KR20220049745A

KR20220049745A - 커피 부산물로부터 추출된 셀룰로오스 나노크리스탈 및 그 용도

Info

Publication number: KR20220049745A
Application number: KR1020200133226A
Authority: KR
Inventors: 임기택
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2020-10-15
Filing date: 2020-10-15
Publication date: 2022-04-22
Also published as: KR102506227B1

Abstract

본 발명은 커피 부산물을 화학적으로 처리하여 커피 부산물로부터 셀룰로오스 나노크리스탈을 얻는 방법 및 그 방법으로 얻어진 셀룰로오스 나노크리스탈을 조직 공학에 유용한 생체 물질로 적용할 수 있는 것이다.

Description

커피 부산물로부터 추출된 셀룰로오스 나노크리스탈 및 그 용도{Cellulose nanocrystals extracted from coffee by-products and use of the same}

본 발명은 커피 부산물로부터 추출된 셀룰로오스 나노크리스탈 및 그 용도에 관한 것이다.

커피는 전 세계적으로 가장 인기있는 음료 중 하나이며, 전 세계적으로 연간 1 억 5 천만 톤의 생산으로 추정되는 산업으로 확산되었으며, 많은 커피 부산물이 커피 펄프, 커피 찌꺼기 등의 형태로 생산된다. 이러한 부산물에 대한 이용이 제한되고, 직접 폐기는 카페인, 탄닌 및 폴리 페놀과 같은 독성 성분으로 인해 환경에 악영향을 미칠 수 있다. 따라서 이들 부산물을 유용한 재료로 변환에 활용할 수 있는 적절하고 경제적인 방법의 개발이 필요하다.

셀룰로오스는 지구상에서 가장 풍부한 바이오 폴리머이며 식품, 바이오 연료 및 제약 분야에서 널리 연구되고 있다. 그것은 구조에 비정질 및 결정질 영역이 있다. 셀룰로오스의 산 가수 분해는 셀룰로오스 나노 결정 (CNC)으로 알려진 나노 미터 고도로 결정질 구조를 생성한다. CNC는 매크로 아날로그 구조가 아닌 우수한 물리 화학적 특성으로 인해 다양한 응용 분야에서 많은 주목을 받았다.

[선행특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제1999-0063952호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 커피 부산물로부터 유용한 재료를 얻는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 커피 부산물을 화학적으로 처리하여 커피 부산물로부터 셀룰로오스 나노크리스탈을 얻는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,

상기 방법은 커피 부산물을 수산화칼륨 용액을 처리하고 산을 처리하여 중화한 후, 아염소 산나트륨(sodium chlorite) 및 초산을 첨가하여 반응시켜서 리그닌을 제거하는 과정을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 커피 부산물로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,

상기 셀룰로오스 나노크리스탈의 평균 셀룰로오스 나노크리스탈 길이는 120 nm인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서,

상기 셀룰로오스 나노크리스탈은 황산염 기를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 커피 부산물로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 인 비트로에서 세포에 처리하여 세포의 증식을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,

상기 세포는 인간 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,

상기 셀룰로오스 나노크리스탈을 세포에 처리하는 농도는 0.5%(w/v)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 커피 부산물로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 인 비트로에서 세포에 처리하여 세포의 광물화를 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,

또한 본 발명은 상기 본 발명의 커피 부산물로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 인 비트로에서 세포에 처리하여 골형성 관련 유전자의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,

상기 골형성 관련 유전자는 BSP(bone sialoprotein)인 것이 바람직하나 ㅇld에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서 우리는 화학적 처리를 통해 커피 찌꺼기에서 CNC를 추출하고 골수 유래 줄기 세포 (BMSCs) 존재 하에서 골 형성 가능성을 평가했다. 수득된 물질은 FTIR, XRD 및 TGA 측정으로 특성화되었다. 커피에서 추출한 CNC의 존재에서 골 형성이 크게 향상되었다.

본 발명에서 알 수 있는 바와 같이, CNC는 커피 찌꺼기에서 성공적으로 추출되었으며 다양한 분광 기술로 특성을 살펴 보았다.

추출된 CNC는 열 안정성이 감소 된 바늘 모양의 결정 형태를 나타냈다. BMSC의 존재 하에서 CNC의 부작용이 관찰되지 않아 생체 적합성을 나타내었고, 세포 생존력은 배지에서 CNC 내용물에 의해 크게 영향을 받았다.

향상된 광물화 및 골 형성 발생이 대조군과 비교하여 CNC 처리된 배지에서 나타났고, 이것은 그들의 우수한 골 형성 잠재력을 나타낸다.

따라서 화학적 처리는 폐 커피박을 조직 공학에 유용한 생체 물질로 성공적으로 전환시킨다.

도 1 (a)는 커피 찌꺼기에서 CNC 추출에 대한 개략도이고,
(b)는 추출된 CNC의 TEM 이미지이며,
(c)는 추출된 셀룰로오스 및 CNC의 FTIR 스펙트럼.
도 2는 추출된 셀룰로오스와 CNC의 (a) XRD 패턴 및 (b) TGA 곡선,
도 3(a)는 추출된 CNC의 존재 하의 BMSC의 세포 생존력이고, (b)는 CNC를 사용하거나 CNC를 사용하지 않은 BMSC의 현미경 형광 이미지이며,
도 4(a)는 추출된 CNC의 광물화 능력이고, (b)는 기재된 기간에서 CNC를 사용하거나 CNC 없이 골 형성 유전자 발현을 나타낸 그림.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 커피 부산물로부터 CNC 추출 및 특성화

CNC 추출

커피 찌꺼기에서 CNC 추출은 이전에 보고된 것을 약간 수정하여 수행되었다 [S. Sung, Y. Chang, J. Han, Carbohydr. Polym.169 (2017) 495-503. doi:10.1016/j.carbpol.2017.04.0375].

요약하면, 건조된 커피 부산물 분말 (30g)을 연속 기계적인 교반과 함께 90 °C에서 2 시간 동안 1:12의 중량비로 3%(w/v) 수산화 칼륨(KOH; Sigma-Aldrich, USA)으로 처리했다. KOH 처리된 커피 부산물 분말을 증류수 (DI)로 세척한 후 10 % (v/v) 염산(HCL; Wako Pure Chemicals Co., Japan)으로 중화했다. 중화된 샘플을 여과하고 60 °C에서 48 시간 동안 건조시켰다.

건조된 물질(14.26g)을 아염소산 나트륨 (대한민국, 대중 화학)과 아세트산을 용액에 존재하는 고형분 1.2g 대 240μL의 비율로 처리하여 리그닌을 제거하였다.

이 과정을 6 회 반복한 후 잔류물을 탈 이온수로 세척하고 동결 건조 (Freeze Dryer, EYELA Freeze Drying Unit 2200, Tokyo Rikakikai Co., Japan)를 24 시간 동안 진행하였다.

잔류 물질 (3.14g)을 수산화 나트륨(NaOH; Sigma-Aldrich, USA) 및 10 % 아세트산 (v/v)으로 50 분 동안 연속 교반하면서 처리하여 헤미셀룰로오스를 제거하였다.

그 후, 그 물질을 탈 이온수로 세척하고 여과하여 순수한 셀룰로오스를 얻었다.

얻어진 셀룰로오스 (1.25g)를 64 % 황산(H2SO4; 대중 화학, 대한민국)으로 45 °C에서 60 분간 처리한 후 10 배의 냉장 탈이온수를 첨가하여 반응을 급냉시켰다. 그 얻어진 물질을 셀룰로오스 튜브(12-14 kDa)로 3-4 일 동안 투석하였다.

Perkin Elmer FTIR 분석기(Frontier, Perkin Elmer, UK)를 적용하여 4cm-1의 해상도로 500-4000cm-1 범위의 기능기를 관찰하였다.

구조적 특성은 X’Pert PRO X 선 회절계(X’Pert PRO MPD, Philips, Eindhoven, Netherlands)에 의해 확인하였다. 크기와 형태는 투과 전자 현미경 (TEM) (JEM 2100F, Jeol, Japan)에 의해 결정되었다. 수득된 물질의 열 안정성은 열 중량 분석기(TGA) (SDT Q600, TA Instruments, USA)를 통해 평가되었다.

실시예 2: 세포 배양 및 골 형성

골수 유래 중간엽 줄기 세포(BMSC)는 대한민국 서울에 있는 서울대학교 소재 한국 세포주 은행 (KCLB)에서 받아 이전에 다른 곳에서 보고된 바와 같이 배양하였다[D. Patel, S. Dutta, J. Hexiu, K. Ganguly, K. Lim, Int. J.Biol. Macromol. 162 (2020) 1429-1441. doi:10.1016/j.ijbiomac.2020.07.2468].

CNC 존재 하에서 BMSC 유래 광물화 및 골 형성 관련 유전자 발현은 본 발명자들의 기존 논문[H. Kim, B. Jin, D. Patel, J. Kim, J. Kim, H. Seonwoo et al., IEEE Trans. Nanobioscience. 18 (2019) 463-468. doi:10.1109/tnb.2019.2914127]과 같이 수행되었다.

상기 실시예의 결과는 하기에서 서술한다.

커피 찌꺼기에서 CNC 추출에 대한 개략도는 그림 1 (a)에 나와 있다. 수득된 샘플은 화학적 처리로 대부분의 비(non)-셀룰로오스 성분이 제거되었음을 나타내는 상당히 흰색이었다.

산 가수 분해된 CNC의 TEM 이미지는 그림 1(b)에 나와 있다.

산 가수 분해는 매우 결정적이고 바늘과 같은 구조를 생성하고 이것은 무정형 셀룰로오스 영역의 제거를 시사한다.

얻은 CNC의 평균 길이는 약 120nm이다. FTIR 분광기는 작용기와 관련된 정보를 가능하게하는 강력한 분석 기술이다. 커피 찌꺼기에서 추출한 셀룰로오스와 CNC의 FTIR 스펙트럼은 그림 1 (c)에 나타내었다.

1700cm^-1에서 FTIR 흡수 피크의 출현은 헤미셀룰로오스의 아세틸 그룹이 존재함을 나타내는 반면,이 피크의 강도는 CNC에서 약화되었다.

CNC에서 813 cm^-1에 추가 피크의 존재는 구조에 황산염 기가 존재함을 시사한다.

CNC의 FTIR 스펙트럼은 셀룰로오스와 유사한 패턴을 나타내며, 이는 산 가수분해에 의해 일어난 셀룰로오스의 분자 구조에 큰 변화가 없음을 보여준다. 추출 된 셀룰로오스와 CNC의 XRD 패턴은 그림 2 (a)와 같다.

셀룰로오스의 XRD 패턴은 ~ 11.9, 21.5 및 22.4 °에서 3 개의 두드러진 회절 피크를 나타내어 셀룰로오스 I 및 셀룰로오스 II 구조를 시사한다.

11.9 °에서 회절 피크는 CNC에서 관찰되지 않는 무정형 셀룰로오스 영역의 존재로 인해 나타나며 산 가수 분해 동안 무정형 영역의 제거를 더욱 확인한다.

22.4 °에서 뚜렷한 결정질 피크가 관찰되었으며 강도가 강화되어 결정질 CNC가 있음을 나타낸다.

TGA는 추출한 물질의 열 안정성을 결정하고 그 결과는 그림 2 (b)에 나와 있다.

셀룰로오스에 비해 그 구조에 황산염 기가 존재하기 때문에 CNC의 열 안정성이 감소하는 것이 관찰되었고 이것은 열 전도성이 높고 열 전달과 빠른 열 분해를 촉진한다.

셀룰로오스 및 CNC의 10 % 중량 손실은 각각 204 및 162 °C에서 발생했다. ~ 100 ° C 아래 지역의 열 분해는 결합된 물 분자의 손실로 인한 것이다.

셀룰로오스 구조의 손실은 ~ 200 °C 이후 발생했으며, 이것은 각각 CNC에서 ~ 320 ° C 및 380 °C 후에서 탄소 잔기의 빠른 해중합(depolymerization)이 수반되었다.

추출된 CNC의 세포 독성은 WST-1 assay를 통해 평가하였으며 그 결과는 도 3 (a)와 같다.

특히, 대조군보다 CNC 처리 그룹에서 더 나은 세포 생존력이 관찰되어 생체 적합성을 나타낸다.

세포 생존력은 CNC의 함량에 크게 영향을 받았으며, 처리된 그룹 중 0.5 % CNC는 우수한 세포 생존력을 나타냈다. BMSC의 현미경 형광 이미지는 그림 3 (b)에 나와 있다.

현미경 이미지는 길쭉한 세포 구조를 보여 주며 세포는 건강했다. 추출된 CNC 광물화 잠재력은 처리 7 일 및 14 일 후에 BMSC를 사용하여 ARS 프로세스를 통해 모니터링되었다.

그 결과는 그림 4 (a)에 제시되어 있다. 샘플이 없는 배지는 대조군으로 취급되었다.

CNC 처리 그룹은 대조군에 비해 더 우수한 광물화 잠재력을 보여주는 더 현저한 광물화를 나타냈다. 이것은 향상된 세포 활동을 촉진하는 CNC의 더 나은 생체 적합성에 기인한다.

추출된 CNC에서 BMSC의 골 형성 관련 유전자 발현은 실시간 PCR로 평가되었으며 데이터는 그림 4(b)에 나와 있다. 이 경우 더 나은 광물화 활성으로 인해 0.5 % CNC를 사용했다.

7 일 배양 후 대조군과 비교하여 CNC 처리 배지에서 골 형성 관련 유전자 (Runx2, Osx, ALP, BSP, OCN, COL1 및 OPN)의 발현 향상이 발생했으며, 이는 처리 시간에 따라 더욱 증가하였고 이것은 그들의 뛰어난 골 형성 능력을 나타낸다.

Claims

커피 부산물을 화학적으로 처리하여 커피 부산물로부터 셀룰로오스 나노크리스탈을 얻는 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 커피 부산물을 수산화칼륨 용액을 처리하고 산을 처리하여 중화한 후, 아염소 산나트륨(sodium chlorite) 및 초산을 첨가하여 반응시켜서 리그닌을 제거하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 커피 부산물로부터 셀룰로오스 나노크리스탈을 얻는 방법.
제1항 또는 제2항의 방법에 의하여 얻어진 커피 부산물로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈.
제3항에 있어서,
상기 셀룰로오스 나노크리스탈의 평균 셀룰로오스 나노크리스탈 길이는 120 nm인 것을 특징으로 하는 커피 부산물로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈.
제3항에 있어서,
상기 셀룰로오스 나노크리스탈은 황산염 기를 가지는 것을 특징으로 하는 커피 부산물로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈.
제3항의 커피 부산물로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 인 비트로에서 세포에 처리하여 세포의 증식을 증가시키는 방법.
제6항에 있어서,
상기 세포는 인간 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 셀룰로오스 나노크리스탈을 세포에 처리하는 농도는 0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항의 커피 부산물로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 인 비트로에서 세포에 처리하여 세포의 광물화를 증가시키는 방법.
제9항에 있어서,
상기 셀룰로오스 나노크리스탈을 세포에 처리하는 농도는 0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항의 커피 부산물로부터 유래한 셀룰로오스 나노크리스탈을 인 비트로에서 세포에 처리하여 골형성 관련 유전자의 발현을 증가시키는 방법.
제11항에 있어서,
상기 골형성 관련 유전자는 BSP(bone sialoprotein)인 방법.