BR112012010249B1

BR112012010249B1 - Esterilização de hidrógeis biodegradáveis

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Publication number: BR112012010249B1
Authority: BR
Publication date: 2018-08-21

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(54) Título: ESTERILIZAÇÃO DE HIDRÓGEIS BIODEGRADÁVEIS (51) lnt.CI.: A61L 2/00; A61L 2/08; A61L 2/10; C08G 65/329; A61K 41/00; A61K 9/16; A61P 43/00; A61K 47/69; C08L 71/02 (30) Prioridade Unionista: 29/10/2009 EP 09 174526.5 (73) Titular(es): ASCENDIS PHARMA AS (72) Inventor(es): HARALD RAU; TOBIAS VOIGT; ULRICH HERSEL (85) Data do Início da Fase Nacional: 30/04/2012

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ESTERILIZAÇÃO DE HIDROGÉIS BIODEGRADÁVEIS.

Hidrogéis com base em PEG biodegradáveis são de interesse para várias aplicações médicas e farmacêuticas tal como regeneração de tecido, fechamento de ferida e liberação de fármaco. Por razões de segurança é fortemente preferido em algumas aplicações, como por exemplo liberação de fármaco, criar biodegradabilidade no hidrogel de PEG. Biodegradabilidade pode ser introduzida em um hidrogel por ligações de éster que sofrem hidrólise espontânea ou enzimática no ambiente in vivo aquoso.

Esterilidade de uma composição farmacêutica ou um dispositivo médico pretendido para implantação ou aplicação tópica é obrigatória para receber aprovação como um produto correspondentemente comercializado. Vários métodos de esterilização foram propostos, tal como calor, pressão, filtragem, químicas ou irradiação. Infelizmente, estes métodos de esterilização não são aplicáveis a hidrogéis de PEG biodegradáveis como eles não são compatíveis com reter a estrutura do hidrogel e propriedades, desse modo limitando o uso médico de hidrogéis de PEG biodegradáveis.

Por exemplo, soluções injetáveis são frequentemente esterilizadas em seus fraconetes por autoclavagem, porém ligações biodegradáveis sofrerão degradação drasticamente acelerada, se submetidas a alta temperatura. Portanto, autoclavar um hidrogel de PEG biodegradável resultará em um material pré-degradado que não qualificará para aplicações terapêuticas.

Alternativamente, uma solução pode ser esterilizada por filtração usando filtros com tamanhos de poro de 0,2 pm para remover qualquer contaminante microbiano e subsequentemente carregar a solução estéril nos frasconetes sob condições assépticas. Entretanto, no caso de hidrogéis de PEG reticulados insolúveis, o material não é solúvel, porém pode estar presente em forma de uma suspensão de micropartículas ou como outro objeto tridimensional (por exemplo, disco ou tubo), tipicamente maior em tamanho do que 0,2 pm e portanto tais suspensões ou objetos de gel não podem ser esterilizados por filtração.

O pedido de patente internacional W02003/035244 descreve um

2/42 aparato de circuito fechado que permite a preparação de micropartículas estéreis. Componentes químicos esterilizados por filtro são mantidos estéreis dentro do ambiente asséptico do sistema ao longo do processo de formação de partícula, desse modo resultando em micropartículas estéreis.

Tal processamento asséptico, que aplica uma etapa de filtração estéril no nível dos materiais de partida e mantém condições assépticas durante o processo, tem certas desvantagens sobre esterilização depois da síntese do hidrogel, chamada esterilização terminal. Quanto mais cedo a etapa de esterilização ocorre no processo de produção, mais alto é o risco de contaminação acidental. Processamento asséptico da mesma forma requer elaborar equipamento técnico, desse modo aumentando custo de produção. Portanto, um método de esterilização terminal é preferido.

Fotodegradação com luz UV e irradiação gama de polímeros gera radicais e/ou íons que frequentemente levam a cilvagem e reticulação. Oxidação da mesma forma ocorre, complicando a situação, visto que exposição a luz é raramente na ausência de oxigênio. Geralmente, isto muda as propriedades do hidrogel e a suscetibilidade do material a biodegradação (Encyclopedia of Polymer Science and Teachnology, Mark Herman (Ed) Wiley, 2004, pag., 263 ff).

Tratamento com gás óxido de etileno ou com soluções contendo peróxido de hidrogênio causarão reações laterais similares negativamente afetando as propriedades de biodegradação do hidrogel e causando divergência substancial das cinéticas de degradação do hidrogel tratado quando comparado ao material de hidrogel não tratado. Além disso, cuidado tem que ser tomado para garantir que nenhuma quantidade significante de por exemplo óxido de etileno permaneça no hidrogel, que pode ser tóxico e causar efeitos colaterais indesejados.

Para evitar as dificuldades associadas com esterilização terminal, os processos de reticulação e esterilização foram combinados. US 5.634.943 detalha um método para gerar hidrogéis de PEG reticulados por irradiação gama. Nesta abordagem, PEG linear (MW 200 kDa) foi dissolvido em solução salina aquosa, desgaseificado e irradiado por meio de uma fonte

3/42 gama tal como Co60. Uma dosagem dentre 2,5 e 25 Mrads (equivalente entre 25 e 250 kGy) foi suficiente para efetuar reticulação das cadeias de PEG por formação de radical e acoplamento de intercadeia, resultando em um hidrogel insolúvel hidratado. Devido ao fato que a dosagem de irradiação foi da mesma forma suficientemente alta para esterilização, em uma etapa um material foi obtido que foi adequado para implantação na córnea do olho.

Similarmente, pedido de patente US US20090030102 descreve um método de formar um gel de polímero reticulado para uso em dispositivos eletrônicos, com base em óxido de polialquileno, óxido de poliarileno, ou éter poliglicidílico, que na presença de um reticulador e solvente orgânico é reticulado através de irradiação UV e/ou gama.

Para outras aplicações, tal como liberação de farmacêuticos, biodegradabilidade do hidrogel de PEG é desejável. US 6.537.569 detalha um processo de gerar hidrogéis de PEG degradáveis através de irradiação gama. Aqui, cadeias de PEG lineares conectadas através de ligações de éster biodegradáveis são empregadas (MW 10 kDa). Irradiação com 25 ou 30 kGy formaram reticuladores de intercadeia e um hidrogel de PEG insolúvel.

Foi da mesma forma tentado controlar cinéticas de liberação de fármaco variando-se o grau de reticulação em hidrogéis de PEG irradiados por UV ou gama (Minkova e outro, J. Polym. Sei., Polym. Phys. 27 (1989) 621-642, Belcheva e outro, Macromol. Symp. 103 (1996) 193, Rosiak e Yoshii, Nuclear Intruments and Methods in Physics research B 151 (1999) 5664, Rosiak e Ulansky, Radiation Physics and Chemistry 55 (1999) 139-151, Dimitrov e outro, Acta Pharmaceutica Turcica 46 (2004) 49-54). Apesar disso, aqui a presença de fármaco durante o processo de irradiação é requerida para fornecer a captura de fármaco, porém a possibilidade de reações laterais causadas por irradiação tal como oxidação ou hidrólise ou conjugações às cadeias de polímero faz esta abordagem não prática para a maioria das entidades terapêuticas.

Foi da mesma forma mostrado, que irradiação afeta outras propriedades de hidrogéis com base em PEG tal como inchaço e aspereza (Kanjickal e outro, J Biomed Mater Res A. 2008 Jan 9 - Efeitos de esteriliza4/42 ção em hidrogéis de poli(etileno glicol)).

Vário hidrogéis com base em PEG foram descritos na literatura. Por exemplo, W02006/003014 descreve conjugados de hidrogel polimérico de um pró-fármaco em que o hidrogel consiste em porções de cadeia principal não biodegradáveis interconectadas por reticuladores compreendendo ligações biodegradáveis.

O pedido de patente europeu EP09167026.5 descreve um hidrogel com base em PEG com uma cinética de degradação semelhante a ruptura de fase tardia característica.

Um hidrogel que apenas consiste em porções de PEG é descrito na patente européia EP1019446. Hidroliticamente ligações instáveis são construídos no hidrogel para permitir degradação. A patente da mesma forma reivindica o uso de tal hidrogel como um sistema de liberação de fármaco.

Patente US 5.514.379 descreve, entre outros, hidrogéis com base em PEG que podem conter rótulos diagnósticos, sozinhos ou em combinação com fármacos terapêuticos. Similarmente, patente US 6.602.952 descreve hidrogéis de PEG-quitosana, contendo agentes biologicamente ativos que podem ser injetados in vivo. O pedido PCT WO2006/38462 descreve poli(óxido etileno)-contendo hidrogéis com reticuladores de carbamato que são usados como dispositivos de liberação de fármaco ou em outras funções biomédicas.

Embora tudos os hidrogéis descritos acima sejam pretendidos ser usados em aplicações que requerem esterilidade, este assunto não é focalizado por estas patentes ou pedidos de patente que limita sua aplicabilidade industrial.

Como uma consequência das faltas em esterilização em hidrogel, hidrogéis com base em PEG biodegradáveis reticulados insolúveis não são ainda aprovados como tal, porém apenas como composições precursoras que formam um hidrogel in situ depois da administração (Corgel™ BioHidrogel, Focal® Technology). Portanto, há uma necessidade de fornecer meios para terminalmente esterilizar hidrogéis em um custo-eficiente e preservar

5/42 maneira para completamente utilizar hidrogéis em aplicações sensíveis a contaminação.

Desse modo, um objetivo da presente invenção é fornecer um método alternativo para esterilização de hidrogel com base em PEG biodegradável insolúvel para pelo menos parcialmente superar desvantagens e satisfazer as necessidades como descrito acima.

O objetivo é obtido por um método para esterilizar um hidrogel insolúvel com base em poli(etileno glicol) biodegradável compreendendo porções da cadeia principal que são interconectadas por ligações hidroliticamente degradáveis, compreendendo as etapas de (a) Fornecer o hidrogel;

(b) Solvatar o hidrogel em um solvente protetor ou em uma mistura de dois ou mais solventes protetores ou soluções aquosas dos mesmos;

(c) Submeter o hidrogel solvatado a radiação gama.

Foi agora surpreendentemente descoberto que hidrogéis insolúvel com base em PEG biodegradáveis pré-formados podem ser esterilizados por radiação gama sem dano às ligações biodegradáveis lábeis e desse modo da mesma forma nenhum dano às ligações estáveis e sem causar reticulação, se a irradiação com raios gama foi realizada na presença de um solvente protetor, preferivelmente N-metil-2-pirrolidona (NMP), DMA, DMF, ou DMI, ainda mais preferivelmente, NMP.

Em particular, cinéticas de degradação in vitro de tais hidrogéis de PEG biodegradáveis insolúveis irradiados de acordo com a invenção foram idênticos a cinéticas de degradação in vitro de hidrogéis de PEG não irradiados. Além disso, tais hidrogéis de PEG biodegradáveis insolúveis irradiados foram ainda completamente degradáveis. Se reticuladores de intercadeia por formação radical tivesse formado, as cinéticas de degradação teriam sido afetadas, e o processo de degradação de hidrogel de PEG biodegradável insolúvel seria mais lento, a curva de degradação seria nivelada e a degradação poderia não chegar a conclusão.

No caso do hidrogel com base em PEG biodegradável insolúvel conter grupos funcionais, tais grupos são ainda funcionais depois da esterili6/42 zação.

Dentro da presente invenção os termos usados têm o significado como segue.

Um hidrogel pode ser definido como uma rede polimérica tridimensional, hidrofílica ou anfifílica capaz de levar grandes quantidades de água. As redes são compostas de homopolímeros ou copolímeros, são insolúveis devido à presença de reticuladores de química ou física covalentes (interações iônicas, hidrofóbicas, emaranhamento). Os reticuladores fornecem a estrutura de rede e integridade física.

O termo hidrogéis com base em PEG (hidrogel de PEG) como entendido aqui significa que a proporção de massa de cadeias de PEG no hidrogel é pelo menos 10% em peso, preferivelmente pelo menos 25%, com base no peso total do hidrogel. O resto pode ser feito de outros polímeros e outras porções.

O termo polímero descreve uma molécula compreendida de repetir unidades estruturais conectadas por ligações químicas de uma maneira linear, circular, ramificada, reticulada ou dendrimérica ou uma combinação das mesmas, que podem ser de origem sintética ou biológica ou uma combinação de ambos. Exemplos incluem, porém não são limitados a, ácidos poli(acrílicos), poli(acrylates), poli(acrilamidas), poli(alquilóxi) polímeros, poli(amidas), poli(amidoaminas), ácidos de poli(amino), poli(anidridos), poli(aspartamida), ácido poli(butírico), poli(caprolactona), poli(carbonatos), poli(cianoacrilatos), poli(dimetilacrilamida), poli(ésters), poli(etileno), poli(etileno glicol), óxido de poli(etileno), poli(etiloxazolina), ácido poli(glicólico), acrilato de poli(hidroxietil), poli(hidroxietiloxazolina), poli(hidroxipropilmetacrilamida), metacrilato de poli(hidroxipropila), poli(hidroxipropiloxazolina), poli(iminocarbonatos), poli(N-isopropilacrilamida), ácido poli(íático), ácido poli(lático-co-glicólico), poli(metacrilamida), poli(metacrilatos), poli(metiloxazolina), fumarato de poli(propileno), poli(organofosfazenos), poli(orto ésteres), poli(oxazolinas), poli(propileno glicol), poli(siloxanos), poli(uretanos), poli(vinilálcoois), poli(vinilaminas), poli(vinilmetiléter), poli(vinilpirrolidona), silicones, ácidos ribonucléicos, ácido desoxinucléico, al7/42 buminas, anticorpos e fragmentos dos mesmos, proteína de plasma de sangue, colágenos, elastina, fascina, fibrina, queratinas, poliaspartato, poliglutamato, prolaminas, transferrinas, citocromos, flavoproteína, glicoproteínas, hemoproteínas, lipoproteínas, metaloproteínas, fitocromos, fosfoproteínas, opsinas, ágar, agarose, alginato, arabinanos, arabinogalactanos, carragenina, celulose, carbometil celulose, hidroxipropil metilcellulose e outros polímeros com base em carboidrato, quitosana, dextrana, dextrina, gelatina, ácido hialurônico e derivados, manana, pectinas, ramnogalacturonanos, amido, hidroxialquil alkyl, xilano, e copolímeros e derivados funcionalizados dos mesmos.

Intacto em relação aos meios de hidrogel esterilizados que não danificaram às ligações biodegradáveis lábeis e desse modo da mesma forma não danificaram às ligações estáveis e nenhuma outra reticulação detectável ocorreu durante a esterilização. A integridade do hidrogel pode ser medida pelas cinéticas de degradação in vitro de hidrogéis com base em PEG biodegradáveis esterilizados de acordo com a invenção e o nível ao qual é idêntico às cinéticas de degradação in vitro de hidrogel de PEG biodegradável não esterilizado. Além disso, tais hidrogéis de PEG biodegradáveis irradiados são ainda completamente degradáveis. Se reticuladores de intercadeia por formação de radical foi formada, as cinéticas de degradação teriam sido afetadas, e o processo de degradação de hidrogel de PEG seria mais lento, a curva de degradação seria nivelada e a degradação poderia não chegar a conclusão. Se cisões de cadeias ocorrerem, o processo de degradação de hidrogel de PEG seria acelerado. Preferivelmente, o termo idêntico em relação a duas cinéticas de degradação significa que o tempo necessário para obter uma degradação de X% não varia entre as duas cinéticas de degradação por mais do que 20%, preferivelmente por não mais do que 15%, e em que X está na faixa dentre 5 a 90.

Se o hidrogel com base em PEG biodegradável contiver grupos funcionais, estes grupos funcionais são preservados. Por exemplo, se os grupos funcionais são grupos amina, o teor de amina do hidrogel com base em PEG é o mesmo antes da esterilização e depois do processo de esterili8/42 zação. Preferivelmente, o termo mesmo neste contexto significa que o número de grupos funcionais em um hidrogel esterilizado de acordo com a presente invenção varia do número de grupos funcionais no hidrogel antes da esterilização por menos do que 30%, preferivelmente por menos do que 20%.

Para medir as cinéticas de degradação, alíquotas de produtos de degradação de cadeia principal solúveis podem ser separadas do hidrogel com base em PEG biodegradável insolúvel e podem ser quantificadas sem interferência de outros produtos de degradação solúveis liberados a partir do hidrogel. Um objetivo de hidrogel pode ser separado de água em excesso de tampão de osmolaridade fisiológica por sedimentação ou centrifugação. Centrifugação pode ser realizada de uma tal maneira que o sobrenadante fornece pelo menos 10% do volume do hidrogel inchado. Produtos de degradação de hidrogel solúveis permanecem no sobrenadante aquoso depois de tal etapa de sedimentação ou centrifugação, e produtos de degradação solúveis em água compreendendo uma ou mais porções de cadeia principal são detectáveis submetendo-se alíquotas de tal sobrenadante a métodos de separação adequados e/ou analíticos.

Alternativamente, produtos de degradação solúveis em água podem ser separados de produtos de degradação insolúveis em água por filtração através de filtros de 0,45 pm, depois de que os produtos de degradação solúveis em água podem ser encontrados no fluxo total. Produtos de degradação solúveis em água podem da mesma forma ser separados de produtos de degradação insolúveis em água por uma combinação de uma etapa de centrifugação e filtração.

Por exemplo, as porções de cadeia principal podem transportar grupos que exibem absorção de UV em comprimentos de onda onde outros produtos de degradação não exibem absorção de UV. Tais grupos de absorção seletiva de UV podem ser componentes estruturais da porção de cadeia principal tal como ligações de amida ou podem ser introduzidos na cadeia principal por ligação a seus grupos reativos funcionais por meios de sistemas de anel aromático tal como grupos indolila.

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Para aumentar propriedades físico-químicas ou farmacocinéticas de um fármaco in vivo, tal fármaco pode ser conjugado com um veículo, por exemplo, um hidrogel. Se o fármaco for transitoriamente ligado a um veículo e/ou um ligador, são geralmente nomeados como pró-fármacos ligados a veículo. De acordo com as definições fornecidas por IUPAC (como determinado sob http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem, acessado no dia 22 de julho de 2009), um pró-fármaco ligado a veículo é um pró-fármaco que contém uma ligação temporária de uma determinada substância ativa com um grupo veículo transitório que produz propriedades físico-químicas ou farmacocinéticas melhoradas e que pode ser facilmente removido in vivo, normalmente por uma divagem hidrolítica.

Os termos fármaco, molécula biologicamente ativa, porção biologicamente ativa, agente biologicamente ativo, agente ativo, e similar significa qualquer substância que pode afetar quaisquer propriedades físicas ou bioquímicas de um organismo biológico, incluindo porém não limitado a vírus, bactérias, fungos, plantas, animais, e humanos. Em particular, quando aqui usado, moléculas biologicamente ativas incluem qualquer substância pretendida para diagnóstico, cura, mitigação, tratamento, ou prevenção de doença em humanos ou outros animais, ou de outra maneira realçar cavidades físicas ou mentais sendo de humanos ou animais. Exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, porém não são limitados a, peptídeos, proteínas, enzimas, fármacos de molécula pequena (por exemplo, fármacos não peptídicos), tinturas, lipídios, nucleosídeos, oligonucleotídeos, polinucleotídeos, ácidos nucleico, células, vírus, lipossomas, micropartículas e micelas. Classes de agentes biologicamente ativos que são adequados para uso com a invenção incluem, porém não são limitadas a, hipnóticos e sedativos, energéticos psíquicos, tranquilizantes, fármacos respiratórios, anticonvulsivantes, relaxantes musculares, agentes anti-parkinson (antagnonistas de dopamina), analgésicos, anti-inflamatórios, antialérgicos, fármacos antiansiedade (ansiolíticos), supressores de apetite, fármacos antiobesidade, agentes antienxaqueca, contractantes musculares, anti-infecciosos (antibióticos, antivirais, antifúngicos, antibacterianos, vacinas) anti-inflamatório, anti10/42 artríticos, antimaláricos, antieméticos, anepiléticos, antidiabéticos, bronco dilatadores, citocinas, fatores de crescimento, agentes anticâncer, anticoagulantes, anti-hipertensivo, fármacos cardiovasculares, vasodilatadores, vasoconstritores, antiarrítmicos, antioxidantes, agentes antiasma, agentes ativos do sistema nervoso central, agentes hormonais incluindo preservativos, agentes de imunomodulação, simpatomiméticos, diuréticos, agentes de regulação de lipídio, agentes antiandrogênicos, antiparasitários, anticoagulantes, neoplásicos, antineoplásicos, hipoglicêmicos, agentes esteroides, agentes nutricionais e suplementos, suplementos de crescimento, agentes antienteri10 te, vacinas, anticorpos, agentes diagnósticos, agentes de contraste, e similares.

Porção biologicamente ativa de molécula pequena refere-se a qualquer das porções biologicamente ativas descritas acima com um peso molecular de 3000 Dalton ou menos.

Biodegradabilidade dos hidrogéis para o método de acordo com a presente invenção é obtida por introdução de ligações hidroliticamente degradantes.

O termo biodegradável dentro do contexto da presente invenção refere-se a ligações que são não enzimaticamente hidroliticamente de20 gradáveis sob condições fisiológicas (tampão aquoso em pH 7,4, 37°C) com meia-vida variando de uma hora a três meses, e que incluem, porém não é limitado a, aconitilas, acetais, anidridos carboxílicos, ésteres carboxílicos, iminas, hidrazonas, amidas de ácido maleâmico, orto ésteres, fosfamidas, fosfoésteres, ésteres de fosfosilila, ésteres de silila, ésteres sulfônicos, car25 bamatos aromáticos, combinações dos mesmos, e similares. Ligações biodegradáveis preferidas são ésteres carboxílicos, carbonatos, fosfoésteres e ésteres de ácido sulfônico e mais preferido são ésteres carboxílicos ou carbonatos. É entendido que para condições aceleradas de estudos in vitro como, por exemplo, pH 9, 37°C, tampão aquoso, pode ser usado para propósi30 tos práticos.

Desta maneira, ligações hidroliticamente degradáveis são, por exemplo, aconitilas, acetais, anidridos carboxílicos, ésteres carboxílicos, imi11/42 nas, hidrazonas, amidas ácido maleâmico, orto ésteres, fosfamidas, fosfoésteres, ésteres de fosfosilila, ésteres de silila, ésteres sulfônicos, carbamatos aromáticos, combinações dos mesmos, e similar. Ligações hidroliticamente degradáveis preferidas são ésteres carboxílicos, carbonatos, fosfoésteres e ésteres de ácido sulfônico e mais preferidos são ésteres carboxílicos ou carbonatos.

O termo interrompeu significa que uma ureia, amida, ou grupo carbamato ou éter seja inserido entre dois carbonos de uma cadeia de carbono.

Não-biodegradável (estável) refere-se a ligações que são ligações permanentes não cliváveis significando que a porção de conexão respectiva tem uma meia-vida de pelo menos seis meses sob condições fisiológicas (tampão aquoso em pH 7,4, 37°C).

Sistemas de distribuição de liberação prolongada referem-se a composições que liberam um fármaco no corpo de um paciente durante um período estendido de tempo.

Selante cirúrgico ou selante médico refere-se a colas com base em hidrogel e outros meios para fechar feridas, tal como incisões, iacerações, punções, abrasões, contusões ou avulsões.

Agentes hemostáticos referem-se a agentes usados para controlar sangramento de feridas.

Esponjas cirúrgicas significa esponjas usadas para absorver líquidos de um sítio cirúrgico.

Radiação gama é definida como radiação eletromagnética com energia de quantum de mais do que 200 keV, independente de sua fonte de radiação. Preferivelmente, a fonte de radiação é cobalto 60.

Estéril significa a ausência de quaisquer agentes transmissíveis detectáveis, incluindo bactérias, leveduras, fungos, vírus, esporos, em todos os estágios de desenvolvimento e formas.

Processo de esterilização refere-se a um procedimento para tornar um material estéril, por exemplo por irradiação, tal como irradiação com raios UV ou gama. Preferivelmente, irradiação com raios gama é usada.

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Solvente protetor descreve um composto químico usado para solvatar o hidrogel seco antes da esterilização para preservar a estrutura tridimensional e propriedades físico-químicas, e desse modo a integridade do hidrogel.

No seguindo a presente invenção é explicada em mais detalhes.

A invenção refere-se a um método para esterilizar hidrogéis insolúveis com base em PEG biodegradável através da irradiação na presença de um solvente protetor que mantém o hidrogel intacto. Hidrogéis insolúveis com base em PEG biodegradáveis esterilizados de acordo com esta invenção têm a mesma cinética de degradação e são completamente degradáveis, significando que nenhum dano às ligações biodegradáveis lábeis e desse modo da mesma forma nenhum dano às ligações estáveis ocorreu e nenhuma reticulação indesejada ocorreu, desse modo a integridade do hidrogel é preservada. Se um hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável esterilizado de acordo com a presente invenção contém grupos funcionais reativos, a funcionalidade destes grupos é da mesma forma preservada, isto é os grupos como tal são preservados. Tais grupos funcionais reativos podem servir como pontos de ligação para ligação direta ou indireta de um ligante de afinidade, grupo de quelação, um fármaco, pró-fármaco, prófármaco ligado a veículo ou similar. Exemplos não limitantes de tais grupos funcionais reativos incluem, porém não são limitados a, ácido carboxílico e derivados ativados, amino, maleimida, tiol, ácido sulfônico e derivados, carbonato e derivados, carbamato e derivados, hidroxila, aldeído, cetona, hidrazina, isocianato, isotiocianato, ácido fosfórico e derivados, ácido fosfônico e derivados, haloacetila, haletos de alquila, acriloila e outros aceptores de michael alfa-beta insaturados, agentes de arilação como fluoreto de aria, hidroxilãmina, dissulfetos como dissulfeto de piridiía, vinil sulfona, vinil cetona, diazoalcanos, compostos diazoacetila, epóxido, oxirano, e aziridina; preferivelmente ácido carboxílico e derivados ativados, amino, tiol, ácido sulfônico e derivados, carbonato e derivados, carbamato e derivados, hidroxila, aldeído, cetona, hidrazina, isocianato, isotiocianato, ácido fosfórico e derivados, ácido fosfônico e derivados, haloacetila, haletos de alquila, agentes de arila13/42 ção de acriloila como fluoreto de arila, hidroxilamina, dissulfetos como dissulfeto de piridila, vinil sulfona, vinil cetona, oxirano, e aziridina. Grupos funcionais reativos preferidos incluem tiol, maleimida, amino, ácido carboxílico e derivados, carbonato e derivados, carbamato e derivados, aldeído, e haloacetila, mais preferivelmente tiol, amino, ácido carboxílico e derivados, carbonato e derivados, carbamato e derivados, aldeído, e haloacetila. Preferivelmente, oa grupos funcionais reativos são grupos amino primários ou ácidos carboxílicos, mais preferido grupos amino primários.

Em uma modalidade, os grupos funcionais reativos do hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável são protegidos com grupos de proteção que são clivados depois da esterilização.

Hidrogéis insolúveis com base em PEG esterilizados de acordo com a presente invenção podem ser usados em qualquer aplicação em que esterilidade é benéfica ou requerida, tal como, por exemplo, engenharia de tecido, enchimento de pele, dispositivos intraoculares, implante médico, selantes cirúrgicos e esponjas, agentes hemostáticos, sistemas de distribuição de liberação prolongada, agentes de imageamento médicos e pró-fármacoveículos. O uso preferido é como sistemas de distribuição de liberação prolongada e pró-fármaco-veículo, mais preferido como pró-fármaco-veículo. O hidrogel tridimensional pré-formado é esterilizado por irradiação na presença de um solvente protetor ou em uma mistura de dois ou mais solventes protetores ou soluções aquosas dos mesmos e o hidrogel estéril pode subsequentemente opcionalmente ser carregado com, por exemplo, porções biologicamente ativas, como por exemplo peptídeos, proteínas ou moléculas pequenas. Tais porções biologicamente ativas podem ser ligadas ao hidrogel por meio de porções espaciais estáveis ou através de porções de ligador degradáveis.

Em uma modalidade alternativa, o hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável é primeiro carregado com porções biologicamente ativas de molécula pequena e em seguida esterilizado por irradiação na presença de um solvente protetor ou em uma mistura de dois ou mais solventes protetores ou soluções aquosas dos mesmos.

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Um hidrogel insolúvel com base em PEG adequado para esterilização de acordo com a presente invenção pode ser de várias formas e inclui, porém não é limitado a, hidrogéis amorfos, esféricos, lenticulares, planos (tal como em películas) ou tubulares. Em uma modalidade preferida, o hidrogel insolúvel com base em PEG consiste em micropartículas esféricas com um diâmetro de partícula de 1 a 1000 mícrons, preferivelmente 10 a 100 mícrons.

Um hidrogel insolúvel com base em PEG adequado para esterilização de acordo com a presente invenção é composto de porções de cadeia principal interconectadas por ligações degradáveis. Opcionalmente, as porções de cadeia principal podem ser reticuladas através de porções oligoméricas, poliméricas ou de reticulação de baixo peso molecular, que são ligadas com a cadeia principal através de ligações degradáveis e podem adicionalmente transportar ligações degradáveis. Opcionalmente, porções de cadeia principal podem transportar ligações permanentes a um ou mais do seguinte: ligantes, grupos de quelação, moléculas espaçadoras, grupos de bloqueio.

Em uma modalidade da presente invenção o hidrogel tem a seguinte composição.

O hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável é composto de porções de cadeia principal interconectadas por ligações hidroliticamente degradáveis. Preferivelmente, a porção de cadeia principal tem um peso molecular na faixa dentre 1 kDa a 20 kDa, mais preferivelmente dentre 1 kDa a 15 kDa.

Preferivelmente, no hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável, uma porção de cadeia principal é caracterizada por vários grupos funcionais, consistindo em grupos funcionais biodegradáveis interconectados e grupos funcionais reativos. Preferivelmente, a soma de grupos biodegradáveis interconectados e grupos funcionais reativos é igual a ou maior do que 16, preferivelmente 16-128, preferido 20-100, da mesma forma preferido 20-40, mais preferido 24-80, da mesma forma mais preferido 28-32 ainda mais preferido 30-60; muito mais preferido 30-32. É compreendido que além

15/42 dos grupos funcionais interconectados e o grupos funcionais reativos da mesma forma grupos protetores podem estar presentes.

Os grupos funcionais podem ser ligados a uma cadeia linear. Neste caso, os grupos funcionais podem ser espaçados regularmente ou irregularmente através da cadeia, ou alternativamente, a cadeia pode ser terminada por duas porções dendríticas, fornecendo para o total de grupos funcionais.

Preferencialmente, um porção de cadeia principal é caracterizada por ter um núcleo de ramificação, do qual pelo menos três cadeias poliméricas com base em PEG estendem. Tais núcleos de ramificação podem compreender em forma de ligação poli- ou oligoálcoois, preferivelmente pentaeritritol, tripentaeritritol, hexaglicerina, sacarose, sorbitol, frutose, manitol, glicose, celulose, amiloses, amidos, hidroxialquil amidos, polivinilálcoois, dextranos, hiualuronanos, ou núcleos de raificação podem compreender em forma de ligação poli- ou oligoaminas tais como ornitina, ácido diaminobutírico, trilisina, tetralisina, pentalisina, hexalisina, heptalisina, octalisina, nonalisina, decalisina, undecalisina, dodecalisina, tridecalisina, tetradecalisina, pentadecalisina ou oligolisinas, polietilenoiminas, polivinilaminas. Preferivelmente, o núcleo de ramificação pode compreender em forma de ligação poliou oligoaminas tais como trilisina, tetralisina, pentalisina, hexalisina, heptalisina, octalisina, nonalisina, decalisina, undecalisina, dodecalisina, tridecalisina, tetradecalisina, pentadecalisina ou oligolisinas, polietilenoiminas, polivinilaminas.

Preferivelmente, o núcleo de ramificação estende-se a três a dezesseis cadeias poliméricas com base em PEG, mais preferivelmente quatro a oito.

A soma de grupos funcionais interconectados e grupos funcionais reativos de uma porção de cadeia principal é igualmente dividida pelo número de cadeias poliméricas com base em PEG estendendo a partir do núcleo de ramificação. Se o número de cadeias poliméricas com base em PEG estendendo-se a partir do núcleo de ramificação não permitir uma distribuição igual, é preferido que o desvio do número médio da soma de gru16/42 pos funcionais interconectados e grupos funcionais reativos por cadeia polimérica com base em PEG seja mantido em um mínimo.

Mais preferivelmente, a soma de grupos funcionais interconectados e grupos funcionais reativos de um porção de cadeia principal é dividida igualmente pelo número de cadeias poliméricas com base em PEG estendose a partir do núcleo de ramificação. Por exemplo, se houver 32 grupos funcionais interconectados e grupos funcionais reativos, oito grupos podem ser fornecidos por cada uma das quatro cadeias poliméricas com base em PEG estendendo-se a partir do núcleo, preferivelmente por meios de porções dendríticas ligadas ao término de cada cadeia polimérica com base em PEG. Alternativamente, quatro grupos podem ser fornecidos por cada uma das oito cadeias poliméricas com base em PEG estendendo-se a partir do núcleo ou dois grupos por cada uma das dezesseis cadeias poliméricas com base em PEG.

Estruturas preferidas para cadeias poliméricas com base em PEG correspondentes estendendo-se a partir de um núcleo de ramificação adequado para porções de cadeia principal são derivados de PEG de multibraço como, por exemplo, detalhado na lista de produtos de JenKem Technology, USA (acessado por download de www.jenkemusa.com em 28 de julho de 2009), Derivados de 4ARM-PEG (núcleo de pentaeritritol), Derivados de 8ARM-PEG (núcleo de hexaglicerina) e Derivados de 8ARM-PEG (núcleo de tripentaeritritol). Mais preferidos são 4arm PEG Amina (núcleo de pentaeritritol) e 4arm PEG Carboxila (núcleo de pentaeritritol), 8arm PEG Amina (núcleo de hexaglicerina), 8arm PEG Carboxila (núcleo de hexaglicerina), 8arm PEG Amina (núcleo de tripentaeritritol) e 8arm PEG Carboxila (núcleo de tripentaeritritol). Pesos moleculares preferidos para tais derivados de PEG de multi-braço em uma porção de cadeia principal são 1 kDa a 20 kDa, mais preferivelmente 2,5 kDa a 15 kDa e ainda mais preferivelmente 5 kDa a 10 kDa. É entendido que estes reagentes estão presentes no hidrogel na forma ligada.

Tais grupos funcionais adicionais podem ser fornecidos por porções dendríticas. Preferivelmente, cada porção dendrítica tem um peso mo17/42 lecular na faixa dentre 0,4 kDa a 4 kDa, mais preferivelmente 0,4 kDa a 2 kDa. Preferivelmente, cada porção dendrítica tem pelo menos 3 ramificações e pelo menos 4 grupos funcionais reativos, e no máximo 63 ramificações e 64 grupos funcionais reativos, preferido pelo menos 7 ramficações e pelo menos 8 grupos funcionais reativos e no máximo 31 ramificações e 32 grupos funcionais reativos.

Exemplos para tais porções dendríticas são trilisina, tetralisina, pentalisina, hexalisina, heptalisina, octalisina, nonalisina, decalisina, undecalisina, dodecalisina, tridecalisina, tetradecalisina, pentadecalisina, hexadecalisina, heptadecalisina, octadecalisina, nonadecalisina na forma ligada. Exemplos para tais porções dendríticas preferidas compreendem trilisina, tetralisina, pentalisina, hexalisina, heptalisina, muito mais preferido trilisina, pentalisina ou heptalisina na forma ligada.

Mais preferivelmente, o hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável é caracterizado pelo fato de que a porção de cadeia principal tem um carbono quaternário da fórmula C(A-Hyp)₄, em que cada A é independentemente uma cadeia polimérica com base em poli(etileno glicoi) terminalmente ligada ao carbono de quarternary por um ligação covalente permanente e a extremidade distai da cadeia polimérica com base em PEG é covalentemente ligada a um porção dendrítica Hyp, cada porção dendrítica Hyp tendo pelo menos quatro grupos funcionais representando os grupos funcionais biodegradáveis interconectados e grupos funcionais reativos e ligações permanentes. Cada porção de cadeia principal contém pelo menos 16 grupos funcionais biodegradáveis interconectados e grupos funcionais reativos e ligações permanentes, preferivelmente 20 a 64 e mais preferivelmente 28 a 64 grupos funcionais biodegradáveis interconectados e grupos funcionais reativos e ligações permanentes.

Preferivelmente, cada A é independentemente selecionado da fórmula -(CH₂)ni(OCH₂CH₂)_nX-, em que n1 é 1 ou 2; n é um número inteiro na faixa dentre 5 a 50; e X é um grupo funcional covalentemente ligando A e HypPreferivelmente, A e Hyp sao covalentemente ligados por um

18/42 grupo funcional amida.

Preferivelmente, a porção dendrítica Hyp é um polipeptídeo hiper-ramificado. Preferivelmente, o polipeptídeo hiper-ramificado é compreendido de lisinas em forma de ligação, preferivelmente Hyp é undecalisinila ou heptalisinila. Preferivelmente, cada porção dendrítica Hyp tem um peso molecular na faixa dentre 0,4 kDa a 4 kDa. É entendido que um porção de cadeia principal C(A-Hyp)₄ pode consistir nas mesmas ou diferentes porções dendríticas Hyp e que cada Hyp pode ser escolhido independentemente. Cada porção Hyp consiste dentre 5 e 21 lisinas, preferivelmente de pelo menos 7 lisinas, isto é cada porção Hyp é compreendida dentre 5 e 32 lisinas na forma de ligação, preferivelmente de pelo menos 7 lisinas na forma de ligação.

Preferivelmente, C(A-Hyp)₄ tem um peso molecular na faixa dentre 1 kDa a 20 kDa, mais preferivelmente 1 kDa a 15 kDa e ainda mais preferivelmente 1 kDa a 10 kDa.

Biodegradabilidade dos hidrogéis de acordo com a presente invenção é obtida por introdução de ligações hidroliticamente degradáveis.

Preferivelmente, porções de cadeia principal podem ser ligados juntas através de porções de reticulador, cada porção de reticulador sendo terminada em pelo menos duas das ligações hidroliticamente degradáveis. Além dos ligações degradáveis de terminação, as porções de reticulador podem conter outras ligações biodegradáveis. Desse modo, cada extremidade da porção de reticulador ligada a um porção de cadeia principal compreende uma ligação hidroliticamente degradável, e ligações biodegradáveis adicionais podem opcionalmente estar presentes no porção de reticulador.

Desta maneira, o hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável compreende porções de cadeia principal que são interconectadas por ligações hidroliticamente degradáveis e em que as porções de cadeia principal são preferivelmente ligadas juntas através de porções de reticulador, cada porção de reticulador sendo terminada em pelo menos duas ligações hidroliticamente degradáveis.

O hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável pode con19/42 ter um ou mais tipos diferentes de porções de reticulador, preferivelmente um. A porção de reticulador pode ser uma molécula linear ou ramificada e preferivelmente é uma molécula linear. Em uma modalidade preferida da invenção, a porção de reticulador é conectada a porções de cadeia principal em pelo menos duas ligações biodegradáveis.

O termo ligação biodegradável descreve ligações que são não enzimaticamente hidroliticamente degradável sob condições fisiológicas (tampão aquoso em pH 7,4, 37°C) com meia-vida variando de uma hora a três meses, inclui, porém não é limitado a, aconitilas, acetais, anidridos car10 boxílicos, ésteres carboxílicos, iminas, hidrazonas, amidas ácido maleâmico, orto ésteres, fosfamidas, fosfoésteres, ésteres de fosfosilila, ésteres de silila, ésteres sulfônicos, carbamatos aromáticos, combinações dos mesmos, e similar. Ligações biodegradáveis preferidas são ésteres carboxílicos, carbonatos, fosfoésteres e ésteres carboxílicos de ácido sulfônico e mais preferido são ésteres carboxílicos ou carbonatos.

Preferivelmente, porções de reticulador têm um peso molecular na faixa dentre 60 Da a 5 kDa, mais preferivelmente, de 60 Da a 4 kDa, ainda mais preferivelmente de 60 Da a 3 kDa, ainda mais preferivelmente de 0,5 a 4 kDa, ainda mais preferivelmente de 1 kDa a 4 kDa e muito mais pre20 ferivelmente de 1 kDa a 3 kDa. Em uma modalidade, uma porção de reticulador consiste em um polímero.

Além das porções de reticulação oligoméricas ou poliméricas, porções de reticulação de peso molecular baixo podem ser usadas, especialmente quando porções de cadeia principal de peso molecular alto hidrofíli25 cas são usadas para a formação de hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável.

Preferivelmente, as porções de reticulador com base em poli(etileno glicol) são cadeias de hidrocarboneto compreendendo unidades de etileno glicol, opcionalmente compreendendo outros grupos funcionais, em que as porções de reticulador com base em poli(etileno glicol) compreendem pelo menos cada unidades de etileno glicol m, em que m é um número intei-ro na faixa dentre 3 a 100, preferivelmente 1 a 70 e preferivelmente dentre

20/42 a 70. Preferivelmente, as porções de reticulador com base em poli(etileno glicol) têm um peso molecular na faixa dentre 60 Da a 5 kDa e mais preferivelmente na faixa dentre 0,5 kDa a 5 kDa.

Preferivelmente, as porções de reticulador são com base em 5 PEGs, preferivelmente representadas por apenas uma cadeia molecular com base em PEG. Preferivelmente, as porções de reticulador com base em poli(etileno glicol) são cadeias de hidrocarboneto compreendendo uma ou mais unidades de glicol de etileno, opcionalmente compreendendo outros grupos funcionais químicos, em que as porções de reticulador com base em po10 li(etileno glicol) compreendem pelo menos cada unidades de etileno glicol m, em que m é um número inteiro na faixa dentre 1 a 100, preferivelmente 3 a 100, preferivelmente de 1 a 70 e ainda mais preferivelmente de 10 a 70. Preferivelmente, os reticuladores com base em poli(etileno glicol) têm um peso molecular de 60 Da a 5 kDa, preferivelmente dentre 0,5 kDa a 5 kDa.

Em uma modalidade preferida da presente invenção a porção de reticulador consiste em uma cadeia de PEG, que é simetricamente conectada através de ligações de éster a dois alfa, espaçadores dicarboxílicos omega-alifáticos fornecidos por porções de cadeia principal conectadas à porção dendrítica hiper-ramificada através de ligações de amida permanentes.

Os ácidos dicarboxílicos das porções espaçadoras conectados a um porção de cadeia principal e no outro lado é conectado a um porção de reticulação consistem em 3 a 12 átomos de carbono, preferivelmente entre 5 e 8 átomos de carbono e podem ser substituídos em um ou mais átomo de carbono. Substituintes preferidos são grupos alquila, grupos hidróxi ou gru25 pos amido ou grupos amino substituídos. Um ou mais dos grupos metileno do ácido dicarboxílico alifático podem opcionalmente ser substituídos por O

-------------ou NH ou N substituído por alquila. Alquila preferida é alquila linear ou ramificada com 1 a 6 átomos de carbono.

A taxa de hidrólise das ligações biodegradáveis entre porções de cadeia principal e porções de reticulador é influenciada ou determinada pelo número e tipo de átomos conectados adjacentes ao grupo carbóxi de éster de PEG. Por exemplo, selecionando-se ácido sucínico, adípico ou glutárico

21/42 para formação de éster de PEG é possível variar as meia-vida de degradação do hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável.

Em uma modalidade alternativa, porções multifuncionais são acopladas ao grupos funcionais reativos do hidrogel polimerizado para au5 mentar o número de grupos funcionais reativos, que, por exemplo, permite aumentar a carga de fármaco do hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável. Tais porções multifuncionais podem ser fornecidas por derivados adequadamente substituídos de lisina, dilisina, trilisina, tetralisina, pentalisina, hexalisina, heptalisina, ou oligolisina, PEI de peso molecular baixo em forma ligada. Preferivelmente, a porção multifuncional é compreendida de lisinas na forma de ligação. Opcionalmente, tal porção multifuncional podem ser protegida com grupos de proteção.

Outro hidrogel, tal de acordo com a invenção pode serfuncionalizado com um espaçador transportando o mesmo grupo funcional, por e15 xemplo, grupos aminos que podem ser introduzidos no hidrogel acoplandose um espaçador heterobifuncional, tal como COOH-PEG₆-NH-Fmoc adequadamente ativado, e removendo-se o grupo de proteção de Fmoc.

Uma porção de reticulador preferida é mostrada abaixo; linhas tracejadas indicam ligações biodegradáveis de interconexão a porções de cadeia principal:

em que q é um número inteiro dentre 5 a 50.

Preferivelmente, o hidrogel insolúvel com base em PEG é composto de porções de cadeia principal interconectadas por ligações hidroliti25 camente degradáveis.

Mais preferivelmente, as porções de cadeia principal compreendem um núcleo de ramificação da seguinte fórmula:

em que a linha tracejada indica ligação ao restante da porção de cadeia principal.

Mais preferivelmente, as porções de cadeia principal compreendem uma estrutura da seguinte fórmula:

22/42

em que n é um número inteiro dentre 5 a 50 e a linha tracejada indica ligação ao restante da porção de cadeia principal.

Preferivelmente, porção de cadeia principal compreende um 5 porção hiper-ramificada Hyp.

Mais preferivelmente, a porção de cadeia principal compreende uma porção hiper-ramificada Hyp da seguinte fórmula:

Η --|-~

NH em que as linhas tracejadas indicam ligação ao resto da molécula e átomos de carbono marcado com asteriscos indicam em uma configuração S de modalidade preferida. Entretanto, é entendido que porções hiper-ramificadas Hyp como mostrado acima pode da mesma forma estar na confirmação R ou pode ser racêmica.

Preferivelmente, as porções de cadeia principal são ligadas a pelo menos um espaçador da seguinte fórmula:

O O

em que um das linhas tracejadas indicam ligação à porção hiper-ramificada Hyp e a segunda linha tracejada indica ligação ao resto da molécula; e em que m é um número inteiro dentre 2 a 4.

Preferivelmente, as porções de cadeia principal são ligadas juntas através de porções de reticulador tendo a seguinte estrutura

23/42 em que q é um número inteiro de 3 a 100.

Mais preferivelmente, as porções de cadeia principal do hidrogel insolúvel com base em PEG são ligadas juntas através de porções da seguinte fórmula:

O O O O em que cada linha tracejada indica ligação a um porção de cadeia principal, respectivamente, e em que n é 45.

Da mesma forma mais preferivelmente as porções de cadeia principal do hidrogel insolúvel com base em PEG são ligadas juntas através de porções da seguinte fórmula:

O O

em que as linhas tracejadas indicam ligação a um porção de cadeia princi15 pal, respectivamente, e em que n é 22.

A presente invenção descreve a esterilização de hidrogéis insolúveis com base em PEG biodegradáveis através de irradiação na presença de solventes protetores. O hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável usado neste procedimento de esterilização é solvatado com o solvente protetor antes da irradiação e o solvente protetor permanece presente durante irradiação. Preferivelmente, o solvente protetor é selecionado a partir do grupo consistindo em ácido acético (solução aquosa, 0,01-1% (v/v)), acetonitrila, 4-acetilmorfolina, dimetilsulfóxido (DMSO), diclorometano (DCM) N,Ndimetilacetamida (DMA) /V,/V-dimetilformamida (DMF), 1,3-dimetil-225 imidazolidinona (DMI), dimetilcarbonato, dimetilformamida, 1-etiI-2pirrolidona, /V-etilacetamida, /V-etilformamida, formamida, 4-formilmorfolina, 1-formilpirrolidona, 1,3-dimetil-2-imidazolidinona, 1,3-Dimetil-3,4,5,6tetraidro-2(1/-/)-pirimidinona (DMPU), álcoois alquílicos, como metanol, etanol, propanol; formamida, hexametilfosforamida (HMPA), /V-metilacetamida, nicotinamida (solução aquosa, 0,1-5% (p/p)), piridoxina (solução aquosa,

24/42

0,1-5% (p/p)), N-metilformamida, ΝΜΡ, carbonato de 1,2-propileno, tetraidrofurano (THF), sulfolano, água, ou misturas dos mesmos.

Mais preferivelmente, o solvente protetor é selecionado a partir do grupo consistindo em ácido acético (solução aquosa, 0,01-1% (v/v)), ace5 tonitrila, dimetilsulfóxido (DMSO), diclorometano (DCM), dimetilacetamida (DMA), dimetilcarbonato, dimetilformamida, 1,3-dimetil-2-imidazolidinona, 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetraidro-2(1/7)-pirimidinona (DMPU), álcoois aiquílicos, como metanol, etanol, propanol; formamida, hexametilfosforamida (HMPA), nicotinamida (solução aquosa, 0,1-5% (p/p)), N-metilformamida, NMP, tetrai10 drofurano (THF), sulfolano, água, ou misturas dos mesmos.

Mais preferivelmente, o solvente protetor é selecionado a partir de 4-acetilmorfolina, DMA, DMF, DMI, DMPU, 1-etil-2-pirrolidona, Λ/etilacetamida, /V-etilformamida, 4-formilmorfolina, 1-formilpirrolidona, Nmetilacetamida, /V-metilformamida, DMSO ou NMP. Ainda mais preferivel15 mente o solvente protetor é selecionado a partir de DMSO, DMA, DMF, DMI ou NMP; ainda mais preferivelmente DMA, DMF, DMI ou NMP; da mesma forma ainda mais preferivelmente DMSO ou NMP, ainda mais preferivelmente NMP.

Opcionalmente, o solvente protetor é desgaseificado e pode op20 cionalmente conter outro, tal como um ou mais agentes de proteção, tal como sais, solúvel no solvente de proteção. Preferivelmente, o agente protetor é compreendido em uma concentração variando de 0,01 a 10%. É entendido que o solvente protetor pode da mesma forma ser uma mistura de dois ou mais solventes protetores ou diluições aquosas dos mesmos.

Agentes de proteção podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em C1-C10 alquil aminas lineares, ramificadas, ou cíclicas opcionalmente substituídas, ácidos C1-C10 alquil carboxílicos opcionalmente substituídos, ácidos C1-C10 alquil sulfônicos lineares ou ramificados opcionalmente substituídos, C1-C10 alquil tióis lineares ou ramificados opcional30 mente substituídos, ou carboidratos. Os agentes de proteção podem ser substituídos com grupos hidroxila ou substituídos ou interrompidos com urei-a; amida, ou grupos caibainato ou interrompidos com éter. Misturas de dois

25/42 ou mais agentes de proteção podem ser adicionadas ao solvente protetor.

Agentes de proteção preferidos são selecionados a partir de propilamina, butilamina, pentilamina, sec. butilamina, etanolamina, dietanolamina, serinol, trisidroximetil-aminometano, ácido acético, ácido fórmico, ácido ascórbico, glicinaamida, ácido piválico, ácido propanóico, ácido sucínico, ácido glutárico, ácido adípico, tioglicerina, ditiotreitol, mercaptoetanol, glutationa reduzida.

Para esterilização, o hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável é colocado em um recipiente adequado, que garante esterilidade depois do procedimento de esterilização. Desta maneira, o hidrogel é solvatado com o solvente protetor, e o recipiente adequado é fechado e submetido ao processo de esterilização. O recipiente adequado é selecionado para garantir esterilidade depois de fechar o recipiente e realizar o procedimento de esterilização. Altemativamente, o hidrogel insolúvel com base em PEG é primeiro solvatado com o solvente protetor e em seguida transferido no recipiente adequado, em que é esterilizado, e o recipiente adequado é em seguida fechado. Esterilização do hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável é realizada por irradiação, preferivelmente com gama-radiação, com uma dose de 5-100 kGy, preferivelmente 8-50 kGy, mais preferivelmente 20-40 kGy, tal como por exemplo 32-40 kGy e mais preferivelmente 20-30 kGy. Irradiação do hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável de acordo com a presente invenção pode ser realizada em uma temperatura variando de temperatura ambiente (25°C) a -80°C. Preferivelmente, irradiação é realizada em temperatura ambiente. Para obter temperaturas abaixo de temperatura ambiente, o recipiente adequado compreendendo o hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável a ser esterilizado pode ser armazenado em um ambiente resfriável ou pode ser cercado por uma substância de resfriamento, tal como gelo ou gelo seco.

Tal hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável esterilizado pode ser usado diretamente, por exemplo como um implante, ou pode ser também modificado, por exemplo acoplando-se porções biologicamente ativas ao hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável esterilizado.

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No último caso, processo é realizado sob condições estéreis, usando quími cas pré-esterilizadas e porções biologicamente ativas.

Em uma modalidade da presente invenção, porções biologicamente ativas de molécula pequena são acopladas aos grupos funcionais do hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável, resultando em um assim chamado hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável transportando porções biologicamente ativas de molécula pequena, que são em seguida esterilizadas por irradiação na presença de um solvente protetor. É óbvio à pessoa versada na técnica que apenas tais porções biologicamente ativas de molécula pequena são adequadas, que retém sua estrutura química durante gama irradiação.

Desta maneira, um aspecto preferido da presente invenção é um método de acordo com a presente invenção, em que o hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável é carregado com porções biologicamente ativas de molécula pequena.

Se um hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável é carregado com porções biologicamente ativas de molécula pequena e esterilizado por irradiação de acordo com o presente método inventivo em seguida a porção biologicamente ativa de molécula pequena deveria ser preservada.

O termo preservado preferivelmente neste contexto significa que pelo menos 90% da porção biologicamente ativa de molécula pequena liberada de tal hidrogel esterilizado está inalterado, como pode ser medido por métodos conhecidos à pessoa versada na técnica, tal como por espectrometria de massa, cromatografia líquida de ultra desempenho ou testes de atividade farmacológicos.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável seco é solvatado com 5-10 ml NMP/g de hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável seco e irradiado com raios gama com uma dose de 25 kGy, usando um recipiente fecha30 do para prevenir contaminações depois da esterilização. Para outro processamento, como acoplamento de porções biologicamente ativas ao hidrogel

-estorilizado, NMP é bocado para o solvente desejado usando seringas equi27/42 padas com filtros ou colunas adequadas. É óbvio à pessoa versada na técnica que todas as etapas depois da esterilização do hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável sejam realizadas sob condições assépticas, usando soluções estéreis.

Em uma modalidade ainda mais preferida da presente invenção, por 1 g de hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável seco 5-10 ml de NMP compreendendo 0,1% - 2% (v/v) de aminoetanol ou propilamina são usados para solvatar o hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável e tal hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável solvatado é subsequentemente irradiado com raios gama com uma dose de 32 kGy, usando um recipiente fechado para prevenir contaminações depois da esterilização. Para outro processamento, como acoplamento de porções biologicamente ativas ao hidrogel esterilizado, o NMP compreendendo 0,1% - 2% (v/v) de aminoetanol ou propilamina são trocados para o solvente desejado usando seringas equipadas com filtros ou colunas adequadas. É óbvio à pessoa versada na técnica que todas as etapas depois da esterilização do hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável sejam realizadas sob condições assépticas, usando soluções estéreis.

Um outro aspecto da presente invenção é um hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável esterilizado, especialmente carregado com porções biologicamente ativas de molécula pequena, obteníveis por quaisquer dos métodos da presente invenção.

Figura 1 mostra as cinéticas de degradação in vitro de 4a (Figura 1a), 4b (Figura 1b), 4c (Figura 1c), 4d (Figura 1d) e 4e (Figura 1e) depois da esterilização, cada qual juntamente com 3a (hidrogel não esterilizado; referência), em pH 10,3, 37°C, e4f (Figura 1f), 4g (Figura 1g), 4h (Figura 1 h), 4i (Figura 1i), 4j (Figura 1j) e 4k (Figura 1k) depois da esterilização, cada qual juntamente com 3b (hidrogel não esterilizado; referência), em pH 9,0, 37°C.

Figura 2 mostra as cinéticas de degradação in vitro de 6 depois da esterilização juntamente com 5 (hidrogel não esterilizado, referência), em pH 9,0, 37 °C.

Exemplosr ’

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Materiais e Métodos

Materiais

Amino 4-arm PEG5000 foi obtido a partir de JenKem Technology, Beijing, P., R. China).

Todas as outras químicas foram de Sigma-ALDRICH Chemie

GmbH, Taufkirchen, Germany.

Para contas de hidrogel, seringas equipadas com fritas de polipropileno foram usadas como vasos de reação ou por etapas de lavagem. Analíticos:

Espectrometria de massa de ionização por eletrovaporização (ESI-MS) foi realizada em um Thermo Fisher Orbitrap Discovery instrument equipada com Waters Acquity UPLC System.

Espectros de MS de produtos de PEG mostraram uma série de porções de (CH₂CH₂O)n devido a polidispersidade de materiais de partida de

PEG. Para interpretação mais fácil apenas um único sinal de m/z representativo é determinado nos exemplos.

Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) foi realizada usando um sistema Amersham Bioscience AEKTAbasic equipado com uma coluna Superdex75 5/150 GL (Amersham Bioscience/GE Healthcare), se não declarado de outra maneira. Um tampão aquoso 4/1 (v/v) (20 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCI, 0,005% de TWEEN 20, pH 7,4)/mistura de acetonitrila foi usada como fase móvel. Absorção foi detectada a 215 nm. Exemplo 1

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Reagente de cadeia principal 1g foi sintetizado a partir de Amino 4-arm PEG5000 1a de acordo com seguinte esquema:

Boc-Lys(Boc)-O H EDC, HOBt. DMSO, Colidina

PEG1250-NH₂

1a

HCI Dioxano/MeOH r PEG1250-Lys(Boc)₂ I -» PEG1250K-Lys(NH-).

1b

1c

Boc-Lys(Boc)-OH _r ·. _HC| Dioxano/MeOH r η Boc-Lys(Boc)-OH

PÊG1250-LysLys₂(Boc)₄ -»- PEG125O-LysLys₂(NH₂)₄ ->1d ^1e

HCI Dioxano/MeOH

PEG1250-LysLys₂Lys₄(Boc)_s

1f

PEG 1250-LysLys₂Lys₄(NH₂)₈

Para síntese de composto 1b, tetraamina 4-arm-PEG5000 1a 5 (MW aproximadamente 5200 g/mol, 5,20 g, 1,00 mmol, sal de HCI) foi dissolvida em 20 mL de DMSO (anidroso). Boc-Lys(Boc)-OH (2,17 g, 6,25 mmols) em 5 mL de DMSO (anidroso), EDC HCI (1,15 g, 6,00 mmols), HOBtH₂O (0,96 g, 6,25 mmols), e colidina (5,20 mL, 40 mmols) foram adicionados. A mistura reacional foi agitada durante 30 minutos em temperatura ambiente.

A mistura reacional foi diluída com 1200 mL de diclorometano e lavada com 600 mL de 0,1 N de H₂SO₄ (2 x), salmoura (1 x), 0,1 M de NaOH (2 x), e 1/1 (v/v) salmoura/água (4 x). Camadas aquosas foram reextraídas com 500 mL de DCM. Fases orgânicas foram secadas em Na₂SO₄, filtradas e evaporadas para produzir 6,3 g de produto cru 1b como óleo incolor. Composto 1b foi purificado por RP-HPLC.

Rendimento 3,85 g (59%) produto vítreo incolor 1b.

MS: m/z 1294,4 = [M+5H]⁵⁺ (calculado = 1294.6).

Composto 1c foi obtido agitando-se de 3,40 g de composto 1b 20 (0,521 mmol) em 5 mL de metanol e 9 mL de 4 N de HCI em dioxano em temperatura ambiente durante 15 minutos. Voláteis foram removidos em vácuo. O produto foi usado na próxima etapa sem outra purificação.

MS: m/z 1151.9 = [M+5H]⁵⁺ (calculado = 1162,0),Para síntese decomposto 1d, 3,26 g de composto 1c (0,54

30/42 mmol) foram dissolvidos em 15 mL de DMSO (anidroso). 2,99 g de BocLys(Boc)-OH (8,64 mmols) em 15 mL de DMSO (anidroso), 1,55 g EDC HCI (8,1 mmols), 1,24 g de HOBt-H₂O (8,1 mmols), e 5,62 mL de colidina (43 mmols) foram adicionados. A mistura reacional foi agitada durante 30 minu5 tos em temperatura ambiente.

Mistura reacional foi diluída com 800 mL de DCM e lavada com

400 mL de 0,1 N de H₂SO₄ (2 x), salmoura (1 x), 0,1 M de NaOH (2 x), e 1/1 (v/v) salmoura/água (4 x). Camadas aquosas foram re-extraídas com 800 mL de DCM. Fases orgânicas foram secadas com Na₂SO₄, filtradas e evapora10 das para produzir um produto cru vítreo.

Produto foi dissolvido em DCM e precipitado com dietiléter resfriado (-18°C). Este procedimento foi repetido duas vezes e o precipitado foi secado em vácuo.

Rendimento: 4,01 g (89%) produto vítreo incolor 1 d, que foi usa15 do na próxima etapa sem outra purificação.

MS: m/z 1405,4 = [M+6H]⁶⁺ (calculado = 1405,4).

Composto 1e foi obtido agitando-se uma solução do composto

1d (3,96 g, 0,47 mmol) em 7 mL de metanol e 20 mL de 4 N de HCI em dioxano em temperatura ambiente durante 15 minutos. Volátes foram removi20 dos em vácuo. O produto foi usado na próxima etapa sem outra purificação. MS: m/z 969,6 = [M+7H}⁷⁺ (calculado = 969,7).

Para a síntese do composto 1f, composto 1e (3,55 g, 0,48 mmol) foi dissolvido em 20 mL de DMSO (anidroso). Boc-Lys(Boc)-OH (5,32 g, 15,4 mmols) em 18,8 mL de DMSO (anidroso), EDC HCI (2,76 g, 14,4 mmols),

HOBtH₂O (2,20 g, 14,4 mmols), e 10,0 mL de colidina (76,8 mmols) foram adicionados. A mistura reacional foi agitada durante 60 minutos em temperatura ambiente.

A mistura reacional foi diluída com 800 mL de DCM e lavada com 400 mL de 0,1 N de H₂SO₄ (2 x), salmoura (1 x), 0,1 M de NaOH (2 x), e

1/1 (v/v) salmoura/água (4 x). Camadas aquosas foram reextraídas com 800 mL de DCM. Fases orgânicas foram secadas em Na₂SO₄, filtradas e evaporadas para produzi^produto cru 1f comu Oleo incolor

31/42

Produto foi dissolvido em DCM e precipitado com dietiléter resfriado (-18°C). Esta etapa foi repetida duas vezes e o precipitado foi secado em vácuo.

Rendimento 4,72 g (82%) de produto vítreo incolor 1f que foi u5 sado na próxima etapa sem outra purificação.

MS: m/z 1505,3 = [Μ+8Η]^θ+ (calculado = 1505,4).

Reagente de cadeia principal 1g foi obtido agitando-se uma solução do composto 1f (MW aproximadamente 12035 g/mol, 4,72 g, 0,39 mmol) em 20 mL de metanol e 40 mL de 4 N de HCI em dioxano em tempe10 ratura ambiente durante 30 minutos. Voláteis foram removidos em vácuo.

Rendimento 3,91 g (100%), reagente de cadeia principal de produto vítreo ig

MS: m/z 977,2 = [M+9H]⁹⁺ (calculado = 977,4).

Rotina sintética alternativa para 1 g

Para síntese do composto 1b, a uma suspensão de 45°C de 4Arm-PEG5000 tetraamina (1a) (50,0 g, 10,0 mmols) em 250 mL de /PrOH (anidroso), boc-Lys(boc)-OSu (26,6 g, 60,0 mmols) e DIEA (20,9 mL, 120 mmols) foram adicionados e a mistura foi agitada durante 30 minutos.

Subsequentemente, n-propilamina (2,48 mL, 30,0 mmols) foi a20 dicionada. Depois de 5 minutos a solução foi diluída com 1000 mL de MTBE e armazenada durante a noite a -20 °C sem agitação. Aproximadamente 500 mL do sobrenadante foram decantados e descartados. 300 mL de MTBE frio foram adicionados e depois de 1 minuto agitando o produto foi coletado por filtração através de um filtro de vidro e lavado com 500 mL de MTBE frio. O produto foi secado em vácuo durante 16 horas.

Rendimento: 65,6 g (74%) 1b como um sólido grumoso branco MS: m/z = 937,4 = [M+7H]⁷⁺(calculado = 937,6).

Composto 1c foi obtido agitando-se de composto 1b da etapa prévia (48,8 g, 7,44 mmols) em 156 mL de 2-propanol a 40 °C. Uma mistura de 196 mL de 2-propanol e 78,3 mL de acetilcloreto foi adicionada sob agitação dentro de 1-2 minutos. A solução foi agitada a 40°C durante 30 minutos ão. 100 mL de MTBE frio fo32/42 ram adicionados, a suspensão foi agitada durante 1 minuto e resfriada durante 1 hora a -30 °C. O produto foi coletado por filtração através de um filtro de vidro e lavado com 200 mL de MTBE frio. O produto foi secado em vácuo durante 16 horas.

Rendimento: 38,9 g (86%) 1c como um pó branco

MS: m/z = 960,1 [M+6H]⁶⁺ (calculado = 960,2).

Para síntese do composto 1d, a uma suspensão de 45°C de 1c da etapa prévia (19,0 g, 3,14 mmols) em 80 mL de 2-propanol foram adicionados boc-Lys(boc)-OSu (16,7 g, 37,7 mmols) e DIEA (13,1 mL, 75,4 mmols) e a mistura foi agitada durante 30 minutos a 45 °C. Subsequentemente, n-propilamina (1,56 mL, 18,9 mmols) foi adicionada. Depois de 5 minutos a solução foi precipitada com 600 mL de MTBE frio e centrifugada (3000 min'¹, 1 min) O precipitado foi secado em vácuo durante 1 hora e dissolvido em 400 mL de THF. 200 mL de éter dietílico foram adicionados e o produto foi resfriado a -30 °C durante 16 horas sem agitação. A suspensão foi filtrada através de um filtro de vidro e lavada com 300 mL MTBE frio. O produto foi secado em vácuo durante 16 horas.

Rendimento: 21,0 g (80%) 1d como um pó branco

MS: m/z 1405,4 = [M+6H]⁶⁺ (calculado = 1405,4).

Composto 1e foi obtido dissolvendo-se composto 1d da etapa prévia (15,6 g, 1,86 mmol) em 3 N de HCI em metanol (81 mL, 243 mmols) e agitando durante 90 minutos a 40 °C. 200 mL de MeOH e 700 mL de iPrOH foram adicionados e a mistura foi armazenada durante 2 horas a -30 °C. Para qualidade de cristalização, 100 mL de MTBE foram adicionados e a sus25 pensão foi armazenada a -30 °C durante a noite. 250 mL de MTBE frio foram adicionados, a suspensão foi agitada durante 1 minutos e filtrada através de ___um filtro de vidro e lavada com 100 mL de MTBE frio. O produto foi secado em vácuo.

Rendimento: 13,2 g (96%) 1e como um pó branco

MS: m/z = 679,1 = [M+10H]^w+ (calculado = 679,1).

Para a síntese do composto 1 f, a uma suspensão de 45°C de 1e ₇ (8,22 g, 1,12 hiii iuI) em 165 mL de 2-propanol foram adicio33/42 nados boc-Lys(boc)-OSu (11,9 g, 26,8 mmols) e DIEA (9,34 mL, 53,6 mmol) e a mistura foi agitada durante 30 minutos. Subsequentemente, npropilamina (1,47 mL, 17,9 mmols) foi adicionada. Depois de 5 minutos a solução foi resfriada a -18 °C durante 2 horas, em seguida 165 mL de MTBE frio foram adicionados, a suspensão foi agitada durante 1 minuto e filtrada através de um filtro de vidro. Subsequentemente, a massa filtrada foi lavada com 4x 200 mL de MTBE/iPrOH 4:1 frio e 1x 200 mL de MTBE frio. O produto foi secado em vácuo durante 16 horas.

Rendimento: 12,8 g, MW (90%) 1f como um sólido grumoso amarelo pálido

MS: m/z 1505,3 = [M+8H]^S+ (calculado = 1505,4).

Reagente de cadeia principal 1g foi obtido dissolvendo-se

4ArmPEG5kDa(-LysLys₂Lys4(boc)8)4 (1f) (15,5 g, 1,29 mmol) em 30 mL de MeOH e resfriando a 0 °C. 4 N de HCI em dioxano (120 mL, 480 mmols, resfriado a 0 °C) foi adicionado dentro de 3 minutos e o banho de gelo foi removido. Depois de 20 minutos, 3 N de HCI em metanol (200 mL, 600 mmols, resfriado a 0 °C) foi adicionado dentro de 15 minutos e a solução foi agitada durante 10 minutos em temperatura ambiente. A solução de produto foi precipitada com 480 mL de MTBE frio e centrifugada em 3000 rpm durante 1 minuto. O precipitado foi secado em vácuo durante 1 hora e redissolvida em 90 mL de MeOH, precipitado com 240 mL de MTBE frio e a suspensão foi novamente centrifugada em 3000 rpm durante 1 minuto. O produto foi secado em vácuo

Rendimento: 11,5 g (89%) como flocos amarelos pálidos.

MS: m/z = 1104,9 [Μ+8Η]^θ+ (calculado = 1104,9).

Exemplo 2

Síntese de reagentes de reticulador 2d

Reagente de reticulador 2d foi preparado a partir de éster mono benzílico de ácido adípico (English, Arthur R., e outro, Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347) e PEG2000 de acordo com o seguinte esquema:

34/42

ο ο

2c β

Uma solução de PEG2000 (2a) (11,0 g, 5,5 mmols) e meio-éster 5 de adipato benzílico (4,8 g, 20,6 mmols) em diclorometano (90,0 mL) foi resfriada a 0°C. Dicicloexilcarbodiimida (4,47 g, 21,7 mmols) foi adicionado seguido por uma quantidade catalítica de DMAP (5 mg) e a solução foi agitada e permitida alcançar temperatura ambiente durante a noite (12 h). O frasco foi armazenado a +4°C durante 5 horas. O sólido foi filtrado e o solvente completamente removido por destilação em vácuo. O resíduo foi dissolvido em 1000 mL 1/1 (v/v) de éter/acetato de etila e armazenado em temperatura ambiente durante 2 horas enquanto uma quantidade pequena de um sólido escamoso foi formado. O sólido foi removido por filtração através de uma almofada de Celite®. A solução foi armazenada em um frasco firmemente fechado a -30°C no congelador durante 12 horas até que a cristalisação foi concluída. O produto cristalino foi filtrado através de uma frita de vidro e lavado com éter resfriado (-30°C). A massa filtrada foi secada em vácuo. Rendimento: 11,6 g (86%) 2b como um sólido incolor. O produto foi usado sem outra purificação na próxima etapa.

MS: m/z 813,1 = [M+3H]³⁺ (calculado = 813,3)

Em uma autoclave de vidro de 500 mL éster bis-benzílico de á-cido PEG2000-bis-adípico 2b (13,3 g, 5,5 mmols) foi dissolvido em acetato

35/42 de etila (180 mL) e 10% de Paládio em carvão (0,4 g) foi adicionado. A solu ção foi hidrogenada em 6 bar, 40°C até que consumo de hidrogênio foi cessado (5-12 horas). Catalisador foi removido por filtração através de uma almofada de Celite® e o solvente foi evaporado em vácuo. Rendimento: 12,3 g (quantitativo) 2c como óleo amarelado. O produto foi usado sem outra purificação na próxima etapa.

MS: m/z 753,1 = [M+3H]³⁺ (calculado = 753,2)

Uma solução de meio éster de ácido PEG2000-bis-adípico 2c (9,43 g, 4,18 mmols), N-hidroxissucinimida (1,92 g, 16,7 mmols) e dicicloe10 xilcarbodiimida (3,44 g, 16,7 mmol) em 75 mL de DCM (anidroso) foi agitada durante noite em temperatura ambiente. A mistura reacional foi resfriada a 0 °C e precipitado foi filtrado. DCM foi evaporado e o resíduo foi recristalizado a partir de THF.

Rendimento: 8,73 g (85%) reagente de reticulador 2d como sóli15 do incolor.

MS: m/z 817,8 = [M+3H]³⁺ (calculado = 817,9).

Exemplo 3

Preparação de contas de hidrogel de baixa densidade contendo grupos amina livres 3a

Uma solução de 300 mg de 1g e 900 mg de 2d em 10,80 mL de

DMSO foi adicionada a uma solução de 100 mg de Arlacel P135 (Croda International PIc) em 80 mL de heptano. A mistura foi agitada a 700 rpm com um agitador de metal sobmedida durante 10 minutos em temperatura ambiente para formar uma suspensão. 1,1 mL Ν,Ν,Ν',Ν'-tertrametileno diamina (TMEDA) foi adicionado para efetuar polimerização. Depois de 2 horas, a velocidade do agitador foi reduzida em 400 rpm e a mistura foi agitada durante 16 horas adicional. 1,6 mL de ácido acético foi adicionado e em seguida depois de 10 minutos 50 mL de água foram adicionados. Depois de 5 minutos, o agitador foi parado e a fase aquosa foi drenada.

Para fracionamento de tamanho de conta, a suspensão de águahidrogel foi peneirada úmida em 75, 50, 40, 32 e 20 pm de peneiras de aço.

-Fraçõos de conta que foiarn retidas nas peneiras de 32, 40, e 50 pm foram

36/42 misturadas e lavadas 3 vezes com água, 10 vezes com etanol e secadas durante 16 horas a 10 Pa (0,1 mbar) para produzir 3a como um pó branco. Preparação de contas de hidrogel de densidade média contendo grupos amino livre 3b

Uma solução de 1200 mg de 1g e 3840 mg de 2d em 28,6 mL de DMSO foi adicionada a uma solução de 425 mg de Arlacel P135 (Croda International PIc) em 100 mL de heptano. A mistura foi agitada a 650 rpm com um agitador de metal sobmedida durante 10 minutos em temperatura ambiente para formar uma suspensão. 4,3 mL de Ν,Ν,Ν',Ν'-tertrametileno diamina (TMEDA) foi adicionado para efetuar polimerização. Depois de 2 horas, a velocidade do agitador foi reduzida em 400 rpm e a mistura foi agitada durante 16 horas adicionais. 6,6 mL de ácido acético foram adicionados e em seguida depois de 10 minutos 50 mL de água foram adicionados. Depois de 5 minutos, o agitador foi parado e a fase aquosa foi drenada.

Para fracionamento de tamanho de conta, a suspensão de águahidrogel foi peneirada úmida em peneiras de aço de 63, 50, 40, 32 e 20 pm. Frações de conta que foram retidas nas peneiras de 32, 40, e 50 pm foram misturadas e lavadas 3 vezes com água, 10 vezes com etanol e secadas durante 16 horas a 0,1 mbar para produzir 2,86 g de 3b como um pó branco. Preparação de contas de hidrogel de alta densidade contendo grupos amino livres 3c

Uma solução de 2400 mg 1g e 3600 mg de 2d em 24,0 mL de DMSO foi adicionada a uma solução de 425 mg de Arlacel P135 (Croda International PIc) em 110 mL de heptano. A mistura foi agitada em 850 rpm com um agitador de metal sobmedida durante 10 minutos em temperatura ambiente para formar uma suspensão. 8,6 mL Ν,Ν,Ν',Ν'-tertrametileno diamina (TMEDA) foi adicionado para efetuar polimerização. Depois de 2 horas, a velocidade do agitador foi reduzida em 400 rpm e a mistura foi agitada durante 16 horas adicionais. 13,2 mL de ácido acético foram adicionados e em seguida depois de 10 minutos 50 mL de água foram adicionados. Depois de 5 minutos, o agitador foi parado e a fase aquosa foi drenada.

Para fracionamento de tamanho de conta, a suspensão de água37/42 hidrogel foi peneirada úmida em peneiras de aço de 63, 50, 40, 32 e 20 pm. Frações de conta que foram retidas nas peneiras de 32, 40, e 50 pm foram misturadas e lavadas 3 vezes com água, 10 vezes com etanol e secadas durante 16 horas a 0,1 mbar para produzir 3,00 g de 3c como um pó branco. Exemplo 4

Preparação e gama irradiação subsequente de contas de hidrogel (4a, 4b,

4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k) mg de porções do hidrogel 3a secas em seringas equipadas com um filtro foram lavadas cinco vezes com os seguintes solventes protetores: NMP (4a), éter dietílico de dietileno glicol (DGDE) (4b), DMSO (4c), ou 0,1% de ácido acético em água (4d).

Igualmente porções de 20 mg do hidrogel seco 3b em seringas equipadas com um filtro foram lavadas cinco vezes com os seguintes solventes protetores: DMI (4f), DMA (4g), NMP + 0,5 vol% de 1-propilamina (4h), NMP + 0,5 vol% de 2-aminoetanol (etanolamina) (4i), NMP + 0,1 vol% de ácido acético (4j), ou NMP contendo 0,2 M de AcOH e 0,1 M de propilamina (4k).

Depois da última lavagem, as seringas foram fechadas, deixando as contas de hidrogel em uma forma inchada com um pequeno excesso de solvente protetor.

Adicionalmente uma amostra secada de hidrogel 3a foi irradiada no estado seco para produzir 4e.

Amostras foram gama irradiadas em temperatura ambiente com uma dose de 40 kGy (4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f) ou 32 kGy (4g, 4h, 4i, 4j, 4k) (fonte de irradiação: Co 60). Subsequentemente, as amostras foram lavadas cinco vezes com etanol e secadas durante 16 horas a 0,1 mbar.

Exemplo 5

Determinação de teor de amino

Fmoc-Asp(OiBu)-OSu (49 mg, 116 pmol) foi dissolvido em 0,9 mL de acetonitrila, e 0,5 mL de 50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,4 foi adicionado. A solução foi adicionada a 20 mg de hidrogel 3a e 4a em um reator de seringa e agitada durante 30 minutos em temperatura ambien38/42 te.

Subsequentemente, o hidrogel foi lavado 10x com acetonitrila/água 2:1 (v/v) + 0,1% de TFA e 10x com DMF.

O grupo Fmoc foi clivado agitando-se 3x 10 minutos com DMF/DBU 98/2 (v/v) e lavagem 10x com DMF/DBU 98/2 (v/v). Todas estas frações foram misturadas, diluídas com DMF e a quantidade de 9-metileno fluoreno foi determinada medindo-se absorção de UV em 295 nm. Um coeficiente de extinção de 9141 L mol'¹ cm'¹ foi usado.

Carregamento amino de 3a: 0,13 mmol/g

Carregamento amino de 4a depois da gama-irradiação: 0,12 mmol/g

Uso alternativo de Fmoc-Gly-OSu em vez de Fmoc-Asp(OiBu)OSu resulta nos mesmos valores de carregamento de amino.

Exemplo 6

Análise de degradação in vitro acelerada de contas de hidrogel

Cinéticas de degradação in vitro de contas de hidrogel 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j e 4k depois da esterilização e 3a e 3b (material de referência, nenhuma esterilização) sob condições aceleradas foram medidas incubando-se 5 mg de cada amostra em 0, 5 mL de 0,5 M de tampão de carbonato de sódio, pH 10,3 a 37 °C (3a, 4a, 4b, 4c, 4d e 4e). Alternativamente 0,5 mL de 0,5 M de tampão de borato de sódio pH 9,0 em condições de 37 °C foi usado para degradação in vitro acelerada (3b, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j e 4k). Alíquotas foram empregadas em intervalos de tempo e foram analisadas por SEC. Sinais de UV correspondendo a produtos de degradação solúvel em água liberados do hidrogel, compreendendo uma ou mais porções de cadeia principal, foram integradas e plotadas contra tempo de incubação (figura 1).

39/42

Amostra	Solvente	Tempo para a liberação dos primeiros 10% de porções de cadeia principal (a)	Tempo para a liberação de 95% das porções de cadeia principal (b)	Rela- ção a/b	Fig.
3a (pH 10,3)		3,1 h	4,9 h	1,58	1a
4a	NMP	3,1 h	4,9 h	1,58	1a
4b	DGDE	4,0 h	9,2 h	2,25	1b
4c	DMSO	3,5 h	5,7 h	1,63	1c
4d	0,1% AcOH	2,4 h	4,9 h	2,04	1d
4e	nenhum	1,2 h	55 h	4,58	1e
3b (pH 9,0)		62 h	95 h	1,53	1f
4f	DMI	59 h	95 h	1,61	1f
4h	DMA	60 h	92 h	1,53	ig
4g	NMP 0,5% propilamina	54 h	80 h	1,48	1h
4i	NMP 0,5% aminoetanol	54 h	80 h	1,48	1i
4j	NMP 0,1% AcOH	57 h	80 h	1,40	1j
4k	NMP0.1M	54 h	75 h	1,39	1k

AcOH, 0,2M pripilamina

Exemplo 7

Preparação de hidrogel carregado por paliperidona gama irradiado 6

Hidrogel carregado por paliperidona 5 foi preparado por modifi5 cação de hidrogel 3c com lisina e subsequente acoplamento de éster de paliperidona-glutarílico como descrito em pedido de patente internacional PC/EP2010/064874. Uma porção de 20 mg das contas de hidrogel secas 5 em uma seringa equipada com um filtro foi lavado cinco vezes com tampão de formulação (85 g/l de diidrato de trealose, 50 mM de sucinato/tampão de

Tris pH 5,0, 0,05% de Tween 20, 1 mM de EDTA). Depois da última etapa de

40/42 ma inchada com um pequeno excesso de solvente protetor. A amostra foi gama-irradiada em um leito de gelo seco com uma dose de 40 kGy (fonte de irradiação: Co 60). Subsequentemente, hidrogel 6 foi lavado cinco vezes com tampão de formulação, cinco vezes com água e cinco vezes com etanol e secado durante 16 horas a 0,1 mbar.

Exemplo 8

Degradação in vitro de 6 irradiado em pH 9 e 37°C

Cinéticas de degradação in vitro de hidrogel 6 (depois da esterilização) e referência 5 (nenhuma esterilização) sob condições aceleradas foi medida incubando-se 2 mg de cada amostra em 1,0 mL 0,5 M de tampão de borato de sódio pH 9,0 a 37 °C. Alíquotas foram empregadas em intervalos de tempo e analisadas por SEC. Sinais de UV (215 nm) correspondendo a produtos de degradação solúveis em água liberados do hidrogel, compreendendo uma ou mais porções de cadeia principal, foram integrados e plotados contra tempo de incubação. Apenas divergências pequenas em procedimento de degradação foram observadas (figura 2).

Exemplo 9

Qualidade de paliperidona liberada do hidrogel 6 irradiado mg de hidrogel 6 de ligador de paliperdiona foi incubado em

1,5 mL pH 7,4 tampão de fosfato (60 mM, 3 mM de EDTA, 0,01% de Tween20) a 37 °C. Depois de 4 d a qualidade de paliperidona liberada no sobrenadante foi checado por HPLC A Waters Acquity UPLC foi usado equipado com uma coluna Waters BEH C18, 50 x 2.1 RG de mm, 1,7 pm de tamanho de partícula. Solvente A: 0,05% de TFA em água, solvente B: 0,04% de TFA em acetonitrila. Um gradiente linear de 0 - 50% de B em 4 minutos foi empregado. Uma pureza de paliperidona de 95% foi encontrada (215 nm). Abreviações:

AcOEt acetato de etila

AcOH Ácido acético

Asp ácido aspártico

Boc T-butiloxicarbonila

DBU 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno

41/42

DCC	Dicicloexilcarbodiimida
DCM	Diclorometano
DGDE	éter dietílico de dietileno glicol
DMA	N,N-dimetilacetamida
DMAP	Dimetilamino-piridina
DMF	N,N-dimetilformamida
DMI	1,3-dimetil-2-imidazolidinona
DMSO	Dimetilsulfóxido
EDC	1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
ESI	ionização por eletrovaporização
eq EtOH	equivalente estequiométrico Etanol
Fmoc	Fluorenilmetoxicarbonila
HOBt	N-hidroxibenzotriazol
iPrOH	isopropanol
kGy LCMS	kilogray cromatografia líquida acoplada por espectrometria de massa
MeOH	metanol
MS	espectro de massa
MTBE	éter metil ferc-butílico
MW	massa molecular
NHS	N-hidróxi sucinimida
NMP	/V-metil-2-pirrolidinona
OtBu	terc-butilóxi
OSu	N-hidróxi sucinimidila
PEG	poli(etileno glicol)
PyBOP RP-HPLC	hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-óxi-tris-pirrolidino-fosfônio cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa
RT	temperatura ambiente
SEC	cromatografia de exclusão de tamanho
fBu	ter.-butila
TFA	ácido trifluoroacético

42/42

THF	Tetraidrofurano
TMEDA	N.N.N^N-tertrametileno diamina
UV	Ultravioleta
VIS	visual

1/3

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para esterilizar um hidrogel insolúvel com base em poli(etileno glicol) biodegradável compreendendo porções de cadeia principal que estão interconectadas por ligações hidroliticamente degradáveis,

5 caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) Fornecer o hidrogel;

(b) Solvatar o hidrogel em um solvente protetor ou em uma mistura de dois ou mais solventes protetores ou soluções aquosas do mesmo; e

10 (c) Submeter o hidrogel solvatado a gama radiação com uma dose de 5 a 100 kGy;

em que a porção da cadeia principal apresenta um carbono quaternário de fórmula C(A-Hyp)4, em que cada A é independentemente uma cadeia polimérica com base em poli(etilenoglicol) terminalmente ligado ao

15 carbono quaternário pela ligação covalente permanente e a porção distai da cadeia polimérica com base em PEG é covalentemente ligada a uma porção dendrítica Hyp, cada porção dendrítica Hyp consistindo em entre 5 e21 lisinas;

as porções da cadeia principal são ligadas através de porções de reticulação que consistem em uma cadeia de poli(etilenoglicol), que é

20 simetricamente concectada através de ligações de ésteres a dois espaçadores alfa, ômega-alifáticos dicarboxílicos fornecidos pelas porçõs da cadeia principal conectados à porção dendrítica hiperramificada através de ligações de amida permanentes;

o solvente protetor é A/-metil-2-pirrolidona (NMP), N, N 25 dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) ou 1,3-dimetil-2imidazolidinona (DMI) e pode opcionalmente conter um ou mais agentes protetores.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que esterilização é obtida com radiação gama com uma dose dentre 8

30 a 50 kGy.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o solvente protetor é NMP.

Petição 870180046495, de 30/05/2018, pág. 9/15

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4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o hidrogel é carregado com porções biologicamente ativas de molécula pequena.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, 5 caracterizado pelo fato de que o hidrogel consiste em mcropartículas esféricas com um diâmetro de partícula de 1 a 1000 mícrons.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as porções de cadeia principal do hidrogel têm cada qual um peso molecular na faixa dentre 1 kDa a 20 kDa.

10
7. Método de acordo com acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as porções de reticulador têm um peso molecular na faixa dentre 60 Da a 5 kDa.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as porções de cadeia principal do hidrogel

15 insolúvel com base em PEG biodegradável compreende como porção hiperramificada Hyp a seguinte fórmula:

4em que as linhas tracejadas indicam ligação ao resto da molécula e átomos de carbono marcados com asteriscos indicam configuração S.

20 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as porções de cadeia principal são ligadas a pelo menos um espaçador da seguinte fórmula:

Petição 870180046495, de 30/05/2018, pág. 10/15

3/3 em que um das linhas tracejadas indica ligação à porção hiper-ramificada Hyp e a segunda linha tracejada indica ligação ao resto da molécula; e em que m é um número inteiro dentre 2 a 4.

5 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
9, caracterizado pelo fato de que as porções de cadeia principal são ligadas juntas através de porções de reticulador compreendendo a seguinte estrutura em que
10 q é um número inteiro de 3 a 100.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

10, caracterizado pelo fato de que os agentes de proteção são selecionados a partir de propilamina, butilamina, pentilamina, sec. butilamina, etanolamina, dietanolamina, serinol, trisidroximetil-aminometano, ácido acético, ácido

15 fórmico, ácido ascórbico, glicinaamida, ácido piválico, ácido propanóico, ácido sucínico, ácido glutárico, ácido adípico, tioglicerina, ditiotreitol, mercaptoetanol e glutationa reduzido.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

11, caracterizado pelo fato de que o hidrogel insolúvel com base em PEG

20 biodegradável seco é solvatado com 5 a 10 ml NMP/g de hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável e irradiado com raios gama com uma dose de 25 kGy, utilizando um recipiente fechado.
13. Hidrogel insolúvel com base em PEG biodegradável esterilizado, caracterizado pelo fato de que é obtenível por qualquer um dos

25 métodos como definidos nas reivindicações 1 a 18.

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Liberação de cadeia principal [%]