CN112675314A - 一种骨靶向纳米胶束递送系统及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨靶向纳米胶束递送系统及其制备方法，属于药物制剂技术领域。所述骨靶向纳米胶束递送系统包括聚多糖交联形成的纳米胶束和包载在纳米胶束内的抗肿瘤药物，在所述纳米胶束表面吸附有胶原酶；所述聚多糖为修饰有骨靶向氨基酸、精氨酸和脂肪酸的多糖分子。采用该纳米胶束包载有抗肿瘤药物，可通过EPR被动效应和骨靶向氨基酸主动靶向双重靶向，降解骨肿瘤部位胶原微环境，实现双重协同作用治疗骨肿瘤。

Description

一种骨靶向纳米胶束递送系统及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种骨靶向纳米胶束递送系统及其制备方法。

背景技术

骨肉瘤是一种多发于青少年的恶性骨肿瘤，起源于原始成骨的间叶组织。临床研究表明，骨肉瘤早期会出现局部疼痛、肿胀、活动受限等症状，后期会出现恶液质现象。骨肉瘤具有病情发展迅速、容易转移、预后治疗差、容易复发等特点，现有的医疗体系中，针对骨肉瘤的临床治疗手段有限、治疗效果不理想。目前，临床骨肉瘤常用的治疗方法包括手术治疗、放射治疗和化疗。

手术治疗是最基础、最传统、最经典的治疗方式，也是临床治疗骨肉瘤的主要手段，但是手术治疗无法完全切除肿瘤的边界组织和潜在的微小肿瘤病灶，存在肿瘤复发和转移的风险。手术治疗同时会损伤骨组织和关节，影响患者的运动功能。放射治疗是一种运用各种放射线(α、β、γ、X线及各种高能粒子射线等)的作用破坏细胞或抑制其生长，从而到达治疗目的的方法。放疗会对正常组织产生不良影响，此外，骨肉瘤对于射线的敏感性较差，较难达到明显的治疗效果，因此放疗常常用于化疗阶段前的辅助治疗。化疗即为化学治疗，是指通过现有的化学药物治疗疾病，也是临床上用于肿瘤治疗的常用手段之一。紫杉醇、甲酰四氢叶酸、阿霉素、甲氨蝶呤、顺铂和异环磷酰胺等，是常见的可以用于骨肉瘤临床治疗的化学药物。但是，目前存在的肿瘤细胞耐药、药物靶向性差、药物毒副作用大、药物靶点过于广泛等问题，使得化疗的进一步发展受限。

近年来，随着纳米技术的逐渐成熟，纳米材料逐渐被用于骨肉瘤的治疗。在这个概念中，利用经过修饰的载体包裹化疗药物递送至肿瘤部位达到杀灭肿瘤的效果。纳米材料递送化疗药物具有稳定性高、毒副作用小、生物相容性良好和易生物降解等特点。因此利用纳米技术治疗骨肉瘤具有较好的前景。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种新型骨靶向纳米胶束递送系统及其制备方法。该纳米胶束由修饰有脂肪酸、骨靶向氨基酸和精氨酸的聚多糖交联形成，可实现通过EPR被动靶向和骨靶向氨基酸的主动靶向作用双重靶向，同时在纳米胶束表面还吸附有胶原酶，可通过降解肿瘤部位的胶原微环境达到深层渗透的效果。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种骨靶向纳米胶束递送系统，包括聚多糖交联形成的纳米胶束和包载在纳米胶束内的抗肿瘤药物，在所述纳米胶束表面吸附有胶原酶，所述胶原酶和纳米胶束的质量比为0.1-2：1；

所述聚多糖为修饰有骨靶向氨基酸、精氨酸和脂肪酸的多糖分子，所述多糖分子的分子量为5-50 kD，脂肪酸在多糖分子上的摩尔取代度为5%-50%，骨靶向氨基酸在多糖分子上的摩尔取代度为5%-20%，精氨酸在多糖分子上的摩尔取代度为5%-30%；

进一步地，所述多糖分子选自糊精、羟乙基淀粉、聚乙二醇、透明质酸、葡聚糖、壳聚糖或海藻酸。

进一步地，所述骨靶向氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。

进一步地，所述脂肪酸为月桂酸。

进一步地，所述抗肿瘤药物为含有芳香环的抗肿瘤药物，选自喜树碱、阿霉素盐酸盐、紫杉醇、多西紫杉醇、甲氨喋呤或姜黄素。

进一步地，所述胶原酶为胶原酶Ⅰ或胶原酶Ⅲ。

上述骨靶向纳米胶束递送系统的制备方法，包括以下步骤：

(1)在脱水剂和催化剂存在下，脂肪酸和多糖分子在极性溶剂中发生酯化反应，得到侧链修饰有脂肪酸的多糖分子；

(2)在脱水剂和催化剂的存在下，Boc保护的骨靶向氨基酸和N-Boc保护的二胺在极性溶剂中发生酰胺化反应，得到修饰有氨基的骨靶向氨基酸小分子；

(3)在催化剂的存在下，丁二酸酐与步骤(1)中合成的多糖分子在极性溶剂中发生酯化反应，得到侧链修饰有脂肪酸和羧基的多糖分子；

(4)在脱水剂和催化剂的存在下，步骤(2)得到的小分子和步骤(3)得到的多糖大分子在极性溶剂中发生酰胺化反应，得到侧链修饰有骨靶向氨基酸、脂肪酸和羧基的多糖分子；

(5)在脱水剂和催化剂存在的条件下，精氨酸和步骤(4)的多糖分子在极性溶剂中发生酰胺化反应，得到侧链修饰有精氨酸、骨靶向氨基酸、脂肪酸和羧基的多糖分子；

(6)将步骤(5)得到的产物和抗肿瘤药物一起溶解在有机溶剂中，搅拌条件下将溶液逐滴加入到含水溶液中，制得载药的纳米胶束；

(7)将胶原酶溶于含水溶液中，搅拌条件下逐滴加入步骤(6)的纳米胶束中，即可得到骨靶向纳米胶束递送系统。

进一步地，所述脱水剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或二环己基碳二亚胺，所述催化剂为二甲氨基吡啶或N-羟基琥珀酰亚胺，所述极性溶剂选自二甲亚砜、无水二甲基甲酰胺或四氢呋喃；所述N-Boc保护的二胺中二胺供体选自乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺或己二胺。

进一步地，步骤(6)中，所述有机溶剂选自二甲亚砜、四氢呋喃或二甲基甲酰胺，所述含水溶液选自水、5 wt.%葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液，步骤(5)得到的产物与抗肿瘤药物的质量比为1-100：1。

进一步地，步骤(7)中，所述含水溶液选自水、5 wt.%葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液，胶原酶和纳米胶束的质量比为2-10：1。

本发明的骨靶向纳米胶束递送系统给药剂量为1-15 mg/kg，可每2-6天静脉注射或腹腔注射进入体内。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的一种基于双管齐下疗法治疗骨肉瘤的葡聚糖纳米胶束。在传统化疗药物治疗肿瘤的基础上联合使用胶原酶，能够使纳米药物在杀死肿瘤的同时达到肿瘤深层部位发挥治疗效果，为肿瘤的治疗提供了一种新的思路。

(2)本发明提供了一种用于治疗骨肉瘤的葡聚糖纳米胶束，采用自组装方法制备，无需过于复杂的操作和设备，制备方法简单。同时，所用的主要原料均安全无毒，所制备的葡聚糖纳米胶束具有良好的生物相容性，较好的提高了细胞的摄取能力，是一种具有较好疗效且低毒的药物制剂。

(3)因此本发明能够简便高效的制备一种具有深层渗透能力的葡聚糖纳米胶束，具有潜在的医用前景。

附图说明

图1为己二胺-天冬氨酸(A)、己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DSAA)(B)制备和结构示意图。

图2为吸附有胶原酶的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖包载抗肿瘤化疗药物紫杉醇的纳米胶束示意图。

图3为月桂酸葡聚糖(DL)的核磁氢谱图(A)和羧基葡聚糖(DS)的核磁氢谱图(B)。

图4为己二胺-天冬氨酸小分子(DA)的质谱图。

图5为己二胺-天冬氨酸葡聚糖(DDA)的核磁氢谱图。

图6为己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DDAA)的元素分析结果。

图7为包载紫杉醇的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束的粒径分布及透射电镜图。

图8为分别吸附有胶原酶的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DDAA)、己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖(DDGA)、乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DEAA)和乙二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖(DEGA)进行三种不同质量比w/w紫杉醇(聚合物/紫杉醇)封装的制剂的粒径(A)和分别吸附有胶原酶的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖、己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖、乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖和乙二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束的电位(B)。

图9吸附有胶原酶的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束的细胞安全性和载药胶束对肿瘤细胞杀伤能力的统计图。

图10为己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DDAA)、己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖(DDGA)、乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DEAA)和乙二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖(DEGA)纳米胶束体外骨靶向能力的考察。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束递送系统的制备方法

(1)称取200 mg葡聚糖溶于2 mL二甲亚砜，随后加入206 mg二环己基碳二亚胺、24mg 4-二甲氨基吡啶以及260 mg月桂酸，混合溶液在惰性气体保护下反应12-24 h，抽滤去除不溶物，将反应液加入至10倍量的无水乙醚中，并于4500 rpm离心10 min，收集离心管底部的白色沉淀并用10 mL去离子水溶解，透析过夜，并冻干，得月桂酸修饰的葡聚糖(DL)。

(2)称取289.5mg N-Boc天冬氨酸、88 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、47 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及116 mg Boc-己二胺溶于二甲亚砜中，室温反应4-24h 后，用饱和碳酸钠溶液和盐酸洗液两次，加入无水硫酸钠过夜。过滤上述混合物，旋干液体，加入3 mL 二氯甲烷和0.5 mL 三氟乙酸，通风橱内搅拌2 h-6 h，旋干即得己二胺-天冬氨酸。

(3)将步骤(1)获得的月桂酸葡聚糖加2 mL二甲亚砜溶解，加50 mg丁二酸酐，混合溶液在惰性气体保护下反应6 h-12 h，按照步骤(1)的方式纯化得羧基葡聚糖(DS)。

(4)将步骤(3)获得的羧化葡聚糖加5 mL二甲亚砜溶解，随后加入198 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、127 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及步骤(2)获得的己二胺-天冬氨酸，混合溶液在惰性气体保护下反应6-12 h，按照步骤(1)的方式纯化得己二胺-天冬氨酸葡聚糖(DDA)。

(5)将步骤(4)获得的己二胺-天冬氨酸葡聚糖加10 mL水溶解，加入228 mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、137 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及40 mg 精氨酸，惰性气体保护下反应12小时，按照步骤(1)的方式纯化得己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖合成物(DDAA)。

(6)取10 mg制备得到的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖合成物以及2 mg紫杉醇共同溶解在100 μL二甲亚砜中，逐滴加入10 mL水溶液中不断搅拌。20 ℃下400W超声3min，即得载有化疗药物紫杉醇的聚合己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束。

(7)将0.5 mg胶原酶溶于水中，逐滴加入步骤(6)所得的溶液中，室温搅拌30 min后，即得吸附有胶原酶的聚合己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束递送系统。

图1为己二胺-天冬氨酸(A)、己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DDAA)(B)制备和结构示意图。

图2为吸附有胶原酶的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖包载抗肿瘤化疗药物紫杉醇的纳米胶束示意图。

图3为月桂酸葡聚糖(DL)的核磁氢谱图(A)和羧基葡聚糖(DS)的核磁氢谱图(B)。由图可知，月桂酸葡聚糖(DL)¹H-NMR谱图显示δ=0.82—0.90峰和δ=1.24峰归为月桂酸上的甲基H峰和亚甲基H峰。羧基葡聚糖(DS) ¹H-NMR谱图显示δ=2.56-2.68峰归为丁二酸亚甲基H峰。这些结果证明DL和DS成功合成。

图4为己二胺-天冬氨酸小分子的质谱图。其分子量为510，由质谱图上显示出的510.4的质谱峰，证明其成功合成。

图5为己二胺-天冬氨酸葡聚糖(DDA)的核磁氢谱图。由图可知， ¹H-NMR谱图显示δ=7.75峰和δ=7.79峰归为己二胺-天冬氨酸小分子上的氨基H峰，证明DDA成功合成。

图6为己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖的元素分析结果图，由图可知，相比于己二胺-天冬氨酸葡聚糖(DDA)聚合物中的N含量，己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DDAA)聚合物中的N含量明显升高，证明精氨酸已经被成功地修饰于己二胺-天冬氨酸葡聚糖(DAA)上。

图7为包载紫杉醇的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束的粒径分布及透射电镜图。通过动态光散射测得的吸附有胶原酶的DDAA纳米凝胶粒径分布如图所示，纳米胶束的粒径为190nm左右，多分散系数为0.21±0.03，说明该系统为均一分布的纳米胶束，这将为递送化疗药物带来优势，纳米胶束以EPR效应富集于肿瘤部位达到治疗效果。同时，纳米胶束的形态学通过透射电镜TEM观察的结果也如图所示。

图8为分别吸附有胶原酶的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DDAA)、己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖(DDGA)、乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DEAA)和乙二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖(DEGA)进行三种不同质量比w/w紫杉醇(聚合物/紫杉醇)封装的制剂的粒径(A)和分别吸附有胶原酶的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DDAA)、己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖(DDGA)、乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DEAA)和乙二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖(DEGA)纳米胶束的电位(B)。结果显示，所有的纳米胶束的粒径均在400 nm以下，吸附有胶原酶的DDAA纳米胶束粒径约为190 nm。所有的纳米胶束的电位均在-10 mV左右。所以，所制备的纳米胶束由于具有较小的粒径和良好的ζ电势，将促进肿瘤细胞摄取药物。

图9吸附有胶原酶的己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束的细胞安全性和载药胶束对肿瘤细胞杀伤能力的统计图。将骨肉瘤细胞和NRK细胞与吸附有胶原酶的DDAA纳米胶束孵育，24 h后统计其细胞存活率，如图所示，吸附有胶原酶的DDAA空载纳米胶束在各个浓度下并未对骨肉瘤细胞和NRK细胞产生明显毒性，证明其具有良好的安全性。将骨肉瘤细胞与载药DSAA纳米胶束和游离紫杉醇共同孵育24 h后统计其细胞存活率。如图所示，载药DDAA纳米胶束相比于游离紫杉醇，IC50值下降，证明其对肿瘤细胞具有较好的杀伤能力。

图10为己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DDAA)、己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖(DDGA)、乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DEAA)和乙二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖(DEGA)纳米胶束体外骨靶向能力的考察。将各组制剂分别与HAP和Ca²⁺共同孵育4 h。结果如图所示，四种纳米胶束都具有一定的骨靶向性，其中己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖(DDAA)对HAP和Ca²⁺的吸附量最高，这可能是由于天冬氨酸自身的结构会与骨主要组成成分HAP和Ca²⁺产生较强的亲和力的原因造成其大量吸附于骨组织上，证明其骨靶向性最优。

实施例2

己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束递送系统的制备方法

(1)称取200 mg葡聚糖溶于2 mL二甲亚砜，随后加入232 mg二环己基碳二亚胺、27mg 4-二甲氨基吡啶以及260 mg月桂酸，混合溶液在惰性气体保护下反应12-24 h，抽滤去除不溶物，将反应液加入至10倍量的无水乙醚中，并于4500 rpm离心10 min，收集离心管底部的白色沉淀并用10 mL去离子水溶解，透析过夜，并冻干，得月桂酸修饰的葡聚糖。

(2)称取303.5mg N-Boc谷氨酸、88 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、47 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及116 mg Boc-己二胺溶于二甲亚砜中，室温反应4-24 h后，用饱和碳酸钠溶液和盐酸洗液两次，加入无水硫酸钠过夜。过滤上述混合物，旋干液体，加入3 mL 二氯甲烷和0.5 mL 三氟乙酸，通风橱内搅拌2 h-6 h，旋干即得己二胺-谷氨酸。

(3)将步骤(1)获得的月桂酸葡聚糖加2 mL二甲亚砜溶解，加50 mg丁二酸酐，混合溶液在惰性气体保护下反应6 h-12 h，按照步骤(1)的方式纯化得羧化葡聚糖。

(4)将步骤(3)获得的羧化葡聚糖加5 mL二甲亚砜溶解，随后加入198 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、127 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及步骤(2)获得的己二胺-谷氨酸，混合溶液在惰性气体保护下反应6-12 h，按照步骤(1)的方式纯化得己二胺-谷氨酸葡聚糖。

(5)将步骤(4)获得的己二胺-谷氨酸葡聚糖加10 mL水溶解，加入242 mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、154mg N-羟基琥珀酰亚胺以及40 mg 精氨酸，混合溶液在惰性气体保护下反应12小时，按照步骤(1)的方式纯化得聚合己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖合成物(DDGA)。

(6)取10mg制备得到的聚合己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖合成物以及2 mg紫杉醇共同溶解在100 μL二甲亚砜中，搅拌下逐滴加入10 mL水溶液中。20 ℃下400W超声3 min，即得载有化疗药物紫杉醇的聚合己二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束。

(7)将0.5 mg胶原酶溶于水中，逐滴加入步骤(6)所得的溶液中，室温搅拌30 min后，即得吸附有胶原酶的聚合己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束递送系统。

实施例3

乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束递送系统的制备方法

(1)称取200 mg葡聚糖溶于2 mL二甲亚砜，随后加入206 mg二环己基碳二亚胺、24mg 4-二甲氨基吡啶以及260 mg月桂酸，混合溶液在惰性气体保护下反应12-24 h，抽滤去除不溶物，将反应液加入至10倍量的无水乙醚中，并于4500 rpm离心10 min，收集离心管底部的白色沉淀并用10 mL去离子水溶解，透析过夜，并冻干，得月桂酸修饰的葡聚糖。

(2)称取289.5mg N-Boc天冬氨酸、88 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、47 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及52 mg Boc乙二胺溶于二甲亚砜中，室温反应4-24 h后，用饱和碳酸钠溶液和盐酸洗液两次，加入无水硫酸钠过夜。过滤上述混合物，旋干液体，加入3 mL 二氯甲烷和0.5 mL 三氟乙酸，通风橱内搅拌2 h-6 h，旋干即得乙二胺-天冬氨酸。

(3)将步骤(1)获得的月桂酸葡聚糖加2 mL二甲亚砜溶解，加50 mg丁二酸酐，混合溶液在惰性气体保护下反应6 h-12 h，按照步骤(1)的方式纯化得羧化葡聚糖。

(4)将步骤(3)获得的羧化葡聚糖加5 mL二甲亚砜溶解，随后加入198 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、127 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及步骤(2)获得的乙二胺-天冬氨酸，混合溶液在惰性气体保护下反应6-12 h，按照步骤(1)的方式纯化得乙二胺-天冬氨酸葡聚糖。

(5)将步骤(4)获得的乙二胺-天冬氨酸葡聚糖加10 mL水溶解，加入220mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、112 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及40 mg 精氨酸，惰性气体保护下反应12小时，按照步骤(1)的方式纯化得聚合乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖合成物(DEAA)。

(6)取10mg制备得到的聚合乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖合成物以及2 mg紫杉醇共同溶解在100 μL二甲亚砜中，逐滴加入10 mL水溶液中不断搅拌。20 ℃下400W超声3min，即得载有化疗药物紫杉醇的聚合乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束。

(7)将0.5 mg胶原酶溶于水中，逐滴加入步骤(6)所得的溶液中，室温搅拌30 min后，即得吸附有胶原酶的聚合乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束递送系统。

实施例4

乙二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束递送系统的制备方法

(1)称取200 mg葡聚糖溶于2 mL二甲亚砜，随后加入232 mg二环己基碳二亚胺、27mg 4-二甲氨基吡啶以及260 mg月桂酸，混合溶液在惰性气体保护下反应12-24 h，抽滤去除不溶物，将反应液加入至10倍量的无水乙醚中，并于4500 rpm离心10 min，收集离心管底部的白色沉淀并用10 mL去离子水溶解，透析过夜，并冻干，得月桂酸修饰的葡聚糖。

(2)称取303.5mg N-Boc谷氨酸、88 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、47 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及52 mg Boc-乙二胺溶于二甲亚砜中，室温反应4-24 h后，用饱和碳酸钠溶液和盐酸洗液两次，加入无水硫酸钠过夜。过滤上述混合物，旋干液体，加入3 mL 二氯甲烷和0.5 mL 三氟乙酸，通风橱内搅拌2 h-6 h，旋干即得乙二胺-谷氨酸。

(3)将步骤(1)获得的月桂酸葡聚糖加2 mL二甲亚砜溶解，加50 mg丁二酸酐，混合溶液在惰性气体保护下反应6 h-12 h，按照步骤(1)的方式纯化得羧化葡聚糖。

(4)将步骤(3)获得的羧化葡聚糖加5 mL二甲亚砜溶解，随后加入198 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、127 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及步骤(2)获得的乙二胺-谷氨酸，混合溶液在惰性气体保护下反应6-12 h，按照步骤(1)的方式纯化得乙二胺-谷氨酸葡聚糖。

(5)将步骤(4)获得的乙二胺-谷氨酸葡聚糖加10 mL水溶解，加入192 mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、95 mg N-羟基琥珀酰亚胺以及40 mg 精氨酸，混合溶液在惰性气体保护下反应12小时，按照步骤(1)的方式纯化得聚合乙二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖合成物(DEGA)。

(6)取10mg制备得到的聚合乙二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖合成物以及2 mg紫杉醇共同溶解在100 μL二甲亚砜中，搅拌下逐滴加入10 mL水溶液中。20 ℃下400W超声3 min，即得载有化疗药物紫杉醇的聚合乙二胺-天冬氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束。

(7)将0.5 mg胶原酶溶于水中中，逐滴加入步骤(6)所得的溶液中，室温搅拌30min后，即得吸附有胶原酶的聚合己二胺-谷氨酸-精氨酸葡聚糖纳米胶束递送系统。

上述实施例仅仅是为清楚地说明所做的举例，公开了本次制备的纳米胶束的实施例和附图，而并非对实施方式的限定。本领域内的科研人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可行的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容，而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍属于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种骨靶向纳米胶束递送系统，其特征在于：包括聚多糖交联形成的纳米胶束和包载在纳米胶束内的抗肿瘤药物，在所述纳米胶束表面吸附有胶原酶，所述胶原酶和纳米胶束的质量比为0.1-2：1；

所述聚多糖为修饰有骨靶向氨基酸、精氨酸和脂肪酸的多糖分子，所述多糖分子的分子量为5-50 kD，脂肪酸在多糖分子上的摩尔取代度为5%-50%，骨靶向氨基酸在多糖分子上的摩尔取代度为5%-20%，精氨酸在多糖分子上的摩尔取代度为5%-30%。

2.根据权利要求1所述的骨靶向纳米胶束递送系统，其特征在于：所述多糖分子选自糊精、羟乙基淀粉、聚乙二醇、透明质酸、葡聚糖、壳聚糖或海藻酸。

3.根据权利要求1所述的骨靶向纳米胶束递送系统，其特征在于：所述骨靶向氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。

4.根据权利要求1所述的骨靶向纳米胶束递送系统，其特征在于：所述脂肪酸为月桂酸。

5.根据权利要求1所述的骨靶向纳米胶束递送系统，其特征在于：所述抗肿瘤药物为含有芳香环的抗肿瘤药物，选自喜树碱、阿霉素盐酸盐、紫杉醇、多西紫杉醇、甲氨喋呤或姜黄素。

6.根据权利要求1所述的骨靶向纳米胶束递送系统，其特征在于：所述胶原酶为胶原酶Ⅰ或胶原酶Ⅲ。

7.权利要求1至6任一项所述的骨靶向纳米胶束递送系统的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)在脱水剂和催化剂的存在下，脂肪酸和多糖分子在极性溶剂中发生酯化反应，得到侧链修饰有脂肪酸的多糖分子；

(2)在脱水剂和催化剂的存在下，Boc保护的骨靶向氨基酸和N-Boc保护的二胺在极性溶剂中发生酰胺化反应，得到修饰有氨基的骨靶向氨基酸小分子；

(3)在催化剂的存在下，丁二酸酐和步骤(1)中合成的多糖分子在极性溶剂中发生酯化反应，得到侧链修饰有脂肪酸和羧基的多糖分子；

(4)在脱水剂和催化剂的存在下，步骤(2)得到的小分子和步骤(3)得到的多糖分子在极性溶剂中发生酰胺化反应，得到侧链修饰有骨靶向氨基酸、脂肪酸和羧基的多糖分子；

(5)在脱水剂和催化剂的存在下，精氨酸和步骤(4)的多糖分子在极性溶剂中发生酰胺化反应，得到侧链修饰有精氨酸、骨靶向氨基酸、脂肪酸和羧基的多糖分子；

(6)将步骤(5)得到的产物和抗肿瘤药物一起溶解在有机溶剂中，搅拌条件下将溶液逐滴滴加到含水溶液中，制得载药的纳米胶束；

(7)将胶原酶溶于含水溶液中，搅拌条件下逐滴加入步骤(6)的载药的纳米胶束中，即可得到骨靶向纳米胶束递送系统。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述脱水剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或二环己基碳二亚胺，所述催化剂为二甲氨基吡啶或N-羟基琥珀酰亚胺，所述极性溶剂选自二甲亚砜、无水二甲基甲酰胺或四氢呋喃；所述N-Boc保护的二胺中二胺供体选自乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺或己二胺。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，所述有机溶剂选自二甲亚砜、四氢呋喃或二甲基甲酰胺，所述含水溶液选自水、5 wt.%葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液，所述步骤(5)得到的产物与抗肿瘤药物的质量比为1-100：1。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(7)中，所述含水溶液选自水、5wt.%葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液，胶原酶和纳米胶束的质量比为2-10：1。

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