JP6108630B2 - 血液凝固因子VII及びVIIa誘導体、それらを含む結合体及び複合体、並びにそれらの使用 - Google Patents
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Description
まず、ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)法を用いてシグナル配列を含むヒトのFactor VII遺伝子を取得した。Factor VII(FacVII)遺伝子増幅のために、ヒト胎児の肝臓(fetal liver)cDNAライブラリー(TAKARA BIO USA)を鋳型とし、配列番号1及び2の正方向及び逆方向プライマーを用いてPCRを行った(95℃で1分間の変性,30サイクル(95℃で30秒間,60℃で30秒間,68℃で90秒間);68℃で5分間)。ここで、クローニング作業を容易にするために、配列番号1のプライマーには制限酵素BamHI認識部位を挿入し、配列番号2のプライマーには制限酵素XhoI認識部位を挿入した。次に、前記PCRにより得られた約1.3kbのPCR産物の塩基配列(配列番号3及び4)を確認した。
VIIXhoIAS R:5’−gggctcgagctagggaaatggggctcgcagg−3’(配列番号2)
実施例1で製造したFacVII遺伝子を含む発現ベクター(pX0GC−FVII)を用い、FacVIIのC末端にSOD1(Superoxide Dismutase 1,配列番号30)の一部配列が結合された形態のFacVII誘導体をコードするポリヌクレオチドを得て、前記誘導体を発現させることのできる発現ベクターを製造した。
実施例1で製造された発現ベクターpX0GC−FVIIに含まれるFacVII遺伝子の3’末端にSOD1の1位〜6位の配列(ATKAVC,配列番号5)をコードするポリヌクレオチドが追加されたポリヌクレオチドを含む組換えFacVII誘導体発現ベクターpX0GC−FVII−ATKAVCを製造した。具体的には、前記発現ベクターpX0GC−FVIIを鋳型とし、下記の配列番号6及び7の正方向及び逆方向プライマーを用いてPCRを行った(95℃で1分間の変性,30サイクル(95℃で60秒間,60℃で60秒間,68℃で90秒間);68℃で5分間)。ここで、クローニング作業を容易にするために、配列番号6のプライマーには制限酵素EcoRI認識部位を挿入し、配列番号7のプライマーには制限酵素XhoI認識部位を挿入した。次に、前記PCRにより得られた約1.4kbのPCR産物の塩基配列(配列番号8)を確認した。
FVII#1XhoIAS R(配列番号7):5’−ccgctcgagtcagcacacggccttcgtcgcgggaaatggggctcgcaggaggactcctgggc−3’
実施例1で製造された発現ベクターpX0GC−FVIIに含まれるFacVII遺伝子の3’末端に6個のアミノ酸(GGGGSC,配列番号10)をコードするポリヌクレオチドが追加されたポリヌクレオチドを含む組換えFacVII誘導体発現ベクターpX0GC−FVII−GGGGSCを製造した。そのために、配列番号6及び11の正方向及び逆方向プライマーを用いてPCRを行うことを除いて、実施例2−1と同様の方法を行うことにより、約1.4kbのPCR産物の塩基配列(配列番号12)を確認した。次に、前記PCR産物を用いることを除いて、実施例2−1と同様の方法を行うことにより、FacVII遺伝子の3’末端にGGGGSC(配列番号10)をコードするポリヌクレオチドが結合された、FacVII誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター(pX0GC−FVII−GGGGSC)を製造した。
実施例1で製造された発現ベクターpX0GC−FVIIに含まれるFacVII遺伝子の3’末端にSOD1の1位〜149位のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが追加されたポリヌクレオチド(配列番号15)を含む組換えFacVII誘導体発現ベクターpX0GC−FVII−SOD1 1−149を製造した。
FVIISODInfAS R:5’−cggccttcgtcgcgggaaatggggctcgcaggag−3’(配列番号17)
SODXhoIAS R:5’−ccgctcgagtcaaattacaccacaagccaaacga−3’(配列番号19)
実施例2−3で製造された発現ベクターpX0GC−FVII−SOD1 1−149に含まれるSOD1遺伝子領域内にFacVIIの自己切断部位を挿入することを試みた。これを達成するために、前記FacVII−SOD1 1−149(配列番号14)の451位〜454位のアミノ酸であるSOD1の7位〜10位のアミノ酸VLKGがIPRIで置換されるように、変異型SOD1の1位〜149位のアミノ酸がFacVIIのC末端に結合された形態のアミノ酸配列(配列番号20)をコードするポリヌクレオチド(配列番号21)を含む組換えFacVII誘導体発現ベクターpX0GC−FVII−SOD1 IPRIを製造した。
FVIISOD1mutAS R:(配列番号23)5’−gatgccctgcactgggccgtcgatcctcggaatgcacacggccttcgtcgcggg−3’
前記SOD1の7位〜10位のアミノ酸であるVLKGがIPRIで置換されるように、変異型SOD1の1位〜25位のアミノ酸がFacVIIのC末端に結合された形態のアミノ酸配列(配列番号24)をコードするポリヌクレオチド(配列番号25)を含む組換えFacVII誘導体発現ベクターpX0GC−FVII−SOD1 1−25 IPRIを製造した。
前記SOD1の7位〜10位のアミノ酸であるVLKGがIPRIに置換されるように、変異型SOD1の1位〜90位のアミノ酸がFacVIIのC末端に結合された形態のアミノ酸配列(配列番号27)をコードするポリヌクレオチド(配列番号28)を含む組換えFacVII誘導体発現ベクターpX0GC−FVII−SOD1 1−90 IPRIを製造した。
実施例2で製造した各発現ベクターを用いて様々なFacVII誘導体を発現させた。
FacVIIのC末端に何も結合していない発現ベクター(対照群)と、FacVIIのC末端にSOD1 1−149配列、変異型SOD1 1−25配列、変異型SOD1 1−90配列、SOD1 1−6配列、又はGGGGSC配列を融合したポリヌクレオチドを含む発現ベクター(pX0GC−FVII−SOD1 1−149、pX0GC−FVII−SOD1 1−25 IPRI、pX0GC−FVII−SOD1 1−90 IPRI、pX0GC−FVII−ATKAVC、又はpX0GC−FVII−GGGGSC)をfreestyleTM293F細胞株(Invitrogen社, cat. no. R79007)に導入して各形質転換体を製造し、前記各形質転換体からそれぞれの様々なFacVII誘導体を発現させた。
実施例2−1で製造した発現ベクターpX0GC−FVII−ATKAVCをDHFR遺伝子の破壊により核酸生合成過程が不完全なDG44/CHO細胞株(CHO/dhfr−)(非特許文献1)に導入して形質転換体を得て、前記形質転換体からFacVII−ATKAVC誘導体を発現させた。
実施例3−2で製造した形質転換体を培養してFacVII−ATKAVCを発現させ、培養物を3000rpmで5分間遠心分離することにより培養上清を得た。
実施例4で精製したFacVII−ATKAVCを様々な分子量のPEGに結合させて結合体を製造した。
40 kDa mPEG−マレイミド(NOF, 日本)をFacVII−ATKAVCのC末端に結合させる(PEGylation)ために、100mMリン酸緩衝液(pH5.5)の条件下でFacVII−ATKAVC(1mg/ml)と40 kDa mPEG−マレイミドを1:20のモル比で混合し、還元剤である2mMトリアリルホスフィンを加えて25℃で2時間反応させた。その結果、モノペグ化されたFacVII−ATKAVC(FacVII−ATKAVC−40 k PEG結合体)が製造された(図3)。図3は製造されたFacVII−ATKAVCとPEGが結合した結合体を示す電気泳動写真であり、Mはサイズマーカー、レーン1は非還元条件でのFacVII−ATKAVC−40 kDa PEG結合体、及びレーン2は非還元条件でのFacVII−ATKAVC−5 kDa PEG結合体である。
アルデヒド−5 kDa PEG−マレイミド(NOF, 日本)をFacVII−ATKAVCのC末端に結合させるために、40 kDa mPEG−マレイミドの代わりにアルデヒド−5 kDa PEG−マレイミドを用いたことを除いて、実施例5−1と同様の方法を行うことにより、ペグ化されたFacVII−ATKAVC(FacVII−ATKAVC−5 kDa PEG結合体)を製造した(図3)。
マレイミド−10 kDa PEG−アルデヒド(NOF, 日本)のアルデヒド反応基と免疫グロブリンFc断片のN末端とを結合させるために、100mMリン酸緩衝液(pH6.0)の条件下で免疫グロブリンFc断片とマレイミド−10 kDa PEG−アルデヒドを1:1のモル比で混合し、タンパク質濃度10mg/mlの条件下で還元剤である20mM Na−CNBH3を加え、低温(4〜8℃)で2時間反応させた。モノペグ化された免疫グロブリンFc断片(マレイミド−10 kDa PEG−Fc)を得るために、陽イオンクロマトグラフィーであるSource15Qを用いて、20mMトリス緩衝液(pH7.5)の条件下で塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出した。
FacVIIとFacVII−ATKAVCの in vitro 活性を測定するために、商用キット(Chromogenix, COASET)を用いてchromogenic assayを行った。活性測定試験は、欧州薬局方「2.7.10.ASSAY OF HUMAN COAGULATION FACTOR VII」の内容に基づいて行った。
部位特異的結合(site-specific conjugation)による活性を確認するために、FacVII−40 kDa PEG、FacVII−ATKAVC、C末端ペグ化FacVII−ATKAVC−40 kDa PEGの in vitro 活性を測定した。商用キット(Chromogenix, COASET)を用いてchromogenic assayを行い、実施例6と同様の試験方法を用いた。テストサンプルの処理濃度による吸光度値の変化はSoftmax Pro 4.0 programの4−parameter modelを用いて確認し、そこから得られたEC50値を用いてペグ化後の相対力価(relative activity)を確認した。
FacVIIa−ATKAVC−PEG−Fcの in vitro 活性を測定するために、商用キット(StaclotVIIa-rTF, Stago)を用い、標準物質としては国際標準品であるNIBSC Factor VIIa(656IU/vial,Code No.07/228)を用いた。この試験法は、rsTF(recombinant soluble tissue factor)がFactor VIIaと特異的に反応して凝固が起こる原理に基づくものである。3つの濃度のNIBSC Factor VIIa、FacVIIa−ATKAVC、FacVIIa−ATKAVC−PEG−Fcは、FacVII欠乏ヒト血漿(human plasma)と1:1の割合でそれぞれ希釈し、その後rsTFとリン脂質(phospholipid)の混合物と約180秒間反応させる。その後、25mM CaCl2を加えて凝固が起こる時間を測定する。Factor VIIaの量が多いほど凝固時間は短くなる。
Claims (42)
- 血液凝固因子VII(第VII因子又はFacVII)のアミノ酸配列(配列番号4)を含み、そのC末端にペプチドリンカーが連結されたFacVII又はその活性型FacVIIaの誘導体であって、前記ペプチドリンカーが、配列番号30の位置1から始まって6〜149の連続するアミノ酸残基又は配列番号10のアミノ酸配列からなることを特徴とするFacVII又はその活性型FacVIIaの誘導体。
- 前記ペプチドリンカーのC末端アミノ酸残基が、システインである請求項1に記載の誘導体。
- 前記ペプチドリンカーが、配列内のVLKG(バリン-ロイシン-リシン-グリシン)が自己切断部位アミノ酸配列であるIPRI(イソロイシン-プロリン-アルギニン-イソロイシンで置換されることにより変異したものである請求項1に記載の誘導体。
- 配列番号9、13、14、20、24、27、34及び35からなる群から選択されるアミノ酸配列で構成される請求項1に記載の誘導体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のFacVII又はその活性型FacVIIaの誘導体をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号8、12、15、21、25及び28からなる群から選択される核酸配列で構成される請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 配列番号8、12、15、21、25及び28からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項7に記載の発現ベクター。
- 請求項7に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
- 寄託番号KCTC12022BPで特定される請求項9に記載の形質転換体。
- FacVII誘導体の製造方法であって、以下の工程、
(i)請求項9の形質転換体を培養して培養液を得る工程と、
(ii)前記培養液からFacVII誘導体を回収する工程と、
を含む、方法。 - 前記回収したFacVII誘導体を活性化する工程をさらに含む請求項11に記載のFacVII誘導体の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のFacVII又はその活性型FacVIIaの誘導体のペプチドリンカーに、血中半減期を延長させることのできる非ペプチド性重合体が結合されているFacVII結合体又はその活性型FacVIIaの結合体。
- 前記非ペプチド性重合体が、FacVII又はその活性型FacVIIaの誘導体のC末端に結合されている請求項13に記載の結合体。
- 前記非ペプチド性重合体が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィド、チオール及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される1個以上の反応基を有するものである請求項13に記載の結合体。
- 前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジル又はスクシンイミジルカーボネートである請求項13に記載の結合体。
- 前記非ペプチド性重合体が、2個又は3個の反応末端を有する請求項13に記載の結合体。
- 前記非ペプチド性重合体が、両末端にそれぞれマレイミド反応基又はアルデヒド反応基を有する請求項13に記載の結合体。
- 前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール非ペプチジル共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質非ペプチド性重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項13に記載の結合体。
- 非ペプチド性重合体を介して、免疫グロブリンFc領域に連結された、請求項1〜4のいずれかに記載のFacVII誘導体又はFacVIIa誘導体からなる、FacVII又はその活性型FacVIIaの複合体。
- 前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項20に記載の複合体。
- 前記非ペプチド性重合体は、1個、2個又は3個の反応末端を有する請求項20に記載の複合体。
- 前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれマレイミド反応基又はアルデヒド反応基を有する請求項20に記載の複合体。
- 免疫グロブリンFc領域が、CH1、CH2、CH3及びCH4ドメインからなる群から選択される1個〜4個のドメインからなる請求項20に記載の複合体。
- 免疫グロブリンFc領域がヒンジ領域をさらに含む請求項20に記載の複合体。
- 免疫グロブリンFc領域が、IgG、IgA、IgD、IgE又はIgMに由来する請求項20に記載の複合体。
- 免疫グロブリンFc領域がIgG4Fc領域である請求項20に記載の複合体。
- 免疫グロブリンFc領域がヒト非グリコシル化IgG4Fc領域である請求項20に記載の複合体。
- FacVIIa複合体の製造方法であって、以下の工程、
(i)一方の末端にスクシンイミド誘導体又はアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体を、pH5.0〜pH9.0において、免疫グロブリンFcのアミン基と共有結合で連結する工程と、
(ii)前記(i)の反応混合物から、前記アミン基において非ペプチド性重合体が共有結合した免疫グロブリンFc領域を含む結合体を回収する工程と、
(iii)回収した結合体の非ペプチド性重合体の他方の末端に、請求項1〜4のいずれかに記載のFacVII誘導体のC末端チオール基を共有結合で連結することにより、非ペプチド性重合体の末端のそれぞれにおいて免疫グロブリンFc領域及びFacVII誘導体を有するFacVII複合体を生成する工程と、
(iv)前記(iii)で生成したFacVII複合体を活性化することにより、非ペプチド性重合体を介して結合された、FacVIIa及び免疫グロブリンFc領域を有するFacVIIa複合体を生成する工程と、
を含む方法。 - FacVIIa複合体の製造方法であって、以下の工程、
(i)一方の末端にスクシンイミド誘導体又はアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体を、pH5.0〜pH9.0において、免疫グロブリンFcのアミン基と共有結合で連結する工程と、
(ii)前記(i)の反応混合物から、前記アミン基において、非ペプチド性重合体が共有結合した免疫グロブリンFc領域を含む結合体を回収する工程と、
(iii)回収した結合体の非ペプチド性重合体の他方の末端に、請求項1〜4のいずれかに記載のFacVIIa誘導体のC末端チオール基を共有結合で連結することにより、非ペプチド性重合体の末端のそれぞれにおいて、免疫グロブリンFc領域及びFacVIIa誘導体を有するFacVIIa複合体を生成する工程と、
を含む 方法。 - FacVIIa結合体の製造方法であって、以下の工程、
(i)請求項1〜4のいずれかに記載のFacVII誘導体のC末端チオール基に、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィド、チオール及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される反応基を有する非ペプチド性重合体を共有結合させる工程と、
(ii)前記FacVII誘導体に非ペプチド性重合体が共有結合により連結されること
により調製されたFacVII結合体を回収する工程と、
(iii)前記回収したFacVII結合体を活性化することにより、FacVIIa領
域が非ペプチド性重合体と連結されたFacVIIa結合体を生成する工程と、
を含む方法。 - FacVIIa結合体の製造方法であって、以下の工程、
(i)請求項1〜4のいずれかに記載のFacVIIa誘導体のC末端チオール基に、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィド、チオール及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される反応基を有する非ペプチド性重合体を共有結合させる工程と、
(ii)前記FacVIIa誘導体に非ペプチド性重合体が共有結合により連結されることにより調製されたFacVIIa結合体を回収する工程と、
を含むFacVIIa結合体の製造方法。 - 請求項31又は32に記載の方法で得られた、回収されたFacVIIa結合体の非ペプチド性重合体の他方の末端に連結された免疫グロブリンFc領域からなるFacVIIa複合体。
- 前記FacVII誘導体、FacVII結合体又はFacVII複合体の活性化が、オンカラム(on-column)活性化又はインソリューション(in-solution)活性化により行われる
ものである請求項29〜32のいずれかに記載の方法。 - 前記非ペプチド性重合体はポリエチレングリコールである請求項29〜32のいずれかに記載の方法。
- 請求項29〜32のいずれかに記載の方法で製造されたFacVIIa結合体又はFacVIIa複合体。
- FacVII誘導体又はFacVIIa誘導体とキャリアが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非ペプチド性重合体を介して連結されたFacVII又はその活性型FacVIIaの複合体であって、前記FacVII誘導体又はFacVIIa誘導体が、請求項1〜4のいずれか1項に記載のものであり、前記キャリアが、抗体、アルブミン及びトランスフェリンからなる群から選択されることを特徴とするFacVII又はその活性型FacVIIaの複合体。
- 前記FacVII結合体又はFacVIIa結合体を構成する非ペプチド性重合体の一方の末端が、抗体、アルブミン及びトランスフェリンからなる群から選択されるキャリアに結合されている請求項37に記載の複合体。
- 前記非ペプチド性重合体が、1個、2個又は3個の反応末端を有する請求項37に記載の複合体。
- 前記非ペプチド性重合体が、両末端にそれぞれマレイミド反応基又はアルデヒド反応基を有する請求項37に記載の複合体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のFacVII誘導体又はFacVIIa誘導体、請求項13〜19のいずれかに記載のFacVII結合体又はFacVIIa結合体、請求項20〜28のいずれかに記載のFacVII複合体又はFacVIIa複合体、又は請求項36に記載のFacVIIa結合体又はFacVIIa複合体を有効成分として含む血友病予防又は治療用の医薬組成物。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のFacVII誘導体又はFacVIIa誘導体、請求項13〜19のいずれかに記載のFacVII結合体又はFacVIIa結合体、請求項20〜28のいずれかに記載のFacVII複合体又はFacVIIa複合体、又は請求項36に記載のFacVIIa結合体又はFacVIIa複合体を有効成分として含む血液凝固促進用の医薬組成物。
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