 것이지만, 질환, 장애, 및/또는 질병의 "위험"은 특정한 개인이 질환, 장애, 및/또는 질병(예컨대, 근이영양증(muscular dystrophy))에 걸릴 가능성을 포함한다. 일부 구현예에서, 위험은 백분율로서 표현된다. 일부 구현예에서, 위험은 0%부터 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%까지이다. 일부 구현예에서, 위험은 참고 샘플의 그룹 또는 참고 샘플과 연관된 위험에 상대적으로 비교한 위험으로서 표현된다. 일부 구현예에서, 참고 샘플 또는 참고 샘플의 그룹은 질환, 장애, 질병 및/또는 사건(예컨대, 근이영양증)의 공지된 위험을 갖는다. 일부 구현예에서, 참고 샘플 또는 참고 샘플의 그룹은 특정한 개인과 유사한 개인들로부터 채취한다. 일부 구현예에서, 상대적인 위험은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상이다.
대상(Subject): 본원에서 사용되는 바, 용어 "대상"은 인간 또는 임의의 비인간 동물(예컨대, 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 말한다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다. 많은 구현예에서, 대상은 인간이다. 대상은 환자일 수 있고, 이는 의료 제공자에게 질환의 진단 또는 치료를 위해 가는 사람을 말한다. 용어 "대상"은 본원에서 "개인" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상은 질환 또는 장애에 걸릴 수 있거나 취약하지만 질환 또는 장애의 증상을 보일 수 있거나 보이지 않을 수 있다.
실질적으로(substantially): 본원에서 사용되는 바, 용어 "실질적으로"는 관심있는 특성 또는 성질의 보이는 전체 또는 거의 전체 규모 또는 정도의 정성적인 상태를 말한다. 생물학 기술분야의 당업자라면 생물학 및 화학적 현상은 완성되고/되거나 완전하게 진행되거나 절대적인 결과를 달성하거나 피하는 일이 설사 있다하더라도 극히 드물다는 것을 이해할 것이다. 그러므로 본원에서 용어 "실질적으로"는 많은 생물학 및 화학적 현상에 고유한 완전함의 잠재적 결핍을 담아내는 데 사용된다.
실질적인 상동성(Substantial homology): 용어구 "실질적인 상동성"은 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 비교를 말하는 것으로 본원에서 사용된다. 당업자라면 인정할 것으로서, 일반적으로 두 개의 서열은 그들의 해당하는 위치에서 상동인 잔기들을 포함하는 경우 "실질적으로 상동(substantially homologous)"인 것으로 간주된다. 상동인 잔기는 동일한 잔기일 수 있다. 대안으로, 상동인 잔기는 적절하게 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징을 갖는 비-동일 잔기일 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 전형적으로 특정 아미노산들은 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄들을 가지는 것으로서 분류된다. 하나의 아미노산을 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것은 종종 "상동성" 치환이라고 간주될 수 있다.
당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN, 아미노산 서열의 경우 BLASTP, 갭(gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것들을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 대표적인 프로그램들은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기술되어 있다. 상동인 서열을 확인하는 것에 추가하여, 상기에 언급된 프로그램들은 전형적으로 상동성의 정도 표시를 제공한다. 일부 구현예에서, 두 개의 서열은 잔기들의 적절한 연장길이(stretch)에 걸쳐서 해당하는 그들의 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이 상동인 경우라면 실질적으로 상동인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 적절한 연장길이는 완전한 서열이다. 일부 구현예에서, 적절한 연장길이는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500개 이상의 잔기들이다.
실질적인 동일성(Substantial identity): 용어구 "실질적인 동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 비교를 말하는 것으로 본원에서 사용된다. 당업자라면 인정할 것으로, 두 개의 서열은 그들의 해당하는 위치에서 동일한 잔기들을 포함하는 경우 "실질적으로 동일한(substantially identical)" 것으로 간주된다. 당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN, 아미노산 서열의 경우 BLASTP, 갭 BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것들을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 대표적인 프로그램들은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기술되어 있다. 동일한 서열들을 확인하는 것에 추가하여, 상기에 언급된 프로그램들은 전형적으로 동일성의 정도 표시를 제공한다. 일부 구현예에서, 두 개의 서열은 잔기들의 적절한 연장길이에 걸쳐서 해당하는 그들의 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이 동일한 경우라면 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 적절한 연장길이는 완전한 서열이다. 일부 구현예에서, 적절한 연장길이는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500개 이상의 잔기들이다.
앓고 있는(suffering from): 질환, 장애, 및/또는 질병을 "앓고 있는" 개인은 질환, 장애, 및/또는 질병의 하나 이상의 증상을 보이거나 진단받았다.
취약한(susceptible to): 질환, 장애, 및/또는 질병에 "취약한" 개인은 질환, 장애, 및/또는 질병을 진단받지 않았다. 일부 구현예에서, 질환, 장애, 및/또는 질병에 취약한 개인은 질환, 장애, 및/또는 질병의 증상들을 보이지 않을 수도 있다. 일부 구현예에서, 질환, 장애, 질병, 또는 사건(예를 들어, DMD)에 취약한 개인은 하기 중 하나 이상으로 특징지어 질 수 있다: (1) 질환, 장애, 및/또는 질병의 발병과 연관된 유전적 돌연변이; (2) 질환, 장애, 및/또는 질병의 발병과 연관된 유전적 다형성(polymorphism); (3) 질환, 장애, 및/또는 질병과 연관된 단백질의 발현 및/또는 활성의 증가 및/또는 감소; (4) 질환, 장애, 질병 및/또는 사건의 발병과 연관된 습관 및/또는 생활 방식으로 (5) 이는 이식을 받거나 받을 예정이거나 필요로 하는 것. 일부 구현예에서, 질환, 장애, 및/또는 질병에 취약한 개인은 질환, 장애, 및/또는 질병이 발병될 것이다. 일부 구현예에서, 질환, 장애, 및/또는 질병에 취약한 개인은 질환, 장애, 및/또는 질병이 발병되지 않을 것이다.
치료 유효량(Therapeutically effective amount): 본원에서 사용되는 바, 용어 치료제의 "치료 유효량"은 질환, 장애 및/또는 질병을 앓고 있거나 이에 취약한 대상에게 투여했을 때, 질환, 장애 및/또는 질병의 증상(들)의 발현을 치료, 진단, 예방 및/또는 지연하는 데 충분한 양을 의미한다. 당업자라면 치료 유효량이 일반적으로 적어도 하나의 단위 투여량을 포함하는 투여 요법을 통해 투여되는 것을 인정할 것이다.
치료하는(treating): 본원에서 사용되는 바, 용어 "치료하다(treat)", "치료(treatment)" 또는 "치료하는"은 부분적으로 또는 완벽하게 특정한 질환, 장애 및/또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 특징을 경감시키고, 개선시키고, 완화시키고, 억제하고, 예방하고, 발병을 지연시키고, 중증도를 감소 시키고/시키거나 이의 빈도를 감소시키는 임의의 방법을 말한다. 질환의 징후를 보이지 않고/않거나 질환의 초기 징후만을 보이는 대상에게 질환과 관련된 병상이 생길 위험을 감소시킬 목적으로 치료가 시행될 수 있다.
특정 구현예의 상세한 설명
본 발명은 무엇보다도 유전성 혈관부종(HAE)을 포함하는 보체-매개성 질병의 개선된 치료를 위한 컨쥬게이트 C1-INH를 제공한다. 특히, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 C1-INH는 페길화된 C1-INH이다.
컨쥬게이트 C1-INH(예컨대, 페길화된 C1-INH, 또는 폴리시알산(PSA) 컨쥬게이트 C1-INH)가 비컨쥬게이트(예컨대, 비-페길화)이지만 다른 점에서는 C1-INH와 동일한 것과 비교하여 연장된 반감기를 갖는 것으로 여겨진다. 본 발명에 따르면, 임의의 C1-INH 단백질이 이에 제한되지 않지만 혈장-유래 또는 재조합 발현 C1-INH 단백질을 포함하여 컨쥬게이트(예컨대, 페길화 또는 PSA 컨쥬게이트)될 수 있다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트(예컨대, 페길화 또는 PSA 컨쥬게이트)될 수 있는 C1-INH 단백질은 융합 단백질이다. 하기에 기술되는 바와 같이, 본 발명에 따른 컨쥬게이션(예컨대, 페길화 또는 PSA 컨쥬게이트)의 결과는 C1-INH 단백질의 예상외로 좋은 생체 이용률 및/또는 생물학적 활성을 유지하면서 생체내 반감기를 연장시킨다. 그러므로, 본원에서 제공된 컨쥬게이트(예컨대, 페길화, 또는 PSA 컨쥬게이트) C1-INH는 예컨대, 투여 빈도를 감소시키고 예방 효능은 증가시킴으로써 HAE 및 다른 보체-매개성 질환, 장애 또는 질병의 개선된 치료를 가능하게 한다.
본 발명의 다양한 양태는 다음의 섹션들에서 상술되고 있다. 섹션의 사용은 본 발명을 제한하는 것을 의미하지 않는다. 각 섹션은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 본 명세서에서, 달리 진술되지 않는 한, "또는(or)"은 "및/또는(and/or)"을 의미한다. 본원에 인용된 모든 기술의 개시는 전체가 참조로서 포함된다.
C1-INH 단백질
본 발명은 임의의 C1-INH 단백질을 컨쥬게이트하는 데 사용될 수 있다. 인간 C1-INH는 넓은 범위의 억제 및 비억제 생물학적 활성을 가지는 중요한 항염증 혈장 단백질이다. 서열 상동성, 그의 C-말단 도메인의 구조, 및 프로테아제 억제 기작에 의해, 이는 혈장 프로테아제 억제제의 가장 큰 부류인 세르핀 슈퍼패밀리에 속하고, 이는 또한 다양한 생리적 시스템을 조절하는 안티트롬빈, α1-단백분해효소 억제제, 플라스미노겐 활성화인자 억제제, 및 많은 다른 구조적으로 유사한 단백질들을 포함한다. C1-INH는 보체계, 키닌 생성의 접촉 시스템, 및 내원성 응고 경로에서 단백분해효소의 억제제이다. Cai, S. & Davis, A. E., Complement Regulatory Protein C1 Inhibitor Binds to Selectins and Interferes with Endothelial-Leukocyte Adhesion, J Immunol, 171:4786-4791 (2003). 구체적으로는, C1-INH는 보체계의 C1r 및 C1s를 억제하는 것으로 나타났다. C1-INH는 또한 응고 인자 XI 및 XII뿐만 아니라 조직형 플라미노겐 활성화 인자 및 플라스민을 포함하는 응고 및 섬유소 용해계의 칼리크레인 및 다른 세린 프로테아제의 주요한 조절 인자이다.
C1-INH의 낮은 혈장 함량 또는 그의 기능 장애는 보체 및 접촉 혈장 다단계 과정 모두의 활성화를 일으키고, 다른 시스템에도 영향을 줄 수 있다. C1-INH 혈장 함량이 55 μg/mL(정상 수준의 약 25%) 미만 수준으로 감소되면 C1의 자발적 활성화가 유도되는 것으로 나타났다.
C1-INH의 구조를 도시하는 개략도가 도 1에 제공된다. 신호 펩티드, N-말단 도메인 및 세르핀 도메인이 도시된다. C1-INH는 22 아미노산 신호 펩티드가 분비를 위해 요구되고 C1-INH 단백질의 나머지 부분으로부터 절단된다. C1-INH는 두 개의 도메인을 갖는다: 전형적인 세르핀 도메인인 365개의 아미노산을 갖는 C-말단 도메인, 및 113개의 아미노산을 갖는 N-말단 도메인. 단백질은 도메인들을 연결하는 두 개의 이황화 다리(disulfide bridges)에 의해 안정화된다. 이들 이황화 다리는 C-말단(세르핀) 도메인의 Cys406과 이황화 결합을 형성하는 N-말단의 Cys101 및 C-말단 도메인의 Cys183 과 이황화 결합을 형성하는 N-말단 도메인의 Cys108에 의해 형성된다. 세르핀 도메인은 C1-INH의 프로테아제 활성의 원인이다. P1-P1'은 Arg444-Thr445의 잘리기 쉬운 결합을 나타낸다.
당화된 단백질의 26%가 넘는 중량이 탄수화물이다. 글리칸은 인간 C1-INH 전체에 불균등하게 분포된다. N-말단은 상당히 당화되고, 세 개의 N-결합(마름모꼴 머리를 갖는 긴 수직선으로 나타냄) 및 적어도 일곱 개의 O-결합(짧은 수직선으로 나타냄) 탄수화물 군을 갖는다. 세 개의 N-부착 글리칸은 세르핀 도메인에 아스파라긴 잔기들 Asn216, Asn231, 및 Asn330에 부착된다(마름모꼴 머리를 가진 긴 수직선으로 나타냄). 유별나게 길고 상당히 당화된 N-말단 도메인의 기능적 역할은 여전히 불명확하지만, 단백질의 구조적 안정성, 인식, 내독소와 셀렉틴(selectins)에 대한 친화도, 및 제거에 있어서 필수적일 수 있다. 탄수화물 모이어티의 내재적 불균질성이 전체 C1-INH의 불균질성에 크게 기여하고, 이는 혈장-유래 C1-INH의 성질을 모방한 재조합 C1-INH의 생산이 어려운 이유 중 하나이다.
본원에서 사용되는 바, 본 발명에 따른 용도 및 컨쥬게이션에 적합한 C1-INH 단백질은 실질적인 C1-INH 생물학적 활성을 보유하는 야생형, 또는 변형 아미노산 서열(예컨대, 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 결실, 절단 및/또는 삽입을 갖는 C1-INH 단백질)을 갖는 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인을 포함한다. 전형적으로, C1-INH 단백질은 재조합 기술을 사용하여 생산되지만, 혈장-유래될 수도 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인은 야생형 인간 C1-INH 단백질(아미노산 1-478)(아미노산 1-97이 밑줄 쳐져 있다)에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일하거나 상동인 아미노산 서열을 포함한다:
NPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA (서열번호 1).
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인은 성숙 야생형 인간 C1-INH 단백질(아미노산 98-478)에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일하거나 상동인 아미노산 서열을 포함한다:
GSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA (서열번호 2).
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인은 E165Q 돌연변이(돌연변이된 아미노산은 볼드체 및 밑줄침)를 갖는 인간 C1-INH 단백질(아미노산 1-478)에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일하거나 상동인 아미노산 서열을 포함한다:
NPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAG E NTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA (서열번호 37).
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인은 E165Q 돌연변이(돌연변이된 아미노산은 볼드체 및 밑줄침)를 갖는 성숙 인간 C1-INH 단백질(아미노산 98-478)에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일하거나 상동인 아미노산 서열을 포함한다:
GSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAG E NTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA (서열번호 38).
인간 C1-INH 단백질의 상동체 또는 유사체는 이러한 방법들을 종합하는 참조에 발견되는 바와 같이 당업자에게 알려진 폴리펩티드 서열을 변형하는 방법에 따라 제조될 수 있다. 당업자라면 인정할 것으로서, 일반적으로 두 개의 서열은 그들의 해당하는 위치에서 상동인 잔기들을 포함하는 경우 "실질적으로 상동(substantially homologous)"인 것으로 간주된다. 상동인 잔기는 동일한 잔기일 수 있다. 대안으로, 상동인 잔기는 적절하게 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징을 갖는 비-동일 잔기일 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 전형적으로 특정 아미노산들은 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄들을 가지는 것으로서 분류된다. 하나의 아미노산을 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것은 종종 "상동성" 치환이라고 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산의 보존성 치환은 하기 그룹내의 아미노산 사이에 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D. 일부 구현예에서, "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어진 단백질의 상대적 전하 또는 크기 특성을 변화시키지 않는 아미노산 치환을 말한다.
당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN, 아미노산 서열의 경우 BLASTP, 갭(gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것들을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 대표적인 프로그램들은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기술되어 있다. 상동인 서열을 확인하는 것에 추가하여, 상기에 언급된 프로그램들은 전형적으로 상동성의 정도 표시를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인은 절단형 C1-INH 단백질일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적합한 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 37 또는 서열번호 38 중 임의의 일부분 또는 단편을 포함한다.
C1-INH 융합 단백질
일부 구현예에서, 본 발명에 따라 컨쥬게이트될 수 있는 C1-INH 단백질은 C1-INH 융합 단백질을 포함한다. C1-INH 융합 단백질은 예를 들어 C1-INH 단백질의 반감기, 안정성, 효능, 및/또는 전달을 강화하거나 증가시키거나 면역원성, 제거(clearance) 또는 독성을 감소시키거나 제거함으로써 C1-INH의 치료 효과를 전형적으로 촉진할 수 있는 C1-INH 도메인(C1-INH 폴리펩티드라고도 지칭됨) 및 또 다른 도메인 또는 모이어티를 포함할 수 있다. C1-INH 융합 단백질에 대한 이와 같은 적합한 도메인 또는 모이어티는 이에 제한되지 않지만 Fc 도메인 및 알부민 도메인을 포함한다. 적합한 융합 도메인 또는 모이어티(예컨대, Fc 또는 알부민 도메인)는 N-말단, C-말단, 또는 C1-INH 단백질 내부에 직접 또는 간접적으로 결합, 융합 또는 부착될 수 있다. 다음 섹션들은 컨쥬게이트될 수 있는 예시적인 C1-INH 융합 단백질을 기술한다.
Fc 도메인들
일부 구현예에서, 적합한 C1-INH 융합 단백질은 FcRn 수용체에 결합하는 Fc 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 비제한적인 예로서, 적합한 Fc 도메인은 IgG와 같은 면역글로불린 하위부류로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 IgM, IgA, IgD 또는 IgE로부터 유래된다. 특히 적합한 Fc 도메인은 인간 또는 인간화된 항체로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 변형된 인간 Fc 부분과 같이 변형된 Fc 부분이다.
C1-억제제 Fc 융합 단백질은 도1에 도시된 바와 같이 이량체로서 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 Fc 도메인은 야생형 인간 IgG1 Fc 도메인에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 3).
일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 보체 활성 및/또는 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 활성("작용기 기능(effector function)"이라고도 지칭됨)을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, IgG1의 L234A 및 L235A(LALA)에 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있다. LALA 돌연변이(돌연변이된 잔기는 밑줄침)를 갖는 예시적인 인간 IgG1 Fc 도메인을 아래에 나타낸다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 4).
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, IgG1의 L234A 및 L235A(LALA)에 상응하는 돌연변이를 유지하면서 서열번호 4에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 결합의 개선이 혈청 반감기를 연장시키는 것으로 여겨진다. 따라서, 일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 FcRn에 결합을 개선시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. FcRn에 개선된 결합에 영향을 주는 Fc 도메인 내의 다양한 돌연변이는 당업계에 알려져 있고 본 발명을 실행하기 위해 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, 인간 IgG1의 Thr 250, Met 252, Ser 254, Thr 256, Thr 307, Glu 380, Met 428, His 433, 및/또는 Asn 434에 상응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
예를 들어, 적합한 Fc 도메인은 H433K(His433Lys) 및/또는 N434F(Asn434Phe)의 돌연변이들을 함유할 수 있다. 비제한적인 예로서, 적합한 Fc 도메인은 돌연변이 H433K(His433Lys) 및 N434F(Asn434Phe)를 함유할 수 있다. Fc 도메인에 포함될 수 있는 추가적인 아미노산 치환은 본원에 참조로서 포함되는 예컨대, 미국 등록특허 번호 제6,277,375호; 제8,012,476호; 및 제8,163,881호에 개시된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, 인간 IgG1의 Thr 250, Met 252, Ser 254, Thr 256, Thr 307, Glu 380, Met 428, His 433, 및/또는 Asn 434에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 유지하면서 인간 IgG1 Fc 도메인에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다(아래 밑줄 침):
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALKFHYTQKSLSLSPGK (서열번호 5).
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, 인간 IgG1의 Thr 250, Met 252, Ser 254, Thr 256, Thr 307, Glu 380, Met 428, His 433, 및/또는 Asn 434에 상응하는 하나 이상의 돌연변이및 IgG1의 L234A 및 L235A(LALA)에 상응하는 돌연변이를 유지하면서 인간 IgG1 Fc 도메인에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다(돌연변이된 잔기는 밑줄침):
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALKFHYTQKSLSLSPGK (서열번호 6).
일부 구현예에서, IgG4로부터 유래된 Fc 도메인이 본 발명을 위해 사용된다. 이론에 구속되기를 원치 않으면서, 보고에 따르면 IgG4는 야생형 IgG1보다 더 낮은 보체 활성을 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 야생형 인간 IgG4 Fc 도메인이 본 발명에서 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 Fc 도메인은 EU 지수에 따른 중심 힌지 영역 서열에서 S228P 치환에 상응하는 돌연변이를 가진 인간 IgG4로부터 유래된다. 이 치환은 Kabat et al(1987 Sequences of proteins of immunological interest. United States Department of Health and Human Services, Washington DC.)에 따라 S241P라고도 지칭되었다. 이론에 구속되기를 원치 않으면서, 이 치환이 야생형 IgGl 또는 IgG2 동형 항체와 동일한 힌지 영역의 중심 서열을 만드는 효과가 있고 IgG4 항체의 동형을 생산하게 되므로, 이형 이량체 IgG4 항체를 생산하게 하는 중쇄의 해리 및 재결합을 방해하게 되는 것으로 여겨진다. 또한, IgG4 유래 Fc 도메인은 고농도에서 안정성을 위해 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 Fc 도메인은 야생형 인간 IgG4 Fc 도메인에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 9).
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, S241P 치환에 상응하는 돌연변이를 유지하면서 인간 IgG4 Fc 도메인에서 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열(돌연변이 잔기 밑줄침)을 포함한다:
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 10).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc 도메인은 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 예시적인 신호 펩티드는 METPAQLLFLLLLWLPDTTG에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 적합한 Fc 도메인은 신호 펩티드를 갖는 인간 IgG1 Fc 도메인에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일하고, FcRn 수용체에 결합을 강화시키는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다(신호 펩티드 및 돌연변이된 잔기는 밑줄침):
METPAQLLFLLLLWLPDTTGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALKFHYTQKSLSLSPGK (서열번호 7).
일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 신호 펩티드를 갖는 인간 IgG1 Fc 도메인에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일하고, FcRn 수용체에 결합을 강화시키는 LALA 및 돌연변이를 둘 다 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다(돌연변이된 잔기는 밑줄침):
METPAQLLFLLLLWLPDTTGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALKFHYTQKSLSLSPGK (서열번호 8).
예시적인 C1-INH-Fc 융합 단백질
특정 구현예에서, 적합한 C1-INH 융합 단백질은 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 C1-INH 융합 단백질은 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인을 Fc 도메인과 결합시키는 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 도2에 도시된 바와 같이, Fc 모이어티는 전체 길이(1-478 aa)뿐 아니라 성숙(98-478) C1-억제제의 N-말단 영역에 직접적으로 융합될 수 있다. 비제한적인 예로서, 적합한 C1-INH Fc 융합 단백질은 하기에 나타난 아미노산 서열을 가질 수 있다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA (서열번호 11)
또는
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또는
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또는
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA (서열번호 16).
일부 구현예에서, 적합한 C1-INH Fc 도메인은 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 32 또는 서열번호 33에 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 상동이거나 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
C1-INH-Fc 융합 단백질은 단독이량체(homodimeric) 또는 단량체(monomeric) 배열(configuration)을 포함하는 다양한 배열로 제공될 수 있다고 여겨진다. 예를 들어, 적합한 단독이량체 배열은 Fc 폴리펩티드 가닥 둘 모두의 N-말단 단부에 결합되는 융합 파트너(예컨대, C1-INH 폴리펩티드 플러스 링커)의 C-말단 단부를 갖도록 설계될 수 있다. 적합한 단량체 배열은 하나의 Fc 이량체에 융합된 융합 파트너(예컨대, C1-INH 폴리펩티드 플러스 링커)의 C-말단 단부를 갖도록 설계될 수 있다.
본원에서 일가(monovalent)라고도 지칭되는 단량체 형태는 특정한 적용 및 투여 경로, 예컨대 피하 투여에 사용될 수 있다. 단량체 배열은 입체 장해를 감소시키고, 반감기를 증가시키고/시키거나 생체 이용률을 증가시킬 수 있다.
이론에 구속되기를 원치 않으면서, 단량체 형태는 C1-INH가 자살 억제제이므로 C1-INH-Fc 융합 구조체(constructs)에 특히 유용할 수 있다고 여겨진다. 자살 억제제이므로, Fc 융합 이량체의 하나의 C1-INH "팔"의 결합은 제2 팔이 결합되지 않고 남아있는 상황에서도 결합된 C1-INH 융합 단백질의 제거율을 증가시킬 것이다.
Fc 융합 단백질의 이점은 단량체 및 이량체 모두 Fc 발현이 C1-INH 단독 발현보다 더 높은 수준에서 일어남이 확인되었다는 것이다. 이량체 C1-INH-Fc 구조체와 Fc 융합 없는 C1-INH와 비교한 활성 분석은 유사한 C1q 결합 활성을 갖는 것으로 나타났다. 링커의 포함은 또한 그의 표적과 결합하는 C1-INH-Fc 융합 단백질의 능력에 영향을 끼치지 않음이 시험되고 확인되었다.
단량체 항체 융합 단백질을 제조하는 방법은 예컨대, PCT 공개 번호 제WO2011/063348호; 제WO2012/020096호; 제WO2013/138643호; 제WO2014087299호; Dumont, J. et al., Monomeric Fc Fusions: Impact on Pharmacokinetic and Biological Activity of Protein Therapeutics, Biodrugs, 20(3): 151-160 (2006); Ishino, T. et al, Protein Structure and Folding: Half-life Extension of Biotherapeutics Modality by N-Glycosylation for the Engineering a Monomeric Fc Domain, J. Biol. Chem., 288:16529-16537 (2013)에 기재된 내용을 포함하고, 이들 개시 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
일가 C1-억제제는 Fc를 단독으로 발현하는 플라스미드와 함께 형질주입된 Fc-C1을 포함하는 플라스미드를 사용하여 제조될 수 있다. 또한, 하나의 프로모터는 Fc-C1을 생성하고 다른 프로모터는 Fc를 단독으로 생성하는 이중 프로모터 플라스미드를 사용하여 제조될 수 있다. 일가 Fc는 또한 Fc의 힌지 영역에 있는 특정 아미노산이 돌연변이되어 Fc 영역의 안정성을 부여하는 이중특이 기술(예컨대, 놉-앤-홀(Knob and hole) 기술 또는 일가 C1을 형성하는 돌연변이를 안정시키는 다른 기술)을 사용하여 제조될 수 있다.
알부민 도메인
일부 구현예에서, 적합한 C1-INH 융합 단백질은 알부민 도메인을 함유한다. 알부민은 혈액 혈청 단백질의 약 1/2을 포함하는 가용성, 단량체 단백질이다. 알부민은 주로 스테로이드, 지방산, 및 감상선 호르몬의 담체 단배질로서 기능하고 세포외액량을 안정화시키는 역할을 한다. 알부민은 분자량 66,500의 구형 비당화 혈청 단백질을 갖는다. 알부민은 신생 단백질(nascent protein)이 조면소포체에서 방출되기 전에 제거되는 N-말단 펩티드를 갖는 프리프로알부민(preproalbumin)으로 간에서 합성된다. 그 산물인 프로알부민은 결국 골지체에서 절단되어 분비 알부민을 생산한다.
알부민은 세 개의 상동인 도메인들(I-III)으로 이루어지고, 이들 각각은 두 개의 서브도메인(A 및 B)으로 구성된다. 인간 혈청 알부민에 결합하는 리간드의 주요 영역은 주로 소수성 및 양하전된 잔기들로 형성되고 유사한 화학적 성질을 나타내는, 서브도메인 IIA 및 IIIA의 공동에 위치한다. 인간 혈청 알부민은 585개의 아미노산과 66,500 Da의 분자량을 갖는다. 아미노산은 35개의 시스테인을 포함하고, 그 중 하나를 제외하고 모두가 17개의 안정화 이황화 결합에 참여한다.
전형적으로, 알부민은 19일의 연장된 혈청 반감기를 갖는다. FcRn은 알부민의 긴 혈청 반감기를 조절한다. FcRn은 알부민뿐 아니라 IgG에 결합하고 세포내 분해로부터 두 단백질 모두를 보호하는 이중 결합 수용체이다. 알부민 분자의 C-말단 도메인은 FcRn에 결합하기 위해 중요한 것으로 나타났다. 특히, 도메인 IIIB는 FcRn에 결합하기 위해 중요한 것으로 보인다. 일부 구현예에서, 도메인 IIIB의 결핍 또는 464His, 510His, 및 535His의 돌연변이는 FcRn 결합을 완전히 파괴한다.
전형적으로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 단량체이다. 일부 구현예에서, 이러한 특징은 단량체 Fc 융합 구현예들에 관해 상기에 기술한 이유들로 인해 이량체 Fc 융합 구현예에 대해 이점일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 알부민 폴리펩티드는 야생형 인간 혈청 알부민에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYKTTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL (서열번호 17).
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 알부민 폴리펩티드는 야생형 인간 혈청 알부민의 D3 도메인에 적어도 50%(예컨대, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
METPAQLLFLLLLWLPDTTGVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL (서열번호 20).
링커 또는 스페이서
C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인은 Fc 도메인 또는 알부민 도메인에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 C1-INH 융합 단백질은 C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인과 Fc 또는 알부민 도메인을 연결하는 링커 또는 스페이서를 포함한다. 아미노산 링커 또는 스페이서는 일반적으로 두 개의 단백질 모이어티 사이에 알파-헬릭스와 같은 구조에 끼어들어가거나 유연하도록 설계된다. 링커 또는 스페이서는 상대적으로 짧을 수 있거나 길 수 있다. 전형적으로, 링커 또는 스페이서는 예를 들어 3-100(예컨대, 5-100, 10-100, 20-100 30-100, 40-100, 50-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100, 5-55, 10-50, 10-45, 10-40, 10-35, 10-30, 10-25, 10-20) 아미노산 길이를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 아미노산 길이 이상이다. 전형적으로, 더 긴 링커는 입체 장애를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신 및 세린 잔기의 혼합물을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 링커는 트레오닌, 프롤린, 및/또는 알라닌 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 링커는 10-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 10-15 아미노산 사이를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 ALEVLFQGP(서열번호 37)로 구성되는 링커가 아니다.
비제한적인 예로서, 본 발명에 적합한 링커 또는 스페이서는 이에 제한되지 않지만, GGG 링커 및 GGGGSGGGGS((GGGGS)2 링커 서열번호 27)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 GGG 및/또는 서열번호 27의 서열을 포함한다.
다른 적합한 링커는 GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG 링커, 서열번호 34); GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG2 링커, 서열번호 35); 및 GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG3 링커, 서열번호 36)를 포함한다.
적합한 링커 또는 스페이서는 또한 상기 예시적 링커들, 예컨대, GGG 링커, GGGGSGGGGS((GGGGS)2 링커 서열번호 27), GAG 링커(서열번호 34), GAG2 링커(서열번호 35) 또는 GAG3 링커(서열번호 36)에 적어도 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 상동이거나 동일한 아미노산 서열을 갖는 것들을 포함한다. 일부 구현예와 사용하기 적합한 추가적인 링커는 2012년 3월 2일에 출원된 미국특허 제2012/0232021호에서 확인될 수 있고, 그의 개시는 본원에 전체가 참조로서 포함된다.
전형적으로, C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인을 Fc 또는 알부민 도메인과 결합시키되, C1-INH 폴리펩티드 또는 도메인이 그의 동족 리간드(예컨대, C1s 등) 중 임의의 것과 결합하는 능력에 실질적으로 영향을 끼치거나 감소시키지 않는 링커가 포함된다.
C1-INH 단백질의 당화/글리칸 맵핑(프로파일)
본 발명에 따르면, C1-INH 단백질은 글리칸 잔기 및/또는 아민기를 통해 컨쥬게이트될 수 있다. 특히, C1-INH 단백질은 예를 들어 시알산 잔기 또는 갈락토스 잔기와 같은 글리칸 잔기에서 컨쥬게이트될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 컨쥬게이션에 적합한 C1-INH 단백질은 특히 시알산 함량과 같은 뚜렷한 글리칸 맵으로 특징지어질 수 있다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 혈장-유래 C1-INH와 유사한 당화 프로파일을 가진다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 혈장-유래 C1-INH와 전혀 다른 당화 프로파일을 가진다.
임의의 이론에 구속되길 원치 않으면서, 가지형 구조의 형태와 복잡성에 따라 글리칸 결합을 포함하는 글리칸 맵은 생체내 제거, 생체이용률, 및/또는 효능에 영향을 줄 수 있다고 여겨진다.
전형적으로, 글리칸 맵은 효소 소화(enzymatic digestion) 및 이후의 크로마토그래피 분석에 의해 결정될 수 있다. 이에 제한되지 않지만 적합한 글리코실라제, 펩티다제(예컨대, 엔도펩티다제, 엑소펩티다제), 프로테아제, 및 포스파타제를 포함하는 다양한 효소들이 효소 소화용으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 효소는 알칼리 포스파타아제이다. 일부 구현예에서, 적합한 효소는 뉴라미니다아제(neuraminidase)이다. 글리칸은 크로마토그래피 분석에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 글리칸은 펄스식 전류 검출법을 이용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAE-PAD) 또는 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 검출될 수 있다. 글리칸 맵 상에 각각의 피크에 의해 나타낸 글리칸의 양은 본원에 개시되고 당업계에 공지된 방법에 따른 글리칸 표준 곡선을 사용하여 산출될 수 있다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 글리칸 맵으로 특징지어질 수 있다. 각각의 피크 그룹에 상응하는 글리칸의 상대적인 양은 미리 결정된 참조 표준에서의 상응하는 피크 그룹 면적에 관한 피크 그룹 면적에 기초하여 결정될 수 있다. 글리칸 맵핑에 대한 다양한 참조 표준들이 당업계에 공지되어 있고 본 발명의 실시를 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 중성, 모노-시알화, 디-시알화, 트리-시알화, 또는 테트라-시알화 C1-INH 단백질의 표시된 피크 그룹에서 선택된 다섯 개 또는 더 적은 피크 그룹을 포함하는 글리칸 맵으로 특징지어질 수 있다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 다음 중 적어도 하나를 포함하는 당화 프로파일을 갖는다: 중성 글리칸 종, 모노-시알화 종, 디-시알화 종, 트리-시알화 종 및/또는 테트라-시알화 종. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 중성 글리칸 종, 모노-시알화 종, 디-시알화 종, 트리-시알화 종 및 테트라-시알화 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 약 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35 % 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15 % 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 약 5% 내지 약 30%의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 약 5% 내지 약 25%의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 약 10% 내지 약 20%의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 평균적으로 분자당 적어도 약 80%의 하전된 글리칸(예컨대, 분자당 약 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 또는 99% 초과의 글리칸)을 포함한다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 약 10% 내지 약 30%의 모노-시알화 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 약 30% 내지 약 50%의 디-시알화 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 약 15% 내지 약 35%의 트리-시알화 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 약 5% 내지 약 15%의 테트라-시알화 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 30% 이하의 중성 글리칸 종; 약 20% 내지 약 30%의 모노-시알화 글리칸 종; 약 30% 내지 약 40%의 디-시알화 글리칸 종; 약 10% 내지 약 20%의 트리-시알화 글리칸 종; 및 약 5% 내지 약 10%의 테트라-시알화 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 혈장-유래 C1-INH와 유사한 시알화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 혈장-유래 C1-INH와 전혀 다른 시알화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 혈장-유래 C1-INH보다 길거나 그와 유사한 반감기를 갖게 하는 시알화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 평균적으로 분자당 적어도 약 10, 11, 12, 13, 또는 14개의 시알화 글리칸 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 평균적으로 분자당 적어도 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개의 시알화 글리칸 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 평균적으로 분자당 적어도 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 시알화 글리칸 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 만노스, α-갈락토스, N-글리코릴뉴라민산(N-glycolylneuraminic acid, NGNA), 또는 올리고만노스형 당화 중 하나 이상을 약 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만으로 함유한다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질이 만노스, α-갈락토스, N-글리코릴뉴라민산(NGNA), 또는 올리고만노스형 당화 중 하나 이상을 약 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하로 함유한다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 면역원성이 아닌 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 혈장-유래 인간 C1-INH와 비교할 때 혈청 제거율을 증가시키지 않는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 혈장-유래 인간 C1-INH와 비교할 때 혈청 제거율을 감소시키는 당화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질은 코네스타트 알파와 비교할 때 혈청 제거율을 감소시키는 당화 프로파일을 갖는다.
단백질의 당화 프로파일을 조작하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이들 방법뿐 아니라 아직 발견되지 않은 다른 방법들도 본 발명에 의해 고려된다. 본 발명의 C1-INH 단백질 및 폴리펩티드의 당화 프로파일을 조작하는 방법은 생체외, 제자리(in situ) 및 생체내 방법들을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현된 단백질 또는 폴리펩티드의 당화 프로파일은 발현된 단백질 또는 폴리펩티드의 발현후 화학적 변형(post-expression chemical modification)을 통해 변형된다. 일부 구현예에서, 세포 배양 조건이 원하는 당화 프로파일을 갖는 단백질의 발현을 달성하도록 조작된다. 이러한 세포 배양 조건은 당화를 강화시키기 위하여 배양의 길이, 배양 배지에 넣는 첨가제, 및/또는 유전자의 공동 발현을 포함하는 생산 및 배양 공정의 조절을 포함한다. 숙주 세포의 선택 및 형질주입된 숙주 세포의 특정 클론은 또한 당화를 강화시키는 데 사용될 수 있다. 당화를 강화하는 일부 방법들은 원하는 당화 프로파일을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 보강하기 위해 정제 공정을 포함한다.
일부 구현예에서, C1-INH 단백질을 발현하도록 가공된 세포들은 또한 당화를 변형하도록, 특히 발현된 C1-INH의 시알화를 증가시키도록 가공될 수 있다. 예를 들어, 세포들은 당화 경로(야생형 또는 돌연변이)에서 이종 효소를 발현하여 원하는 당화를 달성하도록, 예컨대, 시알화를 증가시키도록 가공될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포들은 또한 내인성 효소를 과발현하여 원하는 당화를 달성하도록, 예컨대, 시알화를 증가시키도록 가공될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포들은 시알화를 감소시키거나 억제하거나 저하시키는(예컨대, 안티센스 구조물(antisense construct)로) 내인성 효소의 발현을 감소하거나 방지하도록 가공된다.
본원에 기술된 다양한 당화 패턴/글리칸 맵 및 특히, 시알화 프로파일 또는 레벨은 C1-INH 도메인 또는 폴리펩티드 단독으로 또는 융합 단백질 상황에서(예컨대, C1-INH-Fc 또는 C1-INH-알부민 융합 단백질) 적용될 수 있다. 본원에 기술된 당화 패턴/글리칸 맵, 및 특히 시알화 프로파일 또는 레벨을 갖는 C1-INH 단백질은 컨쥬게이트될 수 있거나 컨쥬게이트되지 않을 수 있다. 원하는 시알화 프로파일 또는 레벨을 포함하는 원하는 당화 패턴/글리칸 맵은 C1-INH 단백질의 생체내 반감기를 연장시킬 수 있다고 여겨진다. 특히, Fc 또는 알부민 융합의 조합에서, 원하는 시알화 프로파일 또는 레벨을 포함하는 원하는 당화 패턴/글리칸 맵은 컨쥬게이션 없이도 본원에 기술된 C1-INH 단백질의 원하는 생체내 반감기를 달성할 수 있다. 하지만 컨쥬게이션(예컨대, 페길레이션)은 원하는 당화 패턴 또는 시알화 레벨을 갖는 것들을 포함하는 C1-INH 단백질의 생체내 반감기를 더 연장시킬 수 있다.
페길화
본 발명에 따르면, 화학적 또는 생물학적 모이어티는 본원에 기술된 C1-INH 단백질에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 특히, 이러한 모이어티는 이에 제한되지 않지만 모노- 또는 폴리-(예컨대, 2-4) PEG 모이어티를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티이다. 본원에서 사용되는 바, 단백질에 직접 또는 간접적으로 PEG 모이어티를 컨쥬게이트하는 과정을 페길화라고 지칭한다. 페길화는 본원에 기술된 바와 같이, C1-INH의 반감기를 증가시킬 수 있다.
페길화는 당업계에 공지된 임의의 적절한 반응을 통해 수행될 수 있다. 페길화된 단백질을 제조하는 방법은 일반적으로 (a) 폴리펩티드를 폴리에틸렌 글리콜(예컨대 반응성 에스테르 또는 PEG의 알데히드 유도체)과 폴리펩티드가 하나 이상의 PEG 그룹에 부착되도록 하는 조건 하에서 반응시키는 단계; 및 (b) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 반응 조건은 알려진 변수 및 원하는 결과에 기초하여 각 사례별로 결정될 수 있다.
예를 들어, 제EP 0 401 384호; Malik et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992); 제EP 0 154 316호; 제EP 0 401 384호; 제WO 92/16221호; 및 제WO 95/34326호에 기재되고 당업자가 이용가능한 많은 PEG 부착 방법이 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 치료 분자를 페길화하는 단계는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자로 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 함으로써 수행될 수 있다.
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일부 구현예에서, 컨쥬게이션을 위한 PEG 모이어티는 활성화된 PEG이다. 예를 들어, 적합한 PEG 모이어티는 아미녹시 작용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 PEG 모이어티는 하이드라지드 작용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 PEG 모이어티는 말레이미드 또는 요오드아세트아미드 작용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 PEG 모이어티는 N-하이드록시석신이미드(hydroxysuccinimide, NHS) 에스테르를 포함할 수 있다. 따라서, PEG 모이어티는 옥심 결합, 아미드 결합, 하이드라존(hydrazone) 결합, 티오에테르(thioether) 결합 또는 다른 유형의 결합들을 통해 C1-INH 단백질에 컨쥬게이트될 수 있다.
일부 구현예에서, PEG 모이어티는 선형 또는 가지형 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, PEG 모이어티는 2, 3, 4, 또는 5개의 팔 가지를 포함할 수 있다. 적합한 PEG-NHS 모이어티는 선형 PEG-NHS 1K, 선형 PEG-NHS 2K, 선형 PEG-NHS 5K, 가지형 PEG-NHS 5K, 가지형 PEG-NHS 20K, 또는 가지형 PEG-NHS 40K를 포함할 수 있다. 추가적인 예로서, PEG-아미녹시 모이어티는 선형 또는 가지형 PEG-아미녹시 2K, PEG-아미녹시 5K, PEG-아미녹시 5K, PEG-아미녹시 10K, PEG-아미녹시 20K, 또는 PEG-아미녹시 40K를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, PEG는 C1-INH 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기를 통해 C1-INH에 컨쥬게이트된다. 도 3 참조.
일부 구현예에서, PEG는 C1-INH 단백질의 하나 이상의 갈락토스 잔기를 통해 C1-INH에 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질의 하나 이상의 갈락토스 잔기는 PEG가 갈락토스 잔기에 컨쥬게이트되기 전에 산화된다.
일부 구현예에서, PEG는 C1-INH 단백질의 하나 이상의 시알산 잔기를 통해 C1-INH에 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질의 시알산 잔기 중 하나 이상은 PEG가 시알산 잔기에 컨쥬게이트되기 전에 산화된다.
일부 구현예에서, PEG는 옥심 결합을 통해서 시알산을 산화시키도록 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, PEG는 하이드라존 결합을 통해서 시알산을 산화시키도록 컨쥬게이트된다.
C1-INH 단백질은 본 발명에 따라 다양한 수준으로 페길화될 수 있다. 예를 들어, PEG 대 C1-INH의 몰비는 약 5:1 내지 100:1; 약 10:1 내지 100:1; 약 15:1 내지 100:1; 약 20:1 내지 100:1; 약 25:1 내지 100:1; 약 30:1 내지 100:1; 약 40:1 내지 100:1; 약 50:1 내지 100:1; 약 10:1 내지 90:1; 약 10:1 내지 80:1; 약 10:1 내지 70:1; 약 10:1 내지 60:1; 약 10:1 내지 50:1; 약 10:1 내지 40:1; 약 15:1 내지 35:1; 또는 약 20:1 내지 30:1의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG 대 C1-INH의 몰비는 적어도 약 1:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 10:1; 적어도 약 15:1; 적어도 약 20:1; 적어도 약 25:1; 적어도 약 30:1; 적어도 약 35:1; 적어도 약 40:1; 적어도 약 45:1; 또는 적어도 약 50:1일 수 있다.
일부 구현예에서, PEG 대 시알산의 몰비는 적어도 약 1:1, 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 적어도 약 1:15, 적어도 약 1:20, 적어도 약 1:25, 적어도 약 1:30, 적어도 약 1:35, 적어도 약 1:40 적어도 약 1:45, 적어도 약 1:50이다. 일부 구현예에서, PEG 대 시알산의 몰비는 약 1:1 내지 약 1:50, 약 1:1 내지 약 1:45, 약 1:1 내지 약 1:40, 약 1:1 내지 약 1:35, 약 1:1 내지 약 1:30, 약 1:1 내지 약 1:25, 약 1:1 내지 약 1:20, 약 1:1 내지 약 1:15, 약 1:1 내지 약 1:10, 또는 약 1:1 내지 약 1:5이다.
폴리시알산 컨쥬게이션
콜로민산(colominic acid, CA)라고도 불리는 폴리시알산(PSA)은 자연 발생 다당류(polysaccharide)이다. 이는 α(2→8) 케토시딕 결합(ketosidic linkage)을 가진 N-아세틸뉴라민산의 동종폴리머이고 이의 비-환원 말단에서 인접한 디올기를 함유한다. 이는 음전하이고 인체의 자연적인 구성 요소이다.
PSA는 N-아세틸뉴라민산의 중합체(일반적으로 동종폴리머)로 구성된다. 이차 아미노기는 보통 아세틸기를 가지지만, 대신 글리코릴기를 가질 수도 있다. 수산기의 가능한 치환기들은 아세틸기, 락틸(lactyl)기, 에틸기, 황산기 및 인산기를 포함한다.
PSA 및 변형 PSA(mPSA)는 일반적으로 2,8- 또는 2,9-글리코시드(glycosidic) 결합 또는 이들의 조합(예컨대, 변형 2,8- 및 2,9- 결합)으로 결합된 N-아세틸뉴라민산 모이어티로 본질적으로 이루어지는 선형 폴리머를 포함한다. 일부 구현예에서, PSA 및 mPSA의 글리코시드 결합은 α-2,8이다. 이러한 PSA 및 mPSA는 콜로민산으로부터 유래된다. 전형적인 PSA 및 mPSA는 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 5개, 보다 바람직하게는 적어도 10 및 가장 바람직하게는 적어도 20개의 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함한다. 따라서, 이들은 2 내지 300개의 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함할 수 있고, 바람직하게는 5 내지 200개의 N-아세틸뉴라민산 모이어티 또는 가장 바람직하게는 10 내지 100개의 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함할 수 있다. PSA 및 CA는 바람직하게는 N-아세틸뉴라민산 이외에 당 모이어티가 본질적으로 없다. 일부 구현예에서, PSA는 적어도 90%, 적어도 95%, 및 또는 적어도 98%의 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함한다.
PSA가 N-아세틸뉴라민산 이외의 모이어티를 포함하는 경우(예를 들어, mPSA 내에), 이들은 바람직하게는 폴리머 사슬의 말단의 한쪽 또는 양쪽에 위치된다. 이러한 "다른" 모이어티들은 예를 들어, 산화 또는 환원에 의해 N-아세틸뉴라민산 모이어티 말단으로부터 유래된 모이어티일 수 있다.
예를 들어, 제WO 2001/087922호는 비환원 말단 N-아세틸뉴라민산 단위가 과요오드산 나트륨과 반응하여 알데히드기로 변환된 mPSA에 대해 기술한다. 추가로, 제WO 2005/016974호는 환원 말단 N-아세틸뉴라민산 단위가 환원 말단 N-아세틸뉴라민산 단위에 있는 고리를 환원적으로 개방하여 환원됨으로써 비시날 디올기(vicinal diol group)가 형성되고 이후 산화에 의해 비시날 디올기가 알데히드기로 변환되는 mPSA에 대해 기술한다.
상이한 PSA 유도체들은 비환원 말단에서 단일 알데히드기를 함유하는 산화 PSA로부터 제조될 수 있다. 아미녹시 PSA의 제조는 예를 들어 제WO2012/166622호에 기술되고 그의 내용이 본원에 참조로서 포함된다. 말단 아미노기를 함유하는 PSA-NH2는 NH4Cl로 환원성 아미노화에 의해 제조될 수 있고, 말단 설프하이드릴기(sulfhydryl group)를 함유하는 PSA-SH는 PSA-NH2와 2-이미노티올란(iminothiolane)(트라우츠 시약(Traut's reagent))과의 반응으로 제조될 수 있으며, 두 과정은 모두 제US 7,645,860 B2호에 기술된다. PSA 하이드라진은 제US 7,875,708 B2호에 따른 산화 PSA와 하이드라진의 반응에 의해 제조될 수 있다. PSA 하이드라진은 산화 PSA와 아디픽산 디하이드라자이드(adipic acid dihydrazide)의 반응에 의해 제조될 수 있다(제WO 2011/012850 A2호).
콜로민산(PSA의 하위 분류)은 α (2→8) 케토시딕 결합을 가진 N-아세틸뉴라민산(NANA)의 동종폴리머이고, 그 중에서도 K1 항원을 소유한 대장균(Escherichia coli)의 특정한 균주에 의해 생산된다. 콜로민산은 많은 생리학적 기능을 갖는다. 이들은 약물 및 화장품의 원료로서 중요하다.
본원에서 사용되는 바, "시알산 모이어티"는 수용성 용액 또는 현탁액에 가용성이고 약학적 유효량으로 PSA-혈액 응고 단백질 컨쥬게이트를 포유류에 투여 시 부작용과 같은 부정적인 영향이 없거나 거의 없는 시알산 단량체 또는 폴리머("다당류")를 포함한다. 하나의 양태에서, 폴리머는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 또는 500개의 시알산 단위를 가지는 것을 특징으로 한다. 특정 양태에서, 상이한 시알산 단위는 사슬에서 결합된다.
일부 구현예에서, 다당류 화합물의 시알산 부분이 고도로 친수성이고 또 다른 구현예에서 전체 화합물이 고도로 친수성이다. 친수성은 주로 시알산 단위의 펜던트 카르복실기(pendant carboxyl group) 및 수산기에 의해 주로 부여된다. 단당류(saccharide) 단위는 다른 작용기, 예컨대 아민기, 수산기, 또는 황산기 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 이들 작용기는 자연 발생 단당류 화합물에 존재할 수 있거나 다당류 화합물 유도체에 도입될 수 있다.
자연 발생 폴리머 PSA는 넓은 크기 분포(예컨대, Sigma C-5762) 및 높은 다분산성(polydispersity, PD)을 나타내는 다분산 제조물로 이용가능하다. 다당류는 보통 내독소를 동시정제(copurifying)하는 내재적 위험을 지니는 박테리아에서 생산되므로, 긴 시알산 폴리머 사슬의 정제가 내독소 함량이 증가될 확률을 높일 수 있다. 1~4개의 시알산 단위를 가진 짧은 PSA 분자는 또한 합성하여 제조될 수 있으므로(Kang SH et al., Chem Commun. 2000;227-8; Ress DK and Linhardt RJ, Current Organic Synthesis. 2004;1:31-46), 높은 내독소 레벨의 위험을 최소화시킬 수 있다. 하지만 좁은 크기 분포와 낮은 다분산성을 갖고 또한 내독소가 없는 PSA 제조물이 현재 제조될 수 있다. 본 개시의 특정 용도의 다당류 화합물은 하나의 양태에서 박테리아에 의해 생산된다. 이들 자연 발생 다당류의 일부는 당지질로 알려져 있다. 일부 구현예에서, 다당류 화합물은 말단 갈락토스 단위가 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, PSA는 C1-INH 단백질의 하나 이상의 시알산 잔기를 통해 C1-INH에 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, C1-INH 단백질의 시알산 잔기 중 하나 이상은 PSA가 시알산 잔기에 컨쥬게이트되기 전에 산화된다.
일부 구현예에서, PSA는 옥심 결합을 통해서 시알산을 산화시키도록 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, PSA는 하이드라존 결합을 통해서 시알산을 산화시키도록 컨쥬게이트된다.
C1-INH 단백질은 본 발명에 따라 다양한 수준으로 PSA와 페길화될 수 있다. 예를 들어, PSA 대 C1-INH의 몰비는 약 5:1 내지 100:1; 약 10:1 내지 100:1; 약 15:1 내지 100:1; 약 20:1 내지 100:1; 약 25:1 내지 100:1; 약 30:1 내지 100:1; 약 40:1 내지 100:1; 약 50:1 내지 100:1; 약 10:1 내지 90:1; 약 10:1 내지 80:1; 약 10:1 내지 70:1; 약 10:1 내지 60:1; 약 10:1 내지 50:1; 약 10:1 내지 40:1; 약 15:1 내지 35:1; 또는 약 20:1 내지 30:1의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, PSA 대 C1-INH의 몰비는 적어도 약 1:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 10:1; 적어도 약 15:1; 적어도 약 20:1; 적어도 약 25:1; 적어도 약 30:1; 적어도 약 35:1; 적어도 약 40:1; 적어도 약 45:1; 또는 적어도 약 50:1일 수 있다.
일부 구현예에서, PSA 대 시알산의 몰비는 적어도 약 1:1, 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 적어도 약 1:15, 적어도 약 1:20, 적어도 약 1:25, 적어도 약 1:30, 적어도 약 1:35, 적어도 약 1:40 적어도 약 1:45, 적어도 약 1:50이다. 일부 구현예에서, PSA 대 시알산의 몰비는 약 1:1 내지 약 1:50, 약 1:1 내지 약 1:45, 약 1:1 내지 약 1:40, 약 1:1 내지 약 1:35, 약 1:1 내지 약 1:30, 약 1:1 내지 약 1:25, 약 1:1 내지 약 1:20, 약 1:1 내지 약 1:15, 약 1:1 내지 약 1:10, 또는 약 1:1 내지 약 1:5이다.
연장된 반감기
본 발명에 따르면, 컨쥬게이션(예컨대, 페길화 또는 PSA 컨쥬게이트)은 C1-INH의 생체내 반감기를 연장시킨다. 전형적으로, 컨쥬게이트(예컨대, 페길화 또는 PSA 컨쥬게이트) C1-INH는 비컨쥬게이트(예컨대 비페길화 또는 비-PSA 컨쥬게이트) C1-INH보다 더 긴 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트(예컨대, 페길화 또는 PSA 컨쥬게이트) C1-INH가 혈장 유래 인간 C1-INH보다 크거나 그와 유사한 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트(예컨대, 페길화 또는 PSA 컨쥬게이트) C1-INH의 반감기는 혈장 유래 C1-INH 단백질의 반감기의 약 80%~500%, 90%~500%, 100%~500%, 110%~500%, 120%~500%, 80%~400%, 90%~300%, 100%~300%, 100%~250%, 100%~200%, 또는 100%~150%의 범위에 있다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트(예컨대, 페길화 또는 PSA 컨쥬게이트) C1-INH 단백질이 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 또는 170 시간의 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트(예컨대, 페길화 또는 PSA 컨쥬게이트) C1-INH는 약 2일, 2.5일, 3일, 3.5일, 4일, 4.5일, 5일, 5.5일, 6일, 6.5일, 7일, 7.5일, 8일, 8.5일, 9일, 9.5일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 이상의 생체내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트(예컨대, 페길화 또는 PSA 컨쥬게이트) C1-INH 단백질은 약 0.5 내지 14일, 0.5 내지 10일, 1일 내지 10일, 1일 내지 9일, 1일 내지 8일, 1일 내지 7일, 1일 내지 6일, 1일 내지 5일, 1일 내지 4일, 1일 내지 3일, 2일 내지 10일, 2일 내지 9일, 2일 내지 8일, 2일 내지 7일, 2일 내지 6일, 2일 내지 5일, 2일 내지 4일, 2일 내지 3일, 2.5일 내지 10일, 2.5일 내지 9일, 2.5일 내지 8일, 2.5일 내지 7일, 2.5일 내지 6일, 2.5일 내지 5일, 2.5일 내지 4일, 3일 내지 10일, 3일 내지 9일, 3일 내지 8일, 3일 내지 7일, 3일 내지 6일, 3일 내지 5일, 3일 내지 4일, 3.5일 내지 10일, 3.5일 내지 9일, 3.5일 내지 8일, 3.5일 내지 7일, 3.5일 내지 6일, 3.5일 내지 5일, 3.5일 내지 4일, 4일 내지 10일, 4일 내지 9일, 4일 내지 8일, 4일 내지 7일, 4일 내지 6일, 4일 내지 5일, 4.5일 내지 10일, 4.5일 내지 9일, 4.5일 내지 8일, 4.5일 내지 7일, 4.5일 내지 6일, 4.5일 내지 5일, 5일 내지 10일, 5일 내지 9일, 5일 내지 8일, 5일 내지 7일, 5일 내지 6일, 5.5일 내지 10일, 5.5일 내지 9일, 5.5일 내지 8일, 5.5일 내지 7일, 5.5일 내지 6일, 6일 내지 10일, 7일 내지 10일, 8일 내지 10일, 9일 내지 10일, 10일 내지 11일, 11일 내지 12일, 12일 내지 13일, 13일 내지 14일의 범위인 생체내 반감기를 갖는다.
약학적 조성물
본 발명은 본원에 기술된 컨쥬게이트 C1-INH 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물을 더 제공한다. 담체 및 컨쥬게이트 C1-INH 단백질은 전형적으로 무균 상태고 투여 모드에 적합하도록 제형화된다.
적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 이에 제한되지 않지만, 물, 염, 용액(예컨대, NaCl), 식염수, 완충 식염수, 알코올, 글리세롤, 에탄올, 아라비아 고무, 식물성 기름, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스 또는 전분과 같은 탄수화물, 만니톨, 수크로스 또는 다른 것들과 같은 당, 덱스트로스, 스테아린산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈 등뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 조제 약품용 물질은 원하는 경우, 활성 화합물과 해로운 반응을 하지 않거나 그들의 활성을 방해하지 않는 보조제(예컨대, 활택제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주는 염, 완충제, 착색 물질, 향미 물질 및/또는 방향 물질 등)와 혼합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 정맥내 투여에 적합한 수용성 담체가 사용된다.
적합한 약학적 조성물 또는 의약품은 또한 원하는 경우에 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 소량 포함할 수 있다. 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 알약, 캡슐, 서방출(sustained release) 제형 또는 가루일 수 있다. 조성물은 또한 트리글리세라이드(triglycerides)와 같은 전통적인 결합제 및 담체와 함께 좌제로서 제형화될 수 있다. 경구용 제형은 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등의 약학용 등급과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.
약학적 조성물 또는 의약품은 인간에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물로서 통상적 절차에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 정맥내 투여용 조성물은 전형적으로 무균 등장성 수성 완충액에 용해된 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 덜어주는 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은 활성제의 양을 표시하는 앰플 또는 사셰트(sachette)와 같은 완전 밀폐 용기 내의 동결 건조 분말 또는 물-무함유 농축물로서 개별적으로 또는 단위 용량 형태로 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 무균 약학용 등급 물, 식염수 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 무균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본원에 기술된 컨쥬게이트 C1-INH는 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 자유 아미노기로 형성된 염들 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철(ferric hydroxides), 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것과 같은 자유 카르복시기로 형성된 염들을 포함한다.
바람직한 제형은 50 mM NaPO4(pH 7.2), 50 mM 소르비톨(Sorbitol), 및 150 mM 글리신을 포함한다. 제형은 액체일 수 있거나 투여 전에 동결건조되고 재구성될 수 있다.
투여 경로
본원에 기술된 컨쥬게이트 C1-INH(또는 본원에 기술된 C1-INH를 함유하는 조성물 또는 의약품)는 임의의 적절한 경로로 투여된다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH 또는 이를 함유하는 약학적 조성물은 전신 투여된다. 전신 투여는 정맥내, 진피내, 두개내, 경막내, 흡입, 경피(국소), 안구내, 근육내, 피하, 근육내, 경구 및/또는 점막경유(transmucosal) 투여일 수 있다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH 또는 이를 함유하는 약학적 조성물은 피하 투여된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "피하 조직"은 피부 바로 밑에 있는 성긴, 불규칙 결합 조직의 층으로 정의된다. 예를 들어, 피하 투여는 이에 제한되지 않지만 허벅지 부위, 배 부위, 볼기 부위 또는 어깨뼈 부위를 포함하는 부위들에 조성물을 주사함으로써 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH 또는 이를 함유하는 약학적 조성물은 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH 또는 이를 함유하는 약학적 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH 또는 이를 함유하는 약학적 조성물은 두개내 투여된다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH 또는 이를 함유하는 약학적 조성물은 경막내 투여된다. 원하는 경우, 하나보다 많은 경로가 동시에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH 또는 이를 함유하는 약학적 조성물은 대상에 피하(즉, 피부 아래에) 투여된다. 이러한 목적을 위해, 제형은 주사기를 사용하여 주입될 수 있다. 하지만, 제형의 투여를 위한 다른 장치들, 예를 들어 주사 장치(예컨대, Inject-easeTM GenjectTM 장치들); 주사기 펜(예컨대, GenPenTM); 바늘없는 장치(예컨대, MediJectorTM 및 BioJectorTM); 및 피하 패치 전달 시스템이 이용가능하다. 따라서, 본 발명은 컨쥬게이트 C1-INH(예컨대, 액체 및 동결건조 형태)를 포함하는 약학적 조성물 및 주사기와 같은 주사 장치를 함유하는 키트를 더 제공한다. 일부 구현예에서, 주사기에 컨쥬게이트 C1-INH를 포함하는 약학적 조성물이 미리 담겨 있다. 약학적 조성물이 동결건조되어 있는 경우, 키트는 재구성 버퍼를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 컨쥬게이트 C1-INH 또는 이를 함유하는 약학적 조성물의 치료 유효량의 일회 및 다회 투여를 고려한다. 컨쥬게이트 C1-INH 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 대상의 질병(예컨대, 유전성 혈관부종)의 특성, 중증도, 정도에 따라 일정한 간격으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 치료 유효량은 일정한 간격(예컨대, 1년에 한 번, 6개월에 한 번, 5개월에 한 번, 3개월에 한 번, 격월(두 달에 한 번), 매달(한 달에 한 번), 격주(이 주에 한 번), 매주, 매일 또는 연속)으로 주기적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 투여는 개인에서 단지 국소적인 효과를 주는 한편, 다른 구현예에서 투여는 개인에서 전신 효과와 같이 다수의 부분에 걸쳐 효과를 줄 수 있다. 전형적으로, 투여는 결과적으로 컨쥬게이트 C1-INH를 하나 이상의 표적 조직에 전달하게 된다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH는 이에 제한되지 않지만, 심장, 뇌, 피부, 혈액, 척수, 가로무늬근(예컨대, 골격근), 민무늬근, 신장, 간, 폐 및/또는 비장을 포함하는 하나 이상의 표적 조직에 전달된다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH는 심장에 전달된다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH는 중추신경계, 특히 뇌 및/또는 척수에 전달된다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH는 세갈래근, 앞정강근, 가자미근, 장딴지근, 두갈래근, 등세모근, 어깨세모근, 네갈래근 및/또는 횡격막에 전달된다.
용량 형태(Dosage Forms) 및 투여 요법(Dosing Regimen)
일부 구현예에서, 조성물은 치료 유효량으로 및/또는 특정한 원하는 결과(예컨대, HAE와 같은 보체-매개성 만성 질환의 예방)와 연관된 투여 요법에 따라 투여된다.
본 발명에 따라 투여되는 특정한 용량 또는 양은 예를 들어, 원하는 결과의 성질 및/또는 정도에 따라, 투여의 경로 및/또는 시기의 상세에 따라, 및/또는 하나 이상의 특성(예컨대, 몸무게, 연령, 개인 이력, 유전적 특성, 생활 방식 변수, 심장 결함의 중증도 및/또는 심장 결함의 위험 수준 등 또는 이들의 조합)에 따라 달라질 수 있다. 이러한 용량 또는 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 용량 또는 양은 표준 임상 기법에 따라 결정된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 적절한 용량 또는 양은 투여되는 바람직한 또는 최적의 용량 범위 또는 양을 확인하는 것을 돕는 하나 이상의 생체외 또는 생체내 분석의 사용을 통해 결정된다.
다양한 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH는 치료 유효량으로 투여된다. 일반적으로, 치료 유효량은 대상에게 의미있는 효과(예컨대, 기본적인 질환 또는 질병의 예방, 치료, 조절, 치유, 방지 및/또는 개선)를 달성하기에 충분한 것이다. 일반적으로, 치료제가 필요한 대상에 투여된 치료제(예컨대, 컨쥬게이트 C1-INH)의 양은 대상의 특성에 따라 다를 것이다. 이러한 특징은 대상의 상태, 질환 중증도, 일반적인 건강 상태, 연령, 성별, 체중을 포함한다. 당업자라면 이러한 요인들과 다른 관련 요인들에 따라 적절한 용량을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 또한, 객관적 및 주관적 분석 둘 다는 최적의 용량 범위를 확인하는 데 선택적으로 적용될 수 있다. 일부 특정한 구현예에서, 투여되는 적절한 용량 또는 양은 생체외 또는 동물 모델 검사 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 약학적 제형으로 제공된다. 일부 구현예에서, 약학적 제형은 HAE 발작의 감소된 발병률 또는 위험의 달성과 연관된 투여 요법에 따른 투여를 위한 단위 투여량이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 컨쥬게이트 C1-INH를 포함하는 제형은 일회 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 컨쥬게이트 C1-INH를 포함하는 제형은 일정한 간격으로 투여된다. 본원에서 사용되는 "간격"으로 투여는 치료 유효량이 주기적으로 투여되는 것(한 번 투여량과 구별됨)을 나타낸다. 간격은 표준 임상 기법으로 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 컨쥬게이트 C1-INH를 포함하는 제형은 격월, 매월, 한 달에 두 번, 삼 주에 한 번, 격주, 매주, 한 주에 두 번, 한 주에 세 번, 매일, 하루에 두 번, 또는 6시간 마다 투여된다. 한 개인에 대한 투여 간격은 고정된 간격일 필요가 없지만, 개인의 필요에 따라 시간에 따라 달라질 수 있다.
치료 유효량은 다회의 단위 용량을 포함할 수 있는 투여요법으로 공통적으로 투여된다. 임의의 특정 치료 단백질의 경우, 치료 유효량(및/또는 효과적인 투여 요법 내의 적절한 단위 용량)은, 예를 들어 투여 경로 또는 다른 치료제들과의 조합에 따라 다를 수 있다. 또한, 임의의 특정 환자를 위한 특이적 치료 유효량(및/또는 단위 용량)은 치료받는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특이적 약학적 제제의 활성; 적용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 전체적인 건강 상태, 성별 및 식이요법; 적용되는 특이적 C1-INH의 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 배출 또는 대사율; 치료의 지속기간; 및 의학적 기술분야에서 잘 알려져 있는 유사한 요인 등을 포함하는 다양한 요인들에 따라 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "격월"은 두 달에 한 번(즉, 매 2개월 마다 한 번) 투여를 의미하고; 용어 "매월"은 한 달에 한 번 투여를 의미하며; 용어 "삼 주에 한 번"은 3주에 한 번(즉, 매 3주 마다 한 번) 투여를 의미하고; 용어 "격주"는 두 주에 한 번(즉, 매 2주 마다 한 번) 투여를 의미하며; 용어 "매주"는 일주일에 한 번 투여를 의미하고; 용어 "매일"은 하루에 한 번 투여를 의미한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 컨쥬게이트 C1-INH를 포함하는 제형은 무기한으로 일정한 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 컨쥬게이트 C1-INH를 포함하는 제형은 한정된 기간 동안 일정한 간격으로 투여된다.
임의의 특정 대상에 있어서, 특이적 투여 요법은 효소 대체 요법의 투여를 투여하고 감시하는 사람의 전문적인 판단 및 개인의 필요에 따라 시간에 걸쳐 조정되어야 함과 본원에 개시된 용량의 범위는 단지 예시일 뿐 청구된 발명의 범위 또는 실시를 제한하지 않는 것임을 추가로 이해해야 한다.
조합 치료(Combination Therapy)
일부 구현예에서, 컨쥬게이트 C1-INH는 보체-매개성 질환의 치료를 위해 현재 사용되는 하나 이상의 공지된 치료제(예컨대, 코르티코스테로이드)와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 공지된 치료제(들)는 그의 표준 또는 승인된 투여 요법 및/또는 스케줄에 따라 투여된다. 일부 구현예에서, 공지된 치료제(들)는 그의 표준 또는 승인된 투여 요법 및/또는 스케줄과 비교하여 변경된 요법에 따라 투여된다. 일부 구현예에서, 이러한 변경된 요법은 하나 이상의 단위 투여량이 양적으로 변경(예컨대, 감소 또는 증가)되고/되거나 투여 빈도가 변경되는(예컨대, 단위 투여량 사이의 하나 이상의 간격이 확장되어 빈도를 줄이거나, 간격이 감소하여 빈도를 높이는) 점에서 표준 또는 승인된 투여 요법과 다르다.
보체-매개성 질병
컨쥬게이트 C1-INH 및 이를 함유하는 약학적 조성물은 HAE 및 여러 가지 다른 보체-매개성 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 단백질은 보체-매개성 질병, 예컨대 NMOSD AMR 및 HAE 발병(event)과 연관된 급성 발작에 적합하다. 이들 발작은 길거나 짧을 수 있다. 일부 구현예에서, 본 질환 또는 질병은 만성이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 예방적으로 사용된다. 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 예시적인 보체-매개성 질병은 이에 제한되지 않지만, 유전성 혈관부종, 항체 매개성 거부 반응, 시신경 척수염 범주 질환, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 뇌허혈 손상, 화상, 독성 표피 괴사용해, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 뇌졸중, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 중증 근무력증, 다초점성 운동 신경병증을 포함한다.
실시예
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 하기의 실시예에서 명백하다. 하지만, 본 발명의 구현예를 명시하는 실시예는 단지 예시를 위한 것일 뿐 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형 및 수정 사항이 실시예로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
실시예 1. C1-INH의 페길화
본 실시예는 C1-INH 단백질의 페길화에 적합한 예시적 방법을 나타낸다. 세개의 상이한 페길화 전략을 탐구하였다. 예시적인 페길화 개요는 도 3-5에 나타낸다. 이는 시알산 잔기에 PEG의 컨쥬게이션(시알산 매개[SAM] 화학 반응), 갈락토스산 잔기에 PEG의 컨쥬게이션(갈락토스 매개[GAM] 화학 반응), 및 PEG의 아민 매개 컨쥬게이션이었다.
아미녹시-PEG를 보다 안정한 옥심 결합을 형성하기 위해 사용하였다. Park et al., Carbohydrate-Mediated Polyethylene Glycol Conjugation of TSH Improves Its Pharmacological Properties. Endocrinology, March 2013, 154(3):1373-1383에 기술된 방법들에 기초하여 개발된 기법을 사용하여 페길화를 수행하였다.
당화된 단백질 상의 노출된 시알산 잔기는 전형적으로 시알산 잔기가 없거나 적은 단백질과 비교하여 반감기를 증가시키는 한편, 탄수화물 사슬 상의 말단 갈락토스 잔기는 수용체 매개성 제거를 일으키고 단백질의 혈청 반감기를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 초기의 노력은 C1 INH의 수용체 매개성 제거를 억제하기 위하여 GAM PEG 컨쥬게이션에 집중되었다. 세개의 접근법 모두 유망한 것으로 나타났지만, 아민과 SAM 페길화가 놀랍게도 효능에 있어서 최소한의 손실 및 수용가능한 손실로 C1-INH 페길화를 최대 수준으로 산출하는 것으로 나타났다. GAM 페길화는 비교하면 덜 효율적이고 보다 불균일하였다.
초기의 생체내 PK 시험은 페길화 C1-INH를 평가하기 위해 수행되었다. 구체적으로는, SAM 5 KDa 및 40 KDa 페길화 C1-INH를 랫 PK 시험에서 아미노 페길화 C1-INH와 비교하였다. 도 6의 패널 A-C를 참조하면, 페길화 C1-INH를 C1-INH를 사용한 항원 분석을 사용하여 정량화하고 표준 곡선을 만들었다. 샘플을 또한 웨스턴 블롯으로 분석하여 잠재적 분해를 확인하였다. 1 mg/kg 정맥내 및 3 mg/kg의 투여량은 인간에서 Cinryze®의 범위(2~3 mg/kg)에 있었다. 이들 시험은 페길화 단백질이 제거가 감소되는 경향으로 인해 반감기가 3~4배 증가하였음을 입증하였다.
C1-INH-PEG를 수컷 SD 랫에 1 mg/kg으로 정맥내 투여하여 추가 약동학적 시험을 수행하였다. 이들 데이터는 하기 표 1에 나타낸다.
Figure pct00002
*PEG는 선형. **PEG는 가지형
표 1. 수컷 스프래그 다우리(Sprague Dawley, SD) 랫에 정맥내 투여된 C1-INH-PEG의 약동학적 변수들.
추가로, NHP 시험에서, 피하 생체이용률이 약 30~40%로 관찰되었고, 이는 비컨쥬게이트 재조합 C1-INH 단백질에 비해 예상치 못한 개선이었다.
그러므로, 페길화 C1-INH는 치료적 이용에 적합한 증가된 반감기와 충분한 생체이용률을 가지는 것으로 보인다.
실시예 2. 예시적인 페길화 프로토콜
공정 A
정제된 C1-INH를 pH 5.6에서 100 mM 아세트산 나트륨으로 투석하였다. 과요오드 산화를 4℃에서 30분간 수행하였다. 4℃에서 15분간 글리세롤로 반응을 종료시켰다. 산화 C1-INH를 아세트산 버퍼로 투석하였다. 그런 다음 상기 재료를 4℃에서 밤새 페길화하였고 이후에 글리신으로 종료시켰다. 자유 PEG를 음이온 교환으로 제거하였다. 공정 A의 예시적인 개략도가 도 7에 제공된다.
공정 A에 의해 제조된 C1-INH-PEG 40 KDa을 다음의 방법을 사용하여 더 정제하였다.
C1-INH에 컨쥬게이트된 40 KDa PEG 아민의 약 1 mg을 샘플 희석 버퍼(pH 7.00에서 5 mM NaPO4)로 20배 희석하였다. 생성 용액은 0.716 mS/cm의 전도도를 나타내었다. 샘플을 a 10 mL GigaCap Q (650) 컬럼 XK16에 로딩하였다. 유동 속도는 전체 공정에서 150 cm/h였다. 컬럼을 샘플 희석 버퍼로 완전히 세척하였고 단백질을 500 mM NaCl에 대해 10 컬럼 부피 구배로 용리하였다. 2 mL의 분획물을 수집하였고 샘플은 SDS-PAGE로 분석하였다. 크로마토그래피 결과를 도 11에 나타내었다. 그런 다음 피크 분획물을 모아서 제형 버퍼(50 mM 포스페이트(pH=7.1), 150 mM 글리신, 50 mM 소르비톨)로 투석하였고, 1.0 mg/ml 이상으로 농축하였고 280 nm 흡광도(나노드랍(Nano-drop))로 정량하였다.
유사한 정제를 C1-INH-PEG 20 KDa 제조물에 수행하여 도 12에 도시하였고, C1-INH-PEG 5 KDa 제조물은 도 13에 도시하였다.
모든 샘플의 정량을 단백질의 아미노산 서열에서 유도한 분자량과 흡광 계수(extinction coefficient)를 사용하여 나노드랍 기구에서 수행하였다. 결과를 하기 표 2에 나타낸다:
Figure pct00003
표 2: C1-INH 페길화 공정 샘플의 정량
공정 B
정제된 C1-INH를 TFF 버퍼 교환을 통해 pH 5.6에서 100 mM 아세트산 나트륨으로 교환하였다. 과요오드 산화를 30분간 실온에서 수행하였다. 과요오드산염을 40배 몰량을 초과(40x molar excess)하여 제공하였다. C1-INH 4 mg/mL까지 반응에 참여하였다. 15분간 실온에서 글리세롤로 반응을 종료시켰다. 그런 다음 상기 재료를 실온에서 밤새 페길화하였다. PEG를 100배 몰량을 초과하여 제공하였다. C1-INH 2 mg/mL까지 반응에 참여하였다. 자유 PEG를 TFF 버퍼 교환으로 제거하였다. 공정 B의 예시적인 개략도가 도 8에 제공된다.
C1-INH를 페길화하는 데 적합한 다른 예시적 페길화 프로토콜은 도 9a 내지 도 9e에 요약되어 있다.
SAM 공정―PEG 5K
본 공정에서, 약 200 mL의 옥틸 담지 물질(트리스/황산 암모늄 용액에서 약 0.9 mg/ml C1-INH)을 Pellicon XL, Biomax, 30kDa (PES) TFF 카세트를 10배 투석부피(diavolume) 교환으로 사용하여 pH 5.6, 100 mM 아세트산 나트륨으로 버퍼 교환하였다. 40 μM C1-INH(3.7 mg/ml)를 1.6 mM 과요오드산 나트륨(40배)으로 30분간 실온에서 부드럽게 교반하며 처리하였다(pH 5.6, 100 mM 아세트산 나트륨에서 50 ml 반응). 15분간 실온에서 1.5% 글리세롤로 반응을 종료시켰다.
21.6 uM C1-INH(2mg/ml)를 2.16 mM 5kDa-PEG(100배)로 부드럽게 교반하며 밤새 실온에서 처리하였다(pH 5.6, 100 mM 아세트산 나트륨에서 92.5 ml 반응). 그런 다음 1시간 동안 실온에서 2.16 mM 글리신(100배)으로 반응을 종료시켰다.
자유 PEG의 TFF 투석 여과 제거를 Pellicon XL, Biomax 100kDa MWCO(PES) TFF 카세트를 10배 투석부피 교환으로 사용하여 50 mM 인산 나트륨, 150 mM 글리신, 및 50 mM 소르비톨로 pH 7.1에서 수행하였다. 그런 다음 생성물을 .22 uM, PES, Millipore steriflip 필터를 이용하여 여과 멸균하였다. 페길화된 샘플의 IC50을 도 10의 패널 A와 B 및 도 20의 패널 A-B에 나타낸다.
각 공정 단계 후의 수율을 하기 표 3에 제시한다:
Figure pct00004
표 3: 옥틸 로드 페길화 단계 수율
SAM 공정―PEG 선형 2K, 5K, 가지형 5K, 10K, 20K, 40K
SAM 공정을 또한 다음 종류의 PEG를 갖는 C1-INH-PEG를 제조하는 데 사용하였다: 선형 2K, 선형 5K, 가지형 5K, 가지형 10K, 가지형 20K 및 가지형 40K.
PEG 2K, 5K, 및 10K로 페길화된 C1-INH를 Amicon 원심분리 필터(컷오프 30K)로 정제하였다. PEG-아미녹시 20K 또는 40K로 페길화된 C1-INH를 AKTA 시스템으로 자유 PEG 제거를 위해 정제하였다. C1-INH의 특성은 도 18의 패널 A-E에 나타낸다. SAM 공정에 의해 생산된 C1-INH-PEG를 순도와 효능에 대해 분석하였고 PK는 랫 모델에서 평가하였다. 이들 데이터를 도 19의 패널 A-C에 제시한다. 페길화 샘플의 추가적인 특성 및 IC50 값은 도 24의 패널 A와 B에 나타낸다.
C1-INH-PEG 생성을 위한 SAM 페길화 조건을 하기 표 4에 나타낸다.
Figure pct00005
표 4. C1-INH-PEG 생성을 위한 SAM 페길화 조건
아민 커플링 공정을 통한 페길화
C1-INH-PEG를 또한 아민 커플링 공정으로 제조하였다. 아미노 커플링 공정을 통한 예시적 페길화의 개략도를 도 21에 도시한다.
PEG 1K, 선형 5K, 및 가지형 5K로 페길화된 C1-INH를 Amicon 원심분리 필터(컷오프 30K)로 정제하였다. 바륨-아이오딘 염색을 PEG5K 모이어티에 대한 자유 PEG를 탐지하는데 사용하였고, RP-HPLC를 자유 PEG1K 및 2K를 탐지하는데 이용하였다. NHS-PEG20K 및 40K로 페길화된 C1-INH를 AKTA 퓨어(pure) 크로마토그래피 시스템으로 정제하였다. 페길화 C1-INH의 특성을 도 22의 패널 A-D에 나타낸다.
아민 커플링 공정에 의해 생산된 C1-INH-PEG를 순도, 효능에 대해 분석하였고, PK는 랫 모델에서 평가하였다. 이들 데이터를 도 23의 패널 A-C에 제시한다.
아민 커플링 공정을 통한 C1-INH-PEG 생성을 위한 페길화 조건을 하기 표 5에 나타낸다.
Figure pct00006
표 5. 아민 커플링 공정을 통한 C1-INH-PEG 생성을 위한 페길화 조건.* 100배 PEG20K로 페길화한 것은 낮은 전환율을 가졌고 추가 40배 PEG20K로 재처리하였다.
실시예 3: 정맥내 투여된 페길화 C1-INH의 비-인간 영장류 PK 시험
비-인간 영장류(NHP)(시노몰구스(cynomolgus) 원숭이)를 두 그룹으로 나누고 재조합 인간 C1-INH(rhC1-INH)를 30 mg/kg으로 정맥내 투여하거나 페길화 rhC1-INH를 5 mg/kg으로 정맥내 투여하였다. 시험의 예시적인 결과를 도 14 및 표 6에 요약한다.
NHP에서 페길화 rhC1-INH는 rhC1-INH와 비교하여 6배 낮은 제거 및 3배 긴 말단 반감기를 보였다. 이와 유사한 경향이 랫 시험에서도 관찰되었고 제거는 4배 감소하였고 반감기는 4배 증가하였다.
Figure pct00007
표 6: 페길화 rhC1 INH 대 rhC1 INH의 NHP PK 시험 결과
a 시험에서 세 마리의 원숭이 중 하나가 408시간 후에 증가된 제거율을 보였고 PK 산출에 포함하지 않았다.
C1-INH를 정맥내 투여한 NHP의 PK에 대한 PEG 로드의 영향
추가 PK 시험을 NHP로 수행하였다. NHP가 C1-INH-PEG를 5배, 10배, 20배 및 40배 로드로 정맥내 투여받았다. 예시적 결과는 도 15에 나타낸다.
실시예 4: 페길화 C1-INH의 NHP 정맥내 대 피하 PK
HP를 두 그룹으로 나누고 페길화 C1-INH를 5 mg/kg으로 정맥내 투여하거나 페길화 C1-INH를 10 mg/kg으로 피하(SC) 투여하였다. 시험의 결과를 도 16 및 표 7에 요약한다. 페길화 C1-INH의 작용 활성(SA = 4.8 U/mg)을 시험의 시간 경과에 따라 유지하였다.
상당히 예상외로, NHP에서 페길화 C1-INH는 정맥내 투여와 유사한 반감기를 가지면서 85%의 생체이용률을 보였다. 따라서 수집된 전임상 데이터가 일주일에 한 번 또는 그보다 적은 빈도의 투여의 가능성을 지지한다.
Figure pct00008
표 7: NHP에서 페길화 rhC1-INH의 정맥내 대 피하 투여
F = 피하 투여 후의 NHP에서의 hrC1-inh에 대해 58%
실시예 5: 최대 PK 프로파일에 대한 최소 PEG를 시험하기 위한 산화/적정(titration)
사용된 DT-1215 역가(titer) 분석은 항-PEG 항체로 혈청 샘플로부터 PEG-rC1-INH 단백질을 획득하는 방법에 기초한 ELISA였다. 그런 다음 단백질을 표지된 항-C1-INH 단백질로 검출하였다. PEG-rC1-INH를 표준 곡선을 만드는 데 사용하였다. 도 17은 DT-1215 역가 분석 및 샘플 고유 활성의 결과를 도시한다. 표 8 및 9는 추가 데이터를 제공한다.
Figure pct00009
표 8: 과요오드산염 처리의 여러 수준에서 관찰된 고유 활성의 변화. 표 9(하기)에 나타낸 바와 같이, 과요오드산염 수준의 변화는 PEG 대 C1 INH의 상이한 비율을 가져온다.
Figure pct00010
표 9: 비컨쥬게이트 C1 INH와 비교한 PEG의 여러 수준에서 달성된 반감기.
실시예 6: 페길화 C1-INH의 물리적 특성
페길화된 제조물의 순도를 SEC 및 SEC-MAL을 사용하여 분석하였다. 0.1 mg/ml PEG-C1-INH의 CD 스펙트럼을 25°C에서 측정하였다. CD 데이터를 AVIV 및 CDNN 소트르웨어로 처리하였다. 단백질이 페길화된 경우 CD 스펙트럼 및 이차 구조 분석에 기초하여 유의미한 변화가 관찰되지 않는다. C1-INH(2OAY)의 C-말단 결정 구조에 따르면, 27% 나선 구조 및 30% 베타-병풍 구조이다.
Figure pct00011
표 10: 데이터는 페길화가 C1-INH의 이차 구조를 변형시키지 않음을 입증.
페길화 C1-INH의 용융 온도(Tm)를 nanoDSF로 측정하였다. 페길화가 C1-INH의 열적 안정성을 급격하게 변화시키지 않음을 확인하였다. 40 KDa 아미노-페길화 C1-INH의 Tm이 시험된 다른 컨쥬게이트보다 2℃더 높게 측정되었다. 이들 데이터는 하기 표 11에 나타낸다.
Figure pct00012
표 11: 페길화 C1-INH의 Tm 분석
페길화 수준을 특징 짓는 데 핵 자기 공명(NMR)을 사용하였다. 아민에 페길화는 낮았고 C1-INH 당 약 3개의 PEG 모이어티였다. 시알산은 5K PEG 반응물에 대해 포화에 이르도록 상당히 페길화될 수 있다. 시알산에 40K 페길화하면 분자당 약 9개의 PEG에 이른다. 페길화 수준은 여러 과요오드산염 농도에서 정량화하였다. 이들 데이터는 하기 표 12에 나타낸다.
Figure pct00013
표 12: 페길화 C1-INH 제조물의 NMR 특성
실시예 7: C1-INH-PSA의 특성
C1-INH를 시알산 매개(SAM) 공정을 통해 폴리시알산(PSA)으로 컨쥬게이트하였다. SAM 공정으로 생산된 C1-INH-PSA의 특성을 순도 및 효능에 대해 분석하였다. 이들 데이터는 도 24의 패널 A 및 B에 제시된다. 데이터는 자유 PSA가 효능 분석 자체를 간섭하지 않고, C1-INH 효능이 여기서 시험된 PSA:C1INH 조건 하에서 약 4~7배까지 감소하였다.
PK 시험을 랫에서 C1-INH-PSA, C1-INH-PEG, 및 Cinryze®-PEG를 사용하여 수행하였다. 데이터를 도 25의 패널 A-C에 제시한다.
등가물 및 범주
당업자는 일상적인 실험만을 이용하여, 본원에 기재된 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 전술된 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에서 설명되는 바와 같다.
SEQUENCE LISTING <110> SHIRE HUMAN GENETIC THERAPIES, INC. <120> CONJUGATED C1 ESTERASE INHIBITOR AND USES THEREOF <130> SHR-1234WO2 <140> PCT/US2017/026001 <141> 2017-04-04 <150> 62/318,003 <151> 2016-04-04 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Pro Asn Ala Thr Ser Ser Ser Ser Gln Asp Pro Glu Ser Leu Gln 1 5 10 15 Asp Arg Gly Glu Gly Lys Val Ala Thr Thr Val Ile Ser Lys Met Leu 20 25 30 Phe Val Glu Pro Ile Leu Glu Val Ser Ser Leu Pro Thr Thr Asn Ser 35 40 45 Thr Thr Asn Ser Ala Thr Lys Ile Thr Ala Asn Thr Thr Asp Glu Pro 50 55 60 Thr Thr Gln Pro Thr Thr Glu Pro Thr Thr Gln Pro Thr Ile Gln Pro 65 70 75 80 Thr Gln Pro Thr Thr Gln Leu Pro Thr Asp Ser Pro Thr Gln Pro Thr 85 90 95 Thr Gly Ser Phe Cys Pro Gly Pro Val Thr Leu Cys Ser Asp Leu Glu 100 105 110 Ser His Ser Thr Glu Ala Val Leu Gly Asp Ala Leu Val Asp Phe Ser 115 120 125 Leu Lys Leu Tyr His Ala Phe Ser Ala Met Lys Lys Val Glu Thr Asn 130 135 140 Met Ala Phe Ser Pro Phe Ser Ile Ala Ser Leu Leu Thr Gln Val Leu 145 150 155 160 Leu Gly Ala Gly Glu Asn Thr Lys Thr Asn Leu Glu Ser Ile Leu Ser 165 170 175 Tyr Pro Lys Asp Phe Thr Cys Val His Gln Ala Leu Lys Gly Phe Thr 180 185 190 Thr Lys Gly Val Thr Ser Val Ser Gln Ile Phe His Ser Pro Asp Leu 195 200 205 Ala Ile Arg Asp Thr Phe Val Asn Ala Ser Arg Thr Leu Tyr Ser Ser 210 215 220 Ser Pro Arg Val Leu Ser Asn Asn Ser Asp Ala Asn Leu Glu Leu Ile 225 230 235 240 Asn Thr Trp Val Ala Lys Asn Thr Asn Asn Lys Ile Ser Arg Leu Leu 245 250 255 Asp Ser Leu Pro Ser Asp Thr Arg Leu Val Leu Leu Asn Ala Ile Tyr 260 265 270 Leu Ser Ala Lys Trp Lys Thr Thr Phe Asp Pro Lys Lys Thr Arg Met 275 280 285 Glu Pro Phe His Phe Lys Asn Ser Val Ile Lys Val Pro Met Met Asn 290 295 300 Ser Lys Lys Tyr Pro Val Ala His Phe Ile Asp Gln Thr Leu Lys Ala 305 310 315 320 Lys Val Gly Gln Leu Gln Leu Ser His Asn Leu Ser Leu Val Ile Leu 325 330 335 Val Pro Gln Asn Leu Lys His Arg Leu Glu Asp Met Glu Gln Ala Leu 340 345 350 Ser Pro Ser Val Phe Lys Ala Ile Met Glu Lys Leu Glu Met Ser Lys 355 360 365 Phe Gln Pro Thr Leu Leu Thr Leu Pro Arg Ile Lys Val Thr Thr Ser 370 375 380 Gln Asp Met Leu Ser Ile Met Glu Lys Leu Glu Phe Phe Asp Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Asp Leu Asn Leu Cys Gly Leu Thr Glu Asp Pro Asp Leu Gln Val 405 410 415 Ser Ala Met Gln His Gln Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Thr Gly Val 420 425 430 Glu Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ile Ser Val Ala Arg Thr Leu Leu Val 435 440 445 Phe Glu Val Gln Gln Pro Phe Leu Phe Val Leu Trp Asp Gln Gln His 450 455 460 Lys Phe Pro Val Phe Met Gly Arg Val Tyr Asp Pro Arg Ala 465 470 475 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Ser Phe Cys Pro Gly Pro Val Thr Leu Cys Ser Asp Leu Glu Ser 1 5 10 15 His Ser Thr Glu Ala Val Leu Gly Asp Ala Leu Val Asp Phe Ser Leu 20 25 30 Lys Leu Tyr His Ala Phe Ser Ala Met Lys Lys Val Glu Thr Asn Met 35 40 45 Ala Phe Ser Pro Phe Ser Ile Ala Ser Leu Leu Thr Gln Val Leu Leu 50 55 60 Gly Ala Gly Glu Asn Thr Lys Thr Asn Leu Glu Ser Ile Leu Ser Tyr 65 70 75 80 Pro Lys Asp Phe Thr Cys Val His Gln Ala Leu Lys Gly Phe Thr Thr 85 90 95 Lys Gly Val Thr Ser Val Ser Gln Ile Phe His Ser Pro Asp Leu Ala 100 105 110 Ile Arg Asp Thr Phe Val Asn Ala Ser Arg Thr Leu Tyr Ser Ser Ser 115 120 125 Pro Arg Val Leu Ser Asn Asn Ser Asp Ala Asn Leu Glu Leu Ile Asn 130 135 140 Thr Trp Val Ala Lys Asn Thr Asn Asn Lys Ile Ser Arg Leu Leu Asp 145 150 155 160 Ser Leu Pro Ser Asp Thr Arg Leu Val Leu Leu Asn Ala Ile Tyr Leu 165 170 175 Ser Ala Lys Trp Lys Thr Thr Phe Asp Pro Lys Lys Thr Arg Met Glu 180 185 190 Pro Phe His Phe Lys Asn Ser Val Ile Lys Val Pro Met Met Asn Ser 195 200 205 Lys Lys Tyr Pro Val Ala His Phe Ile Asp Gln Thr Leu Lys Ala Lys 210 215 220 Val Gly Gln Leu Gln Leu Ser His Asn Leu Ser Leu Val Ile Leu Val 225 230 235 240 Pro Gln Asn Leu Lys His Arg Leu Glu Asp Met Glu Gln Ala Leu Ser 245 250 255 Pro Ser Val Phe Lys Ala Ile Met Glu Lys Leu Glu Met Ser Lys Phe 260 265 270 Gln Pro Thr Leu Leu Thr Leu Pro Arg Ile Lys Val Thr Thr Ser Gln 275 280 285 Asp Met Leu Ser Ile Met Glu Lys Leu Glu Phe Phe Asp Phe Ser Tyr 290 295 300 Asp Leu Asn Leu Cys Gly Leu Thr Glu Asp Pro Asp Leu Gln Val Ser 305 310 315 320 Ala Met Gln His Gln Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Thr Gly Val Glu 325 330 335 Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ile Ser Val Ala Arg Thr Leu Leu Val Phe 340 345 350 Glu Val Gln Gln Pro Phe Leu Phe Val Leu Trp Asp Gln Gln His Lys 355 360 365 Phe Pro Val Phe Met Gly Arg Val Tyr Asp Pro Arg Ala 370 375 380 <210> 3 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 4 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 5 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu Lys Phe His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 6 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu Lys Phe His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 7 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 20 25 30 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 35 40 45 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 50 55 60 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 65 70 75 80 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 85 90 95 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 100 105 110 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 115 120 125 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 130 135 140 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 145 150 155 160 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 165 170 175 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 180 185 190 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 195 200 205 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 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Claims (99)

  1. 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 조성물로서,
    적어도 하나의 글리칸 잔기를 포함하는 C1-INH 단백질; 및
    적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함하되,
    상기 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티는 상기 적어도 하나의 글리칸 잔기와 공유 결합하는, 조성물.
  2. 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 조성물로서,
    적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함하는 C1-INH 단백질을 포함하되,
    상기 적어도 하나의 PEG 모이어티는 옥심 결합을 통해 상기 C1-INH 단백질에 공유 결합하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 옥심 결합이 상기 PEG 모이어티와 C1-INH의 글리칸 잔기 또는 아민기 사이에 있는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리칸 잔기는 시알산 잔기 또는 갈락토스 잔기인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 글리칸 잔기는 시알산 잔기인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질은 재조합하여 생산되거나 혈장 유래된, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 37 또는 서열번호 38과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 C1-INH 도메인을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질은 융합 단백질인, 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 융합 단백질은 C1-INH 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된 Fc 도메인을 포함하는, 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1으로부터 유래된, 조성물.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른 L234A 및 L235A에 상응하는 아미노산 치환을 포함하는, 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 융합 단백질은 C1-INH 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된 알부민 도메인을 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 페길화(PEGylation) 이전에 약 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35 % 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15 % 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 페길화 이전에 약 5% 내지 약 25%의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 평균적으로 분자당 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 하전된 글리칸을 포함하는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 페길화 이전에, 만노스, α-갈락토스, NGNA, 또는 올리고만노스형 당화 중 하나 이상을 약 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만으로 함유하는, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 페길화 이전에, 상기 C1-INH 단백질이 하기 중 하나 이상을 포함하는 당화 프로파일을 갖는, 조성물:
    약 5% 내지 약 30%의 중성 글리칸 종;
    약 10% 내지 약 30%의 모노-시알화 글리칸 종;
    약 30% 내지 약 50%의 디-시알화 글리칸 종;
    약 15% 내지 약 35%의 트리-시알화 글리칸 종; 또는
    약 5% 내지 약 15%의 테트라-시알화 글리칸 종.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 페길화 이전에, 상기 C1-INH 단백질이 다음을 포함하는 당화 프로파일을 갖는, 조성물:
    30% 이하의 중성 글리칸 종;
    약 20% 내지 약 30%의 모노-시알화 글리칸 종;
    약 30% 내지 약 40%의 디-시알화 글리칸 종;
    약 10% 내지 약 20%의 트리-시알화 글리칸 종; 및
    약 5% 내지 약 10%의 테트라-시알화 글리칸 종.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 평균적으로 분자당 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 시알화 글리칸 잔기를 포함하는, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 평균적으로 단백질의 몰당 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 몰의 시알산을 포함하는, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG는 분자량이 약 1 KDa 내지 50 KDa, 약 1 KDa 내지 40 KDa, 약 5 KDa 내지 40 KDa, 약 1 KDa 내지 30 KDa, 약 1 KDa 내지 25 KDa, 약 1 KDa 내지 20 KDa, 약 1 KDa 내지 15 KDa, 약 1 KDa 내지 10 KDa, 또는 약 1 KDa 내지 5 KDa인, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG는 분자량이 약 1 KDa, 5 KDa, 10 KDa, 15 KDa, 20 KDa, 25 KDa, 30 KDa, 35 KDa, 40 KDa, 45 KDa, 또는 50 KDa인, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH는 PEG/C1-INH 비율이 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5인, 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 인간 C1-INH의 반감기보다 크거나 그와 유사한 반감기를 갖는, 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 C1-INH의 반감기의 100%~500% 범위의 반감기를 갖는, 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH가 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 또는 170 시간의 반감기를 갖는, 조성물.
  27. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH가 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일의 반감기를 갖는, 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 인간 C1-INH의 고유 활성(specifc activity)의 50%~150% 범위의 고유 활성을 갖는, 조성물.
  29. 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 제조하는 방법으로서,
    적어도 하나의 글리칸 잔기 및/또는 적어도 하나의 아민기를 포함하는 C1-INH 단백질을 공급하는 단계; 및
    PEG 모이어티가 상기 적어도 하나의 글리칸 잔기 및/또는 상기 적어도 하나의 아민기와 반응하여 결합을 형성할 수 있는 조건 하에서 PEG 모이어티를 공급하여 컨쥬게이트 C1-INH를 제조하는 단계;를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 PEG 모이어티가 PEG-CH2-O-NH2를 포함하는, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 글리칸 잔기는 시알산 잔기인, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 글리칸 잔기는 갈락토스 잔기인, 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 적어도 하나의 글리칸 잔기를 상기 PEG 모이어티와 반응하기 전에 산화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 산화 단계는 과요오드 산화를 포함하는, 방법.
  35. 제30항에 있어서, 상기 과요오드 산화는 과요오드산염 대 C1-INH의 몰비가 약 20:1 내지 약 50:1로 수행되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 과요오드산염 대 PEG의 몰비가 약 2.5 내지 약 40인, 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 대 C1-INH의 몰비가 약 25:1 내지 100:1인, 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 컨쥬게이트 C1-INH를 정제하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 정제 단계는 음이온 교환, 접선 유동 여과 투석 여과(tangential flow filtration diafiltration), 및 투석 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH).
  41. 제1항 내지 제28항 및 제40항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 조성물은 액체인, 약학적 조성물.
  43. 제41항에 있어서, 상기 조성물은 동결건조된, 약학적 조성물.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항의 약학적 조성물 및 주사기를 포함하는 키트.
  45. 제44항에 있어서, 상기 주사기에 상기 약학적 조성물이 미리 담겨 있는, 키트.
  46. 제44항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 동결건조되어 있고, 상기 키트는 재구성 버퍼를 더 포함하는, 키트.
  47. 치료가 필요한 대상에게 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 보체-매개성 질병 치료 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 보체-매개성 질병은 유전성 혈관부종, 항체 매개성 거부 반응, 시신경 척수염 범주 질환, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 뇌허혈 손상, 화상, 독성 표피 괴사용해, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 뇌졸중, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 중증 근무력증, 다초점성 운동 신경병증으로부터 선택되는, 방법.
  49. 보체-매개성 질병을 치료하기 위한 의약품의 제조에 있어서, 제1항 내지 제28항 및 제40항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 C1-에스테라제 억제제를 포함하는 조성물의 용도.
  50. 제49항에 있어서, 상기 보체-매개성 질병은 유전성 혈관부종, 항체 매개성 거부 반응, 시신경 척수염 범주 질환, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 뇌허혈 손상, 화상, 독성 표피 괴사용해, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 뇌졸중, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 중증 근무력증, 다초점성 운동 신경병증으로부터 선택되는, 용도.
  51. 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 조성물로서,
    적어도 하나의 글리칸 잔기를 포함하는 C1-INH 단백질; 및
    적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 모이어티를 포함하되,
    상기 적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 모이어티는 상기 적어도 하나의 글리칸 잔기와 공유 결합하는, 조성물.
  52. 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 조성물로서,
    적어도 하나의 글리칸 잔기를 포함하는 C1-INH 단백질; 및
    적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 모이어티를 포함하되,
    상기 적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 모이어티는 옥심 결합 또는 히드라존 결합을 통해 상기 C1-INH 단백질에 공유 결합하는, 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 모이어티는 옥심 결합을 통해 상기 C1-INH 단백질에 공유 결합하는, 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 상기 적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 모이어티는 히드라존 결합을 통해 상기 C1-INH 단백질에 공유 결합하는, 조성물.
  55. 제52항에 있어서, 상기 옥심 결합이 상기 PSA 모이어티와 C1-INH의 글리칸 잔기 또는 아민기 사이에 있는, 조성물.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리칸 잔기는 시알산 잔기인, 조성물.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질은 재조합하여 생산되거나 혈장 유래된, 조성물.
  58. 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 37 또는 서열번호 38과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 C1-INH 도메인을 포함하는, 조성물.
  59. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질은 융합 단백질인, 조성물.
  60. 제58항에 있어서, 상기 융합 단백질은 C1-INH 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된 Fc 도메인을 포함하는, 조성물.
  61. 제59항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1으로부터 유래된, 조성물.
  62. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른 L234A 및 L235A에 상응하는 아미노산 치환을 포함하는, 조성물.
  63. 제59항에 있어서, 상기 융합 단백질은 C1-INH 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된 알부민 도메인을 포함하는, 조성물.
  64. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 페길화 이전에 약 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35 % 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15 % 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는, 조성물.
  65. 제51항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 페길화 이전에 약 5% 내지 약 25%의 중성 글리칸 종을 포함하는 당화 프로파일을 갖는, 조성물.
  66. 제51항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 평균적으로 분자당 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 하전된 글리칸을 포함하는, 조성물.
  67. 제51항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 PSA와 컨쥬게이션하기 이전에, 만노스, α-갈락토스, NGNA, 또는 올리고만노스형 당화 중 하나 이상을 약 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만으로 함유하는, 조성물.
  68. 제51항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, PSA와 컨쥬게이션 하기 이전에, 상기 C1-INH 단백질이 하기 중 하나 이상을 포함하는 당화 프로파일을 갖는, 조성물:
    약 5% 내지 약 30%의 중성 글리칸 종;
    약 10% 내지 약 30%의 모노-시알화 글리칸 종;
    약 30% 내지 약 50%의 디-시알화 글리칸 종;
    약 15% 내지 약 35%의 트리-시알화 글리칸 종; 또는
    약 5% 내지 약 15%의 테트라-시알화 글리칸 종.
  69. 제51항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, PSA와 컨쥬게이션 하기 이전에, 상기 C1-INH 단백질이 다음을 포함하는 당화 프로파일을 갖는, 조성물:
    30% 이하의 중성 글리칸 종;
    약 20% 내지 약 30%의 모노-시알화 글리칸 종;
    약 30% 내지 약 40%의 디-시알화 글리칸 종;
    약 10% 내지 약 20%의 트리-시알화 글리칸 종; 및
    약 5% 내지 약 10%의 테트라-시알화 글리칸 종.
  70. 제51항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 평균적으로 분자당 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 시알화 글리칸 잔기를 포함하는, 조성물.
  71. 제51항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 단백질이 평균적으로 단백질의 몰당 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 몰의 시알산을 포함하는, 조성물.
  72. 제51항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PSA는 분자량이 약 1 KDa 내지 50 KDa, 약 1 KDa 내지 40 KDa, 약 5 KDa 내지 40 KDa, 약 1 KDa 내지 30 KDa, 약 1 KDa 내지 25 KDa, 약 1 KDa 내지 20 KDa, 약 1 KDa 내지 15 KDa, 약 1 KDa 내지 10 KDa, 또는 약 1 KDa 내지 5 KDa인, 조성물.
  73. 제51항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PSA는 분자량이 약 1 KDa, 5 KDa, 10 KDa, 15 KDa, 20 KDa, 25 KDa, 30 KDa, 35 KDa, 40 KDa, 45 KDa, 또는 50 KDa인, 조성물.
  74. 제51항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH는 PSA/C1-INH 비율이 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5인, 조성물.
  75. 제51항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 인간 C1-INH의 반감기보다 크거나 그와 유사한 반감기를 갖는, 조성물.
  76. 제51항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 C1-INH의 반감기의 100%~500% 범위의 반감기를 갖는, 조성물.
  77. 제51항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH가 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 또는 170 시간의 반감기를 갖는, 조성물.
  78. 제51항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH가 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일의 반감기를 갖는, 조성물.
  79. 제51항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 C1-INH가 혈장 유래 인간 C1-INH의 고유 활성의 50%~150% 범위의 고유 활성을 갖는, 조성물.
  80. 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 제조하는 방법으로서,
    적어도 하나의 글리칸 잔기 및/또는 적어도 하나의 아민기를 포함하는 C1-INH 단백질을 공급하는 단계; 및
    폴리시알산(PSA) 모이어티가 상기 적어도 하나의 글리칸 잔기 및/또는 상기 적어도 하나의 아민기와 반응하여 결합을 형성할 수 있는 조건 하에서 PSA 모이어티를 공급하여 컨쥬게이트 C1-INH를 제조하는 단계;를 포함하는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 적어도 하나의 글리칸 잔기는 시알산 잔기인, 방법.
  82. 제80항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 적어도 하나의 글리칸 잔기를 상기 PSA 모이어티와 반응하기 전에 산화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 산화 단계는 과요오드 산화를 포함하는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 과요오드 산화는 과요오드산염 대 C1-INH의 몰비가 약 20:1 내지 약 50:1로 수행되는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 과요오드산염 대 PSA의 몰비가 약 2.5 내지 약 40인, 방법.
  86. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, PSA 대 C1-INH의 몰비가 약 25:1 내지 100:1인, 방법.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 컨쥬게이트 C1-INH를 정제하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 정제 단계는 음이온 교환, 접선 유동 여과 투석 여과, 및 투석 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  89. 제78항 내지 제86항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH).
  90. 제51항 내지 제79항 및 제89항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 C1 에스테라제 억제제(C1-INH) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 상기 조성물은 액체인, 약학적 조성물.
  92. 제90항에 있어서, 상기 조성물은 동결건조된, 약학적 조성물.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항의 약학적 조성물 및 주사기를 포함하는 키트
  94. 제93항에 있어서, 상기 주사기에 약학적 조성물이 미리 담겨 있는, 키트.
  95. 제93항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 동결건조되어 있고, 상기 키트는 재구성 버퍼를 더 포함하는, 키트.
  96. 치료가 필요한 대상에게 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 보체-매개성 질병 치료 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 보체-매개성 질병은 유전성 혈관부종, 항체 매개성 거부 반응, 시신경 척수염 범주 질환, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 뇌허혈 손상, 화상, 독성 표피 괴사용해, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 뇌졸중, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 중증 근무력증, 다초점성 운동 신경병증으로부터 선택되는, 방법.
  98. 보체-매개성 질병을 치료하기 위한 의약품의 제조에 있어서, 제51항 내지 제79항 및 제89항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 C1-에스테라제 억제제를 포함하는 조성물의 용도.
  99. 제98항에 있어서, 상기 보체-매개성 질병은 유전성 혈관부종, 항체 매개성 거부 반응, 시신경 척수염 범주 질환, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 뇌허혈 손상, 화상, 독성 표피 괴사용해, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 뇌졸중, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 중증 근무력증, 다초점성 운동 신경병증으로부터 선택되는, 용도.

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