CN107750274A - 用于水凝胶微载体的干燥制剂 - Google Patents

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D·亨利
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Abstract

提供了一种制造细胞培养制品的方法。所述方法包括由微载体组合物形成微载体，所述微载体组合物包含聚半乳糖醛酸化合物或藻酸化合物；用干燥制剂浸润微载体以形成经过浸润的微载体；以及干燥经过浸润的微载体以形成干燥的微载体，其中，所述干燥制剂包含糖和单价阳离子中的至少一种。

Description

用于水凝胶微载体的干燥制剂
本申请根据35U.S.C.§119要求于2015年6月8日提交的系列号为62/172,449的美国临时申请的优先权的权益，本申请以该申请的内容为基础，并通过引用的方式全文纳入本文。
背景
技术领域
本公开一般涉及用于水凝胶微载体的干燥制剂，更具体来说，涉及用于对水凝胶微载体进行干燥、灭菌和再水化的方法。
背景技术
在位于平坦表面上进行的细胞培养中，粘附细胞可达到高度汇合并因此通过细胞间接触抑制来限制细胞扩增，与这样的细胞培养不同的是，具有高表面积/体积比的球形微载体为有效的细胞培养放大或扩增提供了有吸引力的平台，其中收获的细胞或条件培养基可以是所需的产品。
含羧基的多糖(例如聚半乳糖醛酸和藻酸)可与二价离子(例如钙离子)交联形成稳定的水凝胶，该稳定的水凝胶可以珠粒的形式用作细胞培养的基底或用作活细胞的封装剂。
交联的水凝胶可通过例如用EDTA除去钙而溶出(至少部分溶解)。这有助于不使用蛋白酶而释放细胞，使用蛋白酶对细胞生理学可具有不利影响。
由于γ灭菌的过程效率和渗透深度，因此其可以用于消毒水凝胶微载体。然而，在γ灭菌期间存在水或湿气生成了不期望的自由基，这些自由基可破坏细胞。因此，考虑在灭菌之前干燥水凝胶微载体，然后在灭菌之后再水化。此外，与湿的水凝胶相比，干燥形式的胶体材料对包装、装运和储存来说更加容易且更加经济。
鉴于前述，提供低成本且有效的方法对水凝胶微载体进行干燥、灭菌然后完全再水化将是有利的，其中再水化的微载体体现了其初始几何形状和机械性质。
概述
根据本公开的实施方式，方法能够对水凝胶珠粒，例如由聚半乳糖醛酸或藻酸制造的珠粒，进行干燥及完全再水化。在珠粒的干燥状态时，可对其进行灭菌，例如通过暴露于辐射来灭菌。完全再水化发生在数分钟内，并且经过再水化的珠粒体现了其原始的(预脱水)几何形状和机械性质。
根据本公开的一个实施方式，在脱水前，将珠粒浸泡在干燥制剂中，所述干燥制剂包括高浓度的单糖或多糖。根据本公开的另一个实施方式，在脱水前，将珠粒浸泡在包括单价阳离子和低浓度单糖或多糖的制剂中。根据本公开的另一个实施方式，在脱水前，将珠粒浸泡在包括单价阳离子的制剂中。本文公开的每个实施方式能够对珠粒进行γ灭菌及随后的再水化以用于细胞培养应用。
制造细胞培养制品的方法包括：由微载体组合物，例如聚半乳糖醛酸化合物或藻酸化合物形成微载体；用干燥制剂浸润微载体以及干燥经过浸润的微载体。所述干燥制剂包括糖和单价阳离子。
细胞培养制品包括聚半乳糖醛酸化合物或藻酸化合物以及干燥制剂，所述干燥制剂选自糖和单价阳离子。在实施方式中，细胞培养制品不含水。
在以下的具体实施方式中提出了本公开主题的其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言根据所作描述即容易理解，或者通过实施包括以下具体实施方式、权利要求书以及附图在内的本文所述的本公开主题而被认识。
应理解，前面的一般性描述和以下的具体实施方式给出了本公开主题的实施方式，并且旨在用来提供理解要求保护的本公开主题的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对本公开的主题的进一步理解，附图并入本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本公开的主题的各个实施方式，并与说明书一起对本公开的主题的原理和操作进行阐述。此外，附图和说明书仅仅是示例性的，并不试图以任意方式限制权利要求的范围。
附图简要说明
当结合以下附图阅读时，能对下文本公开的具体的实施方式的详细描述有最好的理解，附图中相同的结构用相同的附图标记表示，其中：
图1为与钙交联的PGA珠粒的相衬图；
图2为无赋形剂的干燥的再水化PGA珠粒的相衬图；
图3为使用5％葡萄糖的干燥的再水化PGA珠粒的相衬图；
图4为使用20％葡萄糖的干燥的再水化PGA珠粒的相衬图；
图5为使用40％葡萄糖的干燥的再水化PGA珠粒的相衬图；
图6为使用50mM NaCl的干燥的再水化PGA珠粒的相衬图；
图7为使用5％葡萄糖和50mM NaCl的干燥的再水化PGA珠粒的相衬图；
图8为在PGA微载体上培养的hMSC的倍数扩增图表；
图9A-9D示出了根据实施方式的PGA微载体的用钙黄绿素乙酰甲酯(AM)染色的荧光图像；
图10A和10B为描述了恢复的细胞的总数及从经过γ灭菌和高压灭菌的PGA微载体中恢复的活细胞的百分比的图表；
图11A和11B为在具有康宁公司(Corning Incorporated)的-SC表面的PGA微载体上的Vero细胞的用钙黄绿素乙酰甲酯(AM)染色的荧光图像；
图12为细胞密度相对于培养时间的图表；
图13为与钙交联的PGA珠粒的图像；
图14为使用500mM NaCl和1.0mL DMSO的干燥的再水化PGA珠粒的图像；
图15为使用125mM NaCl和1.0mL DMSO的干燥的再水化PGA珠粒的图像；
图16为使用50mM NaCl和1.0mL DMSO的干燥的再水化PGA珠粒的图像；
图17为无赋形剂的干燥的再水化PGA珠粒的图像；
图18为使用125mM NaCl的干燥的再水化PGA珠粒的图像；
图19为使用125mM NaCl和0.5mL DMSO的干燥的再水化PGA珠粒的图像；
图20为使用125mM NaCl和1.0mL DMSO的干燥的再水化PGA珠粒的图像；
具体实施方式
下面将对本发明的主题的各个实施方式进行更详细的描述，其中的一些实施方式例示于附图中。在附图中使用相同的附图标记表示相同或相似的部件。
多糖水凝胶(通过钙交联)的干燥能够使它们进行灭菌以用于生物技术应用，例如大规模细胞培养。灭菌后，对珠粒进行再水化并回复到其原始的(干燥前)几何形状和性质。对于由PGA或藻酸形成的珠粒，交联表现在糖重复单元和钙离子之间。然而，这一交联是可逆的，例如通过由EDTA去除钙。
在传统的干燥中，交联密度随着PGA或藻酸中的各羧基基团更加靠近而增加。这防止了聚合物从再水化回到其原始的水凝胶状态。认为向再水化溶液中加入钠或其他阳离子增加了再水化的程度，即，通过打破新形成的交联结构来增加再水化的程度。然而，向再水化溶液中加入钠也破坏了原始的交联结构，并导致连续膨胀，且伴随着网络结构和相关性质发生变化。
用于形成水凝胶珠粒的方法公开于第PCT/US2014/043624号共同转让的国际申请以及第62/172,299号美国专利申请，两件申请的内容通过引用的方式全文纳入本文。
公开的为对水凝胶珠粒进行有效脱水和再水化的方法。所述方法涉及先对水凝胶珠粒进行处理再进行脱水。
根据本公开的一个实施方式，在脱水前，将珠粒用包含高浓度(例如5-50重量％)单糖或多糖的制剂浸润。根据另一个实施方式，在脱水前，将珠粒用包含单价阳离子(例如10-500mM)和低浓度(例如1-50重量％)单糖或多糖的制剂浸润。根据另一个实施方式，在脱水前，将珠粒用包含单价阳离子(例如10-500mM)的制剂浸润。在珠粒的干燥状态中，糖和/或单价阳离子保留在珠粒中。示例性的糖包括葡萄糖和蔗糖以及它们的组合。示例性的单价阳离子包括钠、钾和铵离子以及它们的组合。本文描述的每个实施方式能够对干燥的珠粒进行γ灭菌及随后的再水化以用于细胞培养应用。
根据本公开的实施方式，本文描述的每种制剂还可以包括非挥发性液体材料。所述非挥发性液体材料可以为例如，但不限于DMSO或低分子量的聚乙二醇，例如PEG-400。制剂可以包括约0.1mL至约2.0mL每100mL的非挥发性液体材料的珠粒。例如，制剂可以包括约0.5mL至约1.5mL每100mL的非挥发性液体材料的珠粒，包括任何上述数值之间的范围。
在浸润期间，将制剂并入到珠粒中，例如通过扩散并入。制剂可以在整个珠粒中均匀分布或不均匀分布。例如，糖或单价阳离子的浓度在珠粒的表面附近可以比中心更高。
浸润可以包括在干燥前将珠粒浸泡在制剂中，例如，浸泡使制剂有效地并入到珠粒中的时间。在这一方法中，浸润和干燥是连续进行的。在一个替换性实施方式中，将制剂浸润到珠粒中以及对珠粒进行干燥可以同时进行，例如通过喷洒干燥。
喷洒干燥为通过用热气体快速干燥来从液体或浆体生产干燥粉末的方法。喷洒干燥器使用雾化器或喷洒喷嘴来分散液体或浆体。热干燥气体可作为并流或逆流通过雾化器。在实施方式中，可对PGA溶液和干燥制剂进行喷洒干燥以同时或共同形成微载体珠粒，将干燥制剂并入到珠粒中并干燥珠粒。
在实施方式中，湿润的微载体珠粒的平均粒径在50至500微米的范围内，例如50、100、200、300、400或500微米，包括任何上述数值之间的范围。用糖浸润的微载体珠粒可包括1至50重量％糖，例如1、2、5、10、20、30、40或50重量％，包括任何上述数值之间的范围。用单价阳离子浸润的微载体珠粒可包括10至500mM阳离子，例如10、20、50、100、200、300、400或500mM，包括任何上述数值之间的范围。用糖和单价阳离子浸润的微载体珠粒可包括上述数值涵盖的任何干燥制剂的组成，例如1至20重量％葡萄糖和10至100mM钠阳离子。
作为干燥粉末，珠粒通常形成附聚物，所述附聚物的附聚粒径(次级粒径)在10至200微米的范围内，例如10、20、50、100或200微米，包括任何上述数值之间的范围。随着从微载体中提取出水，干燥制剂将占其总组成的更大比例。干燥的粉末不含水，即被干燥到至多10重量％的含水量(例如至多1、2、4、5或10重量％的含水量，包括任何上述数值之间的范围)。
在实施方式中，干燥的微载体珠粒包括10至99重量％糖，例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98或99重量％，包括任何上述数值之间的范围。在实施方式中，干燥的微载体珠粒包括0.5至20重量％单价阳离子，例如0.5、1、2、5、10或20重量％，包括任何上述数值之间的范围。用糖和单价阳离子浸润的微载体珠粒在干燥时可包括上述数值涵盖的任何干燥制剂的组成，例如60至80重量％葡萄糖和0.5至10重量％单价阳离子。
实施例
实施例1——对PGA珠粒进行干燥和再水化
使用第WO2014/209865号共同转让的国际公布中公开的方法，通过胶凝和与钙交联合成PGA珠粒，所述国际公布的内容通过引用的方式全文纳入本文。
将2％聚半乳糖醛酸(PGA)的水溶液与碳酸钙混合以形成水性悬浮液。将该悬浮液分散到庚烷中同时以司盘85(Span 85)作为表面活性剂，以形成油包水型乳液。向该乳液中添加乙酸以溶解碳酸钙并释放钙离子以交联PGA分子。使用CaCl2的乙醇溶液，通过将额外的钙离子引入到交联的网络中来进一步强化珠粒。PGA珠粒的直径在100微米至300微米的范围内。
在干燥之前，将PGA珠粒浸泡在水中或含有不同浓度的葡萄糖和/或NaCl的水性溶液中，浸泡2小时。通过过滤器(106微米孔径)用异丙基醇清洗珠粒以去除过量的浸泡溶液并对珠粒进行预脱水。然后，将由此处理的珠粒真空干燥24小时。干燥的珠粒的特征为不透明的白色粉末。
将干燥的珠粒在水中进行再水化(搅拌5分钟，总膨胀时间为10分钟或24小时)。在光学显微镜下观察再水化的珠粒的形态学。
预脱水处理和再水化结果概括于表I。
表I
图1-7为钙交联的PGA珠粒的相衬图。图1示出了干燥之前的珠粒的对照图像(样品1)。图2为在干燥前仅在水中浸泡的再水化珠粒的图像(样品2)。再水化明显不完全。参见图3-5，干燥珠粒的再水化与并入到珠粒中的葡萄糖的量成正比提高。在用5％和20％葡萄糖处理(样品3和4)后实现了部分再水化，虽然即使在24小时后这些珠粒未恢复其原始尺寸和形态学。参见图5，用40％葡萄糖处理实现了珠粒的完全再水化。样品5的珠粒在15分钟内再水化成其原始尺寸和形态学。
图6为在干燥前在50mM NaCl中浸泡的再水化珠粒的图像(样品6)。这些干燥的珠粒被部分地再水化。然而，如图7所示，如果在干燥之前将5％葡萄糖与50mM NaCl溶液合并，则珠粒在15分钟内完全再水化并且在彻底的浸泡期间保持其尺寸和形态学。
实施例2——干燥经涂覆的PGA珠粒以用于细胞培养
涂覆：将30ml的0.25mg/ml溶液添加到含有7.5ml如实施例1所述制备的压实的PGA珠粒的塑料离心管中。温和搅拌后，将管在烘箱中于40℃下加热30分钟并冷却到23℃。用40ml水清洗由此涂覆的珠粒，清洗三次，并且离心以弃去上清液。随后，将湿润的珠粒悬浮在水中并在4℃下储存。未干燥的涂覆珠粒被用作对照。
干燥和γ灭菌：将45ml的339g/l或475g/l葡萄糖添加到7.5ml的如前一步骤所述制备的涂覆的珠粒中。将悬浮液置于100ml烧瓶中并在23℃下温和搅拌18小时以允许葡萄糖分散到珠粒中。在浸泡后，用IPA洗涤经葡萄糖浸润的珠粒，洗涤3次以去除过量的浸泡溶液并使珠粒部分脱水。然后真空干燥珠粒16小时以生成粉末。在氮气下将粉末装在玻璃小瓶中以用于在19-21千戈瑞(kGy)下进行γ照射。在细胞培养之前，用水对具有表面的经γ灭菌的珠粒进行再水化30分钟并用水清洗一次。
细胞培养：将2ml湿润的再水化珠粒添加到具有25ml Mesencult XF培养基的125ml一次性旋转瓶中，并且用约一百万个骨髓来源的hMSC(STEMCELLTM技术(SCT)，目录号：MSC-001F，BM ID号2637)接种。将瓶子静置过夜以允许细胞附着。随后，将接种的微载体在加湿的孵育器(37℃及5％CO2)中间歇搅拌7天。在第4天时完全更换培养基。
在7天后，收获培养的细胞，收获通过首先用D-PBS清洗微载体，然后通过添加包含10ml 50U果胶酶和5mM ETDA的溶液溶解微载体来进行。通过在台盼蓝染色后使用血细胞计数器计数获得培养的细胞总数。基于初始细胞接种密度和第7天时的最终细胞密度计算倍数扩增。用70％乙醇消毒未干燥的涂覆珠粒并将其用作细胞培养期间的对照。
参考图8可见，用高浓度的葡萄糖(339或475g/l)浸润的PGA珠粒支持干燥、γ灭菌、再水化以及在搅拌培养和无血清培养基中的有效的hMSC扩增。在7天内实现了六倍扩增，这与用乙醇消毒的PGA珠粒得到的结果相当。
实施例3——干燥经涂覆的PGA珠粒以用于细胞培养
涂覆：如实施例2，将溶液与20ml PGA珠粒悬浮液(具有10ml压实的珠粒)混合。
干燥和γ灭菌：将经过洗涤的珠粒在23℃下，在包含5％葡萄糖和125mM NaCl的溶液中浸泡2小时。在70ml IPA中清洗浸泡的珠粒以去除过量的葡萄糖和NaCl并且使珠粒部分脱水。然后真空干燥珠粒24小时以生成粉末。在氮气下将粉末装在玻璃小瓶中以用于在19-21kGy下进行γ照射。
细胞培养：在细胞培养之前，用水对具有表面的经γ灭菌的珠粒进行再水化30分钟。然后用含有10％血清的培养基置换上清液并转移到125mL旋转瓶中以用人骨髓来源间充质干细胞(hBMSC)(在50ml的培养基中的1x106细胞每1.8ml的压实珠粒，相当于5,500个细胞/cm2)接种。
在6天后，用钙黄绿素乙酰甲酯(AM)对细胞进行染色并拍摄荧光图像。通过将珠粒溶解于包含10ml 50U果胶酶和5mM ETDA的溶液中获得培养的细胞总数。使用细胞计数器对细胞进行计数。基于初始细胞接种密度和第6天时的最终细胞密度计算倍数扩增。用高压釜消毒未干燥的涂覆珠粒并将其用作细胞培养期间的对照。
培养6天后的经表面涂覆的珠粒的钙黄绿素AM染色荧光图像示于图9A(γ灭菌的珠粒)和图9c(高压灭菌的珠粒)。如图9A所见，hBMSC细胞在γ灭菌的PGA珠粒上附着、扩散并生长。这与如图9C(对比)所示的使用常规高压灭菌的珠粒相当。
微载体易于用果胶酶EDTA溶液溶出，从而将hBMSC细胞释放到溶液中。在第6天时用果胶酶/EDTA溶解微载体后的包含hBMSC的单细胞溶液的相衬图示于图9B(γ灭菌的珠粒)和图9D(高压灭菌的珠粒)(对比)
参考图10，在γ灭菌的PGA微载体上接种和培养的hBMSC的生长和活力与关于高压灭菌的珠粒的相当。如图10A所示，收获时的细胞数表明在培养6天后细胞得到了6倍扩增。另外，如图10B所示，这些细胞中的超过90％的细胞是活的。图10中的数值为在每种灭菌条件下测试的两个样品的平均值±标准差。
实施例4——干燥经涂覆的PGA珠粒以用于细胞培养
涂覆：如实施例2，将表面涂覆溶液与20mlPGA珠粒悬浮液(具有10ml压实的珠粒)混合。
干燥和γ灭菌：将经过洗涤的珠粒在23℃下，在包含5％葡萄糖和125mM NaCl的溶液中浸泡2小时。在70ml IPA中清洗浸泡的珠粒以去除过量的葡萄糖和NaCl并且使珠粒部分脱水。然后真空干燥珠粒24小时以生成粉末。在氮气下将粉末装在玻璃小瓶中以用于在19-21kGy下进行γ照射。
细胞培养：在用5％FBS(康宁，目录号35-010)、1X MEM NEAA(康宁，目录号25-025)和2mM L-谷氨酰胺(康宁，目录号25-005)补充的DMEM(康宁，目录号10-013)中培养Vero细胞(CCL-81TM)。在细胞培养之前，用水对具有涂覆表面的经γ灭菌的珠粒进行再水化30分钟。然后用含血清的培养基置换上清液并转移到125mL旋转瓶中以用Vero细胞以约15,000个细胞/cm2进行接种。
在6天后，用钙黄绿素(AM)对细胞进行染色并用荧光显微术成像。通过将珠粒溶解于包含10ml 50U果胶酶和5mM ETDA的溶液中获得培养的细胞总数。使用细胞计数器对细胞进行计数。珠粒未经干燥处理，具有表面并且用乙醇消毒以及用作对照。
培养4天后的具有表面的珠粒的钙黄绿素AM染色荧光图像示于图11。Vero细胞附着到用乙醇消毒的珠粒(图11A，对比)与附着到γ灭菌并再水化的PGA珠粒(图11B)相当。参考图12，在培养6天后，在γ灭菌并再水化的PGA珠粒上的细胞数超过了在未干燥的经乙醇灭菌的珠粒上的细胞数。如图所示，本干燥制剂能够使PGA珠粒进行干燥、γ灭菌并保持生物学性能。
实施例5——使用不同浓度NaCl溶液和DMSO的干燥和再水化
使用第62/172299号共同转让的美国专利申请中公开的方法，通过胶凝和与钙交联合成PGA珠粒。
将1.75％PGA水溶液滴加通过喷嘴并进入到4.0％碳酸钙溶液中以形成交联的珠粒。然后用水洗涤珠粒以去除任何过量的钙。
在干燥之前，将PGA珠粒浸泡在含有不同浓度NaCl的水性溶液中，浸泡1小时。通过过滤器(106微米孔径)用异丙基醇清洗珠粒以去除过量的浸泡溶液并对珠粒进行预脱水。然后将珠粒放置于烧瓶中，并且对于每100mL的珠粒，向烧瓶中加入1.0mL的DMSO。接着使用旋转蒸发仪干燥珠粒。干燥的珠粒的特征为不透明的白色粉末。
将干燥的珠粒在水中进行再水化，其中，对于每50mg的干燥珠粒，向干燥珠粒中加入8.0mL的水并且混合。观察到再水化在2.0分钟或更短的时间内完成。在光学显微镜下观察再水化的珠粒的形态学。
预脱水处理和再水化结果概括于表II。
表II
图13-17为在本实施例中形成的钙交联的PGA珠粒的相衬图。图13示出了干燥之前的珠粒的对照图像(样品8)。确定图13中的珠粒的尺寸为258±7μm。图14为在干燥前在500mM NaCl中浸泡的再水化珠粒的图像(样品9)。图14中示出的珠粒实现了完全再水化，虽然由于确定了珠粒的尺寸为307±8μm而观察到珠粒过度膨胀。图15为在干燥前在125mMNaCl中浸泡的再水化珠粒的图像(样品10)。对于图15中示出的球粒，由于确定了珠粒的尺寸为256±5μm，因此图15中示出的珠粒实现了完全再水化及膨胀到原始珠粒尺寸和形态学。图16为在干燥前在50mM NaCl中浸泡的再水化珠粒的图像(样品11)。由于确定珠粒的尺寸为192±9μm，因此，图16中的珠粒的再水化不完全。图17为在干燥前未浸泡的再水化珠粒的图像(样品12)。由于确定珠粒的尺寸为125±10μm，因此，图17中的珠粒的再水化明显不完全。
实施例6——使用NaCl溶液和不同体积DMSO的干燥和再水化
如实施例5所述合成PGA珠粒。
在干燥之前，将PGA珠粒浸泡在含有125mM NaCl的水性溶液中，浸泡1小时。通过过滤器(106微米孔径)用异丙基醇清洗珠粒以去除过量的浸泡溶液并对珠粒进行预脱水。然后将珠粒置于分别的烧瓶中，所述分别的烧瓶中的每个烧瓶对每100mL的珠粒加入不同体积的DMSO。接着使用旋转蒸发仪干燥珠粒。干燥的珠粒的特征为不透明的白色粉末。
将干燥的珠粒在水中进行再水化，其中，对于每50mg的干燥珠粒，向干燥珠粒中加入8.0mL的水并且混合。观察到再水化在2.0分钟或更短的时间内完成。在光学显微镜下观察再水化的珠粒的形态学。
预脱水处理和再水化结果概括于表III。
表III
图18-20为在本实施例中形成的钙交联的PGA珠粒的相衬图。图18为在干燥前在125mM NaCl中浸泡但不在DMSO中浸泡的再水化珠粒的图像(样品13)。如图18所示，观察到30-50％的再水化珠粒具有裂纹。图19为在干燥前在125mM NaCl及0.5mL DMSO中浸泡的再水化珠粒的图像(样品14)。虽然观察到一些珠粒含有裂纹，但是观察到样品14的再水化珠粒的开裂相比于样品13的再水化珠粒有所减少。图20为在干燥前在125mM NaCl及1.0mLDMSO中浸泡的再水化珠粒的图像(样品15)。如图20所示，观察到几乎所有的再水化珠粒均不含有裂纹。换言之，观察到样品15的再水化珠粒的开裂相比于样品13和14的再水化珠粒大幅减少。
不希望受限于任何特定的理论，认为由于水被珠粒迅速吸收并且珠粒发生快速膨胀，因此开裂的发生是再水化导致的。珠粒的外部部分比珠粒的内部部分再水化得更慢，并且认为不具有足够的弹性来匹配珠粒的体积膨胀。在干燥制剂中包含非挥发性液体材料(例如DMSO或PEG-400)所提供的液体材料可浸润珠粒，在干燥之后保持珠粒并且在再水化期间向珠粒的外部部分提供弹性。因此，在再水化期间，珠粒的外部部分将能够充分地扩展以匹配珠粒的内部部分体积的增加并防止裂开。
在实施方式中，脱水PGA珠粒的有效再水化可通过在再水化之前用高浓度的单糖或多糖(例如葡萄糖)、用低浓度的单糖或多糖结合单价盐(例如氯化钠)或者用单价盐处理珠粒来实现。
根据本公开的方面(1)，提供了制造细胞培养制品的方法。所述方法包括由微载体组合物形成微载体，所述微载体组合物包含聚半乳糖醛酸化合物或藻酸化合物；用干燥制剂浸润微载体以形成经过浸润的微载体；以及干燥经过浸润的微载体以形成干燥的微载体，其中，所述干燥制剂包含糖和单价阳离子中的至少一种。
根据本公开的另一个方面(2)，提供了根据方面(1)所述的方法，其还包括对干燥的微载体进行灭菌以形成灭菌的干燥微载体。
根据本公开的另一个方面(3)，提供了根据方面(2)所述的方法，其中，对干燥的微载体进行灭菌包括将干燥的微载体暴露于γ辐射。
根据本公开的另一个方面(5)，提供了根据方面(1)-(4)中任一个方面所述的方法，其还包括对微载体进行再水化。
根据本公开的另一个方面(6)，提供了根据方面(1)-(5)中任一个方面所述的方法，其中，用干燥制剂对微载体进行浸润包括将微载体浸泡于干燥制剂的溶液中。
根据本公开的另一个方面(7)，提供了根据方面(1)-(5)中任一个方面所述的方法，其中，用干燥制剂对微载体进行浸润包括同时喷洒微载体组合物和干燥制剂。
根据本公开的另一个方面(8)，提供了根据方面(1)-(7)中任一个方面所述的方法，其中，干燥制剂包含1至50重量％的糖。
根据本公开的另一个方面(9)，提供了根据方面(1)-(8)中任一个方面所述的方法，其中，干燥制剂包含10至500mM的单价阳离子。
根据本公开的另一个方面(10)，提供了根据方面(1)-(9)中任一个方面所述的方法，其中，干燥制剂包含1至50重量％的糖和10至500mM的单价阳离子。
根据本公开的另一个方面(11)，提供了根据方面(1)-(10)中任一个方面所述的方法，其中，糖选自蔗糖和葡萄糖。
根据本公开的另一个方面(12)，提供了根据方面(1)-(11)中任一个方面所述的方法，其中，单价阳离子选自钠、钾和铵离子。
根据本公开的另一个方面(13)，提供了根据方面(1)-(12)中任一个方面所述的方法，其中，干燥制剂包含非挥发性液体材料。
根据本公开的另一个方面(14)，提供了根据方面(13)所述的方法，其中，非挥发性液体材料选自DMSO和低分子量聚乙二醇。
根据另一个方面(15)，提供了一种细胞培养制品。所述细胞培养制品包括：聚半乳糖醛酸化合物或藻酸化合物以及干燥制剂，所述干燥制剂包含糖和单价阳离子中的至少一种，其中，所述细胞培养制品不含水。
根据本公开的另一个方面(16)，提供了根据方面(15)所述的细胞培养制品，其中，干燥制剂包含1至50重量％的糖。
根据本公开的另一个方面(17)，提供了根据方面(15)-(16)中任一个方面所述的细胞培养制品，其中，干燥制剂包含0.5至20重量％的单价阳离子。
根据本公开的另一个方面(18)，提供了根据方面(15)-(17)中任一个方面所述的细胞培养制品，其中，干燥制剂包含1至50重量％的糖和0.5至20重量％的单价阳离子。
根据本公开的另一个方面(19)，提供了根据方面(15)-(18)中任一个方面所述的细胞培养制品，其中，干燥制剂包含非挥发性液体材料。
根据本公开的另一个方面(20)，提供了根据方面(19)所述的细胞培养制品，其中，非挥发性液体材料选自DMSO和低分子量聚乙二醇。
除非上下文另外清楚地说明，否则，本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该/所述”包括复数指代。因此，除非上下文另外清楚地说明，否则，例如，对一种“单价阳离子”的引用包括具有两种或更多种此类“单价阳离子”的实例。
术语“包括”或“包含”意为包括但不限于，即内含而非排它。
“任选”或“任选地”表示随后描述的事件或情形可能发生，也可能不发生，而且该描述包括事件或情形发生的实例和所述事件或情形不发生的实例。
本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，实例包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成了另一个方面。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相结合以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，如果方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序，或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，则都不旨在暗示该任意特定顺序。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面或与任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面置换。
还应注意本文中涉及将部件“构造成”或“使其适于”的描述以特定的方式起作用。就这方面而言，将该部件“构造成”或“使其适于”是为了具体表现特定的性质，或者以特定的方式起作用，这样的描述是结构性的描述，而不是对预期应用的描述。更具体而言，本文所述的将部件“构造成”或“使其适于”的方式表示该部件现有的物理条件，因此可以将其看作该组件的结构特征的限定性描述。
虽然使用过渡语“包含”可以公开特定实施方式的各种特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“由……构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代性实施方式。因此，例如，所示的包含溶解于溶剂中的糖的溶液的替代实施方式包括了由溶解于溶剂中的糖构成的溶液的实施方式以及基本上由溶解于溶剂中的糖构成的溶液的实施方式。
对本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明技术进行各种修改和变动而不偏离本公开的精神和范围。因为本领域技术人员可以结合本发明技术的精神和实质，对所述的实施方式进行各种改良、组合、子项组合和变化，因此应认为本发明技术包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

Claims (19)

1.一种制造细胞培养制品的方法，所述方法包括：
由微载体组合物形成微载体，所述微载体组合物包含聚半乳糖醛酸化合物或藻酸化合物；
用干燥制剂浸润微载体以形成经过浸润的微载体；和
干燥经过浸润的微载体以形成干燥的微载体，其中，所述干燥制剂包含糖和单价阳离子中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括对干燥的微载体进行灭菌以形成灭菌的干燥微载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，对干燥的微载体进行灭菌包括将干燥的微载体暴露于γ辐射。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括对微载体进行再水化。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，用干燥制剂对微载体进行浸润包括将微载体浸泡于干燥制剂的溶液中。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，用干燥制剂对微载体进行浸润包括同时喷洒微载体组合物和干燥制剂。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，干燥制剂包含1至50重量％的糖。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，干燥制剂包含10至500mM的单价阳离子。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，干燥制剂包含1至50重量％的糖和10至500mM的单价阳离子。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，糖选自蔗糖和葡萄糖。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，单价阳离子选自钠、钾和铵离子。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，干燥制剂包含非挥发性液体材料。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，非挥发性液体材料选自DMSO和低分子量聚乙二醇。
14.一种细胞培养制品，所述细胞培养制品包括：
聚半乳糖醛酸化合物或藻酸化合物以及干燥制剂，所述干燥制剂包含糖和单价阳离子中的至少一种，其中，所述细胞培养制品不含水。
15.根据权利要求14所述的细胞培养制品，其中，干燥制剂包含1至50重量％的糖。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的细胞培养制品，其中，干燥制剂包含0.5至20重量％的单价阳离子。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的细胞培养制品，其中，干燥制剂包含1至50重量％的糖和0.5至20重量％的单价阳离子。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的细胞培养制品，其中，干燥制剂包含非挥发性液体材料。
19.根据权利要求18所述的细胞培养制品，其中，非挥发性液体材料选自DMSO和低分子量聚乙二醇。
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