CN103930447A - 用于制备生理活性多肽复合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过使用有机溶剂将生理活性多肽与非肽聚合物通过共价键连接制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物，以及通过将所述缀合物与载体连接制备生理活性多肽复合物以便提高生理活性多肽的体内持续时间和稳定性的方法。本发明的方法可以以高纯度和产率制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物，并且利用此制备的生理活性多肽复合物可以提供生产成本的降低，和体内活性以相对高的水平的延长，并且显著增加血液半衰期，因此可以有效用于开发生理活性多肽的缓释制剂，该制剂可以提高患者服用药物的适应性。

Description

用于制备生理活性多肽复合物的方法
技术领域
本发明涉及通过使用有机溶剂将生理活性多肽与非肽聚合物通过共价键连接制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物的方法，以及通过将该缀合物与载体连接制备生理活性多肽复合物以便提高生理活性多肽的体内持续时间和稳定性的方法。
背景技术
通常，生理活性多肽因它们的低稳定性而容易变性并且被蛋白水解酶分解而容易通过肾脏或肝脏去除。因此，为了维持包含生理活性多肽作为药物活性成分的蛋白药物的血液浓度和效价，必须频繁地向患者施用该蛋白药物。然而，在向患者施用的蛋白药物主要为注射制剂形式的情况下，频繁注射以维持活性多肽的血液浓度可能导致患者过多的痛苦。为了解决此问题，已经在不断努力以通过增加蛋白药物的血液稳定性并更长时间维持血液药物浓度使药理学功效最大化。需要这种持续开发制剂以增加蛋白药物的稳定性并且同时将药物本身的效价维持在足够高的水平，以及在患者中不引起免疫反应。
在现有技术中，为了稳定蛋白质和抑制与蛋白水解酶的接触以及通过肾脏的损失，已经使用了向蛋白药物的表面上化学添加具有高溶解度的聚合物诸如聚乙二醇(下文中称为PEG)的方法。已知PEG通过将PEG非特异性地结合至靶蛋白的特定位点或不同的位点以增加蛋白的溶解度来有效稳定蛋白质并防止蛋白的水解，并且不会导致任何不良副作用(Sada等,J.Fermentation Bioengineering71:137-139,1991)。然而，尽管这样的PEG结合可以增加蛋白稳定性，但其结果是显著降低了生理活性多肽的效价并且与增加PEG的分子量同时PEG与蛋白质的反应性下降，从而降低了结合率。因此，本发明人已经提供了通过用非肽聚合物将生理活性多肽和载体连接而形成的缀合物。然而，对以高产率和纯度制备该缀合物的方法的需求增加，并且现有的首先将载体与非肽聚合物缀合的方法的缺点是其产生巨大开支。
同时，胰岛素是由人胰腺的β细胞分泌的作为在控制机体内血糖水平方面起到非常重要作用的物质的多肽。在胰岛素不适宜分泌或分泌的胰岛素不适宜地在机体中发挥作用的情况下，机体中的血糖不能被控制并且增加，由此诱发称为糖尿病的状态。如上所述的情况被称为2型糖尿病，并且其中胰腺不分泌胰岛素以增加血糖的情况被称为1型糖尿病。
2型糖尿病用包含作为主要成分的化学物质的口服降糖药治疗，并且在某些患者中也用胰岛素治疗。另一方面，对1型糖尿病的治疗必须需要施用胰岛素。
目前广泛使用的胰岛素治疗是在餐前和餐后通过注射施用胰岛素的方法。然而，这种胰岛素治疗要求其不断地一天三次施用，并且因此导致很多痛苦和不便。为了克服这些问题，已经采用了各种尝试。其中之一是尝试通过增加肽药物的生物膜通透性通过口腔或鼻腔借助于吸入来将肽药物递送至体内。然而，与注射相比，此方法在体内的递送效率显著更低，并且因此在要求的条件下保持肽药物的体内活性方面还存在许多困难。
此外，已经尝试了在皮下施用过量药物后延缓吸收的方法。据此，已经提出了仅通过每天单次施用来维持血液药物浓度的方法。一些目前已经被批准作为医药产品(例如，来得时(Lantus),Sanofi-aventis)并且施用于患者。已经进行了用脂肪酸来修饰胰岛素以加强胰岛素聚合物的结合并通过结合于施用部位处和血液中存在的白蛋白来延长持续时间的研究，并且使用此方法制备的药物已经被批准为医药产品(诺和平(Levemir),NovoNordisk)。然而，此类方法具有在施用部位处引起疼痛的副作用，并且另外每天单次注射的施用间隔对患者来说仍然是明显的负担。
此外，已经不断地进行努力以通过在肽药物吸收入机体后增加血液稳定性并且长时间地维持高水平血药浓度来使肽药物的效果最大化。需要这种持续开发肽制剂来提高肽药物的稳定性并且同时将药物本身的效价维持在足够高的水平，以及在患者中不引起免疫反应。这种肽药物制剂已经通过向肽的表面化学添加具有高溶解度的聚合材料诸如聚乙二醇(PEG)的方法来产生。
PEG通过与靶肽的特定位点或不同的位点非特异性结合以增加肽的分子量来有效地抑制肽通过肾脏的损失并且防止水解，并且另外不会引起任何不良副作用。例如，WO2006/076471描述了B-型利钠肽(BNP)，其通过与NPR-A结合激活cGMP的产生从而降低动脉血压，并且因此用作用于治疗充血性心力衰竭的药剂，所述B-型利钠肽与PEG缀合以维持此肽的生物活性。US6,924,264公开了通过将Exendin-4的赖氨酸残基与PEG缀合增加体内持续时间的方法。然而，此方法可以通过增加PEG的分子量来延长肽药物的体内持续时间，但其具有的问题是随着分子量的增加显著降低了肽药物的效价，并且降低了PEG与肽的反应性，从而导致产率降低。
WO02/46227公开了通过重组遗传技术的GLP-1和Exendin-4或其类似物与人血清白蛋白或免疫球蛋白片段(Fc)的融合蛋白，并且US6,756,480公开了甲状旁腺激素(PTH)及其类似物与Fc的融合蛋白。其中公开的方法可以克服低聚乙二醇化产率和非特异性的问题，但具有的问题在于血液半衰期的增加并不显著地高，与预期相反，并且在一些情况下，具有低效价。为了使增加血液半衰期的作用最大化，也可以使用各种类型的肽接头，但可能具有引起免疫反应的可能性。另外，存在的问题在于在使用具有二硫键的肽诸如BNP的情况下，由于高的错误折叠可能性而难以应用，并且在其中存在非天然氨基酸残基的情况下，不可能以遗传重组的形式进行生产。
发明内容
技术问题
本发明人致力于发现同时最大化包含胰岛素的生理活性多肽的血液半衰期增加并维持其体内活性的方法。结果，他们发现，在包含有机溶剂的反应溶液中首先将生理活性多肽与非肽聚合物相连的情况下，可以降低生产成本并且可以以高产率和纯度制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物，并且认识到这样的事实：当使用这样的缀合物制备生理活性多肽复合物时，与已知的框内融合方法相比，缀合物的体内活性保持在高水平并且将增加血液半衰期的效力提高到优异的程度，由此完成了本发明。
技术方案
本发明的目的是提供一种用于制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物的方法，以便延长生理活性多肽的血液半衰期同时保持其体内活性。
本发明的另一目的是提供一种通过将载体与生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物共价连接制备生理活性多肽复合物的方法。
有益效果
本发明的方法可以以高纯度和产率制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物，并且利用其制备的生理活性多肽复合物可以提供后续生产成本的降低，并且以相对高的水平延长体内活性，和显著的血液半衰期增加，并且因此可以有效用于开发生理活性多肽的缓释制剂，其可增加患者对施用药物的能力。
附图说明
图1显示借助于SEC HPLC鉴定β链上的胰岛素-PEG缀合物修饰的分析结果。A：胰岛素的还原条件，B：PEG-胰岛素的还原条件。
图2显示借助于肽图谱鉴定β链的1号苯丙氨酸(B1F)上的胰岛素-PEG缀合物修饰达95％或更多的分析结果。A：胰岛素肽图谱的结果，B：PEG-胰岛素肽图谱的结果，C：肽图谱中PEG-胰岛素序列和估计的切割位点(红线)。
图3显示胰岛素-PEG缀合物在各自缓冲溶液条件下的RP-HPLC、SE-HPLC的分析结果。实线箭头表示单-聚乙二醇化胰岛素的峰并且虚线箭头表示以桥形式的聚乙二醇化的杂质的峰。各自缓冲溶液条件如下。
A：(a)100mM磷酸钾(pH6.0)缓冲溶液；(b)100mM磷酸钾(pH6.0)，30％异丙醇缓冲溶液；(c)100mM磷酸钾(pH6.0)，45％异丙醇缓冲溶液；(d)100mM磷酸钾(pH6.0)，55％异丙醇缓冲溶液；
B：(a)50mM柠檬酸钠(pH6.0)，45％异丙醇缓冲溶液；(b)50mM柠檬酸钠(pH6.0)，55％异丙醇缓冲溶液；
C：(a)50mM醋酸钠(pH4.0)缓冲溶液；(b)50mM醋酸钠(pH4.0)，10％异丙醇缓冲溶液；(c)50mM醋酸钠(pH4.0)，20％异丙醇缓冲溶液；(d)50mM醋酸钠(pH4.0)，30％异丙醇缓冲溶液；(e)50mM醋酸钠(pH4.0)，40％异丙醇缓冲溶液；(f)50mM醋酸钠(pH4.0)，45％异丙醇缓冲溶液；(g)50mM醋酸钠(pH4.0)，50％异丙醇缓冲溶液。
图4显示对胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物的RP HPLC分析(A)和SE HPLC分析(B)的结果。
图5显示对胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物的SDS PAGE分析的结果。M：尺寸标记，1：胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物的还原条件，2：胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物的非还原条件。
图6显示鉴定胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物的体内持续时间的药代动力学测试结果。iv：静脉内给药，sc：皮下给药。
图7显示对胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物的体内效价测试结果。
最佳实施方式
在为实现上述目的的一个方面中，本发明提供用于制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物的方法，其包括：(1)使生理活性多肽与非肽聚合物在包含有机溶剂的反应溶液中反应以连接生理活性多肽与非肽聚合物；和(2)从步骤(1)的反应混合物分离并纯化生理活性多肽与非肽聚合物共价连接的缀合物。
为本发明的目的，本发明中使用的有机溶剂是指能够溶解固体、气体和液体的液体有机化合物，并且其可以包含在反应溶液中以便非肽聚合物可以以高产率和纯度共价连接至生理活性多肽的N-末端。
在本领域中常规使用的任何有机溶剂可以应用于本发明。本发明中使用的有机溶剂可以优选地包括但不限于所有伯醇、仲醇和叔醇。可以使用具有1-10个碳原子的醇类。更优选地，醇可以是异丙醇、乙醇或甲醇。根据生理活性多肽的种类可以自由地选择任何合适的有机溶剂。
有机溶剂包含在反应溶液中用于生理活性多肽和非肽聚合物之间的连接，并且基于反应溶液的总体积可以按体积计占但不限于10-60％的量，优选30-55％的量，且更优选45-55％的量。另外，反应溶液的pH可以优选是但不限于，4.5-7.0，且更优选5.5-6.5。在此情况下，尽管生理活性多肽通常显示在具有弱酸pH的反应溶液中降低溶解度的倾向，但根据本发明使用有机溶剂的优点是可以解决所述溶解度问题从而使反应平稳地继续进行。
在本发明的一个实施方式中，为了将PEG选择性地缀合至胰岛素β链的N-末端，作为有机溶剂的异丙醇包含在反应溶液中以在各种pH水平下进行胰岛素的聚乙二醇化。然后，发现在反应溶液中包含有机溶剂的情况下，可以有效地减少各种类型的杂质从而以高纯度和产率制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物(表1)，并且利用这种发现，可以最终制备均匀的和高度纯化的生理活性多肽复合物。在本发明的实施方式中，杂质的含量和单-聚乙二醇化胰岛素的比率可以随着异丙醇的含量和反应溶液的pH而变化。具体地，认识到当在pH6.0下基于反应溶液的总量以45-55％的水平包含异丙醇时，单-聚乙二醇化胰岛素的含量达到最大可达到水平(表1)。
如在本发明中使用，术语“生理活性多肽”表示在活体中具有任何生理功能的多肽的总称，并且具有多肽结构的共有特征，并且还具有各种生理活性。生理活性通过控制遗传递呈和生理功能在纠正由于参与调节活体中生理功能的物质的缺乏和过多分泌所引起的异常病理中起作用。生理活性多肽可以包括一般的蛋白治疗剂。
如在本发明中使用的生理活性多肽包括在活体中具有生理活性的所有物质，而没有任何限制，并且可以包括，例如胰岛素、促黄体激素(LTH)、促卵泡激素(FSH)、凝血因子VIII、凝血因子VII、脂联素、抗体、抗体片段scFv、Fab、Fab'、F(ab')2或松弛素等，优选是胰岛素。生理活性多肽可以具有两个或更多个N-末端(氨基末端)。
如在本发明中使用，胰岛素是具有根据下述机制控制血糖的功能的肽：在身体中血糖高的情况下，从胰腺分泌胰岛素，并且在肝、肌肉和脂肪组织中吸收糖以作为糖原储存，并且抑制脂肪分解和其作为能量源的利用。该肽包括胰岛素激动剂、前体、衍生物、片段、变体等，优选是天然胰岛素、速释的胰岛素、缓释的胰岛素。
天然胰岛素是由胰腺分泌的激素，并且通常通过促进细胞中葡萄糖的吸收并且抑制脂肪的分解而在控制体内血糖方面起作用。胰岛素通过没有控制血糖功能的胰岛素原前体至具有控制血糖功能的胰岛素通过一系列过程而产生。胰岛素的氨基酸序列如下。
α链:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID No:1)
β链:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ IDNo:2)
胰岛素激动剂意思是与胰岛素的体内受体结合的物质，其表现出与胰岛素相同的生物活性，无论胰岛素的结构如何。
胰岛素衍生物表示显示氨基酸序列与天然胰岛素相比具有至少80％的序列同一性的肽，其具有一些组的以化学置换(例如，α-甲基化、α-羟基化)、去除(例如，脱氨基)或修饰(例如N-甲基化、糖基化、脂肪酸)的形式改变的氨基酸残基，并且具有控制体内血糖的功能。
胰岛素片段表示其中一个或多个氨基酸被添加至胰岛素的氨基端或羧基端或从胰岛素的氨基端或羧基端去除，并且添加的氨基酸也可以是非天然氨基酸(例如D型氨基酸)的胰岛素类型。这种胰岛素片段保留了控制体内血糖的功能。
胰岛素变体表示氨基酸序列中的一个或多个与胰岛素不同并且保留了控制体内血糖的功能的肽。
用于制备胰岛素激动剂、衍生物、片段和变体的各自方法可以单独或组合使用。例如，氨基酸序列中的一个或多个与胰岛素不同并且在N-末端氨基酸残基处具有脱氨基并且也具有控制体内血糖功能的肽包括在本发明的范围内。
就具体的一个实施方式而言，在本发明中使用的胰岛素可以通过重组方法产生，并且也可以由包括固相合成的合成方法产生。
此外，本发明中使用的胰岛素的特征可在于非肽聚合物与β链的N-末端(氨基末端)缀合。在胰岛素的情况下，由于α链的修饰导致减小的活性和稳定性降低，本发明可以将非肽聚合物连接至胰岛素的β链N-末端以保持胰岛素的活性同时提高胰岛素的稳定性。
如本发明中使用，术语“凝血因子”表示参与凝血的蛋白，在由于伤口而引起出血发生的情况下其通过凝血起保护机体的作用。凝血是涉及12种因子的一系列反应。在它们中，凝血因子VIII也称为抗血友病因子，其是因其遗传缺陷而导致血友病的因子，并且凝血因子VII也称为前转变素(proconvertin)，并且是可用作凝血剂以通过其激活引起凝血的因子。
如本发明中使用，术语“脂联素”表示由脂肪细胞分泌的蛋白，并且是参与脂肪和糖的代谢的物质。脂联素是已知具有减少成年期心脏病和糖尿病风险的功能并且通过使肌肉将脂肪转变为能量抑制食欲的蛋白。另外，术语“松弛素”表示由卵巢黄体分泌，并且松弛耻骨联合并促进分娩的激素。松弛素是在松弛整个机体的骨骼和关节中起作用的激素。
如本发明中使用，术语“非肽聚合物”表示通过将两个或更多个重复单元结合而形成的生物相容性聚合物，其中所述重复单元通过任选的共价键而非肽键彼此连接在一起。
可以在本发明中使用的非肽聚合物可以选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物，诸如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及其组合，优选是聚乙二醇。在本领域中已知的其所有衍生物和可以在本领域技术水平下容易制备的衍生物包括在本发明的范围内。
根据现有技术的框内融合法制备的融合蛋白中使用的肽连接物具有的缺点是它们在体内容易被蛋白水解酶裂解，并且因此不能如期望的那样由于使用相应的载体而获得活性药物的血液半衰期的任何增加。然而，在本发明中，发现由于使用对蛋白水解酶具有抗性的聚合物，肽的血液半衰期保持与载体的血液半衰期相似。因此，在本发明中可以使用具有所述功能，即，对体内蛋白水解酶具有抗性的任何聚合物作为非肽聚合物而没有任何限制。该非肽聚合物优选具有在1-100kDa的范围，并且优选为1-20kDa的范围的分子量。另外，尽管待与生理活性多肽缀合的非肽聚合物可以是一种类型的聚合物，但在本发明中也可以使用不同类型的聚合物的组合。
如本发明中使用，非肽聚合物可以在其两个末端或三个末端上具有可以与生理活性多肽和载体缀合的反应基团。
非肽聚合物的反应基团可以优选是但不限于反应性醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基、邻-吡啶基二硫化物和硫醇或琥珀酰亚胺衍生物。在上述中，也可以使用琥珀酰亚胺衍生物丙酸琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧甲基或碳酸琥珀酰亚胺酯。具体地，当非肽聚合物在其末端上具有作为反应基团的反应性醛基时，它们有效地使非特异性反应最小化，并且在其末端上将非肽聚合物分别与生理活性多肽和载体缀合。利用醛键自还原性烷基化生成的最终产物比利用酰胺键自连接产生的产物稳定得多。醛反应基团在低pH下选择性地与氨基末端反应，并且在高pH水平例如在pH9.0的条件下与赖氨酸残基形成共价键。
非肽聚合物的两个末端或三个末端上存在的反应基团可以彼此相同或不同。例如，马来酰亚胺基团可以在一端上存在，而在另一端上可以存在醛基、丙醛基或丁醛基。当在两端上具有羟基反应基团的聚乙二醇用作非肽聚合物时，可以通过已知的化学反应将羟基活化成各种反应基团，或使用具有修饰的反应基团的市售聚乙二醇制备本发明的蛋白缀合物。
同时，在本发明的步骤中(2)，分离和纯化包含其N-末端与非肽聚合物共价结合的生理活性多肽的缀合物的步骤可以使用本领域中已知的任何方法而没有任何限制，并且可以优选采用离子交换层析。
在另一个方面，本发明提供了用于制备生理活性多肽复合物的方法，其包括：(1)根据所述方法制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物；和(2)将选自免疫球蛋白Fc区、抗体、白蛋白和转铁蛋白的载体与所述缀合物的非肽聚合物共价连接以制备其中非肽聚合物的末端分别与所述生理活性多肽和所述载体连接的肽复合物。
在本发明中，“复合物”意在指由至少一个生理活性多肽、至少一个非肽基聚合物和至少一个载体经由它们之间的共价键相互连接组成的结构。为了区分其本身与“复合物”，在本文中使用“缀合物”来指其中仅生理活性多肽和非肽聚合物的配对经由共价键相互连接的结构。
在本发明中，“载体”表示待与药物结合的物质，并且通常是与药物结合以增加和降低或去除药物的生物活性的物质。为了本发明的目的，待与载体结合的药物优选是生理活性多肽，其也可以与非肽聚合物结合。载体是使待结合的生理活性多肽的体内活性减小最小化并同时增加该药物的体内稳定性的物质。载体可以优选包括但不限于免疫球蛋白Fc区、抗体、白蛋白和转铁蛋白。
免疫球蛋白Fc区是在活体内被代谢的生物可降解的多肽，并且因此用作药物的载体是安全的。另外，由于免疫球蛋白Fc区的分子量小于整个免疫球蛋白分子的分子量，因此就缀合物的制备、纯化和产率而言其是有利的。此外，由于在每个抗体中氨基酸序列是不同的，通过去除显示高异质性的Fab部分，可以预期提供可以极大地增加物质的同质性和降低诱导血液抗原性的可能性的效果。
在本发明中，“免疫球蛋白Fc区”表示免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)部分，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)，并且还可以包括重链恒定区中的铰链区。此外，如果本发明的免疫球蛋白Fc区具有与天然形式相比基本相同或提高的作用，其可以是包含免疫球蛋白的部分或全部的重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，不包括重链和轻链可变区的扩展Fc区。此外，其还可以是其中与CH2和/或CH3对应的相当长的氨基酸序列被去除的区域。即，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是(1)CH1结构域，CH2结构域，CH3结构域和CH4结构域，(2)CH1结构域和CH2结构域，(3)CH1结构域和CH3结构域，(4)CH2结构域和CH3结构域，(5)一个或两个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合，和(6)重链恒定区和轻链恒定区的各自结构域的二聚体。
此外，本发明的免疫球蛋白Fc区包括天然氨基酸序列，及其序列突变体。氨基酸序列突变体表示由于天然氨基酸序列中一个或更多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守替换及其组合所产生的具有不同的序列的那些。例如，在IgG Fc的情况下，在位置214至238，297至299，318至322，或327至331中存在的氨基酸残基可以用作适合于修饰的位点。此外，可使用其中能够形成二硫键的位点被去除，从天然Fc的N末端去除一些氨基酸，或可以向天然Fc的N-末端添加甲硫氨酸残基的各种类型突变体。此外，为了去除效应器功能补体结合位点，可以去除例如C1q-结合位点，并且也可以去除ADCC位点。制备免疫球蛋白Fc区的此类序列突变体的技术已经公开在国际专利公开号97/34631和国际专利公开号96/32478等中。
本领域已经进行了蛋白质和肽中的完全不改变分子活性的一些氨基酸互换(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的互换是下述氨基酸残基之间的互换Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu或Asp/Gly。
如果需要，它们可以通过磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙酰化、酰胺化等进行修饰。
如上述的Fc突变体是显示与本发明的Fc区相同的生物活性并且还具有抗热、pH等增加的Fc区结构稳定性的突变体。
另外，这些Fc区可以从分离自人和动物活体的天然形式获得，所述动物包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠等，也可以是获自转化的动物细胞或微生物的重组体或其衍生物。本文，从天然形式获得的Fc区可以通过从人或动物活体分离整个免疫球蛋白并且用蛋白水解酶处理该整个免疫球蛋白而获得。当免疫球蛋白用木瓜蛋白酶处理时，其将裂解为Fab和Fc，并且在胃蛋白酶处理的情况下，免疫球蛋白可以裂解为pF'c和F(ab)2。然后，反应混合物可以进行尺寸排阻色谱以分离Fc或pF'c。
优选的是使用微生物从人源的Fc区获得的重组免疫球蛋白Fc区。
另外，免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链的形式，与天然形式相比增加糖链的形式，与天然形式相比减少糖链的形式，或是去糖基化形式。这种免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可以通过常规方法来实现，包括化学方法、酶学方法和使用微生物的基因工程方法。本文，由于其中从Fc去除糖链的免疫球蛋白Fc区显示补体(C1q)的结合力显著下降，以及提供抗体依赖的细胞毒作用或补体依赖的细胞毒作用的减少或去除，所以它们不会在活体内诱导任何必要的免疫反应。就此而言，更适合于本发明的作为药物载体的基本目的的形式可以是去糖基化或无糖基化的免疫球蛋白Fc区。
在本发明中，“去糖基化”是指用酶从其中去除糖基的Fc区，并且术语“无糖基化”表示从原核生物，优选从大肠杆菌产生的并且未糖基化的Fc区。
另外，免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区，或由源自它们的组合或杂合体的Fc区。优选地，免疫球蛋白Fc区可源自IgG或IgM，两者在人血液中最丰富，并且最优选源自已知提高缀合配体的蛋白的半衰期的IgG。
同时，本发明中的“组合”表示在制备二聚体或多聚体时形成编码来自相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与来自不同来源的单链多肽的结合。即，能够由选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgEFc片段的两个或更多个片段制备二聚体或多聚体。
在本发明中，术语“杂合体”表示对应源自不同来源的两个或更多个免疫球蛋白Fc区的序列出现在单链免疫球蛋白Fc区中。在本发明的具体实施方式中，多种类型的杂合体是可用的。即，包含1-4个选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的结构域的杂合体是可用的，其可进一步包含铰链部分。
此外，IgG也可以分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且在本发明中也可使用其组合或杂合体。优选IgG2和IgG4亚类，并且最优选IgG4的Fc区，其几乎没有效应器功能，诸如补体依赖的细胞毒作用(CDC)。
即，在本发明中最优选用作药物载体的免疫球蛋白Fc区是人IgG4-源的无糖基化Fc结构域。人源Fc区用作人体中的抗原，并且因此比可能导致诸如形成新抗体的非期望免疫反应的非人源Fc区更优选。
本发明的生理活性多肽复合物可以根据本发明的方法以高纯度和产率制备，并且可以显示提高的体内持续时间和稳定性，使得在采用生理活性多肽的治疗中可以大大改善服用药物的适应性。在本发明的一个实施例中，使用根据本发明的方法制备的胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物确认它们的体内清除半衰期。结果，我们发现在静脉给药的情况下它们显示15.73小时的持续时间，而在皮下给药的情况下为16.98小时的持续时间，比天然胰岛素情况下的约0.5小时的持续时间长30倍(图6)。此外，根据体内效价测试的结果，我们也发现它们的血糖降低效价持续约4天(图7)。
本发明还提供了包含生理活性多肽复合物的生理活性多肽的缓释制剂。
在本发明中，术语“施用”是指将给定物质通过任何合适方法引入至患者。复合物可以通过任何常规途径施用，只要该途径可以允许药物到达靶组织。复合物的施用可以包括但不限于腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用等。然而，由于在口服施用的情况下肽药物被消化，优选口服组合物通过将活性药物包衣来配制以保护免于被胃消化。优选地，本发明的复合物可以注射形式施用。另外，缓释制剂可以通过可以允许活性成分移动至靶细胞的任何任选设备施用。
包含本发明的复合物的缓释制剂可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、着色剂、香料等，它们可用于口服施用；缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等可以组合用于注射；并且基质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等可以用于局部施用。本发明的缓释制剂可以通过与如上所述的药学上可接受的载体混合在一起以多种方式制备。例如，对于口服施用，该制剂可以以片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片(wafer)等的形式制备，并且以安瓿的形式用于单位剂量或多剂量注射。本发明的复合物也可以以其他的形式配制，包括溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂等。
同时，作为适合于制剂的载体、赋形剂和稀释剂的例子，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等。另外，可以附加地使用填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、防腐剂等。
本发明的缓释制剂的施用可以根据用作活性成分的药物类型以及各种考虑因素来确定，所述考虑因素包括待治疗的疾病、施用途径、患者的年龄、性别和体重，以及疾病严重程度等。本发明的缓释制剂具有良好的体内持续时间和效价，并且因此，可以使得本发明的药物制剂的施用频次显著减少。此外，该缓释制剂可以维持生理活性多肽的体内持续时间和稳定性，并且因此，可以有效地用于治疗疾病。
具体实施方式
下文，意欲通过实施例更具体地解释本发明。然而，这些实施例仅提供用于更详细地举例说明本发明，并且本发明的范围在任何方面均不受这些实施例的限制。
实施例1:胰岛素的聚乙二醇化反应和单-聚乙二醇化胰岛素的纯化
胰岛素粉末溶解在10mM HCl中，然后与3.4K丙-ALD2PEG(具有两个丙醛基的PEG,IDB,Korea)在4～8℃下在包含摩尔比为1:2-4的胰岛素:PEG和3-5mg/ml的胰岛素浓度的条件下反应约2小时以将胰岛素β链的N-末端聚二乙醇化。此反应在添加了4-20mM NaCNBH3还原剂的50mM柠檬酸钠pH6.0，45％异丙醇下进行。反应溶液用SP-HP(GE Healthcare)柱使用含有柠檬酸钠(pH3.0)和45％EtOH的缓冲液以及KCl浓度梯度纯化。
通过SE-HPLC和肽图谱分析发现这样制备的单-聚乙二醇化胰岛素在β链1号苯丙氨酸(B1F)上聚乙二醇化达98％或更多(图1和2)。
实施例2:取决于反应溶液的pH和有机溶剂的浓度，单PEG-胰岛素的产率和杂质含量的变化
为了比较当在用于胰岛素与PEG的反应的反应溶液中包含诸如异丙醇的有机溶剂时在制备期间单PEG-胰岛素的反应产率和杂质的产生，胰岛素和3.4K丙-ALD2PEG以1:2的摩尔比采用3mg/ml的胰岛素浓度在4℃下反应4小时。本文，作为反应溶液，分别使用50mM柠檬酸钠pH6.0，45％异丙醇缓冲溶液；50mM柠檬酸钠pH6.0，55％异丙醇缓冲溶液；100mM磷酸钾pH6.0缓冲溶液；100mM磷酸钾pH6.0，30％异丙醇缓冲溶液；100mM磷酸钾pH6.0，45％异丙醇缓冲溶液；100mM磷酸钾pH6.0，55％异丙醇缓冲溶液；50mM醋酸钠pH4.0缓冲溶液；50mM醋酸钠pH4.0，10％异丙醇缓冲溶液；50mM醋酸钠pH4.0，20％异丙醇缓冲溶液；50mM醋酸钠pH4.0，30％异丙醇缓冲溶液；50mM醋酸钠pH4.0，40％异丙醇缓冲溶液；醋酸钠pH4.0，45％异丙醇缓冲溶液；和50mM醋酸钠pH4.0，50％异丙醇缓冲溶液，向其中加入20mM NaCNBH3作为还原剂。各个反应溶液采用与实施例1中所使用的相同方法纯化，并且其纯化图谱显示在图3中。当胰岛素的α链和β链的两个N-末端同时与PEG以桥的形式反应时，不可能发生单-聚乙二醇化胰岛素与免疫球蛋白Fc的偶联反应。因此，此类杂质的比例显示在表1中。如从表1中所见，发现单-聚乙二醇化胰岛素的比例随反应溶液中的异丙醇含量和pH条件而变化，并且在pH6.0下当异丙醇含量为约45～55％时，单-聚乙二醇化胰岛素的含量达到最大值。当异丙醇含量升高时，低pH条件导致桥型聚乙二醇化杂质的含量增加的结果，并且因此导致单-聚乙二醇化胰岛素的产率下降。
【表1】
实施例3:单-聚乙二醇化胰岛素和免疫球蛋白Fc的复合物的制备
为了制备胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物，通过实施例1的方法制备的单-聚乙二醇化胰岛素和免疫球蛋白Fc以1:1的摩尔比以20-50mg/ml的总蛋白水平在25℃下反应15-17小时。在此反应中，反应溶液包括100mM HEPES，22mM磷酸钾，10％乙醇，pH8.2，并进一步包含20mM NaCNBH3作为还原剂。
反应结束后，反应溶液首先通过Source15Q(GE Healthcare)柱纯化以去除任何残留的免疫球蛋白Fc和单-聚乙二醇化胰岛素。在此情况下，使用Tris-HCl(pH7.5)缓冲液和NaCl浓度梯度进行洗脱。
然后，使用Source15ISO(GE Healthcare)作为第二柱以去除任何残留的免疫球蛋白Fc和多-聚乙二醇化胰岛素的复合物，由此获得胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物。在此情况下，使用包含Tris-HCl(pH7.5)的硫酸铵浓度梯度进行洗脱。
洗脱的胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物通过RP-HPLC、SE-HPLC和SDS PAGE分析，然后确认其以至少98％的高纯度制备(图4和5)。
实施例4:测量缓释的胰岛素复合物的体内清除半衰期
为了确认实施例3中制备的胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc复合物形式的缓释的胰岛素复合物的体内持续时间，使用正常雄性大鼠(正常SD大鼠)测定通过静脉内和皮下途径施用的药物的药代动力学图谱。0.1㎎/㎏(按胰岛素计)缓释的胰岛素复合物经静脉内和皮下向正常雄性大鼠施用一次，然后通过胰岛素ELISA试剂盒测量血液浓度随时间的变化。从测量的值，使用WinNonlin 5.2计算药代动力学参数。结果，发现在静脉施用的情况下缓释的胰岛素复合物的体内清除半衰期为15.73小时，而在皮下施用的情况下为16.98小时，相当于比天然胰岛素情况下的约0.5小时持续时间长30倍。此外，还发现在皮下给药的情况下，生物利用度为约54％(图6)。
实施例5:胰岛素复合物的体内效价测试
为了比较胰岛素复合物的体内效价，在具有链脲霉素诱发的糖尿病的大鼠中进行比较降低血糖效价的测试。通过将溶解在10 mM柠檬酸缓冲溶液(pH 4.5)中的链脲霉素以60 ㎎/㎏的水平对已经禁食了16小时的正常大鼠腹腔内施用诱发糖尿病。然后，以0.5 ㎎/㎏的剂量将胰岛素复合物对血糖水平升高至500 ㎎/或更高的大鼠皮下施用一次，然后比较血糖降低效价。结果，观察到胰岛素复合物的血糖降低效应持续约4天，在第5天时血糖增加至与媒介相当的水平(图7)。

Claims (22)

1.一种用于制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物的方法，其包括：
(1)使生理活性多肽与非肽聚合物在包含有机溶剂的反应溶液中反应以连接生理活性多肽与非肽聚合物；和
(2)从步骤(1)的反应混合物分离并纯化与非肽聚合物共价连接的生理活性多肽的所述缀合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机溶剂是具有1-10个碳原子的醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述醇选自异丙醇、乙醇和甲醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应溶液基于所述反应溶液的总体积包括按体积计10-60％量的所述有机溶剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应溶液的pH为4.5-7.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述生理活性多肽具有两个或更多个N-末端。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述生理活性多肽选自胰岛素、促黄体激素(LTH)、促卵泡激素(FSH)、凝血因子VIII、凝血因子VII、脂联素、抗体、抗体片段scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和松弛素。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述胰岛素是天然胰岛素或通过在天然胰岛素或其片段的一个或多个氨基酸中的替换、添加、缺失、修饰或其组合的任何之一制备的变体或衍生物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述非肽聚合物与所述胰岛素的β链的N-末端结合。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述非肽聚合物与所述胰岛素或胰岛素衍生物的胺基或硫醇基结合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述非肽聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、聚葡糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及其组合。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述非肽聚合物具有选自下列的反应基团：醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基、邻-吡啶基二硫化物、硫醇和琥珀酰亚胺衍生物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺衍生物是丙酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基羧甲基、羟基琥珀酰亚胺基或碳酸琥珀酰亚胺酯。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述非肽聚合物在其两个末端或三个末端上具有反应基团。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述非肽聚合物在两个末端上具有作为反应基团的醛基。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离和纯化通过离子交换色谱实现。
17.一种用于制备生理活性多肽复合物的方法，其包括：
(1)根据权利要求1-16中任一项所述的方法制备生理活性多肽和非肽聚合物的所述缀合物；和
(2)将选自免疫球蛋白Fc区、抗体、白蛋白和转铁蛋白的载体与所述缀合物的非肽聚合物共价连接，以产生其中非肽聚合物的末端分别与所述生理活性多肽和所述载体连接的肽复合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的1-4个结构域组成。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区进一步包括铰链区。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区是源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc区。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区是人非糖基化IgG4Fc区。
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