CN112521481B - 表面修饰物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表面修饰物及其制备方法和应用，该表面修饰物的制备方法包括：在二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇上接枝脂联素。通过该制备方法制备得到的表面修饰物(ADM)具有很好的稳定性，能够有效地减少细胞凋亡和促进前脂肪细胞增生个细胞迁移，从而减少脂肪积液的术后并发症，促进创伤修复，在脂肪组织创面愈合方面具有很好的应用前景。

Description

表面修饰物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体而言，涉及一种表面修饰物及其制备方法和应用。
背景技术
据统计，美国每年大约有110万人遭受急性创伤，大约有30万住院治疗。切口并发症是最常见的腹部手术术后并发症，发生率约为7％-26％。常见的切口并发症类型包括：脂肪液化、切口积液/血清肿、切口裂开、切口感染等。
其中，脂肪液化是最常见的切口并发症，好发于肥胖患者。同时因糖尿病、截瘫和局部射线照射等所致的慢性难愈性创面相应增多。随着社会进步，人们对美容的要求逐步增高，目前创伤修复的水平与质量无法满足患者的要求，两者间的矛盾日趋尖锐。
因此，亟需一些能够有效促进创伤修复的药物，特别是针对促进外科切口的脂肪组织创面愈合的药物。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表面修饰物及其制备方法和应用，以改善上述技术问题中的至少一个技术问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种表面修饰物的制备方法，其包括：在二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇上接枝脂联素。
可选地，先将二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇氨基化，再接枝所述脂联素。
可选地，氨基化为马来酰亚胺基功能化。
可选地，马来酰亚胺基功能化是将二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯进行反应，再分离纯化。
可选地，二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与所述6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的质量比为2～3:1～2。
可选地，马来酰亚胺基功能化是在搅拌条件下进行，反应时间为至少20小时，更优选20～26小时。
可选地，分离纯化是通过硅胶柱分离纯化。
可选地，接枝脂联素的步骤包括：将氨基化后的二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与脂联素在水中进行反应，再透析纯化。
可选地，氨基化后的二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与所述脂联素的质量比为1～2:1～2；脂联素和水的质量比为1:15～25。
可选地，接枝脂联素的反应是在搅拌条件下进行，反应时间为至少为40小时，更优选为40～60小时，进一步优选为48小时。
可选地，二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇主要由以下步骤制备得到：
将聚乙二醇单甲醚和N,N-碳酰二咪唑于有机溶剂中进行反应，反应产物用乙醚和四氢呋喃的混合液沉淀并静置后，再分离得到固体，然后再将所述固体的有机溶解液滴入三乙胺的胱胺溶液中进行第一次反应，得到含有二硫键的聚乙二醇衍生物。将含有二硫键的聚乙二醇衍生物与羰基咪唑(CDI)反应后再与1-金刚烷甲酸进行二次反应，得到所述二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇。
可选地，在第一次反应和第二次反应后，对产物均进行纯化，更优选地，通过透析膜透析来进行纯化。
第二方面，本发明还提供了一种表面修饰物，其由以上制备方法制备得到。
第三方面，本发明还提供了上述表面修饰物在制备促进创伤修复的药物中的应用。
第四方面，本发明还提供了上述表面修饰物在制备促进脂肪组织创面愈合的药物中的应用。
第五方面，本发明还提供了上述表面修饰物在制备促进前脂肪细胞生长的药物中的应用。
第六方面，本发明还提供了一种创伤修复贴，其与创伤口接触的一面涂覆有创伤修复药物，创伤修复药物包括上述表面修饰物。
本发明具有以下有益效果：通过将二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与脂联素进行结合而获得的表面修饰物能够有效地减少细胞凋亡和促进前脂肪细胞增生个细胞迁移，从而减少脂肪积液的术后并发症，促进创伤修复，并且该表面修饰物具有很好的稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例2中MTT细胞增殖试验中，酶标仪检测在490nm处的吸光度(OD)值；
图2为本发明实施例3的划痕修复实验结。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明提供的一种表面修饰物及其制备方法和应用进行具体说明。
研究发现脂联素是由脂肪细胞分泌的内源生物活性多肽，该多肽通过激活AMPK和PPARγ来促进巨噬细胞的M2型分化，具有调节炎症反应的功能。发明人通过研究和实践创造性地发现了通过二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与脂联素进行结合能够保证脂联素的稳定性，并且其在创伤修复上具有很好的效果，进而提出以下方案。
本发明的一些实施方式提供了一种表面修饰物的制备方法，其包括：在二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇(AD-SS-PEG)上接枝脂联素(GAD)。
该表面修饰物能够很好地与具有创口的组织创面进行作用，有效地减少细胞凋亡和促进前脂肪细胞增生个细胞迁移，从而减少脂肪积液的术后并发症，促进创伤修复，并且该表面修饰物具有很好的稳定性，能够持续作用。
具体地，一些实施方式中，接枝过程包括：先将二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇氨基化，再接枝所述脂联素。
需要说明的是，其他能够将脂联素与二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇进行接枝的手段也在本发明保护的范围之类，即先采用除氨基的其他基团进行修饰后再接枝脂联素。
其中，一些实施方式中，氨基化包括但不限于马来酰亚胺基功能化。
进一步地，马来酰亚胺基功能化是将二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯进行反应，再分离纯化，以获得马来酰亚胺基功能化的AD-SS-PEG即AD-SS-PEG-Mal。
其中，二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与所述6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的质量比可为2～3:1～2，例如，2：1.8。
一些实施方式中，马来酰亚胺基功能化是在搅拌条件下进行，反应时间为至少20小时，更优选20～26小时，例如，反应时间为24小时。其中，搅拌反应过程在室温下进行。
一些实施方式中，上述分离纯化是通过硅胶柱分离纯化。
进一步地，接枝所述脂联素的步骤包括：将氨基化后的二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇(例如AD-SS-PEG-Mal)与脂联素在水中进行反应，再透析纯化。
其中，氨基化后的二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与脂联素的质量比为1～2:1～2，例如1:1；脂联素和水的质量比为1:15～25，例如1:20。
一些实施方式中，接枝脂联素的反应是在搅拌条件下进行，反应时间为至少为40小时，更优选为40～60小时，进一步优选为48小时。
进一步地，以上实施方式中的二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇主要由以下步骤制备得到：
S1、将聚乙二醇单甲醚和N,N-碳酰二咪唑于有机溶剂中进行反应，反应产物用乙醚和四氢呋喃的混合液沉淀并静置后，再分离得到固体，然后再将固体的有机溶解液滴入三乙胺的胱胺溶液中进行第一次反应，得到含有二硫键的聚乙二醇衍生物(PEG-SS-CH2CH2NH2)。
其中，有机溶剂可以选自二甲基亚砜(DMSO)，第一次反应的反应过程可在惰性气体的保护下进行，反应过程进行搅拌，反应时间可以为3～5小时，优选4小时，惰性气体可以为氮气。静置过程在0℃下进行，静置时间可以为1.5～2.5小时，优选2小时。固体的有机溶解液为DMSO溶液。
S2、将PEG-SS-CH2CH2NH2先与羰基咪唑(CDI)反应后再与1-金刚烷甲酸进行二次反应，得到二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇。
其中，第二次反应的反应也是在惰性气体的保护下进行，例如氮气保护下进行。PEG-SS-CH2CH2NH2与羰基咪唑(CDI)反应时间为4小时，第二次反应的反应时间也可以为4小时。
一些实施方式中，为了使得后续产物的纯度更好，药物效果更佳，在第一次反应和第二次反应后，对产物均进行纯化，更优选地，通过透析膜透析来进行纯化。透析膜可以选用MWCO为2000的透析膜。
本发明的一些实施方式还提供了一种表面修饰物，其由上述任一实施方式的制备方法制备得到。
本发明的一些实施方式还提供了上述表面修饰物在制备促进创伤修复的药物中的应用。
本发明的一些实施方式还提供了上述表面修饰物在制备促进脂肪组织创面愈合的药物中的应用。
本发明的一些实施方式还提供了上述表面修饰物在制备促进前脂肪细胞生长的药物中的应用。
本发明的一些实施方式还提供了上述表面修饰物在制备促进前脂肪细胞迁移并存活的药物中的应用。
本发明的一些实施方式还提供了一种创伤修复贴，其与创伤口接触的一面涂覆有创伤修复药物，创伤修复药物包括上述表面修饰物。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种表面修饰物的制备方法，其具体包括：
将5.0g mPEG(1.0mmol)和1.0g CDI(6.2mmol)溶解与20mLDMSO中，在氮气保护下搅拌反应4h。反应产物用1L乙醚/四氢呋喃(体积比4:1)沉淀并置于0℃静置2h。抽滤后产物溶解于20mLDMSO，然后逐滴加入事先溶解于3mL三乙胺的2.2g胱胺溶液，搅拌反应12h，然后用MWCO为2000的透析膜透析透析30h，冷冻干燥得到含二硫键的PEG衍生物(PEG-SS-CH2CH2NH2)2.8g。取1-金刚烷甲酸0.18g溶于20mL无水二氯甲烷，加入0.16gCDI，在氮气保护下反应4h。然后加入1.1gPEG-SS-CH2CH2NH2继续反应4h。纯化方法同PEG-SS-CH2CH2NH2的产物纯化，冷冻干燥得AD-SS-PEG备用。通过1H NMR分析得知，δ为3.6ppm是PEG中-CH2CH2O-对应的质子峰，δ2.7-3.0p pm的为-SS-CH2-的质子峰，δ1.5-1.9ppm为金刚烷中的质子峰，说明AD-SS-PEG成功合成。
取2g AD-SS-PEG与1.8g 6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯室温下搅拌24h，反应后硅胶柱分离纯化，获得马来酰亚胺基功能化的AD-SS-PEG，然后将1g AD-SS-PEG-Mal与1g脂联素与20mL水中搅拌反应48h，透析纯化，获得二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇-脂联素(AD-SS-PEG-GAD)。通过1H NMR分析得知，δ为3.6ppm是PEG中-CH2CH2O-对应的质子峰，δ2.7-3.0p pm的为-SS-CH2-的质子峰，δ1.5-1.9ppm为金刚烷中的质子峰，δ8.1-8.7ppm为脂联素氨基酸残基NH的质子峰，δ3.9-4.7为脂联素氨基酸残基α-H的质子峰，说明AD-SS-PEG-GAD的成功合成。
实施例2
利用MTT法检测实施例1制备得到的AD-SS-PEG-GAD(简写为ADM)对小鼠前脂肪细胞增殖活性的影响。
将培养的前脂肪细胞系按照5*105接种于96孔板中，放置于5％CO2、37℃环境下培养5h，待细胞贴壁后，随机分为5组，每组6个复孔，分别加入ADM 0ng/mL(空白组)、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL(对应为脂联素含量)后，继续培养72h。吸出培养基，每孔加入20微升MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h。使用酶标仪检测在490nm处的吸光度(OD)值，结果如图1。
结果发现，0、0.5、1、5、10ng/mL对应的6孔OD平均值分别为0.2、0.24、0.27、0.25、0.25。表明能够促进前脂肪细胞的生长，在1ng/mL时对应的促进效果最佳。
实施例3
按照5*105接种前脂肪细胞系于6孔板中，放置于5％CO2、37℃环境培养24h。当融合度达到80％时，用20微升移液器枪头制造划痕，用PBS缓冲液清洗3次以去除脱落的细胞层。随机分为2组，分别加入A组：B组：10％DMEM培养基(含10％FBS)；B组：10％DMEM培养基(含10％FBS)和20μg/ml的ADM(对应为脂联素含量)。分别记录划痕在0、6h、12h、24h的细胞愈合情况，结果如图2。需要说明的是，本实施例所用的ADM由实施例1制备得到。
结果发现A组在6h、12h均发生迁移，但在24h发生凋亡，但B组(含促创伤修复的表面修饰物)在6-24h均出现细胞迁移，且在24h完全愈合，说明促创伤修复的表面修饰物(ADM)能够有效促进细胞迁移，有利于脂肪组织伤口愈合。
实施例4
采用50Kg重的巴马猪。取俯卧位，静脉诱导麻醉成功后，消毒铺巾。后背正中线为对称线，旁开3cm，左右两侧各取7个长约4cm切口，全层切开脂肪组织。两侧切口随机分为ADM干预组和对照组。术后每天(术后3天和术后5天)依次打开一个切口，留取局部脂肪组织，并观察脂肪组织切口愈合等级。结果发现对照组Ⅰ期切口愈合等级明显差于ADM干预组，结果如下表所示。
I期切口愈合率 脂肪液化发生率 切口感染发生率
ADM干预组 95％ 6％ 0
对照组 60％ 30％ 7％
需要说明的是，本实施例所用的ADM由实施例1制备得到。
综上所述，通过MTT实验和体外伤口愈合实验检验了本发明实施例的表面修饰物能够促进前脂肪细胞的增殖和迁移，抑制细胞凋亡和促进前脂肪细胞增生和细胞迁移，从减少脂肪积液的术后并发症，促进创伤修复。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种表面修饰物的制备方法，其特征在于，其包括：先将二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇氨基化，再接枝脂联素；
所述二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇主要由以下步骤制备得到：
将聚乙二醇单甲醚和N,N-碳酰二咪唑于有机溶剂中进行反应，反应产物用乙醚和四氢呋喃的混合液沉淀并静置后，再分离得到固体，然后再将所述固体的有机溶解液滴入三乙胺的胱胺溶液中进行第一次反应，得到含有二硫键的聚乙二醇衍生物；
将含有二硫键的聚乙二醇衍生物与羰基咪唑（CDI）反应后再与1-金刚烷甲酸进行二次反应，得到所述二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇；
接枝所述脂联素的步骤包括：将氨基化后的二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与脂联素在水中进行反应，再透析纯化；
所述氨基化后的二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与所述脂联素的质量比为1~2:1~2；所述脂联素和水的质量比为1:15~25。
2.根据权利要求1所述的表面修饰物的制备方法，其特征在于，所述氨基化为马来酰亚胺基功能化。
3.根据权利要求2所述的表面修饰物的制备方法，其特征在于，马来酰亚胺基功能化是将二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯进行反应，再分离纯化。
4.根据权利要求3所述的表面修饰物的制备方法，其特征在于，所述二硫键键合金刚烷修饰的聚乙二醇与所述6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的质量比为2~3:1~2。
5.根据权利要求3所述的表面修饰物的制备方法，其特征在于，马来酰亚胺基功能化是在搅拌条件下进行，反应时间为至少20小时。
6.根据权利要求3所述的表面修饰物的制备方法，其特征在于，分离纯化是通过硅胶柱分离纯化。
7.根据权利要求1所述的表面修饰物的制备方法，其特征在于，接枝脂联素的反应是在搅拌条件下进行，反应时间为至少为40小时。
8.根据权利要求1所述的表面修饰物的制备方法，其特征在于，在第一次反应和第二次反应后，对产物均进行纯化。
9.根据权利要求8所述的表面修饰物的制备方法，其特征在于，通过透析膜透析来进行纯化。
10.一种表面修饰物，其特征在于，其由权利要求1~9任一项所述的制备方法制备得到。
11.如权利要求10所述的表面修饰物在制备促进创伤修复的药物中的应用。
12.如权利要求10所述的表面修饰物在制备促进脂肪组织创面愈合的药物中的应用。
13.如权利要求10所述的表面修饰物在制备促进前脂肪细胞生长的药物中的应用。
14.一种创伤修复贴，其特征在于，其与创伤口接触的一面涂覆有创伤修复药物，所述创伤修复药物包括如权利要求10所述的表面修饰物。
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