KR20200085090A

KR20200085090A - 왕겨로부터 유래된 셀룰로오스 나노크리스탈 및 그 응용

Info

Publication number: KR20200085090A
Application number: KR1020190001204A
Authority: KR
Inventors: 임기택; 서유리
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2019-01-04
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2020-07-14
Also published as: KR102172173B1

Abstract

본 발명은 왕겨로부터 실리카, 헤미셀룰로오스 및 리그닌을 제거하여 왕겨로부터 셀룰로오스 나노크리스탈을 얻는 방법, 얻어진 셀룰로오스 나노크리스탈, 및 그의 세포 증식 및 분화에 응용에 관한 것으로, 본 발명을 통하여 얻어진 왕겨로부터 셀룰로오스 나노크리스탈은 골형성 분화 등을 포함한 다양한 조직공학적 소재로서 사용될 수 있다.

Description

왕겨로부터 유래된 셀룰로오스 나노크리스탈 및 그 응용{A CELLULOSE NANOCRYSTAL DERIVED FROM RICE HUSK AND USE OF THE SAME}

본 발명은 왕겨로부터 유래된 셀룰로오스 나노크리스탈 및 그 응용에 관한 것이다.

왕겨와 같은 농업 부산물은 고 부가가치 소재 개발을 위한 새로운 소재로서 주목 받고 있다. 매 년 다량으로 생산되는 왕겨는 대부분 퇴비나 깔짚과 같은 가공하지 않은 일차원적인 소재로서 사용되고 있다.

또한, 많은 양의 왕겨가 소각되어 버려지기 때문에 공기 오염에도 심각한 문제를 야기한다.

따라서 버려지는 왕겨를 사용하여 조직 공학 등 다양한 생명공학적으로 분야에 적용하기 위한 필요성이 있다. 특히, 왕겨의 주요 성분 중 하나인 셀룰로오스 나노크리스탈 (CNCs)은 조직을 효율적으로 대체할 수 있는 마이크로/나노 플랫폼을 제조하기 위한 유망한 소재로서의 가능성을 살펴볼 필요성이 있다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제1999-0063952호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 왕겨로부터 조직 공학 등에 적용이 가능한 물질을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 왕겨로부터 추출된 물질의 조직공학 분야 등에 적용하는 가능성을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 왕겨로부터 실리카, 헤미셀룰로오스 및 리그닌을 제거하여 왕겨로부터 셀룰로오스 나노크리스탈을 얻는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 왕겨 분말을 수산화칼륨 용액을 처리하여 실리카를 제거하고, 그 현탁액을 아염소산나트륨(sodium chlorite) 및 초산을 첨가하여 반응시켜서 리그닌을 제거하는 과정을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 왕겨로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노크리스탈의 평균 셀룰로오스 나노크리스탈 길이는 128.3 nm이고, 폭은 10.5 nm인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 왕겨로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 인 비트로에서 세포에 처리하여 세포의 증식을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포는 인간 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하고 골조직으로부터 유래한 세포인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노크리스탈을 세포에 처리하는 농도 및 시간은 1% 및 2%(w/v)에서 48시간 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 왕겨로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 인 비트로에서 세포에 처리하여 세포의 분화를 유도시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노크리스탈을 세포에 처리하는 농도 및 시간은 0.5% 및 1%(w/v)에서 14일 처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 폴리카프로락톤(Polycaprolactone;PCL)에 상기 본 발명의 셀룰로오스 나노크리스탈을 첨가하여 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 제조된 복합체를 포함하는 골세포 분화용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 인간중간엽줄기세포 (hMSCs)의 증식과 골 형성에 적합한 물질로서 농업부산물로부터 추출한 CNCs의 효능에 대해 연구하였다. CNCs는 왕겨로부터 가수분해를 통해 얻어졌다. 그 후, 세포 증식 및 분화에 대한 CNCs의 영향을 결정하기 위해 세포배양을 수행하였다. 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 의해 hMSC의 골 형성 분화를 평가하였다. 왕겨로부터 유래된 CNCs가 hMSCs의 증식 및 골 형성 분화를 크게 향상시킨다는 것을 증명하였다. 그 후, CNCs기반 인공 지지체가 조직 공학 응용을 위해 제작되었다. 그래핀 옥사이드는 전기 전도도가 낮은 CNCs를 보강하는 데 사용되었다. 그래핀-코팅된 기판상 위에 CNCs/PCL 지지체는 전기 방사에 의해 제조되었다. CNCs의 첨가는 기계적 특성을 향상시킬 뿐만 아니라 세포 증식 및 분화를 유도하였다. 본 발명의 결과는 제조된 그래핀-코팅된 CNC 생체 나노물질의 지지체가 조직 공학에서 응용할 수 있는 생체 소재로서의 잠재력을 보여주었다.

본 발명을 통하여 다음과 같은 사항을 알 수 있었다.

1. 왕겨로부터 추출된 CNCs는 화학적 처리에 의하여 hemicellulose, lignin, 및 silica와 같은 성분들이 제거되었고, 약 128 nm 길이와 10 nm 폭을 가진 CNCs가 황산의 가수분해에 의하여 제조되었다. 이러한 결과들은 왕겨로부터 얻어진 CNCs가 많은 적용에서 강화제로서 사용될 수 있다는 것을 시사한다.

2. 왕겨 유래 CNCs는 세포 증식을 유도하였다. 특정 농도(0.5%, 1%, 및 2%)의 CNCs 첨가는 세포 증식을 현저하게 증가시켰다.

RT-PCR의 결과들은 14일 후에 OPN, ALP, IBSP, 및 RUNX2의 발현 레벨은 대조군의 것과 비교하여 더 높았다는 것을 확인하였다. CNCs의 존재는 hMSCs에서 모든 골형성 유전자를 업레귤레이션하였다. 따라서 CNCs가 조직공학에서 골형성을 촉진하는 유망한 수단이라는 것을 나타낸다.

3. 여러 농도(0.1, 0.5, 1, 및 2%)의 나노입자를 가지는 NPG 스캐폴드를 제조하여 실험한 결과 CNCs의 존재가 NPG 스캐폴드의 섬유 직경을 감소시켰고, CNCs의 존재가 필러로서 작용하여 PCL의 스트레스 및 강도를 증가시켰으며, NPG 스캐폴드는 PG 스캐폴드와 비교하여 세포 수준에서 독성이 없었으며, 세포 분화 평가의 결과는 다양한 배아 조직의 복잡한 구조 환경을 NPG 스캐폴드에서 hMSCs를 분화하고 유도하여 생성할 수 있다는 것을 시사한다.

NPG 스캐폴드는 7일 이상 배양한 경우에 PG 스캐폴드와 현저하게 달랐다.

도 1은 NPG 스캐폴드를 제조하는 대표적인 그림,
도 2는 왕겨의 사진: (a) 미처리된 왕겨, (b) Wise 방법을 사용하여 처리된 왕겨, (c) H2SO4-처리된 왕겨,
도 3은 왕겨의 SEM 현미경사진 (A) 미처리 및 (B) 처리: (i) 200 μm, (ii) 5 μm 스케일,
도 4는 왕겨로부터 얻은 셀룰로오스에 대한 FT-IR 스펙트럼,
도 5는 정제 전 및 후의 왕겨의 TGA 및 DTG; (A) TGA 및 (B) DTG,
도 6은 TEM에 의한 셀룰로오스 나노크리스탈의 형태. (A) 20kX, (B) 40kX.
도 7은 CNCs의 (A) 길이 및 (B) 폭의 분포,
도 8은 24시간 및 48시간 동안 CNCs를 처리한 hMSCs에 대한 세포 생존률에 대한 WST-1 분석의 결과. *p<0.05.
도 9는 Alizarin Red S에 의하여 염색된 광물화된 결절 형성을 나타낸 그림. (A) 7 및 (B) 14일 동안 CNCs로 처리된 hMSCs: (i) 대조군, (ii) 0.01% CNCs, (iii) 0.1% CNCs, (iv) 0.5% CNCs, (v) 1% CNCs, 및 (vi) 2% CNCs.
도 10은 (A) 7 및 (B) 14일 동안 배양된 hMSCs의 Alizarin red 활성 분석을 나타낸 그림. *p<0.05.
도 11은 (A) 7 및 (B) 14일 동안 유도된 조건 하에서 osteoblast-특정 유전자의 발현에 대한 PCR 분석을 나타낸 그림,
도 12는 NPG 스캐폴드의 SEM 현미경사진: (A) PG 스캐폴드, (B) 0.1% NPG 스캐폴드, (C) 0.5% NPG 스캐폴드, (D) 1% NPG 스캐폴드, (E) 2% NPG 스캐폴드.
도 13은 NPG 스캐폴드의 단일축 인장 테스트. (A) 스트레인-스트레스 곡선, (B) 피크 스트레스의 데이터.
도 14는 CNCs 양에 따른 NPG 스캐폴드에 대한 세포독성 테스트의 결과. *p < 0.05.
도 15는 NPG 스캐폴드 상에서 (A) 7일 및 (B) 14일 동안 배양된 Alizarin 염색된 hMSCs. (i) PG 스캐폴드, (ii) 0.1% NPG 스캐폴드, (iii) 0.5% NPG 스캐폴드, (iv) 1% NPG 스캐폴드, 및 (v) 2% NPG 스캐폴드.
도 16은 NPG 스캐폴드 상에서 (A) 7일 및 (B) 14일 동안 배양된 Alizarin 염색의 결과.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1:왕겨 유래 셀룰로오스 나노크리스탈(이하, 'CNCs'라 함)이 제조

CNCs의 제조

왕겨 분말을 mill (A10, IKA, Germany)로 제조하였다. 왕겨에서 실리카를 제거하기 위하여, 왕겨 분말(10 g)을 3% (w/v) KOH로 교반하고 30분간 가열하였다. 그 후 그 여과물을 증류수로 세척하고 10% (v/v) HCl를 가하였다. 탈리그닌화는 변형된 Wise 방법(Wise et al., 1946)에 따라 수행하였다.

리그닌을 제거하기 위하여, 그 현탁액을 sodium chlorite 및 초산을 첨가하여 반응하고 1시간 동안 계속 교반하였다. 탈리그닌 반응 과정은 5회 반복하였다. 그 잔류물을 증류수로 수회 세척하였다. 그 샘플을 동결건조기(FDU 2200, EYELA, Japan)로 분말 형태로 얻었다. 그 후, 그 샘플을 고체 대 액체 비율을 1 g/ 25 ml로 한 17.5% (w/v) sodium hydroxide 용액을 처리하고, 그 반응을 50분간 수행하였다. 반응 시간의 끝에, 10% (v/v) 초산을 중화를 위하여 첨가하였다. 그 다음, 그 잔류물을 증류수로 수회 세척하였다. CNCs를 얻어진 셀룰로오스 기반 산물의 산 가수분해로부터 얻었다. 산 가수분해 처리는 45°C에서 60분간 수행하였다. 가수분해된 물질을 4일 동안 투석 튜브를 사용하여 세척하였다.

FTIR (Fourier transform infrared ) 분광법

처리된 왕겨 및 미처리된 왕겨의 FTIR(Fourier transform infrared) 스펙트럼(Frontier, PerkinElmer, UK)를 transmission 모드에서 얻었다. 샘플들에 대한 모든 스펙트럼은 16 스캔의 동시-첨가(co-addition)가 원인이다. FTIR 측정치는 해상도 1 cm^-1에서 500-4000 cm^-1파장범위에서 얻었다.

셀룰로오스의 표면 이미지

처리된 왕겨 및 미처리된 왕겨의 표면 형태는 SEM(Scanning electron microscope) (Hitachi S-4300, Japan)를 사용하여 관찰하였다. SEM 관찰은 가속 전압 15kV에서 수행하였다. SEM를 사용하기 전에, 샘플이 비전도이기 때문에 전처리하였다. 그 샘플을 진공에 두어서 표면으로부터 습기와 산소를 제거한 후 platinum을 gold 스퍼터(sputter) (Leica EM ACE600, Germany)로 샘플 상에 코팅하였다.

열중량 ( thermogravimetric:TGA ) 곡선

약 50 mg의 미처리 및 처리 왕겨를 열 특성화 : 열중량(TGA, SDT Q600) 분석에 사용하였다. 그 조사를 상온에서 시작하였고 그 온도는 500°C까지 10°C/min의 가열 속도로 증가시켰다. 온도 증가에 따른 중량 변화를 측정하였다.

TEM (Transmission electron microscopy)

CNCs의 형태를 TEM(HITACHI)을 사용하여 수행하였다. 그 CNCs를 초음파로 탈이온수에서 분산하였다. 한 방울의 희석된 CNCs 수용액 현탁액을 마이크로그리드 상에 축적하고 30분간 건조하였다. 그 그리드를 uranyl acetate로 네가티브하게 염색하고 건조시켰다. CNCs의 차원을 ImageJ로 측정하였다.

실시예 2:CNCs에 대한 인 비트로 골형성 ( osteogenesis )

세포 제조

골로부터 유래한 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)(Korean Cell Line Bank, Republic of Korea)를 10% 우태아 혈청(WELGENE, Republic of Korea) 및 1% antibiotics (WELGENE, Republic of Korea)를 가지는 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) (WELGENE, Republic of Korea)에서 배양하였다. 그 hMSCs를 37°C에서 5% CO₂ 분위기에서 배양하였다. 배양 배지를 실험 동안에 3일 마다 신선한 배지로 교환하였다. hMSCs가 분리되었을 때, 그 hMSCs를 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)(WELGENE, Republic of Korea)으로 세척한 후, 1mL의 trypsin-EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 용액을 첨가하였다. 세포들을 3에서 6계대 사이에서 사용하였다.

세포 증식(세포 생존률 ) 및 분화

0.01% (v/v), 0.1%, 0.5%, 1%, 및 2%의 농도를 가지는 CNCs를 96-웰 플레이트(세포 증식용) 및 24-웰 플레이트(세포 분화용)에 첨가하였다. 세포 증식을 WST-1 어세이(EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, Daeillab Service Co., Ltd, Republic of Korea)를 사용하여 분석하였다.

요약하면, hMSCs를 20,000 cells/ml로 96-웰 플레이트에 접종하고 37°C에서 24 시간 동안 배양하였다. 여러 농도의 CNCs를 단지 배지만을 함유한 5웰(대조군)을 포함하여 각 웰에 첨가하였다. 그 세포들을 37°C에서 24시간 및 48시간 동안 배양하였다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였다. mineralized 염색 테스트를 위하여, hMSCs를 50,000 cells/ml로 24-웰 플레이트 상에 접종하고 골형성 배지에서 7일 및 14일 동안 배양하였다. 그 배지를 제거하고 DPBS로 3회 세척하였다. 세포를 4% formalin을 사용하여 10분간 상온에서 고정한 후 diH₂O로 세포를 헹구었다. 세포를 40 mM alizarin red S 염색 용액(pH 4.1)에서 상온에서 배양하였다. 최종적으로, 세포를 diH2O 린싱을 하고 이미지화하였다.

역전사 중합효소 연쇄 반응(RT- PCR ) 분석

역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 골형성 인자들(Osteopontin (OPN), Alkaline phosphatases (ALP), Integrin binding sialoprotein (IBSP), Runt-related transcription factor 2 (RUNX2))의 발현에 대해 수행하였다.

전체 RNA를 TRIzol reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 세포로부터 추출하였고, RNA 샘플을 cDNA로 전환하였다. RT-PCR는 20μl 최종 부피에서 cDNA 및 프라이머로 AccuPower® Taq PCR PreMix (BIONEER, Republic of Korea)로 수행하였다(표 1). 그 PCR 산물들을 1% agarose gel (Bio-Rad, USA) 전기영동으로 분리하고 Chemidoc XRS 시스템(BR170-8265, Bio-Rad, USA)을 사용하여 젤 이미지 분석 하에서 촬영하였다. 그 실험은 3회 반복 수행하였다.

Name		Sequence (5'-3')	Accession No.	Product size (bp)
ALP	(F)	GGACATGCAGTACGAGCTGA	BC090861	357
	(R)	GCAGTGAAGGGCTTCTTGTC
OPN	(F)	CCCACAGACCCTTCCAAGTA	J04765	279
	(R)	ACACTATCACCTCGGCCATC
IBSP	(F)	CAACAGCACAGAGGCAGAAA	NM_004967	248
	(R)	CGTACTCCCCCTCGTATTCA
RUNX2	(F)	CGCATTCCTCATCCCAGTAT	NM_001015051	432
	(R)	GACTGGCGGGGTGTAAGTAA

표 1은 RT-PCR에 사용된 프라이머 및 프로브 서열

실시예 3: NPG ( 나노셀룰로오스 -코팅된 electrospun PCL nanofiber on rGO ) 스캐폴드의 개발

환원된 그래핀 옥사이드 (reduced graphene oxide)의 제조

환원된 그래핀 옥사이드(이하, 'rGO'라 함)은 modified Hummers 방법(Lee et al., 2015; Lim et al., 2016)으로 제조하였다. 그래핀 분말을 얼음 배스에서 NaNO₃ 및 H-₂SO₄ 속에서 4시간 동안 교반한 후 KMnO4를 첨가하고 40°C에서 교반하였다. 그 현탁액을 워터 배스에서 98 °C에서 1시간동안 가열하였다. 그 현탁액을 H₂O₂로 처리하였다. 그 혼합액을 10% HCl 및 탈이온수로 5회 세척하였다. 그 다음, 그 rGO를 여과하고 진공 하에서 건조하였다.

rGO 기질을 제조하기 위한 스핀 코팅

본 발명에서 스캐폴딩의 개략도를 도7에 나타내었다. 유리 기질을 먼저 70% ethanol로 닦았다. Aliquots의 rGO 용액(각 70 μl)를 유리 기질 위에 떨어트리고 바로 표 2에서 나타낸 조건에서 스핀-코터(coater) 상에서 스핀하였다. 코팅 후, 그 rGO-코팅된 기질을 24시간 동안 상온에서 건조하였다.

Step	Speed (rpm)	Time (s)	Ramp (s)
1	2000	30	10
2	3000	30	10
3	4000	30	10
4	5000	30	10
5	6000	30	10
6	4000	30	10
7	0	30	10

표 2는 rGO 코팅의 조건을 나타낸 표

NPG 스캐폴드의 제조

평균 분자량 80,000을 가지는 PCL (Sigma-Aldrich, USA)을 CNCs/PCL nanocomposites를 제조하는데 사용하였다. PCL를 dimethylformamide (Daejung, Republic of Korea)에 녹여서 15 wt% 용액을 얻었다. 0.1, 0.5, 1, 및 2%의 중량 비를 가지는 CNCs를 PCL와 컴파운드화하였다. CNCs/PCL 용액을 10 cm³ 플라스틱 주사기로 로딩하였다. 그 용액을 일정한 유속으로 고 전압 전원 공급기와 연결된 graphene-코팅된 기질로 운반하였다. 고 전압(18.0 kV/cm) 적용시, Taylor cone 제트를 graphene-코팅된 기질로부터 분출되었다. 세포 접종을 위한 살균 전에, 그 스캐폴드를 70% ethanol 용액에 24시간 동안 침지하고 탈이온수로 충분하게 세척하였다.

기계적 특성

NPG 스캐폴드를 인장 시험을 분석하였다. 테스트 부위는 3 mm x 20mm이다. 인장 시험은 유니버설 테스팅 머신(MCT-1150, AND Inc., Japan)에서 수행하였다. 테스트는 일정한 속도인 10 mm/min를 사용하여 수행하였다. 모든 스캐폴드는 3회 반복하였다.

NPG 스캐폴드에 대한 세포독성

제조된 스캐폴드 상에서 hMSCs를 24시간 배양하여 세포독성을 측정하였다. 제조된 스캐폴드를 24-웰 플레이트에 위치시키고, 37°C, 5% CO2에서 배양하였다.

스캐폴드에 대한 세포 생존률을 WST-1 분석을 사용하여 분석하였다. 대사적으로 활성이 있는 hMSCs는 WST-1 시약과 반응하여 formazan 염료를 생산하고 분광계를 사용하여 490 nm에서 관찰하였다. 세포 배양 후, 그 hMSCs를 DPBS에서 2회 세척하였다. 100 μl의 WST-1 시약을 각 웰에 첨가하고 3시간 동안 반응시켰다. 100 μl를 96-웰 플레이트에 분주하고, 그 흡광도를 490nm에서 측정하였다.

NPG 스캐폴드에 대한 Mineralized 염색 테스트

hMSCs를 7일 및 14일 동안 제조된 스캐폴드 상에서 배양하였다. 배지를 2일 마다 대체하였다. 4 계대 세포를 세포 접종을 위하여 사용하였다. 세포 배양 후, hMSCs를 4% formalin에서 15분간 고정화한 후 30분간 건조하였다. 초과 염료를 탈이온수로 4회 세척하였다. 잔류 염료를 500 μl의 탈염료 용액(10% cetyl pyridinium chloride 및 10 mM sodium phosphate)에서 녹였다. 그 용액을 분광계를 사용하여 562 nm에서 분석하였다.

본 발명의 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 모든 통계적 분석을 위하여, 일원 변량 분석(ANOVA)을 SPSS Statistics (IBM SPSS Statistics 23, IBM Inc., USA)를 사용하여 수행하였다. P 값 <0.05를 유의적으로 간주하였다.

상기 실시예의 결과를 설명한다.

처리된 왕겨의 형태

도 2는 정제 전 후의 왕겨의 사진을 보여준다. sodium chlorite 및 acetic acid의 처리는 원래 왕겨와 비교하여 다르다. 왕겨로부터 흰색 셀룰로오스를 얻었다. 색 변화는 비-셀룰로오스 물질 및 lignin, hemicellulose, silica, 및 wax와 같은 다른 불순물의 제거에 기인한다.

정제 전 및 후의 왕겨의 구조를 SEM을 사용하여 관찰하였다(도 3).

왕겨로부터 셀룰로오스 정제에 사용된 화학적 처리는 색 및 표면 특성과 같은 형태적 변화를 야기하였다. 원래 왕겨는 매끄러운 표면을 가졌다(도 3A). 그러나 화학적 처리는 표면이 거친 것을 확인하였다(도 3B).

이 결과들은 hemicellulose, lignin, 및 wax와 같은 비-셀룰로오스 층의 도메인이 제거되었다는 것을 나타낸다.

따라서 왕겨로부터 유래된 제조된 셀룰로오스는 기계적 강도를 증가시킬 수 있는 물질로 사용될 수 있다.

처리된 왕겨의 화학적 구조

도 4는 정제 전 및 후의 왕겨의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 미처리된 왕겨는 주로 cellulose, hemicellulose, lignin, silica, wax, 등으로 구성되어 있다.

Si-O bonds (800 cm^- ¹)는 KOH 처리로 제거되었다. 원래 왕겨에서 기록된 스펙트럼에서 볼 수 있는 1517 및 1640 cm^-1밴드는 aromatic C=C stretching으로서 리그닌의 존재를 나타낸다. 화학적 처리 후 리그닌이 충분하게 제거되었다는 것을 확인하였다. 원래 왕겨의 스펙트럼에서 1736 cm^-1 밴드는 헤미셀룰로오스의 acetyl 및 uronic 에스테르 기의 C=O stretching에 기인한다. 처리된 왕겨 스펙트럼에서 NaOH 처리에 의하여 헤미셀룰로오스의 현저한 제거로 인하여 이 피크는 감소하였다.

1040 및 896 cm^-1 에 위치하는 밴드는 셀룰로오스의 C-O stretching 및 C-H rock vibrations과 관련이 있다. 이 피크들은 cellulosic components의 퍼센트에서 증가한 것을 나타내었다. 모든 스펙트럼에서 관찰된 3360 cm^-1피크는 C-H stretching 및 O-H stretching를 나타낸다.

이 결과들은 왕겨에 수행된 화학적 처리 동안 cellulose component는 제거되지 않았고 정제 전 및 후 왕겨에서 발견되는 일반적인 물질이라는 것을 나타낸다.

처리된 왕겨의 열적 특성

열적 안정성은 효과적인 강화 물질로 사용하기 위한 필수적인 고려사항이다. 정제 전 및 후 왕겨의 열적 특성을 평가하기 위하여, 주된 결과를 도 5에 나타내었다.

정제 전 및 후 왕겨 샘플 모두에서 수분 증발로 인하여 약 100°C에서 처음 일어난다. 주된 분해 지역은 250 및 370°C 사이에 위치한다. 원래 왕겨의 경우, 두 지역에서 중량 매스가 진행되었다는 것을 확인하였다. 첫번째 부위에서, 리그닌과 동일한 콤포넌트의 존재가 관찰되었다. 두번째 지역에서, 셀룰로오스는 연소된 것을 발견하였다. 처리된 왕겨에서 lignin 및 wax는 제거되었고, 350°C에서 질량 감소가 나타났다.

CNCs의 형태

산 가수분해 처리는 셀룰로오스 섬유의 무정형 부위를 절단하여서 그들의 크기를 나노스케일로 축소시킨다. 도 6은 왕겨로부터 유래한 CNCs의 형태를 보여준다. 왕겨로부터 유래한 CNCs의 추출이 성공적이었다는 것을 확인하였다. 평균 CNCs 길이는 128.3 nm이었고, 폭은 10.5 nm이었다. 길이 및 폭을 도 7에 나타내었다.

세포 증식(세포 생존률 )

CNCs의 세포 증식을 WST-1 분석으로 평가하였다. CNCs를 hMSCs에 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 및 2% 농도(w/v)로 첨가하였다. 그 후, 그 hMSCs를 24h 및 48h 동안 배양하였다. 세포 대사적 증식률을 측정하였다. 세포 증식의 결과는 도 8에 나타내었다.

세포 생존률은 배양 기간 동안 모든 CNCs 농도에서 유사하거나 연속적으로 증가하였다. 24시간 후 배양물의 조사는 대조군과 비교하여 세포 생존률에서 구별되는 차이는 없었다. CNCs 농도 1% 및 2%에서 48시간 배양할 때, 세포 생존률은 크게 개선되었다(각각 105.9% 및 106.7%).

본 발명에서 왕겨에서 추출된 CNCs의 세포 생존률(99%-106%)은 면(cotton)에서 추출된 CNCs의 세포 생존률보다(70%-90%) 더 높았다. 본 발명은 생체물질로서 적합한 결과를 위한 hMSCs에서 세포독성을 나타내었다.

결과적으로 왕겨로부터 추출된 CNCs는 바이오의약 및 생명공학적 적용에 커다란 가능성을 나타낸다.

세포 분화(mineralization)

mineralization 실험은 골형성 분화를 반영하는 인 비트로 평가를 요한다.

도 9는 7일 (도 9A) 및 14일(도 9B) 동안 여려 농도의 처리된 CNCs(0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 및 2%)로 분화 배지에서 배양된 세포의 이미지를 나타낸다.

도 9A에 나타낸 것과 같이, alizarin red 활성은 7일 후 CNCs의 농도에서 증가함에 따라 조금 증가하였다. 14 일 후, hMSCs는 7일때 보다 더 염색되었다(도 9B). 0.5% CNCs의 농도에서 14 일 후 대조군 및 다른 농도와 비교하여 더 진한 적색으로 염색된 석회화 결절들이 유도된다.

hMSCs에 CNCs를 7 일 및 14 일 처리한 다음 ELISA 리더로 정량화하였다(도 10). 14일간 처리한 hMSCs가 7일 간 처리한 hMSCs에 비교하여 세포 분화를 더욱 활성적으로 촉진하였다는 것을 확인하였다. CNCs의 농도가 0.5% 이상일 때, 세포 분화가 현저하게 증가하였다.

hMSCs에서 골형성 분화 마커 유전자의 발현

골형성 마커의 발현에 대한 효과를 평가하기 위하여, OPN, ALP, IBSP, 및 RUNX2의 mRNA 수준을 역전사 PCR로 분석하였다(도 11).

RNA를 7일 및 14일에 0.5 % CNCs 처리된(최고 mineralization) hMSCs로부터 추출하였다. 7일에 유전자 발현은 감소하고 다소 증가하였다 (도 11A).그러나 14일에 OPN, ALP, IBSP, 및 RUNX2의 발현 수준은 증가하였다(도 11B). LP 및 RUNX2의 발현은 7일 및 14일 후에 업레귤레이션되었다. ALP의 발현은 14일에 최대이었다.

이 결과들은 CNCs가 골형성 마커 발현을 통하여 hMSCs 골형성을 유도한다는 것을 나타낸다.

NPG 스캐폴드의 표면 이미지

도 12는 NPG 스캐폴드의 SEM 이미지를 나타낸다. 비록 CNCs를 PCL에 첨가하였지만, 스캐폴드의 외형 및 형태는 보존되었다.

CNCs가 혼합됨에 따라, 스캐폴드의 섬유 형태는 더 균일하여지고, 섬유 직경은 감소하였다. CNCs의 첨가는 CNCs의 황산 에스테르의 존재에 기인하여 용액의 전기 전도성을 증가시켰다. 이 이유로, 섬유의 직경은 더 높은 인장력을 촉진하여 더 작게 형성된다. 스캐폴드에서 PCL 및 낮은 CNCs 양이 첨가될 때, 그 섬유는 엉겨서 구형 비드를 형성하였다. 그러나 CNCs의 첨가는 구형 비드의 생성을 감소시켰다. 잘 분산된 섬유의 형태는 세포 부착 및 세포 증식에 기여하는 인자이다.

따라서 NPG 스캐폴드는 PCL 스캐폴드와 비교하여 세포에 대한 긍정적인 효과를 가지는 것으로 예상된다.

NPG 스캐폴드의 기계적 특성

NPG 스캐폴드의 기계적 특성은 UTM를 사용하여 평가하였다(도 13). 대조군은 CNCs를 포함하지 않는 PG 스캐폴드이다.

NPG 스캐폴드의 스트레스-strain 곡선(도 13A) 및 인장 피크 스트레스 (도 13B)는 다양한 CNCs의 포함을 가지는 스캐폴드의 기계적 특성을 나타낸다. NPG 스캐폴드의 브레이크에서 스트레인과 스트레스 값은 대조군과 비교하여 개선되었다.

최대 스트레인은 2% NPG 스캐폴드에서 나타났고(20.6%), 그 후 그것은 가파르게 감소하였다. 이 값은 CNCs를 포함하는 스캐폴드가 대조군(7.5%)과 비교하여 더 유연하다는 것을 시사한다. 0.1, 0.5, 1% CNCs에서 NPG 스캐폴드는 각각 11.5, 11.1, 및 13.6%에서 스트레인을 가진다.

PG 스캐폴드의 브레이크에서 스트레스는 0.0168 MPa로 확인되었다. NPG 스캐폴드의 0.1% CNCs 양에서 스트레스(0.0162 MPa)는 PG 스캐폴드와 유사하였다. 그러나, 제조된 스캐폴드의 브레이크에서 스트레스는 CNCs 양이 증가함에 따라 증가하였다. NPG 스캐폴드의 브레이크 0.5, 1, 및 2%에서 스트레스의 값은 각각 0.0194, 0.0244, 및 0.0288 MPa이었다.

이 결과들은 CNCs의 높은 특징 비율은 폴리머의 스트레스를 증가시키는 효과를 나타내었다. 또한 이 결과들은 NPG 스캐폴드가 생체물질로 적용될 수 있는 기계적 특성을 가진다는 것을 나타낸다.

세포독성 및 mineralized 테스트

NPG 스캐폴드의 세포독성은 WST-1 분석으로 확인하였다. 세포독성을 세포 생존률로 나타내었다. 세포 생존률의 값은 도 14에 나타내었다.

이 결과들은 세포 생존률은 CNCs 농도가 0.1에서 1%까지 증가함에 따라 증가하는 경향을 나타내었지만 2% CNCs에서 세포 생존률은 1% CNCs 농도에서 생존률과 비교하여 감소하였다.

결론적으로, 제조된 스캐폴드는 PCL 스캐폴드와 비교하여 적어도 110%에서 124%까지 세포 농도가 증가하였다. 이 결과들은 NPG 스캐폴드가 세포독성이 없다는 것을 나타낸다.

따라서 NPG 스캐폴드는 조직 공학 적용에서 세포와 스캐폴드의 상호작용을 촉진하는데 사용될 수 있다.

Mineralized 테스트는 alizarin red 용액을 사용하여 수행하였다.

7일 및 14일 동안 배양된 hMSCs의 alizarin red 염색은 세포 분화에 대한 제조된 스캐폴드의 효과를 평가하는데 수행되었다. 염색된 스캐폴드의 이미지는 도 15에 나타내었다. 0.1% CNCs의 존재는 7일에서 세포 분화를 크게 증가시켰다. 14 일 후, 지속적인 세포 분화는 유도되지 않았다. 1% CNCs의 첨가는 14일 동안 세포분화를 현저하게 유도하였다.

NPG 스캐폴드의 alizarin 염색의 정량화를 도 16에 나타내었다. 2% NPG 스캐폴드는 PG 스캐폴드와 비교하여 7 및 14일에서 감소하였다. 결론적으로 적당한 농도의 CNCs는 골 세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.

Claims

왕겨로부터 실리카, 헤미셀룰로오스 및 리그닌을 제거하여 왕겨로부터 셀룰로오스 나노크리스탈을 얻는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 왕겨 분말을 수산화칼륨 용액을 처리하여 실리카를 제거하고, 그 현탁액을 아염소산나트륨(sodium chlorite) 및 초산을 첨가하여 반응시켜서 리그닌을 제거하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 왕겨로부터 셀룰로오스 나노크리스탈을 얻는 방법.
제1항 또는 제2항의 방법에 의하여 얻어진 왕겨로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈.
제3항에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노크리스탈의 평균 셀룰로오스 나노크리스탈 길이는 128.3 nm이고, 폭은 10.5 nm인 것을 특징으로 하는 왕겨로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈.
제3항의 왕겨로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 인 비트로에서 세포에 처리하여 세포의 증식을 증가시키는 방법.
제5항에 있어서, 상기 세포는 인간 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노크리스탈을 세포에 처리하는 농도 및 시간은 1% 및 2%(w/v)에서 48시간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항의 왕겨로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 인 비트로에서 세포에 처리하여 세포의 분화를 유도시키는 방법.
제8항에 있어서, 상기 세포는 인간 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노크리스탈을 세포에 처리하는 농도 및 시간은 0.5% 및 1%(w/v)에서 14일 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
폴리카프로락톤(Polycaprolactone;PCL)에 제3항의셀룰로오스 나노크리스탈을 첨가하여 복합체를 제조하는 방법.
제11항의 방법에 의하여 제조된 복합체를 포함하는 골세포 분화용 조성물.