RU2558847C9

RU2558847C9 - Стерилизация биоразлагаемых гидрогелей

Info

Publication number: RU2558847C9
Application number: RU2012121915/15A
Authority: RU
Inventors: Харальд РАУ; Тобиас ФОЙГТ; Ульрих ХЕРЗЕЛЬ
Original assignee: Асцендис Фарма Ас
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2016-07-20
Also published as: AU2010311421B2; ZA201203032B; JP2013509216A; US8986609B2; WO2011051406A1; BR112012010249A2; MY157640A; IL218779A; RU2558847C2; CN102686245A; KR20120123260A; AU2010311421A1; KR101756493B1; NZ599583A; EP2493514B1; US20150196667A1; JP5893566B2; CA2776723A1; US9278139B2; CN102686245B

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу финальной стерилизации основанных на полиэтиленгликолях биоразлагаемых нерастворимых гидрогелей с применением излучения. Изобретение представляет способ стерилизации основанного на полиэтиленгликоле биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля с основными структурными единицами, соединенными между собой разлагаемыми гидролитическим путем связями, включающий стадии: (а) получение гидрогеля, (б) сольватирование гидрогеля в защитном растворителе или в смеси двух или нескольких защитных растворителей или в их водных растворах, (в) обработка сольватированного гидрогеля гамма-излучением. Изобретение обеспечивает неожиданный эффект N-метил-2-пирролидона, N,N-диметилацетамида, N,N-диметилформамида и 1,3-диметил-2-имидазолидона, используемых в качестве защитного растворителя, при стерилизации основанного на полиэтиленгликоле биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля. 12 з.п. ф-лы, 9 пр., 2 ил.

Description

Биоразлагаемые гидрогели на основе полиэтиленгликолей представляют интерес во многих областях медицинского или фармацевтического применения, например, при регенерации тканей, для изоляции ран и в составе лекарственных средств. В некоторых областях применения, в частности, при введении в их состав лекарственных средств, из соображений безопасности строго рекомендуется придавать полиэтиленгликолевому гидрогелю способность к биоразложению. Биоразлагаемость может быть придана гидрогелю за счет сложноэфирных связей, которые в водной среде in vivo подвергаются самопроизвольному или ферментативному гидролизу.

Стерильность фармацевтической композиции или медицинского препарата, предназначенного для имплантации или для наружного применения, законодательно обязательна для получения разрешения на выпуск соответствующей продукции на рынок. Предлагались такие различные способы стерилизации, как термическое воздействие, обработка давлением, фильтрование, химическая обработка или облучение. К сожалению, эти способы стерилизации не могут быть использованы на биоразлагаемых полиэтиленгликолевых гидрогелях, поскольку они не позволяют сохранить исходную структуру и свойства такого гидрогеля и в соответствии с этим ограничивают возможность медицинского применения полиэтиленгликолевых биоразлагаемых гидрогелей.

Так, например, растворы для инъекций чаще всего стерилизуются в соответствующих флаконах в автоклавах, но при повышенной температуре биоразлагаемые связи подвергаются ускоренному расщеплению. В соответствии с этим автоклавирование биоразлагаемого полиэтиленгликолевого гидрогеля приведет к преждевременному разложению материала, который после этого окажется непригодным для применения в медицинских целях.

В соответствии с другим способом раствор может быть стерилизован фильтрованием с использованием фильтров с размером пор 0,2 мкм для удаления любой микробной контаминации с последующим заполнением флаконов стерильным раствором в асептических условиях. Однако в случае нерастворимого полиэтиленгликолевого гидрогеля с сетчатой структурой этот материал не может быть переведен в раствор, при этом он может представлять собой суспензию микрочастиц или других трехмерных объектов (например, дисков или трубочек) с размерами, которые обычно превышают 0,2 мкм; в соответствии с этим такие суспензии или гелевые объекты не могут быть стерилизованы фильтрованием.

В заявке на Международный патент WO 2003/035244 представлен аппарат с замкнутым циклом, который обеспечивает получение стерильных микрочастиц. Стерилизованные фильтрованием химические компоненты поддерживаются в системе в стерильном состоянии в асептической среде во время формирования частиц, что и приводит к получению стерильных микрочастиц.

Такой асептический способ получения, включающий стадию стерилизации фильтрованием на уровне исходных материалов и поддержание асептических условий по ходу процесса, имеет определенные недостатки по сравнению со стерилизацией после получения гидрогеля, которую называют термической стерилизацией. Чем раньше реализуется стадия стерилизации в процессе производства, тем выше риск случайной контаминации. Асептический способ получения требует также разработки высокотехнологичного производственного оборудования, что повышает стоимость производства. В соответствии с этим предпочтение отдается способу термической стерилизации.

Фотодеградация полимеров при облучении УФ-светом и гамма-излучением приводит к образованию радикалов и/или ионов, которые часто вызывают расщепление и образование поперечных сшивок. Ситуация осложняется также окислением, поскольку действие света редко осуществляется при отсутствии кислорода. В общем случае это приводит к изменению свойств гидрогеля и способности материала подвергаться биоразложению (Encyclopedia of Polymer Science and Technology, Mark Herman (Изд.) Wiley, 2004, с.263 и сл.).

Обработка газообразным этиленоксидом или раствором, содержащим пероксид водорода, вызовет аналогичные побочные реакции с отрицательным эффектом по отношению к способности гидрогеля к биоразложению и приведет к значительному изменению кинетики разложения обработанного гидрогеля по сравнению с необработанным материалом гидрогеля. В дополнение к этому, надо принимать меры для того, чтобы в гидрогеле не осталось значительных количеств, например, этиленоксида, у которого может проявиться токсичность и который может вызвать нежелательные побочные эффекты.

Для преодоления связанных с термической стерилизацией осложнений объединяли процессы образования сетчатой структуры и стерилизации. Патент США №5634943 относится к способу получения полиэтиленгликолевого гидрогеля с сетчатой структурой при действии гамма-излучения. При таком подходе линейный полиэтиленгликоль (с молекулярной массой 200 кДа) растворяют в водном растворе хлорида натрия, освобождают раствор от газов и облучают его таким источником гамма-излучения, как Со 60. Доза в пределах от 2,5 до 25 Мрад (это эквивалентно дозе от 25 до 250 кГр) достаточна для образования поперечных сшивок между полиэтиленгликолевыми цепями вследствие образования свободных радикалов и установления связей между цепями, и в результате получают гидратированный нерастворимый гидрогель. Поскольку доза радиации достаточно велика и для стерилизации, в одну стадию получают материал, который пригоден для имплантации в роговицу глаза.

По аналогии с этим в заявке на патент США 20090030102 представлен способ формирования предназначенного для использования в электронных устройствах полимерного геля с сетчатой структурой, основанного на полиалкиленоксиде, полиариленоксиде или на полиглицидиловом эфире, при этом сетчатая структура в нем образуется в присутствии средства для образования сетчатой структуры и органического растворителя при облучении УФ-светом и/или при действии гамма-излучения.

Для других областей применения, например для доставки в организм фармацевтических препаратов, желательно, чтобы полиэтиленгликолевый гидрогель был биоразлагаемым. Патент США №6537569 относится к способу получения разлагаемых полиэтиленгликолевых гидрогелей с помощью гамма-излучения. В этом случае используют линейные полиэтиленгликолевые цепи, соединенные биоразлагаемыми сложноэфирными связями (молекулярные массы 10 кДа). Облучение мощностью от 25 до 30 кГр приводит к образованию связей между цепями и к получению нерастворимого полиэтиленгликолевого гидрогеля.

Существует также возможность регулирования скорости выделения лекарства за счет изменения плотности сетчатой структуры в полиэтиленгликолевых гидрогелях, которые облучались УФ-светом или гамма-излучением (Minkova и др., J. Polym. Sci., Polym. Phys. 27 (1989), 621-642; Belcheva и др., Macromol. Symp.103 (1996), 193; Rosiak и Yoshii, Nuclear Instruments and Methods in Physics research B, 151 (1999), 56-64; Rosiak, Ulansky, Radiation Physics and Chemistry 55 (1999), 139-151; Dimitrov и др., Acta Pharmaceutica Turcica 46 (2004) 49-54). Правда, в таком случае присутствие фармацевтического препарата в процессе облучения требует таких условий, при которых фармацевтический препарат не подвергается трансформациям, однако возможность протекания вызванных облучением побочных реакций, например, окисления или гидролиза или же присоединения к полимерным цепям, делает такой способ обработки практически неприменимым для большинства лекарственных средств.

Было показано, что облучение влияет и на такие другие свойства основанных на полиэтиленгликолях гидрогелей, как набухание и однородность (Kanjickal и др., J. Biomed. Mater. Res. A., 2008 Jan 9 - Effects of sterilization on poly(ethylene glycol) hydrogels).

В литературе описаны различные основанные на полиэтиленгликолях гидрогели. Так, например, в WO 2006/003014 представлены пролекарства в виде конъюгатов с полимерным гидрогелем, в которых гидрогель состоит из не подвергающихся биоразложению основных структурных единиц, связь между которыми осуществляется соединительными структурами, в составе которых есть биоразлагаемые связи. Заявка на Европейский патент №09167026.5 относится к основанному на полиэтиленгликолях гидрогелю с характеристической пакетной кинетикой разложения на поздней стадии.

Гидрогель, состоящий только из полиэтиленгликолевых структурных единиц, представлен в Европейском патенте №1019446. Для придания гидрогелю способности к разложению в него встроены подверженные гидролизу связи. Патент относится также к применению такого гидрогеля в качестве средства для доставки в организм лекарства.

В патенте США №5514379 представлены наряду с другими основанные на полиэтиленгликолях гидрогели, которые могут содержать только диагностические метки или их сочетание с терапевтическими препаратами. Аналогично этому в патенте США №6602952 представлены полиэтиленгликоль-хитозановые гидрогели, содержащие биологически активные средства, которые можно вводить инъекционным путем in vivo. В заявке РСТ WO 2006/38462 описаны содержащие поли(этиленоксиды) гидрогели с сетчатой структурой с карбаматными группами, которые применяют в качестве средств для доставки лекарств в организм или для других биомедицинских функций.

Хотя все представленные выше гидрогели должны быть использованы по назначению, которое требует стерильности, в этих патентах или заявках на патент не обращается внимания на выполнение этого требования, что ограничивает возможности их практического применения.

Вследствие трудностей, связанных со стерилизацией гидрогелей, нерастворимые биоразлагаемые гидрогели с сетчатой структурой на основе полиэтиленгликолей пока не нашли широкого применения как таковые, их используют только в качестве прекурсорных композиций, которые образуют гидрогель in situ после поступления в организм (Corgel^ТМ BioHydrogel, Focal® Technology). В соответствии с этим существует потребность в разработке способа финальной стерилизации гидрогелей малозатратным и щадящим путем для эффективного использования гидрогелей в таких областях применения, которые чувствительны к контаминации.

В связи с этим объектом настоящего изобретения является разработка альтернативного способа стерилизации нерастворимого биоразлагаемого гидрогеля на основе полиэтиленгликолей для по крайней мере частичного преодоления представленных выше недостатков и для выполнения представленных выше требований.

Поставленная цель достигается способом стерилизации основанного на поли(этиленгликолях) биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля с основными структурными единицами, соединенными между собой разлагаемыми гидролитическим путем связями, включающего стадии:

(а) получение гидрогеля,

(б) сольватирование гидрогеля в защитном растворителе или в смеси двух или нескольких защитных растворителей или же в их водном растворе,

(в) обработка сольватированного гидрогеля гамма-излучением.

Неожиданно было обнаружено, что предварительно сформированный биоразлагаемый нерастворимый гидрогель на основе полиэтиленгликолей может быть стерилизован гамма-излучением так, что при этом не будут повреждены лабильные биоразлагаемые связи, не будут трансформированы стабильные связи и не произойдет образование сетчатой структуры; для этого обработка гамма-излучением должна проводиться в присутствии защитного растворителя, в предпочтительном случае это N-метил-2-пирролидон, диметилацетамид, диметилформамид или 1,3-диметил-2-имидазолидинон, причем более предпочтительным является N-метил-2-пирролидон.

В частности, кинетика разложения in vitro таких соответствующих изобретению обработанных радиацией нерастворимых биоразлагаемых полиэтиленгликолевых гидрогелей идентична кинетике разложения in vitro таких полиэтиленгликолевых гидрогелей, которые не подвергались облучению. Кроме того, такие обработанные радиацией нерастворимые биоразлагаемые полиэтиленгликолевые гидрогели сохраняют способность к полному разложению. Если бы в результате образования радикалов были получены поперечные связи между цепями, то произошло бы изменение кинетики разложения и процесс разложения нерастворимого, биоразлагаемого гидрогеля замедлился, кривая разложения имела бы более пологий характер и разложение не могло бы быть полным.

В случае, когда нерастворимый биоразлагаемый полиэтиленгликолевый гидрогель содержит функциональные группы, такие группы сохраняют свою функциональность и после стерилизации.

В соответствии с настоящим изобретением используемые в нем понятия имеют приведенное далее значение.

Понятие гидрогеля относится к трехмерной гидрофильной или амфифильной полимерной сетчатой структуре, которая может принимать большое количество воды. Сетчатые структуры состоят из гомополимеров или сополимеров, они нерастворимы из-за того, что в них присутствуют ковалентные химические или физические связи (ионные, гидрофобные взаимодействия, взаимопроникновения), образующие поперечные сшивки. Эти поперечные сшивки формируют в сетчатой структуре каркас и делают ее физически однородной.

Понятие «основанные на полиэтиленгликолях гидрогели» («ПЭГ гидрогели») следует понимать в том смысле, что отношение масс полиэтиленгликолевых цепей в гидрогеле составляет не менее 10 масс.%, в предпочтительном случае не менее 25 масс.%, из расчета на общую массу гидрогеля. Остальная масса может состоять из других полимеров и других структурных единиц.

Понятие полимера относится к молекуле, составленной из повторяющихся структурных единиц, соединенных химическими связями с образованием линейных, кольцевых, разветвленных сетчатых или дендримерных структур или их сочетаний, полимеры могут быть синтетического или биологического происхождения или же они могут быть получены сочетанием двух этих механизмов их образования. В число примеров входят, наряду с другими, поли(акриловые) кислоты, поли(акрилаты), поли(акриламиды), поли(алкоксильные) полимеры, поли(амиды), поли(амидоамины), поли(аминокислоты), поли(ангидриды), поли(аспартамиды), поли(масляная кислота), поли(капролактон), поли(карбонаты), поли(цианоакрилаты), поли(диметилакриламиды), поли(эфиры), поли(этилены), поли(этиленгликоли), поли(этиленоксиды), поли(этилоксазолины), поли(гликолевая кислота), поли(гидроксиэтилакрилаты), поли(гидроксиэтил-оксазолины), поли(гидроксипропилметакриламиды), поли(гидроксипропилметакрилаты), поли(гидроксипропилоксазолины), поли(иминокарбонаты), поли(N-изопропилакриламиды), поли(дактиды), сополимеры молочной и гликолевой кислоты, поли(метакриламиды), поли(метакрилаты), поли(метилоксазолины), поли(пропиленфумараты), поли(органофосфазены), поли(ортоэфиры), поли(оксазолины), поли(пропиленгликоль), поли(силоксаны), поли(уретаны), поли(виниловые спирты), поли(виниламины), поли(винилметиловый эфир), поли(винилпирролидон), силиконы, рибонуклеиновые кислоты, дизоксирибонуклеиновые кислоты, альбумины, антитела и их фрагменты, белок плазмы крови, коллагены, эластин, фасцин, фибрин, кератины, полиаспартат, полиглютамат, проламины, трансферрины, цитохромы, флавопротеин, гликопротеины, гемопротеины, липопротеины, металлопротеины, фитохромы, фосфопротеины, опсины, агар, агароза, альгинат, арабинаны, арабиногалактаны, каррагенан, целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и другие основанные на углеводах полимеры, хитозан, декстран, декстрин, желатин, гиалуроновая кислота и ее производные, маннан, пектины, рамногалактуронаны, крахмал, гидроксиалкилированный крахмал, ксилан, а также их сополимеры и функционализированные производные.

Понятие «интактный», используемое по отношению к стерилизованному гидрогелю, означает, что в процессе стерилизации не произошло нарушение лабильных биоразлагаемых связей, при этом также не были нарушены стабильные связи и не обнаруживается появление других поперечных сшивок. «Интактность» гидрогеля можно определить по кинетике разложения in vitro основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого гидрогеля, стерилизованного в соответствии с изобретением, когда ее уровень идентичен кинетике разложения in vitro нестерилизованного биоразлагаемого полиэтиленгликолевого гидрогеля. Более того, такие облученные биоразлагаемые полиэтиленгликолевые гидрогели сохраняют способность к полному разложению. Если бы в результате генерирования радикалов происходило образование связей между цепями, то это проявилось бы на кинетике процесса разложения гидрогеля и скорость процесса разложения гидрогеля замедлилась, стала бы более пологой кривая, описывающая процесс разложения, а сам процесс разложения мог бы стать неполным. Если бы происходил разрыв цепей, то процесс разложения полиэтиленгликолевого гидрогеля должен был ускориться. В предпочтительном случае понятие «идентичный» по отношению к двум кинетикам разложения означает, что время, требуемое для разложения доли в х %, изменяется в обеих кинетиках разложения не более чем на 20%, в предпочтительном случае не более чем на 15%, при этом х лежит в пределах от 5 до 90.

Если биоразлагаемый гидрогель, основанный на полиэтиленгликолях, содержит функциональные группы, то эти функциональные группы не изменяются. Так, например, если функциональные группы представлены аминными группами, то содержание амина в основанном на полиэтиленгликолях гидрогеле после процесса стерилизации остается тем же самым, что и до стерилизации. В этом контексте понятие «тот же самый» означает, что число функциональных групп в стерилизованном в соответствии с настоящим изобретением гидрогеле отличается от числа функциональных групп в гидрогеле до стерилизации не более чем на 30%, в предпочтительном случае не более чем на 20%.

Для изучения кинетики разложения от нерастворимого биоразлагаемого гидрогеля, основанного на полиэтиленгликолях, могут быть отделены аликвотные пробы растворимых продуктов разложения основной структуры и проведено их количественное определение так, чтобы при этом не учитывалось содержание других растворимых продуктов разложения, выделяющихся из гидрогеля. Сам гидрогель может быть отделен от избытка водного буфера с осмотически физиологической концентрацией раствора отстаиванием или центрифугированием. Центрифугирование можно проводить так, чтобы количество супернатанта составляло не менее 10% от объема набухшего гидрогеля. Растворимые продукты разложения гидрогеля остаются в водном супернатанте после проведения такого отстаивания или центрифугирования и растворимые в воде продукты разложения, включающие один или несколько структурных элементов основной структуры, можно изучать, направляя аликвоты этого супернатанта на соответствующее разделение и/или на аналитическое исследование.

В альтернативном случае растворимые в воде продукты разложения могут быть отделены от нерастворимых в воде продуктов разложения фильтрованием через фильтр 0,45 мкм, после которого растворимые в воде продукты разложения оказываются в фильтрате. Растворимые в воде продукты разложения могут быть также отделены от нерастворимых продуктов разложения с помощью комбинирования процессов центрифугирования и фильтрования.

Так, например, структурные единицы основной структуры могут включать группы, которые поглощают УФ-свет с такими длинами волн, в области которых другие продукты разложения ультрафиолетовый свет не поглощают. Группы, характеризующимися избирательным поглощением УФ-света, могут быть представлены такими структурными элементами основной структуры, как амидные связи, или же они могут быть введены в основную структуру присоединением по входящим в ее состав реакционно-способным функциональным группам с включением таких ароматических кольцевых систем, как индолильные группы.

Для улучшения физико-химических или фармакокинетических свойств лекарства in vivo такое лекарство может быть сопряжено с носителем, например, с гидрогелем. Если прочность связи лекарства с носителем и/или с соединительным элементом невелика, то такие системы обозначают как соединенные с носителем пролекарства. В соответствии с определением IUPAC (его можно найти по адресу http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem, от 22 июля 2009 г.) соединенное с носителем пролекарство представляет собой такое пролекарство, которое содержит легко разлагающуюся связь соответствующего активного вещества с лабильной группой носителя, что приводит к улучшению физико-химических или фармакокинетических свойств, при этом лекарство может легко отделяться in vivo, обычно в результате гидролитического расщепления.

Понятия «лекарство», «биологически активная молекула», «биологически активная структурная единица, «биологически активное действующее вещество», «активное действующее вещество» и подобные им относятся к какому-либо веществу, которое может влиять на какие-либо физические или биохимические свойства биологического организма, включая, наряду с другими, вирусы, бактерии, грибы, растения, животных и людей. В частности, в этих рамках, биологически активные молекулы представляют собой любые вещества, предназначенные для диагностики, ухода за больными, ослабления симптомов, лечения или профилактики болезней у людей или у других животных, а также, с другой стороны, для улучшения физического или ментального самочувствия у людей или у животных. В число примеров биологически активных молекул, наряду с другими, входят пептиды, белки, ферменты, лекарства с небольшими молекулами (например, лекарства непептидной природы), красители, липиды, нуклеозиды, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты, клетки, вирусы, липосомы, микрочастицы и мицеллы. Классы биологически активных действующих веществ, которые могут быть использованы в рамках изобретения, представлены, наряду с другими, снотворными и успокаивающими средствами, психостимуляторами, транквилизаторами, респираторными лекарствами, антиконвульсантами, мышечными релаксантами, средствами для лечения паркинсонизма (антагонистами дофамина), анальгетиками, противовоспалительными средствами, противоаллергическими средствами, анксиолитиками (средствами для снятия тревожных состояний), средствами для подавления аппетита, средствами от ожирения, средствами для лечения мигрени, мышечными контрактантами, противоинфекционными препаратами (антибиотиками, противовирусными средствами, противогрибковыми средствами, бактерицидами, вакцинами), противовоспалительными препаратами, средствами для лечения артритов, противомалярийными препаратами, противорвотными средствами, противоэпилептическими средствами, антидиабетическими средствами, бронходилаторами, цитокинами, факторами роста, противораковыми средствами, антикоагулянтами, средствами для снижения давления крови, сердечно-сосудистыми лекарствами, сосудорасширяющими средствами, сосудосуживающими средствами, антиаритмическими средствами, антиоксидантами, антиастматическими средствами, средствами для воздействия на центральную нервную систему, гормональными препаратами, включая противозачаточные средства, иммуномодуляторами, симпатомиметиками, диуретиками, активными веществами для регулирования уровня липидов, антиандрогенными препаратами, противопаразитарными средствами, антикоагулянтами, неопластическими и антинеопластическими препаратами, гипогликемическими средствами, стероидными препаратами, пищевыми веществами и пищевыми добавками, стимуляторами роста, антиэнтеритными средствами, вакцинами, антителами, диагностическими препаратами, контрастными средствами и подобными им.

Понятие «элементы структуры из небольших биологически активных молекул» относится к представленным выше биологически активным элементам структуры с молекулярной массой 3000 Дальтон или меньше.

Биоразлагаемость гидрогелей, получаемых в соответствии с настоящим изобретением, достигается путем введения в их состав связей, расщепляемых гидролитическим путем.

Понятие «биоразлагаемый» в контексте настоящего изобретения относится к системе связей, которые не подвергаются неферментативному гидролитическому разложению в физиологических условиях (водный буфер с рН 7,4 при 37°С) с периодом полупревращения в пределах от одного часа до трех месяцев и в число которых, наряду с другими, входят аконитилы, ацетали, карбоксангидриды, карбоксилатные сложные эфиры, имины, гидразоны, амиды малеиновой кислоты, ортоэфиры, фосфамиды, фосфорные эфиры, фосфосилильные эфиры, силильные эфиры, сульфонильные эфиры, ароматические карбаматы, а также их сочетания и подобные им. Предпочтительные биоразлагаемые системы связей представлены карбоксилатными эфирами, карбонатами, фосфорными эфирами и эфирами сульфокислот, при этом особое предпочтение отдается карбоксилатным эфирам или карбонатам. Понятно, что при исследовании in vitro из практических соображений можно выбрать условия ускоренного протекания процесса, например, водный буфер со значением рН 9 при 37°С.

В соответствии с этим разлагаемые гидролитическим путем связи представлены, например, связями в аконитилах, ацеталях, карбоксангидридах, карбоксилатных сложных эфирах, иминах, гидразонах, амидах малеиновой кислоты, ортоэфирах, фосфамидах, фосфорных эфирах, фосфосилильных эфирах, силильных эфирах, сульфонильных эфирах, ароматических карбаматах, а также в их сочетаниях и подобных им. Предпочтительные биоразлагаемые связи представлены связями в карбоксилатных эфирах, карбонатах, фосфорных эфирах и эфирах сульфокислот, при этом особое предпочтение отдается карбоксилатным эфирам или карбонатам.

Если говорится о «прерванной цепи», то это означает, что между двумя атомами углерода углеродной цепи встроена мочевинная, амидная или карбаматная группа или же иная группа.

Понятие «не подвергающиеся биоразложению» (устойчивые) относится к связям, которые представляют собой нерасщепляющиеся стабильные связи, то есть к соответствующим соединительным структурным элементам с периодом полупревращения в физиологических условиях (водный буфер со значением рН 7,4 при 37°С) не менее шести месяцев.

Понятие «системы доставки пролонгированного действия» относится к композициям, которые высвобождают лекарство в теле пациента в течение продолжительного периода времени.

Понятие «хирургическая пластырная масса» или «медицинская пластырная масса» относится к основанным на гидрогелях клеям и другим составам, предназначенным для закрывания таких ран, как разрезы, рваные раны, проколы, потертости, закрытые травмы или места отрыва.

Понятие «гемостатические средства» относится к средствам для остановки кровотечения из ран.

Понятие «хирургические губки» относится к губкам, которые используют для абсорбирования жидкости там, где происходит хирургическое вмешательство.

Гамма-излучение определяется как электромагнитное излучение с энергией кванта более 200 кэВ, независимо от источника этого излучения. В предпочтительном случае источником излучения является кобальт 60.

Понятие «стерильный» относится к отсутствию любых обнаруживаемых передающихся возбудителей, включая бактерии, дрожжи, грибы, вирусы, споры, во всех видах и на всех стадиях их развития.

«Процесс стерилизации» представляет собой процедуру, осуществляемую для того, чтобы сделать материал стерильным, например, с помощью такого излучения, как УФ-свет, или с помощью гамма-излучения. В предпочтительном случае используют гамма-излучение.

Понятие «защитный растворитель» относится к химическому соединению, используемому для сольватирования сухого гидрогеля перед стерилизацией для сохранения его трехмерной структуры и физико-химических свойств, то есть для защиты его от повреждения.

Далее следует более детальное описание настоящего изобретения.

Изобретение относится к способу стерилизации основанных на полиэтиленгликолях биоразлагаемых нерастворимых гидрогелей путем облучения их в присутствии защитного растворителя, который сохраняет гидрогель в неповрежденном состоянии. Основанные на полиэтиленгликолях биоразлагаемые нерастворимые гидрогели, стерилизованные в соответствии с настоящим изобретением, характеризуются той же самой кинетикой разложения, что и до стерилизации, и они подвергаются полному разложению; это означает, что в их составе не произошло повреждение лабильных биоразлагаемых связей, а также не нарушались стабильные связи и не происходило образование нежелательных поперечных связей, то есть гель сохранился в исходном состоянии. Если основанные на полиэтиленгликолях биоразлагаемые нерастворимые гидрогели, стерилизованные в соответствии с настоящим изобретением, содержат реакционно-способные функциональные группы, то сохраняется и функциональность этих групп, то есть эти группы сохраняются в исходном виде. Такие реакционно-способные функциональные группы могут служить в качестве точек присоединения с образованием прямых или промежуточных связей с аффинным лигандом, хелатирующей группой, лекарством, пролекарством, пролекарством, присоединенным через соединительный элемент, и с аналогичными веществами. Не ограничивающими объем притязаний примерами таких реакционно-способных функциональных групп, наряду с другими, служат функциональные группы карбоновых кислот и активированных производных, аминов, малеинимидов, тиолов, сульфокислот и их производных, карбонатов и их производных, карбаматов и их производных, гидроксильные, альдегидные, кетонные, гидразиновые, изоцианатные, изотиоцианатные группы, функциональные группы кислот фосфора и их производных, фосфоновых кислот и их производных, галогенацетильные, алкилгалогенидные, акрилоильные группы и другие альфа-бета-ненасыщенные группы, выступающие в роли акцепторов в реакциях по Михаэлю, такие арилирующие остатки, как арилфторидные, гидроксиламинные группы, такие дисульфидные группы, как пиридилдисульфидные, винилсульфонильные, винилкетонные, диазоалкановые, диазоацетильные соединения, эпоксидные, оксирановые и азиридиновые группы, при этом предпочтение отдается функциональным группам карбоновых кислот и их активированных производных, аминным, тиольным группам, функциональным группам сульфокислот и их производных, карбонатным группам и их производным, карбаматным группам и их производным, гадроксильным, альдегидным, кетонным, гидразиновым, изоцианатным, изотиоцинатным группам, функциональным группам кислот фосфора и их производных, функциональным группам фосфоновых кислот и их производных, галогенацетильным, алкилгалогенидным, акрилоильным группам, таким арилирующим остаткам, как арилфторидные остатки, гидроксиламинным, таким дисульфидным группам, как пиридилдисульфидные группы, винилсульфонильным, винилкетонным, оксирановым и азиридиновым группам. В число предпочтительных реакционно-способных функциональных групп входят тиольные, малеинимидные, аминные группы, функциональные группы карбоновых кислот и их производных, карбонатные группы и их производные, карбаматные группы и их производные, альдегидные, галогенацетильные группы. Более предпочтительными являются тиольные группы, аминогруппы, карбоксилатные группы и их производные, карбонатные группы и их производные, карбаматные группы и их производные, альдегидные и галогенацетильные группы. В предпочтительном случае реакционно-способными функциональными группами являются первичные аминогруппы или функциональные группы карбоновых кислот, особое предпочтение отдается первичным аминным группам.

В одном из вариантов реакционно-способные функциональные группы в биоразлагаемых нерастворимых гидрогелях на основе полиэтиленгликолей защищены защитными группами, которые отщепляются после стерилизации.

Стерилизованные в соответствии с настоящим изобретением нерастворимые гидрогели на основе полиэтиленгликолей могут найти применение по любому назначению, в соответствии с которым их стерильность желательна или обязательна, так, например, это тканевая инженерия, накожное применение, внутриглазное применение, медицинская имплантация, хирургические пластырные массы и губки, гемостатические составы, системы доставки пролонгированного действия, средства для медицинской визуализации и пролекарственные носители. В предпочтительном случае их применяют в качестве систем доставки с пролонгированным действием и пролекарственных носителей, в особо предпочтительном случае в качестве пролекарственных носителей. Предварительно сформированный трехмерный гидрогель стерилизуют облучением в присутствии защитного растворителя или смеси двух или нескольких защитных растворителей или же их водных растворов, после этого в стерильный гидрогель могут быть введены, например, такие биологически активные структурные единицы, как, например, пептиды, белки или небольшие молекулы. Такие биологически активные структурные единицы могут быть присоединены к гидрогелю как через стабильные спейсерные структуры, так и через биоразлагаемые соединительные структурные элементы.

В альтернативном варианте в состав соответствующих настоящему изобретению биоразлагаемых нерастворимых гидрогелей на основе полиэтиленгликолей сначала вводят структурные элементы в виде небольших биологически активных молекул и после этого проводят стерилизацию облучением в присутствии защитного растворителя или смеси двух или нескольких защитных растворителей или же их водных растворов.

Подходящие для стерилизации соответствующие настоящему изобретению нерастворимые гидрогели на основе полиэтиленгликолей могут иметь разную форму, в их число, наряду с другими входят бесформенные образования, сферические, двояковыпуклые, плоские (например, в виде пленок) или трубчатые гидрогели. В предпочтительном варианте основанный на полиэтиленгликолях нерастворимый гидрогель состоит из сферических микрочастиц с диаметром частиц от 1 до 1000 микронов, в предпочтительном случае от 10 до 100 микронов.

Подходящий для стерилизации в соответствии с настоящим изобретением основанный на полиэтиленгликолях нерастворимый гидрогель состоит из основных структурных единиц, связанных между собой разлагаемыми связями. В соответствующих случаях основные структурные единицы могут иметь образующие сетчатую структуру поперечные сшивки через олигомерные, полимерные или низкомолекулярные структурные единицы, которые соединены с основными структурами разлагаемыми связями и которые в дополнение к этому могут иметь другие разлагаемые связи. В случае необходимости основные структурные единицы могут иметь прочные связи с одной или с несколькими из представленных далее структур: лигандные хелатирующие группы, спейсерные молекулы, блокирующие группы.

В одном из вариантов настоящего изобретения гидрогель имеет представленный далее состав.

Основанный на полиэтиленгликолях нерастворимый биоразлагаемый гидрогель состоит из основных структурных единиц, соединенных между собой связями, которые разлагаются гидролитическим путем. В предпочтительном случае основная структурная единица имеет молекулярную массу в пределах от 1 кДа до 20 кДа, в более предпочтительном случае от 1 кДа до 15 кДа.

В предпочтительном случае в основанном на полиэтиленгликолях нерастворимом биоразлагаемом гидрогеле основные структурные единицы характеризуются числом функциональных групп, состоящих из образующих поперечные сшивки биоразлагаемых функциональных групп и реакционно-способных функциональных групп. В предпочтительном случае сумма образующих поперечные сшивки биоразлагаемых групп и реакционно-способных функциональных групп равна шестнадцати или более, в предпочтительном случае эта сумма составляет от 16 до 128, в более предпочтительном случае от 20 до 100, в еще более предпочтительном случае от 20 до 40, в еще более предпочтительном случае от 24 до 80, в еще более предпочтительном случае также от 28 до 32, в наиболее предпочтительном случае от 30 до 60 и в самом предпочтительном случае от 30 до 32. Понятно, что в дополнение к образующим поперечные сшивки функциональным группам и к реакционно-способным функциональным группам могут присутствовать еще и защитные группы.

Функциональные группы могут быть присоединены к линейной цепи, в этом случае функциональные группы могут быть в регулярном или в случайном порядке распределены по цепи или же, в альтернативном случае, цепь может оканчиваться двумя дендритными структурными единицами, включающими все функциональные группы.

Предпочтительно, когда основная структурная единица имеет центр разветвления, от которого отходят по крайней мере три полимерных цепи на основе полиэтиленгликолей. Такие центры разветвления могут состоять из собранных в компактную группу поли- или олигоспиртов, в предпочтительном случае это пентаэритрит, трипентаэритрит, гексаглицерин, сахароза, сорбит, фруктоза, манит, глюкоза, целлюлоза, амилозы, крахмалы, гидроксиалкилированные крахмалы, поливиниловые спирты, декстраны, гиалуронаны, или же центры разветвления могут состоять из собранных в компактную группу таких поли- или олигоаминов, как орнитин, диаминомасляная кислота, трилизин, тетрализин, пентализин, гексализин, гептализин, октализин, нонализин, декализин, ундекализин, додекализин, тридекализин, тетрадекализин, пентадекализин или олиголизины, полиэтиленимины, поливиниламины. В предпочтительном случае центр разветвления может включать в связанном виде такие поли- или олигоамины, как трилизин, тетрализин, пентализин, гексализин, гептализин, октализин, нонализин, декализин, ундекализин, додекализин, тридекализин, тетрадекализин, пентадекализин или олиголизины, полиэтиленимины, поливиниламины.

Предпочтительно, когда от центра разветвления отходят от трех до шестнадцати основанных на полиэтиленгликолях полимерных цепей, в более предпочтительном случае их от четырех до восьми.

Сумма образующих сшивки функциональных групп и реакционно-способных функциональных групп в основной структурной единице в равных долях распределена по всем основанным на полиэтиленгликолях полимерным цепям, отходящим от центра разветвления. Если число отходящих от центра разветвления основанных на полиэтиленгликолях полимерных цепей не может обеспечить такое распределение в равных долях, то отклонение от среднего числа суммы образующих поперечные сшивки функциональных групп и реакционно-способных функциональных групп в основанной на полиэтиленгликолях полимерной цепи в предпочтительном случае должно быть минимальным.

В более предпочтительном случае сумма образующих поперечные сшивки функциональных групп и реакционно-способных функциональных групп в основной структурной единице равномерно распределена по числу основанных на полиэтиленгликолях полимерных цепей, отходящих от центра разветвления. Так, например, если число образующих поперечные сшивки функциональных групп и реакционно-способных функциональных групп равно тридцати двум, то на каждую из четырех основанных на полиэтиленгликолях полимерных цепей, отходящих от центра разветвления, должно приходиться восемь таких групп; в предпочтительном случае они должны образовывать дендритную структуру, присоединенную к концу каждой основанной на полиэтиленгликолях полимерной цепи. В альтернативном случае на каждую из восьми основанных на полиэтиленгликолях полимерных цепей, отходящих от центра разветвления, должно приходиться четыре такие группы или же на каждую из шестнадцати основанных на полиэтиленгликолях полимерных цепей должно приходиться две такие группы.

Предпочтительными структурами для соответствующих основанных на полиэтиленгликолях полимерных цепей, отходящих от центра разветвления, которые подходят для образования основных структурных элементов, являются такие многорукие полиэтиленгликолевые производные, как, например, представленные в перечне продукции JenKem Technology, USA (доступен по адресу www.jenkemusa.com от 28 июля 2009 года), производные 4ARM-PEG (пентаэритритный центр разветвления), производные 8ARM-PEG (гексаглицериновый центр разветвления) и производные 8ARM-PEG (трипентаэритритный центр разветвления). Наиболее предпочтительными являются 4arm PEG Amine (пентаэритритный центр разветвления) и 4arm PEG Carboxyl (пентаэритритный центр разветвления), 8arm PEG Amine (гексаглицериновый центр разветвления), 8arm PEG Carboxyl (гексаглицериновый центр разветвления), 8arm PEG Amine (трипентаэритритный центр разветвления) и 8arm PEG Carboxyl (трипентаэритритный центр разветвления). Предпочтительно, когда молекулярные массы таких многоруких полиэтиленгликолевых производных для основной структурной единицы составляют от 1 кДа до 20 кДа, в более предпочтительном случае от 2,5 кДа до 15 кДа и в еще более предпочтительном случае от 5 кДа до 10 кДа. Понятно, что эти соединения присутствуют в гидрогеле в связанном виде.

Такие дополнительные функциональные группы могут включать дендритные структурные единицы. Предпочтительно, когда каждая дендритная структурная единица имеет молекулярную массу в пределах от 0,4 кДа до 4 кДа, в более предпочтительном случае от 0,4 кДа до 2 кДа. В предпочтительном случае каждая дендритная структурная единица имеет не менее трех ответвлений и не менее четырех реакционно-способных функциональных групп, а максимальное число ответвлений составляет 63 и максимальное число реакционно-способных функциональных групп составляет 64, также предпочтительно, когда минимальное число ответвлений составляет 7 и минимальное число реакционно-способных функциональных групп составляет 8, а максимальное число ответвлений составляет 31 и максимальное число реакционно-способных функциональных групп составляет 32.

Примерами таких дендритных структурных единиц служат трилизин, тетрализин, пентализин, гексализин, гептализин, октализин, нонализин, декализин, ундекализин, додекализин, тридекализин, тетрадекализин, пентадекализин, гексадекализин, гептадекализин, октадекализин и нонадекализин в связанном виде. Примерами таких предпочтительных дендритных структурных единиц служат трилизин, тетрализин, пентализин, гексализин, гептализин, наибольшее предпочтение отдается трилизину, пентализину или гептализину в связанном виде.

В наиболее предпочтительном случае биоразлагаемый основанный на полиэтиленгликолях нерастворимый гидрогель характеризуется тем, что его основная структурная единица имеет четвертичный атом углерода в формуле C(A-Hyp)₄, где каждый остаток А независимо от других представлен основанной на поли(этиленгликолях) полимерной цепью, присоединенной одним из концов стабильной ковалентной связью к четвертичному атому углерода, тогда как периферический конец основанной на поли(этиленгликолях) полимерной цепи связан ковалентной связью с дендритной структурной единицей Hyp, при этом каждая дендритная структурная единица Hyp имеет не менее четырех функциональных групп, представляющих собой образующие сшивки биоразлагаемые функциональные группы, а также реакционно-способные функциональные группы и стабильные связи. Каждая основная структурная единица содержит по крайней мере шестнадцать образующих поперечные сшивки биоразлагаемых функциональных групп, а также реакционно-способных функциональных групп и стабильных связей, в предпочтительном случае от 20 до 64 и в более предпочтительном случае от 28 до 64 образующих поперечные сшивки биоразлагаемых функциональных групп, а также реакционно-способных функциональных групп и стабильных связей.

В предпочтительном случае каждый остаток А независимо от других выбирают из вариантов формулы -(CH₂)n₁(OCH₂CH₂)_nX-, где n1 принимает значения 1 или 2; n означает целое число в пределах от 5 до 50 и Х означает функциональную группу, связывающую ковалентной связью А и Hyp.

Предпочтительно, когда А и Hyp ковалентно связаны амидной функциональной группой.

В предпочтительном случае дендритная структурная единица Hyp представлена сверхразветвленным полипептидом. Предпочтительно, когда сверхразветвленный полипептид состоит из лизина в связанном виде, в наиболее предпочтительном случае Hyp представлен ундекализинилом или гептадекализинилом. Предпочтительно, когда каждая дендритная структурная единица Hyp имеет молекулярную массу в пределах от 0,4 кДа до 4 кДа. Следует понимать, что основная структурная единица C(A-Hyp)₄ может включать одинаковые или различные дендритные структурные единицы Hyp и что каждую структурную единицу Hyp выбирают независимо от других. Каждая структурная единица Hyp включает от пяти до двадцати одного остатков лизина, в предпочтительном случае не менее семи остатков лизина, то есть каждая структурная единица Hyp включает от пяти до тридцати двух остатков лизина в связанном виде, в предпочтительном случае не менее семи остатков лизина в связанном виде.

В предпочтительном случае C(A-Hyp)4 имеет молекулярную массу в пределах от 1 кДа до 20 кДа, в более предпочтительном случае от 1 кДа до 15 кДа, в еще более предпочтительном случае от 1 кДа до 10 кДа.

Способность к биоразложению соответствующих настоящему изобретению гидрогелей достигается путем введения связей, разлагаемых гидролитическим путем.

В предпочтительном случае основные структурные единицы могут быть соединены между собой через образующие поперечные сшивки структурные единицы, при этом каждая образующая поперечные сшивки структурная единица имеет на концах не менее двух связей, которые могут разлагаться гидролитическим путем. В дополнение к разлагающимся концевым связям образующие поперечные сшивки структурные единицы могут также содержать другие биоразлагаемые связи. В соответствии с этим каждый конец образующей поперечные сшивки структурной единицы, соединенный с основной структурной единицей, включает расщепляющуюся гидролитическим путем связь, а в соответствующих случаях в образующей поперечные сшивки структурной единице могут присутствовать также дополнительные биоразлагающиеся связи.

В соответствии с этим основанный на полиэтиленгликолях биоразлагаемый нерастворимый гидрогель включает основные структурные единицы, которые соединены между собой разлагаемыми гидролитическим путем связями, при этом основные структурные единицы в предпочтительном случае связаны между собой структурными единицами, образующими поперечные сшивки, и каждая образующая поперечные сшивки структурная единица имеет на конце не менее двух разлагающихся гидролитическим путем связей.

Основанный на полиэтиленгликолях биоразлагаемый нерастворимый гидрогель может содержать один или несколько различных типов образующих поперечные сшивки структурных единиц, в предпочтительном случае они относятся к одному типу. Образующая поперечные сшивки структурная единица может быть представлена как линейной, так и разветвленной молекулой, в предпочтительном случае она представлена линейной молекулой. В предпочтительном варианте изобретения образующая поперечные сшивки структурная единица соединена с основной структурной единицей не менее чем двумя биоразлагаемыми связями.

Понятие биоразлагаемых связей относится к связям, которые в физиологических условиях (водный буфер с рН 7,4 при 37°С) при отсутствии ферментов не подвергаются гидролитическому расщеплению с временем полупревращения от одного часа до трех месяцев; в их число, наряду с другими, входят аконитильные, ацетальные связи, карбоксангидридные связи, карбоксилатные сложноэфирные связи, иминные, гидразонные, малеамидные, ортоэфирные, фосфамидные, фосфорноэфирные связи, связи фосфосилильных эфиров, связи эфиров кислот кремния, сульфонильноэфирные связи, связи ароматических карбаматов, их сочетания и подобные им. Предпочтительные биоразлагаемые связи представлены связями карбоксилатных эфиров, карбонатов, фосфорных эфиров и эфиров сульфокислот, при этом особое предпочтение отдается связям карбоксилатных эфиров или карбонатов.

В предпочтительном случае образующие поперечные сшивки структурные единицы имеют молекулярную массу в пределах от 60 Да до 5 кДа, в более предпочтительном случае от 60 Да до 4 кДа, в еще более предпочтительном случае от 60 Да до 3 кДа, и в еще более предпочтительном случае от 0,5 кДа до 4 кДа, в еще одном более предпочтительном случае от 1 кДа до 4 кДа и в самом предпочтительном случае от 1 кДа до 3 кДа. В одном из вариантов образующая поперечные сшивки структурная единица состоит из полимера.

В дополнение к олигомерным или полимерным структурным единицам, образующим поперечные сшивки, могут быть использованы низкомолекулярные образующие поперечные сшивки структурные единицы, в частности, когда для образования основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля используют гидрофильные высокомолекулярные основные структурные единицы.

В предпочтительном случае основанные на поли(этиленгликолях) структурные единицы, образующие поперечные связи, представлены углеводородными цепями с этиленгликолевыми фрагментами, в случае необходимости они включают дополнительные функциональные группы, при этом основанные на поли(этиленгликолях) структурные единицы, образующие поперечные сшивки, включают в каждом отдельном случае не менее m этиленгликолевых фрагментов, где m означает целое число в пределах от 3 до 100, в предпочтительном случае от 1 до 70 и в наиболее предпочтительном случае от 10 до 70. Предпочтительно, когда основанные на поли(этиленгликолях) структурные единицы, образующие поперечные сшивки, имеют молекулярную массу в пределах от 60 Да до 5 кДа и в более предпочтительном случае в пределах от 0,5 кДа до 5 кДа.

В предпочтительном случае образующие поперечные сшивки структурные единицы основаны на полиэтиленгликолях, в предпочтительном случае это только одна основанная на полиэтиленгликолях молекулярная цепь. Предпочтительно, когда образующие поперечные сшивки полиэтиленгликолевые структурные единицы представляют собой углеводородные цепи, включающие один или несколько этиленгликолевых остатков; они могут также включать другие химические функциональные группы, при этом основанные на поли(этиленгликолях) структурные единицы, образующие поперечные сшивки, включают в каждом отдельном случае не менее m этиленгликолевых остатков, где m означает целое число в пределах от 1 до 100, в предпочтительном случае от 3 до 100, в более предпочтительном случае от 1 до 70 и в наиболее предпочтительном случае от 10 до 70. Предпочтительно, когда основанные на поли(этиленгликолях) структурные единицы, образующие поперечные сшивки, имеют молекулярную массу в пределах от 60 Да до 5 кДа и в более предпочтительном случае в пределах от 0,5 кДа до 5 кДа.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения образующая поперечные сшивки структурная единица состоит из полиэтиленгликолевой цепи, которая симметрично соединена через сложноэфирные связи с двумя альфа- и омега-алифатическими дикарбоксилатными спейсерами, отходящими от основной структурной единицы и соединенными стабильными амидными связями со сверхразветвленной дендритной структурной единицей.

Дикарбоновые кислоты спейсерных структурных единиц, соединенные с основной структурной единицей, с другой стороны соединены со структурной единицей, образующей поперечные сшивки, эти спейсерные структурные единицы включают от трех до двенадцати атомов углерода, в более предпочтительном случае от пяти до восьми атомов углерода, при этом они могут быть замещены по одному или по нескольким атомам углерода. Предпочтительными заместителями являются алкильные группы, гидроксильные группы или амидные группы или же замещенные аминогруппы. Одна или несколько метиленовых групп алифатических дикарбоновых кислот в соответствующих случаях могут быть заменены атомами кислорода, NH-группой или алкилзамещенной иминогруппой. Предпочтительно, когда алкильная группа представлена линейной или разветвленной алкильной группой с числом атомов углерода от одного до шести.

Скорость гидролиза биоразлагаемых связей между основными структурными единицами и образующими поперечные сшивки структурными единицами зависит от числа и типа соединяющих атомов, находящихся в окружении карбоксильной группы полиэтиленгликолевого сложного эфира, или определяется ими. Так, например, при образовании полиэтиленгликолевого сложного эфира, выбирая из янтарной кислоты или глутаровой кислоты, можно изменять время полупревращения биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля, основанного на полиэтиленгликолях.

В альтернативном варианте с реакционно-способными функциональными группами полимеризованного гидрогеля соединяются многофункциональные структурные единицы для повышения числа реакционно-способных функциональных групп, которые, например, позволяют увеличивать количество лекарства, введенного в состав основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля. В состав таких многофункциональных структурных единиц могут входить в связанном виде подходящие замещенные производные лизина, дилизина, трилизина, тетрализина, пентализина, гексализина, гептализина или олиголизинов, полиэтиленимины с низкой молекулярной массой. Предпочтительно, когда многофункциональная структурная единица состоит из молекул лизина в связанном виде. В случае необходимости такие многофункциональные структурные единицы могут быть замещены защитными группами.

Кроме того, такой соответствующий изобретению гидрогель может быть функционализирован спейсером, несущим ту же самую функциональную группу; так, например, аминогруппы могут быть введены в состав гидрогеля сочетанием такого гетеробифункционального спейсера, как соответственно активированный СООН-PEG₆-NH-Fmoc, с последующим удалением Fmoc-защитной группы.

Далее показана предпочтительная структурная единица для образования поперечной сшивки:

где штриховые линии показывают биоразлагаемые связи, соединяющие ее с основными структурными единицами и q означает целое число от 5 до 50.

В предпочтительном случае основанный на полиэтиленгликолях нерастворимый гидрогель состоит из основных структурных единиц, соединенных между собой связями, которые разлагаются гидролитическим путем.

В более предпочтительном случае основные структурные единицы включают центры разветвления представленной далее формулы:

где штриховая линия показывает связь, соединяющую этот структурный элемент с остальной основной структурной единицей.

В более предпочтительном случае основная структурная единица включает структуру представленной далее формулы:

где n означает целое число от 5 до 50 и штриховая линия показывает связь, соединяющую этот фрагмент с остальной основной структурной единицей.

В предпочтительном случае основная структурная единица включает сверхразветвленную структурную единицу Hyp.В более предпочтительном случае основная структурная единица включает сверхразветвленную структурную единицу Hyp представленной далее формулы:

где штриховые линии показывают связи, соединяющие этот фрагмент с остальной молекулой, а отмеченные звездочками атомы углерода в предпочтительном варианте имеют S-конфигурацию. В то же время следует понимать, что представленная выше сверхразветвленная структурная единица Hyp может также иметь R-конфигурацию или быть рацемической.

В предпочтительном случае основные структурные единицы соединены с не менее чем одним спейсером представленной далее формулы:

где одна из штриховых линий показывает соединение со сверхразветвленной структурной единицей Hyp, а другая штриховая линия показывает присоединение к остальной части молекулы и где m означает целое число от 2 до 4.

В предпочтительном случае основные структурные единицы соединены вместе образующими поперечные сшивки структурными единицами представленной далее формулы:

где q означает целое число от 3 до 100.

В более предпочтительном случае основные структурные единицы основанного на полиэтиленгликолях нерастворимого гидрогеля соединены вместе структурными единицами представленной далее формулы:

где каждая штриховая линия показывает присоединение к соответствующей основной структурной единице и где п принимает значение 45.

Более предпочтительными являются также основные структурные единицы основанного на полиэтиленгликолях нерастворимого гидрогеля, связанные вместе структурными единицами представленной далее формулы:

где штриховые линии показывают точки присоединения к соответствующей основной структурной единице и где n принимает значение 22.

Настоящее изобретение относится к стерилизации основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля облучением в присутствии защитных растворителей. Используемый в процедуре стерилизации основанный на полиэтиленгликолях биоразлагаемый нерастворимый гидрогель перед облучением сольватируют защитным растворителем и этот защитный растворитель остается в нем во время облучения. В предпочтительном случае защитный растворитель выбирают из группы, состоящей из уксусной кислоты (водный раствор, от 0,01 до 1 объемн. %), ацетонитрила, 4-ацетилморфолина, диметилсульфоксида, дихлорметана, N,N-диметилацетамида, N,N-диметилформамида, 1,3-диметил-2-имидазолидинона, диметилкарбоната, диметилформамида, 1-этил-2-пирролидона, N-этилацетамида, N-этил-формамида, формамида, 4-формилморфолина, 1-формилпирролидона, 1,3-диметил-2-имидазолидинона, 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1H)-пиримидинона, таких алкиловых спиртов, как метанол, этанол, пропанол, а также формамида, гексаметилфосфортриамида, N-метилацетамида, никотинамида (водный раствор, от 0,1 до 5 масс.%), пиридоксина (водный раствор, от 0,1 до 5 масс.%), N-метилформамида, N-метилпирролидона, 1,2-пропиленкарбоната, тетрагидрофурана, сульфолана, воды или их смесей.

В более предпочтительном случае защитный растворитель выбирают из группы, состоящей из уксусной кислоты (водный раствор, от 0,01 до 1 объемн. %), ацетонитрила, диметилсульфоксида, дихлорметана, диметилацетамида, диметилкарбоната, диметилформамида, 1,3-диметил-2-имидазолидинона, 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1H)-пиримидинона, таких алкиловых спиртов, как метанол, этанол, пропанол, а также формамида, гексаметилфосфортриамида, никотинамида (водный раствор, от 0,1 до 5 масс.%), N-метилформамида, N-метилпирролидона, тетрагидрофурана, сульфолана, воды или их смесей.

В особо предпочтительном случае защитный растворитель выбирают из 4-ацетил-морфолина, диметилацетамида, диметилформамида, 1,3-диметил-2-имидазолидинона, 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1H)-пиримидинона, 1-этил-2-пирролидона, N-этил-ацетамида, N-этилформамида, 4-формилморфолина, 1-формилпирролидона, N-метил-ацетамида, N-метилформамида, диметилсульфоксида или N-метилпирролидона. И в наиболее предпочтительном случае защитный растворитель выбирают из диметилсульфоксида, диметилацетамида, диметилформамида, 1,3-диметил-2-имидазолидинона или N-метилпирролидона, в еще более предпочтительном случае это диметилацетамид, диметилформамид, 1,3-диметил-2-имидазолидинон или N-метилпирролидон; особо предпочтительны также диметилсульфоксид или N-метилпирролидон; еще более предпочтителен N-метилпирролидон.

В случае необходимости защитный растворитель освобождают от газов, кроме того, в случае необходимости он может содержать один или несколько других защитных агентов, например, это соли, которые растворимы в защитном растворителе. В предпочтительном случае защитный агент содержится в концентрации в пределах от 0,01 до 10%. Следует понимать, что защитный растворитель может быть также представлен смесью двух или нескольких защитных растворителей или их водными растворами.

Защитные агенты могут быть выбраны из группы, состоящей из замещенных или незамещенных линейных, разветвленных или циклических алкиламинов с числом атомов углерода от одного до десяти, замещенных или незамещенных линейных или разветвленных алканкарбоновых кислот с числом атомов углерода от одного до десяти, замещенных или незамещенных линейных или разветвленных алкансульфокислот с числом атомов углерода от одного до десяти, замещенных или незамещенных линейных или разветвленных алкилтиолов с числом атомов углерода от одного до десяти или углеводов. Защитные агенты могут быть замещены гидроксильными группами или же мочевинными, амидными или карбаматными группами, которые также могут быть встроены в алкильную цепь, в алкильную цепь могут быть также встроены функциональные группы простых эфиров. К защитному растворителю можно добавлять смеси двух или нескольких защитных агентов.

Предпочтительные защитные агенты выбирают из пропиламина, бутиламина, пентиламина, втор-бутиламина, этаноламина, диэтаноламина, серинола, трис(гидроксиметил)аминометана, уксусной кислоты, муравьиной кислоты, аскорбиновой кислоты, глицинамида, пивалиновой кислоты, пропионовой кислоты, янтарной кислоты, глутаровой кислоты, адипиновой кислоты, тиоглицерина, дитиотреитола, меркаптоэтанола, восстановленного глютатиона.

Основанный на полиэтиленгликолях биоразлагаемый нерастворимый гидрогель для стерилизации помещают в соответствующую емкость, которая обеспечивает стерильность после проведения стерилизации. Гидрогель соответственно сольватируют защитным растворителем, соответствующую емкость закрывают и направляют на стерилизацию. Соответствующую емкость выбирают так, чтобы она обеспечивала стерильность после ее закрывания и после проведения операции по стерилизации. В альтернативном случае основанный на полиэтиленгликолях нерастворимый гидрогель сначала сольватируют защитным растворителем и после этого переносят в соответствующую емкость, в которой проводят его стерилизацию, и после этого закрывают емкость. Стерилизацию основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля проводят облучением, в предпочтительном случае используют гамма-излучение, с дозировкой от 5 до 100 кГр, в предпочтительном случае от 8 до 50 кГр, в более предпочтительно случае от 20 до 40 кГр, например, от 32 до 40 кГр, и в еще более предпочтительном случае от 20 до 30 кГр. Облучение соответствующего настоящему изобретению основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля проводят при температуре в пределах от комнатной температуры (25°С) до -80°С. В предпочтительном случае облучение проводят при комнатной температуре. Для получения температуры ниже комнатной температуры соответствующую емкость, содержащую основанный на полиэтиленгликолях биоразлагаемый нерастворимый гидрогель, который должен подвергаться стерилизации, можно выдерживать в охлаждающей среде, например, во льду или в сухом льду.

Такой стерилизованный биоразлагаемый нерастворимый гидрогель, основанный на полиэтиленгликолях, может быть использован сразу, например, в виде имплантата, или же он может быть далее модифицирован, например, сочетанием стерилизованного биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля, основанного на полиэтиленгликолях, с биологически активными структурами. В последнем случае последующую переработку проводят в стерильных условиях, используя предварительно стерилизованные химические соединения и биологически активные структурные единицы.

В одном из вариантов настоящего изобретения небольшие молекулы биологически активных структурных единиц присоединяют к функциональным группам основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля и получают то, что называют основанным на полиэтиленгликолях биоразлагаемым нерастворимым гидрогелем, несущим небольшие молекулы биологически активных соединений, после этого его стерилизуют облучением в присутствии защитного растворителя. Специалисту в этой области понятно, что только такие небольшие молекулы в биологически активных структурах подходят для того, чтобы сохранять их химическую структуру в процессе гамма-облучения.

В соответствии с этим, предпочтительным аспектом настоящего изобретения является соответствующий настоящему изобретению способ, в рамках которого в состав основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля вводят небольшие молекулы в биологически активных структурах.

Если в состав основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля вводят небольшие молекулы в виде биологически активных структур и проводят стерилизацию в соответствии со способом, который лежит в основе настоящего изобретения, то небольшие молекулы в биологически активных структурах должны сохраниться в неизмененном виде. Понятие «сохраниться в неизмененном виде» в этом контексте в предпочтительном случае означает, что по крайней мере 90% небольших молекул в биологически активных структурах, выделяющихся из такого стерилизованного гидрогеля, остаются неизмененными в той мере, в которой это можно определить такими известными специалисту в этой области способами, как масс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография или исследования фармакологической активности.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения сухой биоразлагаемый нерастворимый гидрогель, основанный на полиэтиленгликолях, сольватирован N-метилпирролидоном в количестве от 5 до 10 мл на грамм сухого биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля, основанного на полиэтиленгликолях; его облучают гамма-излучением в дозе 25 кГр, используя при этом закрытую емкость для предотвращения контаминации после стерилизации. Для последующей переработки, например, путем присоединения биологически активных структур к стерилизованному гидрогелю, заменяют N-метилпирролидон на требуемый для этого растворитель, используя снабженные фильтрами шприцы или подходящие для такого случая колонки. Специалисту в данной области понятно, что все стадии после стерилизации основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля проводят в асептических условиях, используя стерильные растворы.

В еще более предпочтительном варианте настоящего изобретения на один грамм сухого биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля, основанного на полиэтиленгликолях, используют от 5 до 10 мл N-метилпирролидона, содержащего от 0,1% до 2% (объемные соотношения) аминоэтанола или пропиламина в качестве средства для сольватации основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля и такой сольватированный биоразлагаемый нерастворимый гидрогель, основанный на полиэтиленгликолях, последовательно облучают гамма-излучением в дозе 32 кГр, используя закрытую емкость для предотвращения контаминации после стерилизации. Для последующей переработки, например, путем присоединения биологически активных структур к стерилизованному гидрогелю, заменяют содержащий аминоэтанол или пропиламин в количестве от 0,1% до 2% (объемные соотношения) N-метилпирролидон на требуемый для этого растворитель, используя снабженные фильтрами шприцы или подходящие для такого случая колонки. Специалисту в данной области понятно, что все стадии после стерилизации основанного на полиэтиленгликолях биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля проводят в асептических условиях, используя стерильные растворы.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является получаемый в соответствии с любым из представленных в настоящем изобретении способов стерилизованный биоразлагаемый нерастворимый гидрогель, основанный на полиэтиленгликолях, в частности, когда в его состав введены биологически активные структуры в виде небольших молекул.

На фиг.1 показана кинетика разложения in vitro образцов 4а (фиг.1a), 4b (фиг.1б), 4 с (фиг.1в), 4d (фиг.1г) и 4е (фиг.1д) после стерилизации, в каждом отдельном случае вместе с образцом 3а (нестерилизованный гидрогель для сравнения), при рН 10,3 и температуре 37°С, а также образцов 4f (фиг.1e), 4g (фиг.1ж), 4h (фиг.1з), 4i (фиг.1и), 4j (фиг.1к) и 4k (фиг.1л) после стерилизации, в каждом отдельном случае с образцом 3b (нестерилизованный гидрогель для сравнения), при рН 9,0 и температуре 37°С.

На фиг.2 показана кинетика разложения in vitro образца 6 после стерилизации вместе с образцом 5 (нестерилизованный гидрогель для сравнения) при рН 9,0 и при температуре 37°С.

Примеры Материалы и способы

Материалы

Amino 4-arm PEG5000 получен от компании JenKem Technology, Пекин, Китайская Народная Республика.

Все другие химические продукты получены от Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Тауфкирхен, Германия.

При получении гранул гидрогеля используют снабженные полипропиленовыми насадками шприцы в качестве реакционных сосудов и устройств для промывок.

Проведение аналитических исследований

Масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением проводят на приборе Thermo Fisher Orbitrap Discovery instrument, оборудованном системой Waters Acquity UPLC.

В масс-спектрах продуктов на основе полиэтиленгликолей проявляются серии структурных единиц (СН₂СН₂O)n, что объясняется полидисперсностью полиэтиленгликолевого исходного материала. Для более простой интерпретации в примерах приводится только одно представительное значение сигнала m/z.

Гель-проникающую хроматографию проводят с использованием системы Amersham Bioscience AEKTAbasic, оборудованной колонкой Superdex75 5/150 GL (Amersham Bioscience/GE Healthcare), если не указано иное. В качестве подвижной фазы используют смесь водного буфера (20 ммолей фосфата натрия, 150 ммолей хлорида натрия, 0,005% TWEEN 20, рН 7,4) и ацетонитрила в отношении 4/1 (объемные соотношения). Абсорбцию определяют при 215 нм.

Пример 1

Синтез реагента основной структурной единицы 1g

Реагент основной структурной единицы 1g синтезируют из Amino 4-arm PEG5000 1a в соответствии с представленной далее схемой:

Для получения соединения 1b в 20 мл безводного диметилсульфоксида растворяют 4-Arm-PEG5000 tetraamine 1a (молекулярная масса около 5200 г/моль, 5,20 г, 1,00 ммоль, хлористоводородная соль). Прибавляют Boc-Lys(Boc)-OH (2,17 г,

6,25 ммоля) в 5 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО), гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC HCl, 1,15 г, 6,00 ммолей), гидрат гидроксибензтриазола (HOBt·H₂O, 0,96 г, 6,25 ммоля) и коллидин (5,20 мл, 40 ммолей). Реакционную смесь 30 минут перемешивают при комнатной температуре.

Реакционную смесь разбавляют добавлением 1200 мл дихлорметана и промывают 600 мл 0,1 н. серной кислоты (два раза), раствором хлорида натрия (один раз), 0,1 М раствором гидроксида натрия (два раза) и смесью 1:1 (объемные соотношения) концентрированного раствора хлорида натрия и воды (четыре раза). Водные слои снова экстрагируют 500 мл дихлорметана. Органические фазы сушат над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают, получают 6,3 г сырого вещества 1b в виде бесцветного масла. Соединение 1b очищают с помощью обращено-фазовой ВЭЖХ. Выход 3,85 г (59%) вещества 1b в виде бесцветного стекловидного продукта.

Соединение 1с получают при перемешивании 3,40 г соединения 1b (0,521 ммоля) в 5 мл метанола и 9 мл 4 н. хлористого водорода в диоксане при комнатной температуре в течение 15 минут. Летучие вещества удаляют в вакууме. Полученный продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки. Масс-спектр: m/z 1151,9=[М+5H]⁵⁺(расчетное значение 1152,0).

Для синтеза соединения 1d растворяют 3,26 г соединения 1с (0,54 ммоля) в 15 мл диметилсульфоксида (безводного), прибавляют 2,99 г Boc-Lys(Boc)-OH (8,64 ммоля) в 15 мл безводного диметилсульфоксида, 1,55 г гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламино-пропил)карбодиимида (8,1 ммоля), 1,24 г гидрата гидроксибензтриазола (8,1 ммоля) и 5,62 мл коллидина (43 ммоля). Реакционную смесь 30 минут перемешивают при комнатной температуре.

Реакционную смесь разбавляют добавлением 800 мл дихлорметана и промывают 400 мл 0,1 н. серной кислоты (два раза), раствором хлорида натрия (один раз), 0,1 М раствором гидроксида натрия (два раза) и смесью 1:1 (объемные соотношения) концентрированного раствора хлорида натрия и воды (четыре раза). Водные слои снова экстрагируют 800 мл дихлорметана. Органические фазы сушат над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают, получают стекловидное сырое вещество. Его растворяют в дихлорметане и осаждают охлажденным диэтиловым эфиром (-18°С). Эту операцию повторяют два раза и сушат осажденный продукт в вакууме. Выход бесцветного стекловидного вещества 1d 4,01 г (89%), его используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Масс-спектр: m/z 1405,4=[М+6Н]⁶⁺ (расчетное значение 1405,4).

Соединение 1е получают перемешиванием раствора соединения 1d (3,96 г, 0,47 ммоля) в 7 мл метанола и 20 мл 4 н. хлористого водорода в диоксане при комнатной температуре в течение 15 минут. Летучие вещества удаляют в вакууме. Полученный продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки. Масс-спектр: m/z 969,6=[М+7Н]⁷⁺ (расчетное значение 969,7).

Для синтеза соединения 1f растворяют соединение 1е (3,55 г, 0,48 ммоля) в 20 мл диметилсульфоксида (безводного), прибавляют Boc-Lys(Boc)-OH (5,32 г, 15,4 ммоля) в 18,8 мл безводного диметилсульфоксида, гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламино-пропил)карбодиимида (2,76 г, 14,4 ммоля), гидрат гидроксибензтриазола (2,20 г, 14,4 ммоля) и 10,0 мл коллидина (76,8 ммоля). Реакционную смесь 60 минут перемешивают при комнатной температуре.

Реакционную смесь разбавляют добавлением 800 мл дихлорметана и промывают 400 мл 0,1 н. серной кислоты (два раза), раствором хлорида натрия (один раз), 0,1 М раствором гидроксида натрия (два раза) и смесью 1:1 (объемные соотношения) концентрированного раствора хлорида натрия и воды (четыре раза). Водные слои снова экстрагируют 800 мл дихлорметана. Органические фазы сушат над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают, получают сырое вещество 1f в виде бесцветного масла. Его растворяют в дихлорметане и осаждают охлажденным диэтиловым эфиром (-18°С). Эту операцию повторяют два раза и сушат осажденный продукт в вакууме. Выход бесцветного стекловидного вещества 1f 4,72 г (82%), его используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Масс-спектр: m/z 1505,3=[М+8Н]⁸⁺ (расчетное значение 1505,4).

Реагент для образования основной структурной единицы 1g получают перемешиванием раствора соединения 1f (молекулярная масса около 12035 г/моль, 4,72 г, 0,39 ммоля) в 20 мл метанола и 40 мл 4 н. хлористого водорода в диоксане при комнатной температуре в течение 30 минут. Летучие вещества удаляют в вакууме. Выход стекловидного реагента для образования основной структурной единицы 1g 3,91 г (100%). Масс-спектр: m/z 977,2=[М+9H]⁹⁺(расчетное значение 977,4).

Альтернативный путь синтеза 1g

Для получения соединения 1b к суспензии 4-Arm-PEG5000 tetraamine 1a (50,0 г, 10,0 ммоль) в 250 мл безводного изопропанола при 45°С прибавляют Boc-Lys(Boc)-OSu (26,6 г, 60,0 ммолей) и диизопропилэтиламин (20,9 мл, 120,0 ммолей) и перемешивают в течение 30 минут.

После этого прибавляют н-пропиламин (2,48 мл, 30,0 ммолей). Через 5 минут раствор разбавляют прибавлением 1000 мл метил-трет-бутилового эфира и оставляют на ночь при -20°С без перемешивания. Декантируют примерно 500 мл жидкости над осадком и отбрасывают ее. Прибавляют 300 мл охлажденного метил-трет-бутилового эфира и после встряхивания в течение 1 минуты отделяют продукт фильтрованием через стеклянный фильтр и промывают его 500 мл холодного метил-трет-бутилового эфира. Продукт сушат в вакууме в течение 16 часов.

Выход 1b 65,6 г (74%) в виде белого комковатого твердого вещества. Масс-спектр: m/z 937,4=[М+7H]⁷⁺(расчетное значение 937,6).

Соединение 1с получают при перемешивании полученного на предыдущей стадии соединения 1b (48,8 г, 7,44 ммоля) в 156 мл 2-пропанола при 40°С. При перемешивании в течение 1-2 минут прибавляют смесь 196 мл 2-пропанола и 78,3 мл ацетилхлорида. Раствор перемешивают при 40°С в течение 30 минут и оставляют на ночь при охлаждении до -30°С без перемешивания. Прибавляют 100 мл охлажденного метил-трет-бутилового эфира, встряхивают суспензию в течение одной минуты и охлаждают в течение 1 часа при -30°С. Продукт реакции отделяют фильтрованием через стеклянный фильтр и промывают 200 мл холодного метил-трет-бутилового эфира. Продукт сушат в вакууме в течение 16 часов.

Выход 1с в виде белого порошка 38,9 г (86%). Масс-спектр: m/z 960,1=[М+6Н]⁶⁺ (расчетное значение 960,2).

Для синтеза соединения 1d к суспензии полученного на предыдущей стадии соединения 1с (19,0 г, 3,14 ммоля) в 80 мл 2-пропанола при 45°С прибавляют Boc-Lys(Boc)-OSu (16,7 г, 37,7 ммоля) и диизопропилэтиламин (13,1 мл, 75,4 ммоля) и перемешивают смесь в течение 30 минут при 45°С. После этого прибавляют н-пропиламин (1,56 мл, 18,9 ммоля). Через 5 минут к раствору прибавляют 600 мл холодного метил-трет-бутилового эфира и центрифугируют осадок (3000 мин^-1, 1 минута). Осадок сушат в вакууме в течение 1 часа и растворяют его в 400 мл тетрагидрофурана, прибавляют 200 мл диэтилового эфира и охлаждают смесь при -30°С в течение 16 часов без перемешивания. Суспензию отфильтровывают через стеклянный фильтр и промывают 300 мл холодного метил-трет-бутилового эфира. Продукт сушат в вакууме в течение 16 часов.

Выход 1d в виде белого порошка 21,0 г (80%).

Соединение 1е получают при растворении полученного на предыдущей стадии соединения 1d (15,6 г, 1,86 ммоля) в 3 н растворе хлористого водорода в метаноле (81 мл, 243 ммоля) и при перемешивании в течение 90 минут при 40°С. Прибавляют 200 мл метанола и 700 мл изопропанола и 2 часа выдерживают смесь при -30°С. Для завершения кристаллизации прибавляют 100 мл метил-трет-бутилового эфира и оставляют суспензию на ночь при -30°С. Прибавляют 250 мл холодного метил-трет-бутилового эфира, встряхивают суспензию в течение 1 минуты, фильтруют через стеклянный фильтр и промывают 100 л холодного метил-трет-бутилового эфира. Продукт сушат в вакууме. Выход 13,2 г (96%) 1е в виде белого порошка.

Масс-спектр: m/z 679,1=[М+10Н]¹⁰⁺ (расчетное значение 679,1).

Для синтеза соединения 1f к полученному на предыдущей стадии соединению 1е (8,22 г, 1,12 ммоля) в 165 мл 2-пропанола при 45°С прибавляют Boc-Lys(Boc)-OSu (11,9 г, 26,8 ммоля) диизопропилэтиламин (9,34 г, 53,6 ммоля) и перемешивают смесь в течение 30 минут. После этого прибавляют н-пропиламин (1,47 мл, 17,9 ммоля). Через 5 минут охлаждают раствор до -18°С, выдерживают 2 часа, затем прибавляют 165 мл холодного метил-трет-бутилового эфира, встряхиваю суспензию в течение 1 минуты и фильтруют через стеклянный фильтр. После этого осадок на фильтре промывают четыре раза по 200 мл холодной смесью 4:1 метил-трет-бутилового эфира и изопропанола и один раз холодным метил-трет-бутиловым эфиром (200 мл). Продукт 16 часов сушат в вакууме.

Выход 12,8 г (90%) 1f в виде комковатого твердого вещества желтоватого цвета.

Масс-спектр: m/z 1505,3=[М+8H]⁸⁺ (расчетное значение 1505,4).

Для получения реагента для образования основной структурной единицы 1g в 30 мл метанола растворяют 4ArmPEG5kDa(-LysLys₂Lys₄(Boc)₈)₄ (1f) (15,5 г, 1,29 ммоля) и охлаждают до 0°С. В течение трех минут прибавляют 120 мл охлажденного до 0°С 4 н. хлористого водорода в диоксане (480 ммолей) и удаляют баню со льдом. Через 20 минут в течение 15 минут прибавляют охлажденный до 0°С 3 н. хлористый водород в метаноле (200 мл, 600 ммолей) и перемешивают раствор в течение 10 минут при комнатной температуре. Проводят осаждение продукта из раствора добавлением 480 мл холодного метил-трет-бутилового эфира и одну минуту центрифугируют при 3000 об/мин. Осадок сушат в вакууме в течение одного часа и снова растворяют его в 90 мл метанола, осаждают добавлением 240 мл холодного метил-трет-бутилового эфира и снова центрифугируют суспензию при 3000 об/мин в течение одной минуты. Продукт сушат в вакууме.

Выход 11,5 г (89%) в виде бледно-желтых хлопьев.

Масс-спектр: m/z 1104,9=[М+8Н]⁸⁺ (расчетное значение 1104,9).

Пример 2

Синтез реагента для образования поперечных сшивок 2d

Реагент для образования поперечных сшивок 2d получают из монобензилового эфира адипиновой кислоты (English, Arthur R. И др., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347) и полиэтиленгликоля 2000 в соответствии с представленной далее схемой:

Раствор полиэтиленгликоля 2000 (2а) (11,0 г, 5,5 ммоля) и монобензилового эфира адипиновой кислоты (4,8 г, 20,6 ммоля) в дихлорметане (90,0 мл) охлаждают до 0°С. Прибавляют дициклогексилкарбодиимид (4,47 г, 21,7 ммоля) и после этого каталитическое количество диметиламинопиридина (5 мг), раствор перемешивают и оставляют на ночь (на 12 часов), позволяя ему нагреться до комнатной температуры. Колбу выдерживают при +4°С в течение пяти часов. Твердое вещество отфильтровывают и полностью удаляют растворитель, отгоняя его в вакууме. Остаток растворяют в 1000 мл смеси 1:1 серного эфира и этилацетата (объемные соотношения) и два часа выдерживают при комнатной температуре, в течение этого времени образуется небольшое количество хлопьевидного осадка. Это твердое вещество отделяют фильтрованием через слой инфузорной земли (Celite®). Раствор 12 часов выдерживают в плотно закрытом сосуде в морозильной камере при -30°С до полной кристаллизации. Кристаллический продукт отфильтровывают через стеклянный пористый фильтр и промывают охлажденным эфиром (-30°С). Осадок на фильтре сушат в вакууме. Выход 2b 11,6 г (86%) в виде бесцветного твердого вещества. Продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Масс-спектр: m/z 813,1=[M+3Н]³⁺ (расчетное значение 813,3).

В стеклянном автоклаве объемом 500 мл в 180 мл этилацетата растворяют 2b (диацилированный монобензиловым эфиром адипиновой кислоты полиэтиленгликоль 2000, 13,3 г, 5,5 ммоля) и прибавляют 0,4 г 10%-ного палладия на угле. Раствор гидрируют при давлении 6 бар при 40°С до прекращения поглощения водорода (от 5 до 12 часов). Катализатор отделяют фильтрованием через слой инфузорной земли Celite® и отгоняют растворитель в вакууме. Выход 2 с в виде желтоватого масла 12,3 г (количественный). Этот продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки. Масс-спектр: m/z 753,1=[M+3Н]³⁺ (расчетное значение 753,2).

Раствор диацилированного монобензиловым эфиром адипиновой кислоты полиэтиленгликоля 2000 2 с (9,43 г, 4,18 ммоля), N-гидроксисукцинимида (1,92 г, 16,7 ммоля) и дициклогексилкарбодиимида (3,44 г, 16,7 ммоля) в 75 мл сухого дихлорметана оставляют на ночь при перемешивании при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждают до 0°С и отделяют осадок фильтрованием. Отгоняют дихлорметан и перекристаллизовывают остаток из тетрагидрофурана.

Выход образующего поперечные сшивки реагента в виде бесцветного твердого вещества 2d 8,73 г (85%).

Масс-спектр: m/z 817,8=[M+3Н]³⁺ (расчетное значение 817,9).

Пример 3

Получение гранул содержащего свободные аминогруппы гидрогеля низкой плотности 3а

Раствор 300 мг 1g и 900 мг 2d в 10,80 мл диметилсульфоксида прибавляют к раствору 100 мг Arlacel P135 (Croda International Plc) в 80 мл гептана. Смесь перемешивают со скоростью 700 об/мин обычной металлической мешалкой при комнатной температуре в течение 10 минут и получают суспензию. Для запуска полимеризации прибавляют 1,1 мл N,N,N′,N′-тетраметилендиамина. Через два часа скорость вращения мешалки уменьшают до 400 об/мин и перемешивают смесь еще 16 часов. Прибавляют 1,6 мл уксусной кислоты и по истечении 10 минут прибавляют 50 мл воды. Через пять минут прекращают перемешивание и сливают водную фазу.

Для фракционирования по размерам гранул суспензию гидрогеля в воде пропускают во влажном состоянии через стальные сита на 75, 50, 40, 32 и 20 мкм. Фракции гранулированного продукта, задержанные ситами на 32, 40 и 50 мкм объединяют и промывают три раза водой, десять раз этанолом и сушат в течение 16 часов при давлении 0,1 мбар; получают 3а в виде белого порошка.

Получение гранул содержащего свободные аминогруппы гидрогеля средней плотности 3b

Раствор 1200 мг 1g и 3840 мг 2d в 28,6 мл диметилсульфоксида прибавляют к раствору 425 мг Arlacel P135 (Croda International Plc) в 100 мл гептана. Смесь перемешивают со скоростью 650 об/мин обычной металлической мешалкой при комнатной температуре в течение 10 минут и получают суспензию. Для запуска полимеризации прибавляют 4,3 мл N,N,N′,N′-тетраметилендиамина. Через два часа скорость вращения мешалки уменьшают до 400 об/мин и перемешивают смесь еще 16 часов. Прибавляют 6,6 мл уксусной кислоты и по истечении 10 минут прибавляют 50 мл воды. Через пять минут прекращают перемешивание и сливают водную фазу.

Для фракционирования по размерам гранул суспензию гидрогеля в воде пропускают во влажном состоянии через стальные сита на 63, 50, 40, 32 и 20 мкм. Фракции гранулированного продукта, задержанные ситами на 32, 40 и 50 мкм объединяют и промывают три раза водой, десять раз этанолом и сушат в течение 16 часов при давлении 0,1 мбар; получают 2,86 г 3b в виде белого порошка.

Получение гранул содержащего свободные аминогруппы гидрогеля высокой плотности 3с

Раствор 2400 мг 1g и 3600 мг 2d в 24,0 мл диметилсульфоксида прибавляют к раствору 425 мг Arlacel P135 (Croda International Plc) в 110 мл гептана. Смесь перемешивают со скоростью 850 об/мин обычной металлической мешалкой при комнатной температуре в течение 10 минут и получают суспензию. Для запуска полимеризации прибавляют 8,6 мл N,N,N′N′-тетраметилендиамина. Через два часа скорость вращения мешалки уменьшают до 400 об/мин и перемешивают смесь еще 16 часов. Прибавляют 13,2 мл уксусной кислоты и по истечении 10 минут прибавляют 50 мл воды. Через пять минут прекращают перемешивание и сливают водную фазу.

Для фракционирования по размерам гранул суспензию гидрогеля в воде пропускают во влажном состоянии через стальные сита на 63, 50, 40, 32 и 20 мкм. Фракции гранулированного продукта, задержанные ситами на 32, 40 и 50 мкм объединяют и промывают три раза водой, десять раз этанолом и сушат в течение 16 часов при давлении 0,1 мбар; получают 3,00 г 3с в виде белого порошка.

Пример 4

Получение и последующее облучение гамма-радиацией гранул гидрогелей (4а, 4b, 4с, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k)

Порции по 20 мг высушенного гидрогеля 3а в шприцах с фильтрами промывают пять раз представленными далее защитными растворителями: N-метилпирролидон (4а), диэтиловый эфир диэтиленгликоля (4b), диметилсульфоксид (4с) или 0,1% уксусной кислоты в воде (4d).

По аналогии с этим порции по 20 мг высушенного гидрогеля 3b в шприцах с фильтрами промывают пять раз представленными далее защитными растворителями: 1,3-диметил-2-имидазолидинон (4f), N,N-диметилацетамид (4g), N-метилпирролидон + 0,5 объемн.% 1-пропиламина (4h), N-метилпирролидон + 0,5 объемн.% 2-амино-этанола (этаноламина) (4i), N-метилпирролидон+0,1 объемн.% уксусной кислоты (4j) или N-метилпирролидон, содержащий 0,2 М уксусной кислоты и 0,1 М пропиламина (4k).

После последней промывки шприцы закрывают, оставляя гранулы гидрогеля в набухшем виде с небольшим избытком защитного растворителя. Проводят также облучение сухого образца гидрогеля 3а в сухом состоянии и получают 4e.

Образцы подвергают обработке гамма-излучением при комнатной температуре дозой 40 кГр (4а, 4b, 4с, 4d, 4e, 4f) или 32 кГр (4g, 4h, 4i, 4j, 4k), источник излучения Со 60.

После этого образцы пять раз промывают этанолом и сушат в течение 16 часов при давлении 0,1 мбар.

Пример 5

Определение аминной компоненты

В 0,9 мл ацетонитрила растворяют Fmoc-Asp(OtBu)-OSu (49 мг, 116 мкмолей) и прибавляют 0,5 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера с рН 7,4. Этот раствор прибавляют к 20 мг гидрогеля 3а и 4а в реакционном сосуде в виде шприца и встряхивают в течение 30 минут при комнатной температуре.

После этого гидрогель десять раз промывают ацетонитрилом с водой (2:1, объемные соотношения) + 0,1% трифторуксусной кислоты и десять раз диметилформамидом.

Флуренилметилоксикарбонильную группу (Fmoc) отщепляют трехкратным встряхиванием каждый раз в течение 10 минут со смесью диметилформамида и 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (98:2, объемные соотношения). Все эти фракции объединяют, разбавляют диметилформамидом и определяют содержание 9-метилен-флуорена по абсорбции УФ-света с длиной волны 295 нм. Используют коэффициент экстинкции 9141 л·моль^-1·см^-1.

Содержание аминных функций в 3а составляет 0,13 ммоль/г.

Содержание аминных функций в 4а после обработки гамма-излучением составляет 0,12 ммоль/г.

При использовании Fmoc-Gly-OSu вместо Fmoc-Asp(OtBu)-OSu получают те же самые значения содержания аминных функций.

Пример 6

Исследования ускоренного разложения гранул гидрогеля in vitro

Изучение кинетики разложения в условиях ускоренного превращения in vitro гранул гидрогелей 4а, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j и 4k после стерилизации и 3а и 3b (образцы сравнения, без стерилизации) определяют при инкубировании 5 мг каждого из образцов в 0,5 мл 0,5 М натрий-карбонатного буфера с рН 10,3 при 37°С (3а, 4а, 4b, 4c, 4d и 4e). В альтернативном варианте для ускоренного превращения in vitro используют такие условия: 0,5 мл 0,5 М натрий-боратного буфера с рН 9,0, температура 37°С (3b, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j и 4k). В определенные интервалы времени отбирают аликвоты и анализируют их с использованием гель-проникающей хроматографии. Сигналы УФ-датчика, соответствующие выделившимся в результате разложения гидрогеля растворимым в воде продуктам, включающие одну основную структурную единицу или несколько основных структурных единиц, приводят к среднему значению и строят график, отражающий зависимость этих величин от времени инкубирования (фиг.1).

Образец

Растворитель

Время на выделение первых 10% основных

Время на выделение 95% основных

Отношение а:б

Фиг.

структурных единиц (а)			структурных единиц (б)
3а (рН 10,3)		3,1 часа	4,9 часа	1,58	1a
4а	НМП	3,1 часа	4,9 часа	1,58	1a
4b	ДЭДГ	4,0 часа	9,2 часа	2,25	1b
4с	ДМСО	3,5 часа	5,7 часа	1,63	1с
4d	0,1% уксусная кислота	2,4 часа	4,9 часа	2,04	1d
4е	отсутствует	1,2 часа	5,5 часа	4,58	1e
3b (рН 9.0)		62 часа	95 часов	1,53	1f
4f	ДМИ	59 часов	95 часов	1,61	1f
4g	ДМА	60 часов	92 часа	1,53	1g
4h	НМП + 0,5% пропиламина	54 часа	80 часов	1,48	1h
4i	НМП + 0,5% аминоэтанола	54 часа	80 часов	1,48	1i
4j	НМП + 0,1% уксусной к-ты	57 часов	80 часов	1,40	1j
4k	НМП + 0,1 М уксусной к-ты, 0,2 М пропиламина	54 часа	75 часов	1,39	1k

Пример 7

Получение обработанного гамма-излучением гидрогеля 6 с введенным в его состав палиперидоном

Содержащий палиперидон гидрогель 5 получают модифицированием гидрогеля 3с лизином и последующим сочетанием с палиперидон-глутариловым эфиром так, как это представлено в заявке на Международный патент РСТ/ЕР 2010/064874. Порцию массой 20 мг высушенных гранул гидрогеля 5 в снабженном фильтром шприце промывают пять раз составом на основе буфера (85 г/л дигидрата трегалозы, 50 мМ буфера сукцинат/Трис с рН 5,0, 0,05% Tween 20, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты) После последней стадии промывки закрывают шприц, оставляя гидрогель в набухшем состоянии с небольшим избытком защитного растворителя. Образец обрабатывают гамма-излучением в бане с сухим льдом дозой 40 кГр (источник излучения Со 60). После этого гидрогель 6 пять раз промывают буфером представленного выше состава, пять раз водой и пять раз этанолом и сушат в течение 16 часов при давлении 0,1 мбар.

Пример 8

Разложение in vitro облученного образца 6 при рН 9 и 37°С

Кинетику разложения в условиях ускоренного превращения in vitro образца 6 (после стерилизации) и в качестве образца сравнения гидрогеля 5 (без стерилизации) определяют при инкубировании 2 мг каждого из образцов в 1,0 мл 0,5 М натрий-боратного буфера при рН 9 и температуре 37°С. В соответствующие интервалы времени отбирают аликвоты и анализируют их с помощью гель-проникающей хроматографии. Сигналы в УФ-области 215 нм, соответствующие выделившимся растворимым в воде продуктам разложения гидрогеля, включающим одну основную структурную единицу или несколько основных структурных единиц, приводят к среднему значению и строят график, отражающий зависимость этих величин от времени инкубирования. Отмечаются лишь небольшие различия в характере разложения (фиг.2).

Пример 9

Качество выделившегося из облученного гидрогеля 6 палиперидона

В 1,5 мл фосфатного буфера с рН 7,4 (60 мМ, 3 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,01% Tween 20) при 37°С инкубируют 1 мг гидрогеля 6, с которым через линкер связан палиперидон. По истечении четырех дней с помощью ВЭЖХ проверяют качество палиперидона, выделившегося в супернатант, для этого используют прибор А Waters Acquity UPLC, оборудованный колонкой Waters ВЕН С 18, 50 х 2,1 мм I.D., размер частиц 1,7 мкм. Растворитель А: 0,05% трифторуксусной кислоты в воде, растворитель Б: 0,04% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле. Используют линейный градиент от 0 до 50% Б в течение четырех минут. Чистота палиперидона определяется равной 95% (215 нм).

Сокращения:

AcOEt	Этилацетат
АсОН	Уксусная кислота
Asp	Аспарагиновая кислота
Воc	трет-Бутилоксикарбонильная группа
DBU	1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен
DCC	Дициклогексилкарбодиимид
DCM	Дихлорметан
DGDE	Диэтиловый эфир диэтиленгликоля
DMA	N,N-Диметилацетамид (ДМА)
DMAP	Диметиламинопиридин
DMF	N,N-Диметилформамид
DMI	1,3-Диметил-2-имидазолидинон(ДМИ)
DMSO	Диметилсульфоксид (ДМСО)
EDC	1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид
ESI	Ионизация электрораспылением
eq	Стехиометрический эквивалент
EtOH	Этанол
Fmoc	Флуоренилметоксикарбонильная группа
HOBt	N-Гидроксибензтриазол
iPrOH	Изопропанол
kGy	Килогрей
LCMS	Масс-спектрометрия, сопряженная с жидкостной хроматографией
МеОН	Метанол
MS	Масс-спектр
МТВЕ	Метил-трет-бутиловый эфир
MW	Молекулярная масса
NHS	N-Гидроксисукцинимид
NMP	N-Метил-2-пирролидинон (НМП)
OtBu	трет-Бутилоксигруппа
OSu	N-Гидроксисукцинимидильный остаток
PEG	Поли(этиленгликоль)
РуВОР	Гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидино-фосфония
RP-HPLC	Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
RT	Комнатная температура
SEC	Гель-проникающая хроматография (эксклюзионная хроматография)
tBu	трет-Бутильная группа
TFA	Трифторуксусная кислота
THF	Тетрагидрофуран
TMEDA	N,N,N′,N′-тетраметилендиамин
UV	Ультрафиолетовый свет
VIS	Видимый свет

Claims

1. Способ стерилизации основанного на полиэтиленгликоле биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля с основными структурными единицами, соединенными между собой разлагаемыми гидролитическим путем связями, включающий стадии:
(а) получение гидрогеля,
(б) сольватирование гидрогеля в защитном растворителе или в смеси двух или нескольких защитных растворителей или в их водных растворах,
(в) обработка сольватированного гидрогеля гамма-излучением, причем
основная структурная единица имеет четвертичный атом углерода формулы С(А-Hyp)₄, где каждый остаток А независимо означает основанную на полиэтиленгликоле полимерную цепь, присоединенную одним из концов стабильной ковалентной связью к четвертичному атому углерода, тогда как дистальный конец основанной на полиэтиленгликоле полимерной цепи связан ковалентной связью с дендритной структурной единицей Hyp, при этом каждая дендритная структурная единица Hyp состоит из от 5 до 21 остатков лизина;
основные структурные единицы соединены вместе через сшивающие структурные единицы, состоящие из полиэтиленгликолевой цепи, которая симметрично соединена через сложноэфирные связи с двумя альфа- и омега-алифатическими дикарбоксилатными спейсерами, предоставленными основными структурными единицами и соединенными стабильными амидными связями со сверхразветвленной дендритной структурной единицей; и
защитным растворителем является N-метил-2-пирролидон, N,N-диметилацетамид, N,N-диметилформамид или 1,3-диметил-2-имидазоли-динон.

2. Способ по п. 1, где стерилизация достигается действием гамма-излучения с дозой от 5 до 100 кГр.

3. Способ по п. 1, где стерилизация достигается действием гамма-излучения с дозой от 8 до 50 кГр.

4. Способ по п. 1, где защитным растворителем является N-метил-2-пирролидон.

5. Способ по п. 1, где в состав гидрогеля вводят биологически активные структурные единицы из небольших молекул.

6. Способ по п. 1, где гидрогель состоит из сферических микрочастиц с диаметром частиц от 1 до 1000 микронов.

7. Способ по п. 1, где основные структурные единицы гидрогеля имеют в каждом отдельном случае молекулярную массу в пределах от 1 кДа до 20 кДа.

8. Способ по п. 1, где сшивающие структурные единицы имеют молекулярную массу в пределах от 60 Да до 5 кДа.

9. Способ по п. 1, где основные структурные единицы основанного на полиэтиленгликоле биоразлагаемого нерастворимого гидрогеля включают в качестве сверхразветвленной структурной единицы Hyp формулы

где штриховые линии показывают точки соединения с остальной молекулой, а отмеченные звездочками атомы углерода имеют S-конфигурацию.

10. Способ по п. 1, где основные структурные единицы соединены с по меньшей мере одним спейсером формулы

где одна из штриховых линий показывает соединение со сверхразветвленной структурной единицей Hyp, а вторая штриховая линия показывает точку присоединения к остальной части молекулы и где m означает целое число от 2 до 4.

11. Способ по п. 1, где основные структурные единицы соединены вместе через сшивающие структурные единицы формулы

где q означает целое число от 3 до 100.

12. Способ по п. 1, где защитный растворитель содержит один или несколько защитных агентов.

13. Способ по п. 12, где защитные агенты выбирают из пропиламина, бутиламина, пентиламина, втор-бутиламина, этаноламина, диэтаноламина, серинола, трис(гидроксиметил)аминометана, уксусной кислоты, муравьиной кислоты, аскорбиновой кислоты, глицинамида, пивалиновой кислоты, пропановой кислоты, янтарной кислоты, глутаровой кислоты, адипиновой кислоты, тиоглицерина, дитиотреитола, меркаптоэтанола, восстановленного глютатиона.