KR20120123260A - 생분해성 하이드로겔의 살균 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 조사(irradiation)를 사용한 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔을 위한 종말 살균 공정과 관련이 있다. 보호 용매의 존재는 기능적으로 보존된 입체성 및 생리학적 특성을 무손상으로 유지하는 것을 보장한다.

Description

생분해성 하이드로겔의 살균 {Sterilization of biodegradable hydrogels}
생분해성의 PEG-계 하이드로겔은 조직 재생, 상처 봉합 및 약물 전달과 같은 다양한 의학 및 약학 적용의 관심사이다. 안전상의 이유로 어떤 적용에, 예를 들어 약물전달과 같은, PEG 하이드로겔의 생분해능력을 조작하기 위해, 이는 강력하게 선호된다. 생분해능력은 생체 내 수성의 환경에서 자발적 또는 효소에 의한 가수분해를 수행하는 에스테르 결합에 의해 하이드로겔에 도입될 수 있다.
피하 주입(implantation) 또는 외용제(topical application)를 위한 의료 장치 또는 약학 조성물의 살균은 판매되는 상품으로서 허가를 얻기 위해 의무이다. 열, 압력, 여과, 화학약품 또는 방사선 처리와 같은 다양한 살균방법은 제안되어 왔다. 불행히도, 이러한 살균 방법은 하이드로겔의 구조 및 속성의 유지와 양립될 수 없기 때문에 생분해성 PEG-하이드로겔에 적용될 수 없다. 따라서 생분해성 PEG-하이드로겔의 의료용도가 제한된다.
예를 들어, 주사가능한 용액은 바이알에서 고압살균에 의해 가장 자주 살균된다. 그러나 생분해성 결합은 높은 온도가 가해지는 경우 분해가 급격하게 가속화될 것이다. 따라서 생분해성의 PEG 하이드로겔의 고압살균으로 인해 치료제제로서 적합하지 않은 선분해(pre-degraded) 물질이 산출될 것이다.
대안적으로, 용액은 임의의 미생물 오염물을 제거하기 위해 공극 크기가 0.2㎛인 필터를 사용한 여과에 의해 살균될 수 있고, 이어서 상기 살균 용액을 무균 조건에서 바이알에 채운다. 그러나, 불용성의 가교된 PEG 하이드로겔의 경우, 이 물질은 가용성이 아니고, 미립자의 현탄액의 형태 또는 또 다른 입체 도형 물체 (예를 들어, 디스크 또는 튜브)로 존재할 수 있는데, 전형적으로는 0.2㎛ 보다 큰 사이즈이므로 상기 현탄액 또는 겔 물체는 여과에 의해 살균될 수 없다.
국제특허 출원 WO2003/035244는 살균 미립자의 제조를 가능하게 하는 폐쇄된-회로 장치를 기재하고 있다. 필터-살균된 화학성분은 시스템의 무균 환경 내에서 입자 형성 과정 동안 무균 환경을 유지하여, 살균 미립자를 얻는다.
이러한 무균 가공은, 출발 물질 수준에서 살균 여과 단계를 적용하고 상기 공정 동안 무균 조건을 유지하고, 종말 살균법이라 불리는 하이드로겔의 합성 후 살균에 대하여 특정 난점을 갖는다. 생산 공정에서 살균 단계가 더 일찍 이루어질수록, 우발적인 오염의 위험은 더 높아진다. 무균 가공은 또한 정교한 기술적 장치를 필요로 하므로 생산 비용이 증가한다. 따라서, 종말 살균 방법이 바람직하다.
UV 광선 및 감마선 처리에 의한 폴리머의 광분해는 라디칼 및/또는 이온을 생성하고 이는 종종 절단(cleavage) 및 가교를 유발한다. 산소의 부재에서 빛에 대한 노출이 드물기 때문에 산화 또한 일어나는데, 상황을 복잡하게 한다. 일반적으로, 이는 하이드로겔의 특성 및 상기 물질의 생분해에 대한 물질의 감수성을 변화시킨다 (Encyclopedia of Polymer Science and Technology, Mark Herman (Ed) Wiley, 2004, p. 263 ff 참조).
산화 에틸렌 가스 또는 과산화수소 함유 용액으로의 처리는 하이드로겔의 생분해 속성에 부정적 영향을 미치는 유사한 부반응을 일으킬 것이며, 상기 처리되지 않은 하이드로겔 물질과 비교하여 상기 처리된 하이드로겔의 분해 동역학의 현저한 편차를 초래할 것이다. 게다가, 독성이 있을 수 있고 바람직하지 않은 부-작용을 초래할 수 있는, 예컨대 산화에틸렌이 하이드로겔에 유의적인 양으로 잔존하지 않게 하도록 주의가 필요하다.
종말 살균과 관련된 난점을 피하기 위하여, 가교 및 살균 공정이 결합되었다. US 5,634,943는 감마선 처리에 의한 가교된 PEG 하이드로겔의 생성을 위한 방법을 열거하고 있다. 이 접근에서, 선형 PEG (MW 200 kDa)는 식염수(aqueous saline)에 용해되고, 탈 가스 및 Co60과 같은 감마선 공급원에 의하여 처리된다. 2.5 및 25 Mrads 사이(25 및 250 kGy 사이와 동등함)의 양은 라디칼 형성 및 사슬 사이 연결에 의하여 상기 PEG 사슬은 가교결합시키기에 충분하여, 불용성의 하이드로겔 수화물을 생성하였다. 상기 방사선 조사량이 또한 살균을 위해 충분히 높은 사실 때문에, 한 단계로 눈의 각막에 이식을 위해 적합한 물질이 얻어졌다.
유사하게, 미국 특허 출원 US20090030102는 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리아릴렌 옥사이드, 또는 폴리글리시딜 에테르를 기재로 하는, 전자 장치에 사용하기 위한 가교결합된 폴리머 겔 형성 방법을 기재하고 있는데, 이는 가교제 및 유기용매의 존재 하에 UV 및/또는 감마선 조사를 통해 가교결합된다.
약물의 전달과 같은, 다른 적용예에서, PEG 하이드로겔의 생분해능력은 바람직하다. US 6,537,569 은 감마선 조사를 통한 분해가능한 PEG 하이드로겔 생성의 과정을 열거하고 있다. 여기서, 생분해성 에스테르 연결을 통해 연결된 선형 PEG 사슬이 사용된다 (MW 10 kDa). 25 또는 30 kGy 조사는 사슬 사이 가교결합 및 불용성의 PEG 하이드로겔을 형성하였다.
또한, UV 또는 감마선이 조사된 PEG 하이드로겔에서 가교결합의 정도를 다양화하여 약물 방출능(drug release kinetics)을 조절하는 것이 시도되었다[문헌 (Minkova et al., J. Polym. Sci., Polym. Phys. 27 (1989) 621-642, Belcheva et al., Macromol. Symp. 103 (1996) 193, Rosiak and Yoshii, Nuclear Instruments and Methods in Physics research B 151 (1999) 56-64, Rosiak and Ulansky, Radiation Physics and Chemistry 55 (1999) 139-151, Dimitrov et al., Acta Pharmaceutica Turcica 46 (2004) 49-54) 참조]. 그럼에도 불구하고, 여기서 방사선 조사 과정 동안 약물의 존재는 약물의 포획(entrapment)을 제공하기 위해 요구된다. 그러나 폴리머 사슬에 대한 산화 또는 가수분해 또는 콘쥬게이션 같은 방사선 조사-유발 부반응의 가능성은 대부분의 치료개체(therapeutic entities)에 대한 이 접근을 비실용적이게 한다.
또한, 방사선 조사는 팽윤 및 거침(roughness)과 같은 PEG-계 하이드로겔의 다른 성질에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다[문헌 (Kanjickal et al, J Biomed Mater Res A. 2008 Jan 9 - Effects of sterilization on poly(ethylene glycol)hydrogels)참조].
다양한 PEG-계 하이드로겔은 문헌에서 기재되어 있다. 예를 들어, WO2006/003014는 프로드러그(prodrug)의 폴리머 하이드로겔 컨쥬게이트를 기재하고 있으며, 여기서 하이드로겔은 생분해성의 결합을 포함하는 가교결합제에 의해 서로 연결된 비-생분해성 백본 모이어티로 이루어진다.
유럽 특허 출원 EP09167026.5는 말기 버스트 유사(late-stage burst-like) 분해 동역학 특징을 가진 PEG-계 하이드로겔을 기재하고 있다.
PEG-모이어티로만 이루어진 하이드로겔은 유럽 특허 EP1019446에 기재되어 있다. 가수분해적으로 불안정한 결합은 하이드로겔에 위치하여 분해를 허용한다. 상기 특허는 또한 약물 전달 시스템으로서 상기 하이드로겔의 용도를 청구하고 있다.
미국 특허 5,514,379호는, 특히, 진단적 라벨(labels)을 단독 또는 치료 약물과 조합하여 포함할 수 있는 PEG-계 하이드로겔을 기재하고 있다. 유사하게, 미국 특허 6,602,952호는 생체 내 투여될 수 있는 생물학적 활성제를 포함하는 PEG-키토산 하이드로겔을 기재하고 있다. PCT 출원 WO2006/38462호는 카바메이트 가교결합된 폴리(산화 에틸렌)-포함 하이드로겔을 기재하고 있다. 이는 약물 전달 장치로서 또는 다른 생물의학 기능에 사용된다.
비록 상기 기재된 모든 하이드로겔은 살균이 요구되는 적용예에 사용되는 것을 의미할지라도, 이 문제는 그들의 산업상 이용가능성을 제한하는 이들 특허 또는 특허 출원에 의해 언급된 것은 아니다.
하이드로겔 살균의 단점 때문에, 불용성 가교결합된 생분해성 PEG-계 하이드로겔이 아직 그것 나름으로는 승인되지 않았지만, 단지 투여 후에 인시투로 하이드로겔을 형성하는 전구체 조성물로서는 승인되었다 (Corgel™ Biohydrogel, Focal® Technology). 따라서, 오염-민감성 적용예에서 충분히 하이드로겔을 이용하기 위하여, 비용-효율이고 보존하는 방안에서, 마지막으로 하이드로겔 살균 수단을 제공하는 것에 대해 요구가 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 적어도 부분적으로 상기 기재한 단점을 극복하고 요구를 충족시키기 위한 불용성의 생분해성 PEG-계 하이드로겔 살균을 위한 대안적인 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적은 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 상호 연결된 백본 모이어티를 포함하는, 생분해성의 폴리(에틸렌 글리콜)계 불용성 하이드로겔의 살균하는 방법으로서,
(a) 하이드로겔을 제공하는 단계;
(b) 보호용매(protective solvent) 또는 2종 이상의 보호용매의 혼합물 또는 이의 수용액에서, 상기 하이드로겔을 용매화하는 단계;
(c) 상기 용매화된 하이드로겔에 감마선 처리하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 달성된다.
이미-형성된(pre-formed) 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은, 감마선 처리가 보호용매, 바람직하게는 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP), DMA, DMF, 또는 DMI, 더욱 바람직하게는 NMP의 존재에서 수행된다면, 감마선 처리에 의해, 불안정한(labile) 생분해성 결합에 손상을 가하지 않고, 따라서 안정한 결합에도 손상을 가하지 않고 가교결합을 초래함이 없이, 살균될 수 있다는 것이 놀랍게도 이제 밝혀졌다.
특히, 본 발명에 따른 상기 방사선 조사된 불용성의 생분해성 PEG 하이드로겔의 시험관 내 분해 동역학은 비-조사된(irradiation) PEG 하이드로겔의 시험관 내 분해 동역학과 동일하였다. 더욱이, 상기 조사된(irradiation) 불용성 생분해성 PEG 하이드로겔은 여전히 완전히 분해될 수 있었다. 라디칼 형성에 의한 사슬간 가교가 형성되었다면, 상기 분해 동역학은 영향을 받았을 것이며, 불용성의 생분해성 PEG 하이드로겔 분해 과정은 더 늦어지고, 분해 곡선은 평평해지고 분해는 완성에 이르지 못했을 것이다.
도 1은 살균 후 4a (도 1a), 4b (도 1b), 4c (도 1c), 4d (도 1d) 및 4e (도1e)의 분해 역학을 각각 3a (살균하지 않은 하이드로겔; "대조군")와 함께 pH 10.3, 37°C에서 나타낸 것이며, 살균 후 4f (도 1f), 4g (도 1g), 4h (도 1h), 4i (도 1i), 4j (도 1j) 및 4k (도 1k)의 분해 역학을 각각 3b (살균하지 않은 하이드로겔: "대조군")와 함께 pH 9.0, 37°C에서 나타낸 것이다.
도 2는 살균 후 6의 시험관내 분해 역학을 5 (살균하지 않은 하이드로겔, "대조군")와 함께 pH 9.0, 37 °C에서 나타낸 것이다.
불용성의 생분해성 PEG-계 하이드로겔이 작용기를 포함하는 경우, 상기 기는 살균 후에도 여전히 기능적이다.
본 발명에 사용된 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다.
하이드로겔은 3차원으로서, 많은 양의 물을 흡수할 수 있는 친수성이거나 친양쪽성의 폴리머 망으로 정의될 수 있다. 상기 망은 단일 중합체 또는 공중합체로 구성되며, 공유 화학적 또는 물리적(이온, 소수성 상호작용, 얽힘) 가교결합의 존재로 불용성이다. 상기 가교결합은 망 구조 및 물리적 온전성(integrity)을 제공한다.
본 명세서에서 이해되는 바와 같이 용어 "PEG-계 하이드로겔" ("PEG 하이드로겔")은 하이드로겔에서 PEG 사슬의 질량 비율이, 하이드로겔의 총 중량을 기준으로 10중량% 이상, 바람직하게는 25중량% 이상인 것을 의미한다. 잔여는 다른 폴리머 및 다른 모이어티로 구성될 수 있다.
용어 폴리머는 선형, 고리형, 분지형, 가교 또는 수지상 방법으로 또는 이들의 조합에 의한 화학적 결합으로 연결된 반복되는 구조적 단위를 포함하는 합성 또는 생물학적 기원 또는 양자의 조합일 수 있는 분자를 나타낸다. 예를 들어 폴리(아크릴 산), 폴리(아크릴레이트), 폴리(아크릴아미드), 폴리(알킬옥시) 폴리머, 폴리(아미드), 폴리(아미도아민), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(아스파트아미드), 폴리(부티르산), 폴리(카프로락톤), 폴리(카보네이트), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(디메틸아크릴아마이드), 폴리(에스테르), 폴리(에틸렌), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌옥사이드), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(글리콜 산), 폴리(하이드록시에틸 아크릴레이트), 폴리(하이드록시에틸옥사졸린), 폴리(하이드록시프로필메타크릴아미드), 폴리(하이드록시프로필메타크릴레이트), 폴리(하이드록시프로필옥사졸린), 폴리(이미노카보네이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(락트산), 폴리(락틱-co-글리콜산), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(메틸옥사졸린), 폴리(프로필렌 푸마르산), 폴리(오르가노포스파젠), 폴리(오르토에스테르), 폴리(옥사졸린), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(실록산), 폴리(우레탄), 폴리(비닐알코올), 폴리(비닐아민), 폴리(비닐메틸에테르), 폴리(비닐피롤리돈), 실리콘, 리보핵산, 데스옥시핵산(desoxynucleic acid), 알부민, 항체 및 이의 조각(fragments), 혈장단백질, 콜라겐, 엘라스틴, 파신(fascin), 피브린, 케라틴, 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트, 프롤라민, 트랜스페린, 시토크롬, 황색단백질(flavoprotein), 당단백질, 헴단백질, 지질단백질, 금속단백질, 피토크롬, 인단백질, 옵신, 아가, 아가로즈, 알지네이트, 아라비난, 아라비노갈락탄, 카라기난, 셀룰로즈, 카보메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스 및 기타 카보하이드레이트-계 폴리머, 키토산, 덱스트란, 덱스트린, 젤라틴, 히알루론산 및 유도체, 만난, 펙틴, 람노갈락투로난, 전분, 히드록시알킬 전분, 크실란, 및 공중합체 및 이들의 기능화된 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
살균된 하이드로겔과 관련하여 "무손상한"은 상기 불안정한 생분해성 결합에 해를 입지 않고, 따라서 안정한 결합에도 해를 입지 않는 것, 그리고 살균 동안에 더 감지가능한 가교가 일어나지 않는 것을 의미한다. 하이드로겔의 "무손상"은 본 발명에 따라 살균된 생분해성 PEG-계 하이드로겔의 시험관 내 분해 동역학에 의해 측정될 수 있고 이에 대한 레벨은 비-살균 생분해성 PEG 하이드로겔의 시험관 내 분해 동역학과 동일하다. 더욱이, 이런 방사선 처리된 생분해성 PEG 하이드로겔은 여전히 완벽히 분해가능하다. 라디칼 형성에 의한 측쇄 가교가 형성되었다면, 분해 역학은 영향을 받았을 것이고, 상기 PEG 하이드로겔 분해 과정은 더 느려졌을 것이고, 분해 곡선은 평평해졌을 것이고, 분해는 완성에 이르지 못했을 것이다. 사슬의 시전(cisions)이 발생한다면, PEG 하이드로겔 분해 과정은 가속화될 것이다. 바람직하게는, 두가지 분해 동역학과 관계된 용어 "동일한"은 X %의 분해를 달성하기 위해 소요된 시간이 두 분해 동역학 사이에 20% 초과로 다르지 않다는 것을 의미하고, 바람직하게는 15%이하이고, 여기서 X는 5 내지 90의 범위에 있다.
생분해성 PEG-계 하이드로겔이 작용기를 포함한다면, 이들 작용기는 보존될 것이다. 예를 들어, 작용기가 아민기인 경우, PEG-계 하이드로겔의 아민 함량은 살균 전과 살균 공정 후에서 동일하다. 바람직하게는, 본 문맥에서의 용어 “동일(same)”은 본 발명에 따라 살균된 하이드로겔의 작용기의 수가 살균 전 하이드로겔의 작용기의 수와 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만으로 다른 것을 의미한다.
분해 동역학을 측정하기 위해, 가용성의 백본 분해 결과물의 시료는, 불용성의 생분해성 PEG 계 하이드로겔로부터 분리될 수 있고, 하이드로겔로부터 방출된 다른 가용성 분해 결과물로부터 방해 없이 정량화될 수 있다. 하이드로겔 object는 침강법 또는 원심분리에 의해 생리적 삼투질 농도의 버퍼 과도한 물로부터(excess water of buffer of physiological osmolality) 분리될 수 있다. 원심분리는 상청액이 팽윤된 하이드로겔 부피의 적어도 10%를 대비하는 그런 방식으로 수행될 수 있다. 상기 침강법 또는 원심분리 단계 후에 가용성 하이드로겔 분해 결과물은 수성 상청액에 남아 있고, 하나 이상의 백본 모이어티를 포함하는 수용성의 분해 결과물은, 상기 상청액의 시료를 적당한 분리 및/또는 분석 방법을 통해 검출 가능하다.
대안적으로, 수용성 분해 결과물은 0.45㎛ 필터를 통한 여과에 의해 수불용성의 분해 결과물로부터 분리될 수 있고, 그 후에 수용성의 분해 결과물은 관류(flow-through)에서 발견될 수 있다. 수용성의 분해 생산물은 원심분리 및 여과 단계의 조합에 의해 수불용성의 분해 결과물로부터 또한 분리될 수 있다.
예를 들어, 상기 백본 모이어티는 다른 분해 결과물이 UV 흡수를 보이지 않는 파장에서 UV 흡수를 보이는 (기)그룹을 지닐 수 있다. 이러한 선택적인 UV-흡수 (기)그룹은, 아미드결합과 같은 백본 모이어티의 구조적 구성요소일 수 있거나 인돌일 기와 같은 방향족 고리 시스템을 통해 반응성 작용기에 결합함으로써 백본에 도입될 수 있다.
약물의 물리화학적 또는 약력학적 성질을 생체 내에서 향상시키기 위해, 상기 약물은 담체, 예를 들어, 하이드로겔과 컨쥬게이트될 수 있다. 약물이 일시적으로 담체 및/또는 연결제와 결합된다면, 상기 시스템은 일반적으로 담체-연결된 프로드러그(carrier-linked prodrugs)로 지칭될 것이다. lUPAC가 제공한 정의에 의하면 (http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem 에서 제공, 2009. 7. 22,자 접속), 담체-연결된 프로드러그는 일시적인 담체 그룹과 주어진 활성 물질의 임시적인 연결을 포함하는 프로드러그이다. 이는 향상된 물리화학적 또는 약력학적 성질을 제공하고, 이는 생체 내에서 쉽게 제거될 수 있다. 보통, 가수분해에 의한다.
용어 "약물," "생물학적 활성 분자" "생물학적 활성 모이어티," "생물학적 활성제," "활성제,” 및 이와 유사한 것들은 본 발명의 생물 유기체의 어떠한 물리적 생화학적 성질에 영향을 미칠 수 있는 모든 물질을 의미하고, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 식물, 동물 및 인간을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성 분자는 인간 또는 다른 동물의 질병의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방 또는 인간 또는 동물의 육체적 또는 정신적 복지를 향상시키기 위해 의도되는 모든 물질을 포함한다. 생물학적 활성 분자의 예는 펩티드, 단백질, 효소, 저분자 의약품 (예를 들어, 비펩티드성 약물), 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 세포, 바이러스, 리포솜, 미립자 및 미셀을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원발명에 적합한 생물학적 활성제 분류는 수면제 및 진정제, 정신자극제, 정신안정제, 호흡기 약, 항경련제, 근이완제, 항파킨슨제 (도파민 길항제), 진통제, 항염증제, 항-알러지, 항불안제 (불안 완화제), 식욕 억제제 (appetite suppressants), 항비만제, 항편두통제, 근육 수축제(muscle contractants), 항감염제(항생제, 항바이러스제, 항진균제, 항균제, 백신) 항염증제(anti-inflammatory), 항관절염제, 말라리아예방약, 진토제, 항간질약, 항-당뇨제, 기관지 확장제, 사이토카인, 성장인자, 항암제, 항응혈제, 항고혈압제, 심혈관계통약물, 혈관확장(vasodilating), 혈관수축(vasoconstricting), 항부정맥제, 항산화제, 항천식제, 중추신경계 활성제(central nervous system-active agents), 피임제를 포함하는 호르몬제, 면역조절제, 교감신경작용약, 이뇨제, 지질강하제, 항남성호르몬제, 항기생충제, 항응고제, neoplastics, 항종양제, 혈당강하제(hypoglycemic), 스테로이드제, 영양제(nutritional agents) 및 보충제, 성장 보충제(growth supplements), 항장염제(antienteritis agents), 백신, 항체, 진단제, 조영제(contrasting agents), 및 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. .
“저분자 생물학적 활성 모이어티"는 3000 달톤 이하의 분자량을 가진 상기 기재된 모든 생물학적 활성 모이어티를 나타낸다.
본 발명에 따른 방법을 위한 상기 하이드로겔의 생분해능력은 가수분해로 분해가능한 결합의 도입에 의해 달성된다.
본 발명의 문맥 내에서의 용어 “생분해성”은 반감기 범위가 1시간 내지 3개월인 생리적인 조건(수성완충액, pH 7.4, 37℃)에서, 비-효소적으로 가수분해적으로 분해가능한 연결을 나타내며, 이는 아코니틸(aconityls), 아세탈, 카르복실 무수물, 카르복실산에스테르, 이민(imines), 하이드라존, 말레암산 아미드(maleamic acid amides), 오르토에스테르, 포스파미드, 포스포에스테르, 포스포실릴에스테르, 실릴에스테르, 술폰에스테르(sulfonic esters), 방향족 카바메이트, 이들의 조합, 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 생분해성 연결은 카르복실릭 에스테르, 카보네이트, 포스포에스테르 및 술폰산 에스테르이고 가장 바람직하게는 카르복실릭 에스테르 또는 카보네이트이다. 시험관 내 연구를 위한 가속화된 유사 조건은, 예를 들어, pH 9, 37℃, 수성완충액, 실용적인 목적을 위해 사용될 수 있다고 이해된다.
따라서, 가수분해적으로 분해가능한 결합은, 예를 들어, 아코니틸, 아세탈, 카르복실 무수물, 카르복실산에스테르, 이민, 하이드라존, 말레암산 아미드, 오르토에스테르, 포스파미드, 포스포에스테르, 포스포실릴에스테르, 실릴에스테르, 술폰에스테르(sulfonic esters), 방향족 카바메이트, 이들의 조합, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 바람직한 가수분해적으로 분해가능한 결합은 카르복실 에스테르, 카보네이트, 포스포에스테르 및 술폰산 에스테르이고, 가장 바람직하게는 카르복실산에스테르 또는 카보네이트이다.
용어 "개재된"은 요소, 아미드, 또는 카바메이트기 또는 에테르가 탄소사슬의 두 탄소 사이에 삽입된 것을 의미한다.
“비-생분해성” (안정)은 비-분열(cleavable) 영구적인 연결을 나타내며, 이는 생리적 조건에서 (수성완충액, pH 7.4, 37℃) 각각의 연결 모이어티가 6 개월 이상의 반감기를 갖는 것을 의미한다.
“지속적인 방출 전달 시스템”은 환자의 신체 내 장시간에 걸쳐 약물을 방출하는 조성물을 나타낸다.
“수술 실란트” 또는 “의료 실란트”는 절개, 열상, 천자, 찰과상, 타박상 또는 찢겨짐(avulsions)과 같은 상처를 봉합하는 하이드로겔-계 접착제 및 기타 수단을 나타낸다.
“지혈제”는 상처 지혈에 사용되는 제제를 나타낸다.
“수술용 스펀지”는 수술 부위의 액체를 흡수하는 데 사용되는 스폰지를 의미한다.
감마선 조사는 200 keV 이상의 양자 에너지를 갖는 전자기 방사선으로 정의된다. 바람직하게, 방사선원은 코발트 60이다.
“살균"은 모든 발생단계 및 형태의 박테리아, 효모, 곰팡이, 바이러스, 포자를 포함하여 임의의 감지 가능한 전염성 매개물의 부재를 의미한다. .
“살균 공정”은 물질을 살균하게 하는 과정을 지칭한다. 예를 들어 UV- 또는 감마선으로 조사와 같은 조사를 나타낸다. 바람직하게, 감마선 조사가 사용된다.
"보호용매"는 살균 전 건조 하이드로겔을 용매화하는데 사용되는, 3차원 구조 및 물리화학적 속성을 보전하고, 따라서 상기 하이드로겔의 무손상을 보전하기 위한, 화학적 화합물을 말한다.
하기에서, 본원발명은 더 상세히 설명된다.
본 발명은 하이드로겔 무손상을 유지하는 보호용매의 존재하에 빛을 조사하여 생분해성의 PEG-계 불용성 하이드로겔을 살균하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 살균된 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 동일한 분해 동역학을 가지고 충분히 분해가능한데, 이것은 불안정한 생분해성 결합에 손상이 없고 따라서 안정한 결합에도 손상이 없고, 바람직하지 않은 가교 결합이 발생하지 않아, 따라서 하이드로겔의 무손상이 유지된다는 뜻이다. 본 발명에 따라 살균된 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔이 반응성 작용기를 포함한다면, 이들 기의 기능성은 또한 유지된다. 즉, 상기 기는 보존된다. 이러한 반응성 작용기는 친화성 리간드, 킬레이팅 그룹, 약물, 프로드러그, 담체-연결된 프로드러그 또는 이와 유사한 것의 직접적 또는 간접적 연결을 위한 부착 포인트의 역할을 할 수 있다. 상기 반응성 작용기의 비제한적인 예는 카르복시산 및 활성화된 유도체, 아미노, 말레이미드, 티올, 술폰 산 및 유도체, 카보네이트 및 유도체, 카바메이트 및 유도체, 히드록실, 알데히드, 케톤, 히드라진, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 인산 및 유도체, 포스폰 산 및 유도체, 할로아세틸(haloacetyl), 알킬 할라이드, 아크릴로일 및 기타 알파-베타 불포화 마이클 수용체, 아릴 플루오라이드와 같은 아릴화제, 히드록실아민, 피리딜 디설파이드와 같은 디설파이드, 비닐 술폰, 비닐 케톤, 디아조알칸, 디아조아세틸 화합물, 에폭사이드, 옥시란, 및 아지리딘을 포함하나 이에 제한되지 않으며; 바람직하게는 카르복시산 및 활성화된 유도체, 아미노, 티올, 술폰산 및 유도체, 카보네이트 및 유도체, 카바메이트 및 유도체, 히드록실, 알데히드, 케톤, 히드라진, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 인산 및 유도체, 포스폰 산 및 유도체, 할로아세틸, 알킬 할라이드, 아크릴로일, 아릴 플로오라이드와 같은 아릴화제, 히드록실아민, 피리딜 디설파이드와 같은 디설파이드, 비닐 술폰, 비닐 케톤, 옥시란, 및 아지리딘이다. 바람직한 반응성 작용기는 티올, 말레이미드, 아미노, 카르복시산 및 유도체, 카보네이트 및 유도체, 카바메이트 및 유도체, 알데히드, 및 할로아세틸이고, 더욱 바람직하게는 티올, 아미노, 카르복시 산 및 유도체, 카바메이트 및 유도체, 알데히드, 및 할로아세틸이다. 바람직하게는, 상기 반응성 작용기는 일차 아미노기 또는 카르복시산이며, 가장 바람직하게는 일차 아미노기이다.
한 구체예에서, 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔의 반응성 작용기는 살균 후 잘라지는 보호기로 보호된다.
본 발명에 따라 살균된 PEG-계 불용성 하이드로겔은 살균이 유용하거나 요구되는 임의의 적용에도, 예를 들어 조직 공학, 스킨필링(skin filling), 안내 장치(intraocular devices), 의료 이식(medical implants), 수술용 실란트 및 스폰지, 지혈제, 지속적인 방출 전달 시스템, 의료 영상제제 및 프로드러그-담체에, 사용될 수 있다. 바람직한 용도는 지속적인 방출 전달 시스템 및 프로드러그-담체이며, 더욱 바람직하게는 프로드러그-담체이다. 기-형성된 3차원 하이드로겔은 보호용매의 존재 또는 2종 이상의 보호용매 또는 이들의 수용액의 혼합물에서 조사에 의해 살균되고, 살균 하이드로겔은 이어서 선택적으로 예를 들어 펩타이드, 단백질 또는 저분자와 같은 생물학적 활성 모이어티를 가질 수 있다. 상기 생물학적 활성 부분은 안정한 스페이서 모이어티를 경유하거나 분해가능한 링커 모이어티를 통해 하이드로겔과 연결될 수 있다.
대안적인 구체예에서, 상기 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 먼저 저분자 생물학적 활성 모이어티를 가지고 그 후에 보호용매의 존재 또는 2종 이상의 보호용매 또는 이들의 수용액의 혼합물에서 조사에 의해 살균된다.
본원 발명에 따른 살균에 적합한 PEG-계 불용성 하이드로겔은 다양한 형태 일 수 있고, 무정형, 구형, 렌티큘라, 편평(필름과 같은) 또는 관형의 하이드로겔을 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 상기 PEG-계 불용성 하이드로겔 입자 직경이 1 내지 1000 microns, 바람직하게는 10 내지 100 microns인 구형의 미립자로 이루어진다.
본원 발명에 따른 살균에 적합한 PEG-계 불용성 하이드로겔은 분해성 결합에 의해 상호 연결된 백본 모이어티를 포함한다. 선택적으로, 상기 백본 모이어티는 올리고머, 폴리머 또는 저분자량 가교 결합 모이어티를 통해 가교 결합될 수 있다. 이는 분해성 결합을 통해 백본과 결합하고, 부가적으로 분해성 결합을 가질 수 있다. 선택적으로, 백본 모이어티는 하나 이상의 다음의 영구적인 연결기를 지닐 수 있다: 리간드, 킬레이팅 그룹, 스페이서 분자, 블록킹 그룹.
본원 발명의 한 구체예세서 상기 하이드로겔은 다음의 조성물을 갖는다.
생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 가수분해적으로 분해 가능한 결합에 의해 상호연결된 백본 모이어티를 포함한다. 바람직하게는, 상기 백본 모이어티는 분자량이 1 kDa 내지 20 kDa 분자량을 가지며, 더 바람직하게는 1 kDa 내지 15 kDa 범위 내이다.
바람직하게는, 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔에서, 백본 모이어티는 상호연결된 생물분해가능한 작용기 및 반응성의 작용기로 이루어진 다수의 작용기를 특징으로 한다. 바람직하게는, 상호 연결된 분해성 기의 및 반응성의 작용기의 합은 16 이상, 바람직하게는 16 내지 128, 바람직하게는 20 내지 100, 또한 바람직하게는 20 내지 40, 더욱 바람직하게는 24 내지 80, 또한 더욱 바람직하게 28 내지 32, 더욱 바람직하게는 30 내지 60, 가장 바람직하게 30 내지 32이다. 상호 연결된 작용기 및 상기 반응성 작용기를 비롯하여 또한 보호기는 존재할 수 있다고 이해된다.
상기 작용기는 선형 사슬에 부착될 수 있다. 이 경우, 상기 작용기는 사슬을 따라 규칙적으로 또는 불규칙적으로 간격을 둘 수 있거나 또는 대안적으로, 상기 사슬은 두 수지상 모이어티에 의해 종결될 수 있고, 작용기의 총합을 대비한다.
우선적으로, 백본 모이어티는 브랜치 코어를 가지는 것을 특징으로 한다. 이로부터 3 이상의 PEG-계 폴리머 사슬이 연장된다. 상기 브랜치 코어는 결합된 형태로 폴리- 또는 올리고알콜, 바람직하게는 펜타에리트리톨, 트리펜타에리트리톨, 헥사글리세린, 수크로오스, 소르비톨, 프룩토오스, 만니톨, 글루코즈, 셀루로즈, 아밀로즈, 전분, 히드록시알킬 전분, 폴리비닐알콜, 덱스트란, 히알루로난(hyualuronans)을 포함할 수 있다. 또는 브랜치코어는 결합된 형태로 폴리-또는 올리고아민, 예컨대 오르니틴, 디아미노부틸산, 트리리신, 테트라리신, 펜타리신, 헥사리신, 헵타리신, 옥타리신, 노나리신, 데카리신, 운데카리신, 도데카리신, 트리데카리신, 테트라데카리신, 펜타데카리신 또는 올리고리신, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐아민을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 브랜치 코어는 결합된 형태의 폴리- 또는 올리고 아민, 예컨대 트리리신, 테트라리신, 펜타리신, 헥사리신, 헵타리신, 옥타리신, 노나리신, 데카리신, 운데카리신, 도데카리신, 트리데카리신, 테트라데카리신, 펜타데카리신 또는 올리고리신, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐아민을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 브랜칭 코어는 3 내지 16 PEG-계 폴리머 사슬로 연장된다. 더욱 바람직하게는 4 내지 8이다.
백본 모이어티의 반응성 작용기 및 상호 연결된 작용기의 합은 브랜칭 코어부터 연장된 PEG-계 폴리머 사슬의 수에 의해 동등하게 분할된다. 브랜칭 코어부터 연장된 PEG-계 폴리머 사슬의 수가 동등한 분배를 허용하지 않는다면, PEG-계 폴리머 사슬 당 상호연결된 작용기 및 반응성 작용기의 합의 평균으로부터 얻은 편차를 최소한으로 유지하는 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는, 상기 상호연결된 작용기 및 백본 모이어티의 반응성 작용기의 합은 브랜칭 코어로부터 연장된 PEG-계 폴리머 사슬의 수에 의해 동등하게 분할된다. 예를 들어, 32 상호연결된 작용기 및 반응성 작용기가 있다면, 코어로부터 연장된 4개의 PEG-계 폴리머 사슬 각각에 의해 8 그룹이 제공될 수 있으며, 바람직하게는 각 PEG-계 폴리머 사슬의 상기 말단에 부착된 수지상 모이어티에 의한다. 대안적으로, 코어로부터 연장된 각 8 PEG-계 폴리머 사슬에 의해 4 그룹이 제공되거나 각 16 PEG-계 폴리머 사슬에 의해 두그룹이 제공될 수 있다.
백본 모이어티로 적합한 브랜칭 코어로부터 연장된 PEG-계 폴리머 사슬에 상응하는 바람직한 구조는 멀티 암(multi-arm) PEG 유도체로서, 예를 들어, JenKem Technology, USA (accessed by download from www.jenkemusa.com on July 28, 2009)생산물 리스트에 구체적으로 기재되어 있는데, 4ARM-PEG 유도체(pentaerythritol core), 8ARM-PEG 유도체(hexaglycerin core) 및 8ARM-PEG 유도체(tripentaerythritol core)이다. 가장 바람직하게는 4arm PEG 아민 (pentaerythritol core) 및 4arm PEG 카르복실 (pentaerythritol core), 8arm PEG 아민 (hexaglycerin core), 8arm PEG 카르복실 (hexaglycerin core), 8arm PEG 아민 (tripentaerythritol core) 및 8arm PEG 카르복실 (tripentaerythritol core)이다. 백본 모이어티에서 상기 멀티암 PEG-유도체의 바람직한 분자량은 1 kDa 내지 20kDa, 보다 바람직하게는 2.5 kDa 내지 15 kDa 및 더욱 바람직하게는 5 kDa 내지 10 kDa이다. 이들 시약(reagents)은 결합된 형태로 하이드로겔에 존재하는 것으로 생각된다.
상기 부가적인 작용기는 수지상 모이어티에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 각 수지상 모이어티는 0.4 kDa 내지 4 kDa의 범위의 분자량을 가지며, 보다 바람직하게는 0.4 kDa 내지 2 kDa이다. 바람직하게는, 각 수지상 모이어티는 3 이상 분지 및 4 이상 반응성 작용기, 및 63 분지 및 64 반응성 작용기 이하, 바람직하게는 7 이상 분지 및 8 이상 반응성 작용기 및 31 분지 및 32 반응성 작용기 이하를 갖는다.
상기 수지상 모이어티의 예는 트리라이신, 테트라라이신, 펜타라이신, 헥사라이신, 헵타라이신, 옥타라이신, 노나라이신, 데카라이신, 운데카라이신, 도데카라이신, 트리데카라이신, 테트라데카라이신, 펜타데카라이신, 헥사데카라이신, 헵타데카라이신, 옥타데카라이신, 노나데카라이신이 결합된 형태이다. 상기 바람직한 수지상 모이어티는 트리라이신, 테트라라이신, 펜타라이신, 헥사라이신, 헵타라이신, 가장 바람직하게는 트리라이신, 펜타라이신 또는 헵타라이신을 결합된 형태로 포함한다.
가장 바람직하게는, 상기 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 백본 모이어티가 화학식 C(A-Hyp)4의 4급 탄소를 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 각 A는 영구적인 공유 결합에 의해 독립적으로 4급 탄소에 말단으로 부착된 폴리(에틸렌 글리콜) 계 폴리머 사슬이고 상기 PEG-계 폴리머 사슬의 상기 원위 말단(distal end)은 수지상 모이어티 Hyp에 공유적으로 결합하며, 상호결합된 생분해성 작용기 및 반응성의 작용기 및 영구적인 결합을 나타내는 4 이상의 작용기를 가지는 각 수지상 모이어티 Hyp이다. 각 백본 모이어티는 16 이상의 상호연결된 생분해성 작용기 및 반응성 작용기 및 영구적인 결합을 포함하며, 바람직하게는 20 내지 64이고 보다 바람직하게는 28 내지 64 상호연결된 생분해성 작용기 및 반응성의 작용기 및 영구적인 결합이다.
바람직하게는, 각 A는 독립적으로 화학식 -(CH2)n1(OCH2CH2)nX- 에서 선택된다. 여기서 n1은 1 또는 2; n 은 5 내지 50의 범위 내의 정수이고; 및 X는 A 및 Hyp와 공유적으로 결합하는 작용기이다.
바람직하게는, A 및 Hyp는 아미드 작용기에 의해 공유적으로 결합된다.
바람직하게, 상기 수지상 모이어티 Hyp는 과분지된(hyperbranched) 폴리펩티드이다. 바람직하게, 상기 과분지된 폴리펩티드는 라이신을 결합된 형태로 포함하며, 가장 바람직한 Hyp는 운데카라이신일 또는 헵타라이신일이다. 바람직하게는, 각 수지상 모이어티 Hyp는 0.4 kDa 내지 4 kDa 범위 내에서 분자량을 갖는다. 백본 모이어티 C(A-Hyp)4는 동일하거나 다른 수지상 모이어티 Hyp로 이루어질 수 있고 각 Hyp는 독립적으로 선택될 수 있다고 이해된다. 각 모이어티 Hyp는 5 및 21 사이의 라이신으로 이루어지고, 바람직하게는 7 이상 라이신, 즉, 각 모이어티 Hyp는 5 및 32 사이 라이신을 결합된 형태, 바람직하게는 7 이상 라이신을 결합된 형태로 포함한다.
바람직하게는, C(A-Hyp)4는 1 kDa 내지 20 kDa 범위의 분자량을 가지며, 보다 바람직하게는 1 kDa 내지 15 kDa 그리고 더욱 바람직하게는 1 kDa 내지 10 kDa 범위 내 분자량을 가진다.
본원발명에 따른 상기 하이드로겔의 생분해능력은 가수분해적으로 분해가능한 결합의 도입에 의해 달성된다.
바람직하게는, 백본 모이어티는 크로스링커 모이어티를 통해 서로 결합될 수 있고, 각 크로스링커 모이어티는 2 이상의 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 종결된다. 종결하는 분해가능한 결합이외에, 상기 크로스링커 모이어티는 생분해성 결합를 더 포함할 수 있다. 따라서, 백본 모이어티에 연결된 각 크로스링커 모이어티의 말단은 가수분해적으로 분해가능한 결합을 포함하고 부가적으로 생분해성 결합은 크로스링커 모이어티에 선택적으로 존재할 수 있다.
따라서, 상기 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 상호연결된 백본 모이어티를 포함하고 상기 백본 모이어티는 바람직하게는 크로스링커 모이어티를 통해 서로 연결되며, 각 크로스링커 모이어티는 2 이상의 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 종결된다.
상기 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 하나 이상의 다른 종류의 크로스링커 모이어티를 포함할 수 있고, 바람직하게는 하나이다. 크로스링커 모이어티는 선형 또는 분지형 분자일 수 있고 바람직하게는 선형 분자이다. 본원발명의 바람직한 구체예에서, 상기 크로스링커 모이어티는 2이상의 생분해성 결합에 의해 백본 모이어티에 연결된다.
생분해성 결합이라는 용어는 1시간 내지 3개월 범위의 반감기를 가지며 생리적 조건에서(수성완충액, pH 7.4, 37℃) 비-효소적 가수분해적으로 분해가능한 연결을(linkage) 나타내며, 아코니틸, 아세탈, 카르복실 무수물, 카르복실산에스테르, 이민, 하이드라존, 말레암산 아미드, 오르토에스테르, 포스파미드, 포스포에스테르, 포스포실릴에스테르, 실릴에스테르, 술폰에스테르, 방향족 카바메이트, 이들의 조합, 및 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 생분해성 결합은 카르복실산에스테르, 카보네이트, 포스포에스테르 및 술폰산에스테르이고 가장 바람직하게는 카르복실산에스테르 또는 카보네이트이다.
바람직하게는, 크로스링커 모이어티는 60 Da 내지 5 kDa의 범위에서 분자량을 가지며, 보다 바람직하게는 60 Da to 4 kDa, 더욱 바람직하게는 60 Da 내지 3 kDa, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 4 kDa, 더욱 바람직하게는 1 kDa 내지 4 kDa 및 가장 바람직하게는 1 kDa 내지 3 kDa이다. 하나의 구체예에서, 크로스링커 모이어티는 폴리머로 이루어진다.
올리고머 또는 폴리머 크로스링커 모이어티 이외에도, 저-분자량 크로스링커 모이어티가 사용될 수 있고, 특히 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔 형성을 위해 친수성 고분자량 백본 모이어티가 사용된다.
바람직하게는, 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 계 크로스링커 모이어티는 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 탄화수소 사슬이며, 선택적으로 작용기를 더 포함하는데, 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 계 크로스링커 모이어티는 각 m 에틸렌 글리콜 단위 이상을 포함하며, 상기 m은 3 내지 100 범위 내의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 70 및 가장 바람직하게는 10 내지 70 범위 내의 정수이다. 바람직하게는, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)계 크로스링커 모이어티는 60 Da 내지 5 kDa 및 더욱 바람직하게는 0.5 kDa 내지 5 kDa 범위 내에서 분자량을 갖는다.
바람직하게는, 상기 크로스링커 모이어티는 PEG-계이고, 바람직하게는 단지 하나의 PEG-계 분자사슬에 의해 대표된다. 바람직하게는, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)-계 크로스링커 모이어티는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 탄화수소 사슬이며, 선택적으로 화학적 작용기를 더 포함하며, 여기서 폴리(에틸렌 글리콜) 계 크로스링커 모이어티는 각 m 에틸렌 글리콜 단위 이상을 포함하고, 여기서 m은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 100, 바람직하게는 1 내지 70 및 더욱 바람직하게는 10 내지 70 범위 내에서 정수이다. 바람직하게는, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)-계 가교결합제는 60 Da 내지 5 kDa 분자량을 가지고, 바람직하게는 0.5 kDa 내지 5 kDa이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 크로스링커 모이어티는 PEG 사슬로 이루어지며, 이는 대칭적으로 에스테르 결합을 통해 영구적인 아미드 결합을 통한 과분지된 수지상 모이어티에 연결된 백본 모이어티에 의해 제공된 두 개의 알파, 오메가-지방족 디카르복시 스페이서에 연결된다.
다른 측면에서 백본 모이어티에 연결된 스페이서 모이어티의 디카르복실 산은 3 내지 12 탄소 원자로, 가장 바람직하게는 5 및 8 사이 탄소 원자로 이루어진 가교결합 모이어티에 연결되고, 하나 이상의 탄소 원자에서 치환될 수 있다. 바람직한 치환기는 알킬기,히드록시기 또는 아미도기 또는 치환된 아미노기이다. 하나 이상의 지방족 디카르복실산의 메틸렌기는 선택적으로 O 또는 NH 또는 알킬-치환된 N에 의해 치환될 수 있다. 바람직한 알킬은 1 내지 6의 탄소원자의 선형 또는 분지형 알킬이다.
백본 모이어티 및 크로스링커 모이어티 사이의 상기 생분해성 결합의 가수분해 비율은 상기 PEG-에스테르 카르복시기에 인접하여 연결된 원자의 종류 및 수에 의해 결정되거나 영향을 받는다. 예를 들어, PEG 에스테르 형성을 위해, 숙신산, 아디프산 또는 글루타르산으로부터 선택함으로써 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔의 분해 반감기를 다양하게 할 수 있다.
대안적인 구체예에서, 다-기능성 모이어티는 폴리머화된 하이드로겔의 반응성 작용기에 커플링되어 반응성 작용기의 수를 증가시키며, 이는, 예를 들어, 상기 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔의 약물 로드(load)를 증가시키는 것을 가능하게 한다. 상기 다-기능성 모이어티는 라이신, 디라이신(dilysine), 트리라이신, 테트라라이신, 펜타라이신, 헥사라이신, 헵타라이신, 또는 올리고 라이신의 적절하게 치환된 유도체, 저분자질량 PEI 결합된 형태에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 상기 다-작용 모이어티는 결합된 형태의 라이신을 포함한다. 선택적으로, 상기 다-작용 모이어티는 보호기에 의해 보호될 수 있다.
더욱이, 본원발명에 따르는 상기 하이드로겔은 동일한 작용기를 가지는 스페이서에 의해 작용화될 수 있으며, 예를 들어, 적합하게 활성화된 COOH-PEG6-NH-Fmoc와 같은 이종 헤테로 2작용성 (heterobifunctional) 스페이서를 커플링하고 Fmoc-보호기를 제거함으로써 아미노기는 상기 하이드로겔에 도입될 수 있다.
하나의 바람직한 크로스링커 모이어티는 하기와 같다 : 파선은 백본 모이어티에 상호연결하는 생분해성 연결을 나타낸다.
Figure pct00001
여기서 q는 5 내지 50의 정수이다.
바람직하게는, 상기 PEG-계 불용성 하이드로겔은 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 상호 연결된 백본 모이어티를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 백본 모이어티는 하기 식의 브랜칭 코어를 포함한다.
Figure pct00002
여기서 상기 파선은 상기 백본 모이어티의 잔여부분에 결합을 가리킨다.
보다 바람직하게, 백본 모이어티는 하기 화학식의 구조를 포함한다:
Figure pct00003
여기서 n은 5 내지 50의 정수이고 상기 파선은 백본 모이어티의 잔여에 부착된 것을 나타낸다.
바람직하게는, 백본 모이어티는 과분지된 모이어티 Hyp을 포함한다.
보다 바람직하게, 상기 백본 모이어티는 하기 식의 과분지된 모이어티 Hyp를 포함한다.
Figure pct00004
식 중, 상기 파선은 분자의 나머지 부분에 부착된 것을 나타내고, 별표 (*) 표시된 탄소 원자는 바람직한 구체예에서 S-배위(S-configuration)를 나타낸다. 그러나, 상기 나타낸 과분지된 모이어티 Hyp 또한 R-배위 (R-confirmation) 또는 라세미(racemic)일 수 있다고 이해된다.
바람직하게는, 상기 백본 모이어티는 하기 화학식의 하나 이상의 스페이서에 부착될 수 있다:
Figure pct00005
여기서 상기 파선 하나는 과분지된 모이어티 Hyp에 부착된 것을 나타내고, 두번째 파선은 분자의 나머지에 부착된 것을 나타내며; 여기서 m은 2 내지 4의 정수이다.
바람직하게는, 백본 모이어티는 하기 구조를 가진 크로스링커 모이어티를 통해 서로 연결된다
Figure pct00006
식 중,
q 는 3 내지 100의 정수이다.
보다 바람직하게는, PEG-계 불용성 하이드로겔의 백본 모이어티는 하기 화학식의 모이어티를 통해 함께 연결된다.
Figure pct00007
여기서 각 파선은 백본 모이어티 각각에 부착된 것을 나타내며, 여기서 n 은 45이다.
또한 더욱 바람직하게 상기 PEG-based insoluble 하이드로겔의 백본 모이어티는 하기 화학식의 모이어티를 통해 함께 연결된다.
Figure pct00008
여기서 상기 파선은 각각 백본 모이어티 각각에 부착된 것을 나타내고 여기서 n은 22이다.
본원발명은 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔의 보호용매 존재에서 조사에 따른 살균을 기재하고 있다. 이 살균 과정에 사용되는 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 조사 전 보호용매로 용해되고 조사 동안 보호용매가 남아서 존재한다. 바람직하게는, 보호용매는 아세트산(수용액, 0.01-1% (v/v)), 아세토니트릴, 4-아세틸모르폴린, 디메틸설폭사이드 (DMSO), 디클로로메탄(DCM), N,N-디메틸아세트아미드 (DMA), N,N-디메틸포름아미드(DMF), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논 (DMI), 디메틸카보네이트, 디메틸포름아미드, 1-에틸-2-피롤리돈, N-에틸아세트아미드, N-에틸포름아미드, 포름아미드, 4-포르밀모르폴린, 1-포르밀피롤리돈, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2(1H)-피리미디논 (DMPU), 알킬 알코올, 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올 ; 포름아미드, 헥사메틸포스포아미드 (HMPA), N-메틸아세트아미드, 니코틴아미드(수용액, 0.1-5% (w/w)), 피리독신(수용액, 0.1-5% (w/w)), N-메틸포름아미드, NMP, 1,2-프로필렌 카보네이트, 테트라하이드로퓨란 (THF), 설포란, 물, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는, 상기 보호용매는 아세트산(수용액, 0.01-1% (v/v)), 아세토니트릴, 디메틸설폭사이드 (DMSO), 디클로로메탄 (DCM), 디메틸아세트아미드 (DMA), 디메틸카보네이트, 디메틸포름아미드, l,3-디메틸-2-이미다졸리디논, l,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2(lH)-피리미디논 (DMPU), 메탄올, 에탄올, 프로판올과 같은 알킬 알코올; 포름아미드, 헥사메틸포스포르아미드 (HMPA), 니코틴아미드 (수용액, 0.1-5% (w/w)), N-메틸포름아미드, NMP, 테트라하이드로퓨란 (THF), 설포란, 물, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 상기 보호용매는 4-아세틸모르폴린, DMA, DMF, DMI, DMPU, 1-에틸-2-피롤리돈, N-에틸아세트아미드, N-에틸포름아미드, 4-포르밀모르폴린, 1-포르밀피롤리돈, N-메틸아세트아미드, N-메틸포름아미드, DMSO 또는 NMP로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 보호용매는 DMSO, DMA, DMF, DMI 또는 NMP으로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는 DMA, DMF, DMI 또는 NMP로부터 선택되고; 또한 더욱 바람직하게는 DMSO 또는 NMP이고; 더욱 바람직하게는 NMP 이다.
선택적으로, 상기 보호용매는 탈가스화되고 선택적으로 보효용매에 가용성인 다른 것, 예컨대 염과 같은 하나 이상의 보호제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 보호제는 0.01 내지 10% 범위 농도로 포함된다. 또한 보호용매는 2종 이상의 보호용매 또는 이의 수성 희석액의 혼합물이 될 수 있다고 이해된다.
보호제는 선택적으로 치환된 선형, 분지형, 또는 환형 C1-C10 알킬 아민, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-C10 알킬 카르복실 산, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-C10 알킬 술폰 산, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-C10 알킬 티올, 또는 카보하이드레이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 보호제는 하이드록실기로 치환될 수 있거나 우레아, 아미드 또는 카바메이트기로 치환된거나 개재되거나 에테르로 개재된다. 2종 이상의 보호제의 혼합물은 상기 보호용매에 첨가될 수 있다.
바람직한 보호제는 프로필아민, 부틸아민, 펜틸아민, sec.부틸아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 세리놀, 트리스하이드록시메틸-아미노메탄, 아세트산, 포름산, 아스코르빈산, 글리신아미드, 피발산, 프로판산, 숙신산, 글루타르산, 아디핀산, 티오글리세린, 디티오트레이톨, 머캅토에탄올, 환원된 글루타치온에서 선택된다.
살균을 위해, 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 적합한 용기에 위치되며, 이는 살균 과정 후에 무균상태를 보장한다. 따라서, 하이드로겔은 보호용매로 용매화되며, 상기 적합한 용기는 밀폐되고 살균공정을 받는다. 상기 적합한 용기는 용기를 밀폐한 후에 무균상태를 보장하기 위해 선택되고 살균 과정을 수행한다. 대안적으로, PEG-계 불용성 하이드로겔은 먼저 보호용매로 용매화되고 나서 적합한 용기에 이동되고, 살균된 후에 상기 적합한 용기는 그 후 밀폐된다. 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔의 살균이 조사에 의해 수행되는데, 바람직하게는 감마선으로, 5-100 kGy의 양으로, 바람직하게는 8-50 kGy, 보다 바람직하게는 20-40 kGy, 예를 들어 32-40 kGy, 그리고 보다 바람직하게는 20-30 kGy이다. 본원발명에 따른 상기 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔의 조사는 실온 (25℃) 내지 -80℃의 범위에서 수행될 수 있다. 바람직하게는 처리는 실온에서 수행된다. 실온 이하의 온도를 얻기 위해, 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔을 포함하는 살균되는 적합한 용기는 냉각 가능한 환경에 저장되거나, 얼음 또는 드라이 아이스와 같이 냉각 물질에 의해 둘러싸여질 수 있다.
상기 살균된 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 예를 들어 이식과 같이 직접적으로 사용될 수 있거나, 또는 예를 들어 생물학적 활성 모이어티를 살균된 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔에 커플링함으로써 더 변형될 수 있다. 후자의 경우에, 기-살균된 화학물질 및 생물학적 활성모이어티를 사용하여, 살균 조건에서 추가의 공정이 수행된다,
본원발명의 한 구체예에서, 저분자 생물학적 활성 모이어티는 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔의 작용기에 커플링되어, 결과로서 소위 저분자 생물학적 활성 모이어티를 가진 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔을 얻는데, 이는 그 후 보호용매의 존재하에 조사에 의해 살균된다. 당업자에게 단지 상기 저분자 생물학적 활성 모이어티는 안정하다는 것은 자명하며, 감마선 조사 동안 이는 그들의 화학 구조를 유지한다.
따라서, 본원발명의 바람직한 측면은 본원발명에 따른 방법이며, 여기서 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 저분자 생물학적 활성 모이어티를 가진다.
만약 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔이 저분자 생물학적 활성 모이어티를 가지며 본원 독창적인 방법에 따라 살균된다면 그 후 상기 저분자 생물학적 활성 모이어티는 보존될 것이다. 본 명세서에서 용어 "보전된" 은 바람직하게는 상기 살균된 하이드로겔로부터 방출된 90% 이상의 저분자 생물학적 활성 모이어티가 변화하지 않은 것을 의미하며, 이는 질량분석법, 고성능 액체 크로마토 그래피 또는 약리학적 활성 테스트와 같이 당업자에 알려진 방법으로 측정할 수 있다.
본원발명의 바람직한 구체예에서, 건조 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 5-10 ml NMP/g 건조 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔로 용매화될 수 있고, 살균 후에 오염을 방지하기 위해 밀폐된 용기를 사용하여 25 kGy 양의 감마선으로 조사될 수 있다. 생물학적 활성 모이어티를 살균된 하이드로겔에 커플링하는 것과 같은 추가 공정을 위하여, NMP은 필터 또는 적합한 컬럼이 구비된 시린지를 사용하여 소망하는 용매로 교환된다. 당업자에게 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔의 살균 후 모든 단계가 살균 용액을 사용하여 무균조건에서 수행되는 것은 자명하다.
본원 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 건조 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔 2g 당 0.1 % - 2 % (v/v) 아미노에탄올 또는 프로필아민을 포함하는 5-10 ml NMP가 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔을 용매화하는 데 사용되고, 상기 용매화 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔은 이어서 32 kGy양의 감마선으로 조사되는데, 살균 후 오염을 방지하기 위한 밀폐된 용기를 사용한다. 살균된 하이드로겔에 대한 생물학적 활성 모이어티의 커플링과 같은 추가의 공정을 위해, 0.1 % - 2 % (v/v) 아미노에탄올 또는 프로필아민을 포함하는 NMP은 필터 또는 적합한 컬럼을 갖춘 시린지를 사용하여 소망하는 용매로 교환된다. 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔의 살균 후 모든 단계는 살균 용액을 사용하여 무균 조건에서 수행되는 것은 당업자에게 자명하다.
본원 발명의 추가적인 측면은 살균된 생분해성 PEG-계 불용성 하이드로겔이며, 특히 저분자 생물학적 활성 모이어티를 보유하며, 본원 발명의 임의의 방법에 의해서 얻어질 수 있다.
실시예
재료와 방법
재료
Amino 4-arm PEG5000은 젠켐 테크놀러지(베이징,중화인민공화국)의 제품을 사용하였다. 다른 모든 화학물질은 시그마-알드리치 케미 유한책임회사(타우프키르헨, 독일)의 제품을 사용하였다. 하이드로겔 비즈의 세척과정 혹은 반응조로써 폴리프로필렌 프리트가 장착된 시린지를 사용하였다.
분석:
Waters Acquity ULPC system을 갖춘 Thermo Fisher Orbitrap Discovery intrument로 전기분무이온화질량분석법 (ESI-MS)을 시행하였다.
PEG출발물질의 다분산성때문에 PEG결과물의 MS스펙트럼은 일련의 (CH2CH20)n 모이어티로 나타났다. 실시예에서는 해석의 편의상 단 하나의 대표 m/z 시그널만 주었다.
별다른 언급이 없다면, Superdex75 5/150 GL 컬럼(Amersham Bioscience/GE Healthcare)을 장착한 Amersham Bioscience AEKTAbasic system을 이용하여 크기배제크로마토그래피(SEC)를 시행하였다. 이동상으로는 4/1 (v/v) 수성 완충액(20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, 0.005 % TWEEN20, pH 7.4) / 아세토니트릴 혼합물을 사용하였다. 215nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예1
백본 시약 1g의 합성
Figure pct00009
Amino 4-arm PEG5000 1a로부터 다음 방법으로 백본 시약 1g을 합성하였다.:
Figure pct00010

화합물 1b를 합성하기 위해, 4-Arm-PEG5000 테트라아민 1a (분자량 약. 5200 g/mol, 5.20g, 1.00mmol, HCl염)을 DMSO (무수) 20ml에 용해시켰다. 5ml의 DMSO(무수) 중 Boc-Lys(Boc)-OH (2.17 g, 6.25 mmol), EDC HCl (1.15 g, 6.00 mmol), HOBtㆍH20 (0.96 g, 6.25 mmol), 및 콜리딘 (5.20 mL, 40 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 실온에서 30분간 교반하였다.
반응 혼합물은 1200mL의 디클로로메탄에 희석하고 600mL의 0.1 N 황산 (2 x), 염수(1 x), 0.1M 수산화나트륨 (2 x) 과 1/1 (v/v) 염수/물 (4x)으로 세척하였다. 수성층은 500mL의 DCM으로 재추출하였다. 유기상은 황산나트륨으로 건조하였고, 여과하고 증발시켜서 무색의 오일로서 조 생성물 1b 6.3 g을 얻었다. 화합물 1b는 RP-HPLC로 정제하였다.
수율 3.85 g (59%) 무색의 유리질 결과물 1b를 얻음.
MS: m/z 1294.4 = [M+5H]5+ (계산치 = 1294.6).
화합물 1c는 화합물 1b (0.521 mmol) 3.40 g 을 디옥산 중 4N 염산 9mL 및 메탄올 5mL 에 실온에서 15분간 교반하여 획득하였다. 휘발성물질은 진공에서 제거하였다. 결과물은 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 이용하였다.
MS: m/z 1151.9 = [M+5H]5+ (계산치= 1152.0).
화합물 1d를 합성하기 위해, 화합물 1c (0.54mmol) 3.26 g 을 DMSO (무수) 15mL에 용해하였다. 15 mL DMSO (무수)중 2.99 g의 Boc-Lys(Boc)-OH (8.64 mmol), 1.55 g EDC HCl (8.1 mmol), 1.24 g HOBt-H20 (8.1 mmol), 및 콜리딘 (43 mmol) 5.62 mL을 추가하였다. 반응 혼합물은 실온에서 30분간 교반하였다.
반응 혼합물은 DCM 800mL에 희석하여, 400mL의 0.1 N 황산 (2 x), 염수 (1x), 0.1 M 수산화나트륨 (2 x), 및 1/1 (v/v) 염수/물 (4 x)로 세척하였다. 수성층은 DCM 800 mL을 사용하여 재추출하였다. 유기상은 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 증발시켜서 유리질의 조 결과물을 얻었다.
결과물을 DCM에 용해시키고, 차가운 (- 18 ℃) 디에틸에테르를 사용하여 침전시켰다. 이 과정을 두번 반복하고 침전물을 진공에서 건조시켰다.
수율: 4.01g (89%)의 무색 유리질의 결과물 1d를 얻었으며, 추가의 정제과정없이 다음 단계에 사용하였다.
MS: m/z 1405.4 = [M+6H]6+ (계산치 = 1405.4).
화합물 1e는 화합물 1d (3.96 g, 0.47 mmol), 메탄올 7mL, 디옥산에 섞은 4N 염산 20mL에 혼합하여 만든 용액을 실온에서 15분간 교반하여 얻어졌다. 휘발성물질은 진공으로 제거하였다. 결과물은 추가 정제과정 없이 다음 단계에서 사용하였다.
MS: m/z 969.6 = [M+7H]7+ (계산치= 969.7).
화합물 1f를 합성하기 위해서, 화합물 1e (3.55 g, 0.48 mmol)를 DMSO(무수) 20mL에 용해하였다. 18.8mL의 DMSO (무수) 중의 Boc-Lys(Boc)-OH (5.32 g, 15.4 mmol) , EDC HCl (2.76 g, 14.4 mmol), HOBt-H20 (2.20 g, 14.4 mmol) 및 10.0 mL의 콜리딘 (76.8 mmol) 을 추가하였다. 반응 혼합물은 실온에서 60분간 교반하였다.
반응 혼합물을 DCM 800mL에 희석시키고, 400ml의 0.1 N 황산(2 x), 염수 (1 x), 0.1 M 수산화나트륨(2 x), 1/1 (v/v) 염수/물 (4 x) 로 세척하였다. 수성층을 800ml DCM으로 재추출하였다. 유기상은 황산나트륨에 건조하였으며, 여과시키고 증발시켜 무색의 오일로서 조결과물 1f을 얻었다.
결과물을 DCM에 용해시키고 차가운 (- 18 ℃) 디에틸에테르로 침전시켰다. 이 과정은 두번 반복하였으며 침전물은 진공에서 건조시켰다.
수율 무색유리질의 결과물 1f 4.72g (82%)을 얻었으며, 추가 정제과정없이 다음단계에 이용하였다.
MS: m/z 1505.3 = [M+8H]8+ (계산치= 1505.4).
백본 시약 1g는 다이옥산 중의 4N 염산 40mL과 20ml 메탄올 중 화합물 1f(분자량 약 12035 g/mol, 4.72 g, 0.39mmol)의 용액을 실온에서 30분간 교반하여 얻어졌다. 휘발성물질은 진공에서 제거하였다.
수율 유리질의 결과물 백본 시약 1g 3.91g (100%) 얻음
MS: m/z 977.2 = [M+9H]9+ (계산치= 977.4).
1g의 대체합성경로
화합물 1b를 합성하기 위해, 250 mL iPrOH (무수) 중 4-Arm-PEG5000테트라아민(1a) (50.0 g, 10.0 mmol) 45 ℃ 현탁액에, boc-Lys(boc)-OSu (26.6 g, 60.0 mmol) 및 DIEA (20.9 mL, 120 mmol)에 첨가하고 혼합물을 30분간 교반하였다.
그 후에, n-프로필아민 (2.48 mL, 30.0 mmol)을 추가하였다. 5분후에 용액을 MTBE 1000mL로 희석시킨 다음에 교반하지 않고 -20 ℃ 에서 하룻밤동안 저장하였다. 약 500mL의 상층액을 가만히 따라서 버렸다. 차가운 MTBE을 300mL을 추가하였고, 1분간 진탕한 후, 유리필터로 여과하여 결과물을 수집하였고, 차가운 MTBE 500mL로 세척하였다. 결과물은 진공에서 16시간동안 건조하였다.
수율: 백색의 덩어리진 고체 1b 65.6 g (74%)
MS: m/z = 937.4 = [M+7H]7+ (계산치= 937.6).
화합물 1c는 이전 과정에서 얻은 화합물 1b (48.8 g, 7.44 mmol) 를 2-프로판올 156mL중에 40 ℃에서 교반하여 얻었다. 교반과정중 1-2분 이내에, 2-프로판올 196 mL 과 아세틸클로라이트 78.3 mL의 혼합물을 추가했다. 용액을 40 ℃에서 30분간 교반하고, 교반과정없이 -30 ℃로 냉각시키고 하룻밤동안 두었다. 차가운 MTBE 100mL을 추가하고, 현탁액을 1분간 진탕하고 -30 ℃에서 한시간동안 냉각시켰다. 결과물은 유리필터를 통해 여과하여 수집하였고, 200mL의 차가운 MTBE로 세척하였다. 결과물은 진공에서 16시간동안 건조시켰다.
수율: 백색 분말로서 1c 38.9 g (86%)
MS: m/z = 960.1 [M+6H]6+ (계산치= 960.2).
화합물 1d를 합성하기 위해 80mL 2-프로판올 중의 전 단계에서 만들어진 1c (19.0 g, 3.14 mmol)의 45 ℃ 현탁액에 boc-Lys(boc)-OSu (16.7 g, 37.7 mmol) 과 DIEA (13.1 mL, 75.4 mmol) 을 추가하고, 이 혼합물을 45 ℃에서 30분간 교반하였다. 그 후에 n-프로필아민 (1.56 mL, 18.9 mmol)을 첨가하였다. 5분후에 차가운 MTBE 600ml로 용액을 침전시키고 원심분리를 하였다(3000 min-1, 1 min). 침전물은 진공에서 1시간 동안 건조시키고 400mL THF에 용해시켰다. 200mL 디에틸에테르가 추가되고 상기 결과물은 교반과정없이 -30 ℃로 16시간 동안 냉각하였다. 현탁액은 유리필터로 여과하여 차가운 MTBE 300mL로 세척하였다. 이 결과물은 진공에서 16시간동안 건조하였다.
수율: 백색분말의 1d 21.0g (80%)
MS: m/z 1405.4 = [M+6H]6+ (계산치= 1405.4).
화합물 1e는 메탄올 (81 mL, 243 mmol)중 3N 염산에 전 단계에서 얻어진 화합물 1d(15.6g, 1.86mmol)를 용해시킨후 40 ℃에서 90분간 교반하여 얻어졌다. 200mL의 메탄올과 700mL의 이소프로판올을 추가하여 혼합물을 -30 °C에서 2시간 저장했다. 결정화를 완결하기 위해서, 100mL의 MTBE를 현탁액에 추가하고 -30 ℃에 하룻밤 동안 저장했다. 250mL의 차가운 MTBE를 추가하고, 현탁액은 1분간 흔든 다음 유리필터로 여과하고 100mL의 차가운 MTBE로 세척했다. 결과물은 진공에서 건조시켰다.
수율: 백색의 분말 1e 13.2g (96%)
MS: m/z = 679.1 = [M+10H]10+ (계산치 = 679.1).
화합물 1f를 합성하기 위해, 165mL 2-프로판올 중의 전 단계의 만들어진 1e (8.22 g, 1.12 mmol)의 45 ℃ 현탁액에 boc-Lys(boc)-OSu (11.9 g, 26.8 mmol) 과 DIEA (9.34 mL, 53.6 mmol)을 추가하고, 이 혼합물을 30분간 교반하였다. 그 후에 n-프로필아민 (1.47 mL, 17.9mmol)을 추가하였다. 5분후에 용액을 -18 ℃에서 2시간동안 냉각하고, 차가운 MTBE 165ml을 추가한 다음, 이 현탁액을 1분간 진탕하고 유리필터로 여과하였다. 이후에, 필터케이크를 200mL의 차가운 MTBE/이소프로판올 4:1로 4번 세척하고 200mL의 차가운 MTBE로 한번 세척하였다. 이 결과물은 진공에서 16시간 동안 건조하였다.
수율: 옅은 황색의 덩어리진 고체 1f 12.8 g, MW (90 %)
MS: m/z 1505.3 = [M+8H]8+ (계산치= 1505.4).
백본시약 1g 는 4ArmPEG5kDa(-LysLys2Lys4(boc)8)4 (1f)을 30mL의 메탄올에 용해시키고 0 ℃까지 냉각시켜서 얻어졌다. 디옥산 중의 4N 염산 (120 mL, 480 mmol, 0 ℃까지 냉각함)을 3분이내에 추가하고 얼음중탕을 제거하였다. 20분 후에 메탄올 중의 3N 염산 (200 mL, 600 mmol, 0 ℃까지 냉각함) 을 15분 이내에 추가하고 실온에서 10분간 용액을 교반하였다. 결과용액을 480mL의 차가운 MTBE로 침전시키고 3000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 침전물은 1시간 동안 진공에서 건조시키고, 90mL의 메탄올에 다시 용해시킨 다음, 240mL의 차가운 MTBE로 침전시키고, 현탁액을 3000rpm에서 1분 동안 다시 원심분리하였다. 결과물은 진공에서 건조시켰다.
수율: 옅은 황색의 플레이크 11.5 g (89 %)
MS: m/z = 1104.9 [M+8H]8+ (계산치= 1104.9).
실시예2
크로스링커 시약 2d의 합성
크로스링커 시약 2d는 아디핀산 모노 벤질 에스테르 (English, Arthur R. et al., Journal of MedIcinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347)와 PEG2000을 사용하여 다음 방법으로 준비했다.
Figure pct00011
디클로로메탄 (90.0mL) 중의 벤질 아디페이트 하프-에스테르 (4.8 g, 20.6 mmol) 와 PEG2000 (2a) (11.0 g, 5.5 mmol) 이 혼합된 용액을 0°C로 냉각시켰다. 디사이클로헥실카보디이미드 (4.47 g, 21.7 mmol) 를 추가하고 촉매용량의 DMAP (5mg) 을 추가한 다음에 용액을 교반하고, 하룻밤 동안 (12시간) 동안 두어 실온의 온도가 되게 하였다. 플라스크는 +4°C에서 5시간 동안 보관하였다. 고체는 여과시키고 용매는 진공에서 완전히 제거되게 하였다. 잔여물은 1000 mL의 1/1(v/v) 에테르/ 에틸아세테이트에 용해시키고 소량의 얇은 조각모양의(flacky) 고체가 형성되는 동안 실온에서 2시간 보관하였다. 이 고체는 Celcite® 패드를 통하여 여과하여 제거하였다. 용액은 단단히 잠근 플라스크에 담아 냉동고에서 -30℃로 12시간동안 결정화가 마무리될때까지 두었다. 결정성 결과물은 유리 프리트를 통해 여과하고 차가운 에테르 (-30℃)로 세척하였다. 필터케이크는 진공에서 건조하였다.
수율: 무색의 고체 11.6 g (86 %) 2b. 결과물은 추가의 정제과정 없이 다음단계에 사용하였다.
MS: m/z 813.1 = [M+3H]3+ (계산치= 813.3)
500ml의 유리 고압멸균기에서 PEG2000-비스-아디프산-비스-벤질 에스테르 2b(13.3g, 5.5mmol)를 에틸 아세테이트(180mL)에 용해시키고 차콜상 10% 팔라듐(0.4g)을 추가하였다. 용액을 수소의 소모가 멈출 때까지 (5-12시간). 6bar, 40℃에서 수소화시켰다. Celite® 패드로 여과하여 촉매를 제거하고 용매는 진공에서 증발시켰다. 수율: 황색의 오일 2c 12.3g(정량적). 결과물은 추가의 정제없이 다음단계에 사용하였다.
MS: m/z 753.1 = [M+3H]3+( 계산치= 753.2)
75mL의 DCM(무수) 중의 PEG2000-비스-아디프산 하프 에스테르 2c (9.43 g, 4.18 mmol), N-하이드록시숙신이미드(1.92 g, 16.7 mmol), 디사이클로헥실카보디이미드 (3.44 g, 16.7 mmol) 용액을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고 침전물은 여과하여 제거하였다. DCM를 증발시키고, 잔여물은 THF로부터 재결정화하였다.
수율: 무색의 고체상태인 크로스링커 시약 2d 8.73 g (85%)
MS: m/z 817.8 = [M+3H]3+ (계산치 = 817.9).
실시예3
자유 아미노기를 포함하는 저밀도 하이드로겔 비즈 3a 의 제조
10.80mL DMSO 중의 900mg의 2d와 300mg의 1g의 용액을 80mL의 헵탄에 녹인 100 mg Arlacel P135 (Croda International PIc)용액에 첨가했다. 이 혼합물을 주문제작한 금속 교반기로 700rpm속도로 실온에서 10분간 교반하여 현탁액을 만들었다. 1.1 mL Ν,Ν,Ν',Ν'-테트라메틸렌 디아민(TMEDA)을 추가하여 중합반응을 수행하였다. 2시간후에 교반기의 속도를 400rpm으로 줄이고 혼합물을 16시간 더 교반하였다. 1.6mL 아세트산을 추가하고 10분후에 50mL의 물을 추가하였다. 5분후에 교반기를 멈추고 수성층을 따라내었다.
비드 사이즈를 분류하기 위해서, 물-하이드로겔 현탁액을 75, 50, 40, 32 및 20 μm 강철체에 습식분체하였다. 32, 40 및 50 μm체에 남겨진 비즈 분획들은 한데 모아서 물로 3번 세척하고, 에탄올로 10번 세척하여 0.1mbar에서 16시간동안 건조하여 백색분말의 3a를 수득하였다.
자유 아미노기를 포함하는 중밀도 하이드로겔 비즈 3b 의 제조
28.6mL DMSO 중의 3840mg의 2d와 1200mg의 1g의 용액을 100mL의 헵탄 중의 425 mg Arlacel P135 (Croda International PIc)용액에 첨가했다. 이 혼합물을 주문제작한 금속 교반기로 650rpm속도로 실온에서 10분간 교반하여 현탁액을 만들었다. 4.3 mL Ν,Ν,Ν',Ν'-테트라메틸렌 디아민(TMEDA) 를 추가하여 중합반응을 수행하였다. 2시간 후에 교반기의 속도를 400rpm으로 줄이고 혼합물을 16시간 더 교반하였다. 6.6mL 아세트산을 추가하고 10분 후에 50mL의 물을 추가하였다. 5분 후에 교반기를 멈추고 수성층을 따라내었다.
비즈 사이즈를 분류하기 위해서, 물-하이드로겔 현탁액을 63, 50, 40, 32 및 20 μm 강철체에 습식분체하였다. 32, 40 및 50 μm 체에 남겨진 비즈 분획들은 한데 모아서 물로 3번 세척하고, 에탄올로 10번 세척하여 0.1mbar에서 16시간 동안 건조하여 백색분말의 3b 2.86g을 수득하였다.
자유 아미노기를 포함하는 고밀도 하이드로겔 비즈 3c 의 준비
24.0mL DMSO 중의 3600mg의 2d와 2400mg의 1g의 용액을 110mL의 헵탄 중의425 mg Arlacel P135 (Croda International PIc)용액에 첨가했다. 이 혼합물은 주문 제작한 금속 교반기로 850rpm속도로 실온에서 10분간 교반하여 현탁액을 만들었다. 8.6 mL Ν,Ν,Ν',Ν'-tertramethylene dIamine (TMEDA) 를 추가하여 중합반응을 수행하였다. 2시간 후에 교반기의 속도를 400rpm으로 줄이고 혼합물을 16시간 더 교반하였다. 13.2mL 아세트산을 추가하고 10분 후에 50mL의 물을 추가하였다. 5분 후에 교반기를 멈추고 수성층을 따라내었다.
비즈 사이즈를 분류하기 위해서, 물-하이드로겔 현탁액을 63, 50, 40, 32 및 20 μm 강철체에 습식분체하였다. 32, 40 및 50 μm 체에 남겨진 비즈들은 한데 모아서 물로 3번 세척하고, 에탄올로 10번 세척하여 0.1mbar에서 16시간동안 건조하여 백색분말의 3c 3.00g을 수득하였다.
예시 4
하이드로겔 비즈의 제조 및 감마선 조사 (4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k)
필터가 장착된 시린지에 건조된 하이드로겔 3a의 20mg 분량을 다음의 보호용매로 다섯번 세척하였다: NMP (4a), 디에틸렌 글리콜 디에틸 에테르 (DGDE) (4b), DMSO (4c), 수 중의 0.1 %아세트산 (4d).
비슷한 방법으로 필터가 장착된 시린지에, 건조된 하이드로겔 3b의 20mg 분량을 다음의 보호용매로 다섯번 세척하였다: DMI (4f), DMA (4g), NMP + 0.5 vol % 1-프로필아민(4h), NMP + 0.5 vol % 2-아미노에탄올 (에탄올아민) (4i), NMP + 0.1 vol % 아세트산 (4j),또는 0.2 M AcOH 과 0.1 M 프로필아민 포함하는 NMP(4k).
마지막 세척후 시린지를 잠그고 하이드로겔 비즈를 조금 과량의 보호용매로 팽윤시켜두었다.
추가로, 하이드로겔 3a의 건조된 표본을 건조시킨상태에서 조사하여 4e를 얻었다. 표본은 실온에서 40 kGy (4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f) 나 32 kGy (4g, 4h, 4i, 4j, 4k) (조사원: Co 60) 의 양으로 감마선 처리를 하였다. 그리고 나서, 표본은 에탄올로 5번 세척하고 0.1mbar에서 16시간동안 건조시켰다.
실시예 5
아미노 함량의 측량
0.9 mL의 아세토니트릴에 Fmoc-Asp(Otbu)-OSu (49 mg, 116 μmol)을 용해시키고, pH7.4의 50mM 인산나트륨 완충용액 0.5mL을 추가하였다. 이 용액을 20mg 시린지 반응기 중의 하이드로겔 3a, 4a를 첨가하고 주위온도에서 30분간 진탕하였다. 그 후에, 이 하이드로겔을 acetonitrile/water 2:1 (v/v)로 10번 DMP로 10번 세척하였다.
DMF/DBU 98/2 (v/v)로 10분간 세번 진탕시키고, DMF/DBU 98/2(v/v)로 10번 세척하여 Fmoc-기를 절단해냈다. 모든 분획을 한데 모아서 DMF로 희석시키고, 295nm에서 UV흡광도를 측정하여 9-메틸렌 플루오렌의 양을 결정하였다. 흡광계수는 9141Lmol-1cm-1 을 사용하였다
3a의 아미노 부하량: 0.13 mmol/g
감마선 처리후 4a의 아미노 부하량: 0.12 mmol/g
Fmoc-Asp(OtBu)-OSu대신 Fmoc-Gly-OSu를 사용해도 아미노 부하량은 같게 나왔다.
실시예 6
하이드로겔 비즈의 가속화된 시험관내 분해 분석
가속화된 조건에서, 살균후의 하이드로겔 비즈 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k 와 3a,3b(기준물질, 살균하지 않음) 의 시험관내 분해 역학은 37 ℃ 의 조건 (3a, 4a, 4b, 4c, 4d,4e)에서 0.5 mL 0.5 M 탄산나트륨완충용액 pH 10.3에 각 표본을 5mg 배양함으로써 측정하였다. 대안적으로, 가속화된 시험관내 분해를 (3b, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j 및 4k)위해서 37 ℃의 조건에서 0.5mL, 0.5M 붕산나트륨완충용액 pH 9.0, 를 사용하였다. 일정한 시간간격을 두고 시료를 채취하여 SEC로 분석하였다. 하나이상의 백본 모이어티를 포함하는, 하이드로겔의 유리된 수용성 분해결과물에 해당하는 UV신호를 통합하여 배양시간에 대하여 그래프를 그렸다. (도 1)
Figure pct00012

실시예 7
감마선 처리가 된 팔리페리돈이 충진된 하이드로겔 6의 제조
팔리페리돈이 충진된 하이드로겔 5는 국제특허 PCT/EP2010/064874에 기술된 방법대로 하이드로겔 3c에 리신을 사용하여 변화시킨 다음에 팔리페리돈-글루타릴 에스테르 커플링 방법을 사용하여 제조하였다. 건조된 하이드로겔 비즈 5를 20mg 덜어 필터가 장착된 시린지 중의 건조된 하이드로겔 비즈 5의 20mg 분량을 제형완충용액(85 g/l 트레할로스 디하이드레이트, 50 mM 숙시네이트/트리스 완충용액pH 5.0, 0.05 % Tween 20, 1 mM EDTA)으로 다섯번 세척하였다. 마지막 세척 단계 후에, 시린지를 닫고, 약간 과도한 보호 용매로 부푼 하이드로겔 비드를 남겨두었다. 표본은 드라이아이스 상(bed)에서 40 kGy (조사원: Co 60)의 양으로 감마선 처리를 시행하였다. 그 후에 하이드로겔 6은 제형완충용액으로 다섯번 세척하고, 물로 다섯번 세척하고, 에탄올로 다섯번 세척하여 0.1mbar에서 16시간동안 건조하였다.
실시예 8
pH9 및 37℃에서, 방사선 처리가 된 6의 시험관내 분해
가속화된 조건에서, 하이드로겔 6(살균후) 와 기준 5(살균하지 않음)의 시험관내 분해 역학은 37 ℃에서 1.0 mL 0.5 M 붕산나트륨 완충용액 pH 9.0 에서 각각의 표본을 2mg씩 배양하여 측정하였다. 일정한 시간간격을 두고 시료를 채취하여 SEC로 분석하였다. 하나이상의 백본 모이어티를 포함하는, 하이드로겔의 유리된 수용성 분해물에 해당하는 UV신호 (215 nm)를 통합하여 배양시간에 대하여 그래프를 그렸다. 분해 양상에서 단지 작은 편차만이 관찰되었다 (도 2) .
실시예 9
조사된 하이드로겔 6에서 유리된 팔리페리돈의 품질
37 ℃에서, 조사된 팔리페리돈-링커-하이드로겔 6 1mg을 pH 7.4의 인산 완충용액 (60 mM, 3 mM EDTA, 0.01% Tween-20) 1.5mL 에서 배양하였다. 4d 후에 Waters BEH C18 column, 50 x 2.1 mm I.D., 1.7 μm 입자크기를 장착한 HPLC A Waters Acquity UPLC를 이용하여 상층액에 유리된 팔리페리돈의 품질을 측정하였다. 용매 A: 수 중 0.05% TFA, 용매 B: 아세토니트릴 중 0.04% TFA. 선형그라디언트 0-50% B 를 4분간 주었다. 팔리페리돈의 순도는 95%로 확인되었다(215nm).
약어:
AcOEt 에틸 아세테이트
AcOH 아세트산
Asp 아스파트 산
Boc t-부틸옥시카르보닐
DBU 1,8 - 디아자비사이클로[5.4.0]운덱-7-엔
DCC 디사이클로헥실카르보디이미드
DCM 디클로로메탄
DGDE 디에틸렌 글리콜 디에틸 에테르
DMA N,N-디에틸아세트아마이드
DMAP 디메틸아미노-피리딘
DMF N,N-디메틸포름아마이드
DM I 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논
DMSO 디메틸설폭사이드
EDC 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드
ESI 전기분무이온화
eq 화학당량방정식
EtOH 에탄올
Fmoc 플루오레닐메톡시카르보닐
HOBt N-하이드록시벤조트리아졸
iPrOH 이소프로판올
kGy 킬로그레이
LCMS 액체크로마토그래피 탠덤 질량분석법
MeOH 메탄올
MS 질량스펙트럼
MTBE 메틸 삼차-부틸 에테르
MW 분자량
NHS N-하이드록시 썩시마이드
NMP N-메틸-2-피롤리디논
OtBu 삼차-부틸옥시
OSu N-하이드록시 썩시니미딜
PEG 폴리(에틸렌 글리콜)
PyBOP 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포니움-헥사플루오로포스페이트
RP-HPLC 역위상 고성능 액체 크로마토그래피
RT 실온
SEC 크기 배제 크로마토그래피
tBu 삼차 부틸
TFA 삼불화아세트산
THF 테트라하이드로퓨란
TMEDA Ν,Ν,Ν',Ν'-테트라메틸렌 디아민
UV 자외선
VIS 육안

Claims (19)

  1. 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 상호 연결된 백본 모이어티를 포함하는 생분해성 폴리(에틸렌 글리콜)계 불용성 하이드로겔을 살균하는 방법으로서,
    (a) 하이드로겔을 제공하는 단계;
    (b) 보호용매 또는 2종 이상의 보호용매의 혼합 또는 이의 수용액에서, 상기 하이드로겔을 용매화하는 단계;
    (c) 상기 용매화된 하이드로겔에 감마선을 처리하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 보호용매는 아세트산(수용액, 0.05-1% (v/v)), 아세토니트릴, 4-아세틸모르폴린, 디메틸설폭사이드, 디클로로메탄, N,N-디메틸아세트아미드, 디메틸카보네이트, 디메틸포름아미드, 1-에틸-2-피롤리돈, N-에틸아세트아미드, N-에틸포름아미드, 4-포르밀모르폴린, 1-포르밀피롤리돈, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2(1H)-피리미디논, 알킬 알코올, 포름아미드, 헥사메틸포스포아미드, N-메틸아세트아미드, 니코틴아미드(수용액 0.1-5% (w/w)), 피리독신(수용액, 0.1-5% (w/w)), N-메틸포름아미드, NMP, 1,2-프로필렌 카보네이트, 테트라하이드로퓨란, 설포란, 물, 또는 이들의 혼합물인 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 보호용매는 NMP, DMA, DMF 또는 DMI인 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 살균은 5 내지100 kGy 양의 감마선으로 이루어지는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 살균은 8 내지 50 kGy 양의 감마선으로 이루어지는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔은 저분자 생물학적 활성 모이어티를 가지는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔의 백본 모이어티가 각각 1 kDa 내지 20 kDa의 분자량의 범위인 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔의 백본 모이어티는 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 상호 연결되고, 상기 백본 모이어티가 크로스링커 모이어티를 통해 서로 연결되고, 각 크로스링커 모이어티는 2 이상의 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 종결되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가수분해적으로 분해가능한 결합은 카르복실산에스테르, 카보네이트, 포스포에스테르 또는 술폰산 에스테르인 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 크로스링커 모이어티는 60 Da 내지 5 kDa 범위의 분자량을 가지는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 PEG 계 불용성 하이드로겔의 백본 모이어티는 하기 화학식의 브랜칭 코어를 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00013

    여기서, 상기 파선은 백본 모이어티의 잔여부분에 부착된 것을 나타냄.
  12. 제1항 내지 제11중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 PEG 계 불용성 하이드로겔의 백본 모이어티는, 하기 화학식의 구조를 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00014

    식 중, n은 5 내지 50의 정수이고 파선은 분자의 나머지 부분에 부착된 것을 나타냄.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 PEG 계 불용성 하이드로겔의 백본 모이어티는 과분지된 모이어티 Hyp를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 생분해성 PEG 계 불용성 하이드로겔의 백본 모이어티는 하기 화학식의 과분지된 모이어티 Hyp를 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00015

    식 중, 상기 파선은 분자의 나머지 부분에 부착된 것을 나타내고, 별표 (*) 표시된 탄소원자는 S-배위(S-configuration)를 나타냄.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 백본 모이어티는 하기 화학식의 하나 이상의 스페이서에 부착되는 것인 방법:
    Figure pct00016

    식 중, 파선 중 하나는 과분지된 모이어티 Hyp에 부착된 것을 나타내고, 두번째 파선은 분자의 나머지 부분에 부착된 것을 나타내고; 여기서 m은 2 내지 4의 정수이다.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백본 모이어티는 하기 구조를 포함하는 크로스링커 모이어티를 통해 서로 연결된 것인 프로드러그:
    Figure pct00017

    식 중, q는 3 내지 100의 정수임.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호용매는 하나 이상의 보호제제를 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 보호제제는 프로필아민, 부틸아민, 펜틸아민, sec.부틸아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 세리놀, 트리스하이드록시메틸-아미노메탄, 아세트산, 포름산, 아스코르빈산, 글리신아미드, 피발산, 프로판산, 숙신산, 글루타르산, 아디핀산, 티오글리세린, 디티오트레이톨, 머캅토에탄올, 환원된 글루타치온에서 선택되는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능한 살균된 생분해성 PEG계 불용성 하이드로겔.
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2769162C (en) * 2009-07-31 2017-12-05 Ascendis Pharma As Biodegradable polyethylene glycol based water-insoluble hydrogels
KR101759499B1 (ko) 2009-07-31 2017-07-19 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 지속형 인슐린 조성물
EP2459228B1 (en) 2009-07-31 2020-03-04 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an insulin linker conjugate
WO2011044421A1 (en) 2009-10-08 2011-04-14 C. R. Bard, Inc. Spacers for use with an ultrasound probe
WO2011051406A1 (en) * 2009-10-29 2011-05-05 Ascendis Pharma As Sterilization of biodegradable hydrogels
CA2806353A1 (en) 2010-08-09 2012-02-16 C.R. Bard Inc. Support and cover structures for an ultrasound probe head
EP2438930A1 (en) 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
USD699359S1 (en) 2011-08-09 2014-02-11 C. R. Bard, Inc. Ultrasound probe head
US11021733B2 (en) 2011-09-26 2021-06-01 Qiagen Gmbh Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
AU2012314515B2 (en) 2011-09-26 2018-03-15 Preanalytix Gmbh Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids
US9211107B2 (en) 2011-11-07 2015-12-15 C. R. Bard, Inc. Ruggedized ultrasound hydrogel insert
EP2861153A4 (en) 2012-06-15 2016-10-19 Bard Inc C R APPARATUS AND METHODS FOR DETECTION OF A REMOVABLE CAP ON AN ULTRASONIC PROBE
US10724074B2 (en) 2012-09-25 2020-07-28 Qiagen Gmbh Stabilisation of biological samples
EP2910600B1 (en) * 2012-10-19 2017-12-06 Daicel Polymer Ltd. Cellulose ester composition
MX2015012114A (es) 2013-03-08 2016-01-12 Genzyme Corp Fabricacion continua integrada de principios activos proteinicos terapeuticos.
EP2976425B1 (en) 2013-03-18 2019-11-06 Qiagen GmbH Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
JP6381628B2 (ja) 2013-03-18 2018-08-29 キアゲン ゲーエムベーハー 生物試料の安定化
TWI709570B (zh) 2014-01-17 2020-11-11 美商健臻公司 無菌層析法及製法
TWI709569B (zh) * 2014-01-17 2020-11-11 美商健臻公司 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途
US20170274012A1 (en) * 2014-09-03 2017-09-28 Entegrion, Inc. Acceleration of Reconstitution of Plasma Powder by Mixing with Small Beads
IL254158B2 (en) 2015-02-25 2023-04-01 Decision Sciences Medical Company Llc Acoustic signal transmission couplers and coupling means
CN107750274A (zh) 2015-06-08 2018-03-02 康宁股份有限公司 用于水凝胶微载体的干燥制剂
US11203777B2 (en) 2015-11-20 2021-12-21 Qiagen Gmbh Method of preparing sterilized compositions for stabilization of extracellular nucleic acids
JOP20190245A1 (ar) 2017-04-20 2019-10-15 Novartis Ag أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط
JP2021536353A (ja) 2018-08-31 2021-12-27 ジェンザイム・コーポレーション 無菌クロマトグラフィー樹脂および製造方法におけるその使用
TW202027794A (zh) 2018-10-03 2020-08-01 瑞士商諾華公司 血管生成素樣３多肽之持續遞送
US20200248124A1 (en) 2019-02-05 2020-08-06 Corning Incorporated Methods of culturing cells on woven cell culture substrates and bioreactors using the same
US20220134608A1 (en) * 2019-03-06 2022-05-05 Decision Sciences Medical Company, LLC Methods for manufacturing and distributing semi-rigid acoustic coupling articles and packaging for ultrasound imaging
WO2020219705A1 (en) 2019-04-23 2020-10-29 Allan Wegner Semi-rigid acoustic coupling articles for ultrasound diagnostic and treatment applications
US11118151B2 (en) 2019-11-05 2021-09-14 Corning Incorporated Fixed bed bioreactor and methods of using the same
CN111171339B (zh) * 2019-12-18 2022-07-05 青岛大学 一种可注射水凝胶前驱液的制备方法可注射水凝胶及其应用
ES2952213T3 (es) 2020-02-06 2023-10-30 Ocular Therapeutix Inc Composiciones y métodos para tratar enfermedades oculares
MX2022010333A (es) 2020-03-25 2022-12-08 Ocular Therapeutix Inc Implante ocular que contiene un inhibidor de la tirosina cinasa.
WO2021224169A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Ascendis Pharma A/S Hydrogel irradiation
CN115160599B (zh) * 2022-08-03 2023-06-02 苏州大学 一种按需降解的聚多巴胺交联聚乙二醇水凝胶材料及其制备方法与应用

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2539135B1 (fr) 1983-01-11 1986-02-28 Essilor Int Hydrogels de polyurethane et procede de fabrication
JPH0611290B2 (ja) 1986-11-05 1994-02-16 住友ベークライト株式会社 ポリビニルアルコ−ルゲルのγ線滅菌法
US5634943A (en) 1990-07-12 1997-06-03 University Of Miami Injectable polyethylene oxide gel implant and method for production
US5514379A (en) 1992-08-07 1996-05-07 The General Hospital Corporation Hydrogel compositions and methods of use
US5705780A (en) 1995-06-02 1998-01-06 Howmedica Inc. Dehydration of hydrogels
US20020064546A1 (en) 1996-09-13 2002-05-30 J. Milton Harris Degradable poly(ethylene glycol) hydrogels with controlled half-life and precursors therefor
US6566406B1 (en) 1998-12-04 2003-05-20 Incept, Llc Biocompatible crosslinked polymers
GB9724055D0 (en) 1997-11-15 1998-01-14 Dow Corning Sa Curable polysiloxane compositions
AU1249001A (en) 1999-06-11 2001-01-31 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrogels derived from chitosan and poly(ethylene glycol) or related polymers
CN1121876C (zh) * 1999-08-12 2003-09-24 中国原子能科学研究院 水凝胶复合型创伤敷料及其辐射合成方法
US6537569B2 (en) 2001-02-14 2003-03-25 Microvention, Inc. Radiation cross-linked hydrogels
EP1306127B2 (en) 2001-10-26 2011-09-07 OctoPlus PolyActive Sciences B.V. Method for the preparation of purified microparticles
EP1525890A1 (en) 2003-10-02 2005-04-27 Complex Biosystems GmbH Protein-Proteophore complexes
DK1732607T3 (da) 2004-03-23 2019-07-22 Ascendis Pharma Gmbh Polymer-prodrug med en selvofrende linker
US7968085B2 (en) 2004-07-05 2011-06-28 Ascendis Pharma A/S Hydrogel formulations
JPWO2006038462A1 (ja) 2004-10-01 2008-05-15 国立大学法人九州大学 新規ステロイド産生細胞
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
JP2008228744A (ja) * 2005-06-23 2008-10-02 Osaka Prefecture Univ 生体由来移植用組織の石灰化を抑制するための処理方法および処理された組織
EP1840152B1 (en) 2006-03-31 2009-07-08 Sony Deutschland Gmbh A method of forming a crosslinked polymer gel
US20070275030A1 (en) * 2006-05-25 2007-11-29 The General Hospital Corporation Dba Massachusetts General Hospital Anti-cross-linking agents and methods for inhibiting cross-linking of injectable hydrogel formulations
US9353170B2 (en) 2007-06-08 2016-05-31 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Long-acting transient polymer conjugates of exendin
US8318695B2 (en) 2007-07-30 2012-11-27 Allergan, Inc. Tunably crosslinked polysaccharide compositions
DK2237799T3 (da) 2008-02-01 2019-06-11 Ascendis Pharma As Prodrug omfattende en selv-spaltbar linker
EP2247645B1 (en) * 2008-02-13 2017-12-06 Hyperbranch Medical Technology, Inc. Crosslinked polyalkyleneimine hydrogels with tunable degradation rates
SI2279007T1 (sl) 2008-04-29 2016-09-30 Ascendis Pharma Growth Disorders Division A/S Spojine pegiliranega rekombinantnega humanega rastnega hormona
AU2010220324A1 (en) 2009-03-05 2011-09-01 Ascendis Pharma As Interferon alpha carrier prodrugs
CA2769162C (en) 2009-07-31 2017-12-05 Ascendis Pharma As Biodegradable polyethylene glycol based water-insoluble hydrogels
WO2011051406A1 (en) * 2009-10-29 2011-05-05 Ascendis Pharma As Sterilization of biodegradable hydrogels

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Publication number Publication date
BR112012010249A2 (pt) 2015-09-22
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US20120253071A1 (en) 2012-10-04
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KR101756493B1 (ko) 2017-07-10
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MY157640A (en) 2016-07-15
JP5893566B2 (ja) 2016-03-23
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AU2010311421B2 (en) 2014-11-20
US20150196667A1 (en) 2015-07-16
US9278139B2 (en) 2016-03-08

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