TWI443106B - 使用免疫球蛋白片段之VIIa因子錯合物 - Google Patents
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Description
本發明係有關用於VIIa因子(FacVIIa)長效型製劑之凝血錯合物。詳言之,本發明係有關一種凝血錯合物,其中FacVIIa、非肽基聚合物與免疫球蛋白Fc區係利用共價鍵連接在一起,使得血清半衰期明顯提高、維持凝血功能且病患之角色行為順從性顯著改善。又,本發明係有關製備凝血因子錯合物之方法。
據估計,全世界有140,000人罹患血友病,且發生率每年增加20%。從基因學而言,每誕生10,000人發生一次血友病,惟僅全部血友病病例之大約25%被診斷及治療。以凝血因子治療所產生的最大問題之一為逐漸形成對抗習知藥物之抗體。A型血友病是由缺乏凝血因子VIII引起,於此疾患中最常見,佔血友病病例之80%。B型血友病係涉及缺乏凝血因子XI之疾患,佔血友病病例之約20%。若干血友病患對所投與之凝血因子逐漸產生抗體,發生頻率於A型血友病為10至15%,於B型血友病為1至3%。
FacVIIa為FacVII之活化型。由肝臟製造之FacVII係由406個胺基酸組成之酵素,其中γ-羧基化之麩胺酸在位置10、N-醣化之天冬醯胺在位置145與322,而O-醣化之絲胺酸在位置52與60。FacVII具有兩個類EGF功能部位(domain)及一個絲胺酸蛋白酶功能部位,其係藉由位置152精胺酸與位置153異白胺酸間之鍵裂解,造成重鏈中之活性部位暴露而被活化。於此過程中,呈與輕鏈及重鏈一起結合之單鏈之FacVII轉化為具有輕鏈與重鏈分開之兩鏈結構之FacVIIa。
與其他各種凝血因子不同,FacVIIa於凝血機制之附屬路徑作用,不產生抗體,因此可以高劑量投與。由於就抗體產生及高劑量投與而言,其能被安全使用,於是,FacVIIa可應用於治療A型以及B型血友病,並開始作為血友病習知療法之替代方案。此外,因回應投與血友病患之諸因子而造成之抗體產生,也使得難以應用FacVIIa以外之其他凝結因子。
然而,FacVIIa雖未引致產生抗體,惟其在各種凝血因子中係具有最短之血清半衰期。因此,FacVIIa不僅必須經常投與(造成病患之痛苦),亦須大量投與(造成病患經濟負擔)。為了克服彼等缺點,應將FacVIIa調製為預期能用於預防血友病之長效型,而不僅只是出血後之補充因子。
於臨床前階段之rVIIa-FP(CSL Behring),其白蛋白融合於FacVIIa C端,被發現相較於大鼠中之天然FacVIIa,具有增加6.7倍之血清半衰期。然而,4.38小時之血清半衰期仍非常短,不足以令其有效地用於預防及治療血友病。
又,於臨床前階段之PEGLip-FVIIa(Omri),一種FacVIIa之聚乙二醇化脂質體製劑,具有天然FacVIIa兩倍長之血清半衰期。
MAXY-VII(Bayer/Maxygen)與NN7128(Novo/Neose)為第七因子(Factor VII)產物,二者分別由於Gla功能部位突變與高醣化及由於40K聚乙二醇化而具有延長之血清半衰期,惟仍進行第1及第2階段之研究,各者之血清半衰期較天然FacVII長5倍,仍不足以預防及治療血友病。
為了使血清半衰期增加至最大,同時保持活體內活性,乃使用免疫球蛋白Fc、非肽基聚合物與FacVIIa經由共價鍵而位置專一性地互相連接之製備方法,導致產生本發明。結果,凝血因子錯合物之血清半衰期顯著延長至達60小時,經證實比利用習知聚乙二醇化或同義融合(in-frame fusion)技術獲得者增長許多。
因此本發明之目的在於提供使FacVIIa之血清半衰期延長,同時保持相當高量活體內活性,從而發揮極佳凝結功能之FacVIIa錯合物;包含彼等之長效型製劑;及其製備方法。
從下文之詳細說明及隨附之圖式,將更清楚瞭解本發明之上述與其他目的、特徵及其他優點。
根據用以達成上述目的之一態樣,本發明乃提出一種FacVIIa錯合物,其中FacVIIa經由非肽基聚合物連接於免疫球蛋白Fc區。
本文所用之術語"FacVIIa"係指活化型之凝結因子VII。
較佳為,本發明FacVIIa錯合物係經由活化FacVII錯合物而進行製備。於此情形下,長效型錯合物係以FacVII、非肽基聚合物及免疫球蛋白Fc區製備,然後令其進行活化程序,形成由FacVIIa、非肽基聚合物與免疫球蛋白Fc區組成之FacVIIa錯合物,於其間,錯合物之活體內活性增加,於結構上成為更同質。
FacVII錯合物轉化為FacVIIa錯合物之活化程序可包括,惟不限於,管柱(on-column)活化程序及溶液中(in-solution)活化程序。本發明中之FacVII錯合物以使用管柱活化較佳。
於管柱活化程序,亦稱為固相活化程序中,係使FacVII錯合物固定於陰離子交換管柱上,然後進行"自活化作用"而無特定添加劑。
與管柱活化程序不同地,溶液中活化程序需要例如鈣離子濃度、pH、溫度及FacVII濃度等各項因素以活化FacVII。
本發明之FacVIIa乃涉及凝血機制附屬路徑之FacVII活化胜肽;此類胜肽為活化型之天然FacVII、FacVIIa促效劑、前驅物、衍生物、片段及變異體。
本文所用之術語"FacVIIa促效劑"係指無關FacVIIa結構而展現與FacVIIa相同生物活性之物質。
本文所用之術語"FacVIIa衍生物"係指於活體內具有調控凝血功能之胜肽,其與天然FacVIIa具有至少80%胺基酸序列同源性,其若干胺基酸殘基可利用化學取代(例如,α-甲基化、α-羥基化)、刪除(例如,去胺作用)或裝飾(例如,N-甲基化)而予以修飾。
本文所用之術語"FacVIIa衍生物"係指從FacVIIa胺基酸序列增添或刪除一或多個胺基酸殘基及具有活體內凝血活性之胜肽。所增添之胺基酸殘基可為非天然胺基酸(例如,D-胺基酸)。
本文所用之術語"FacVIIa變異體"係指胺基酸序列有一或多個胺基酸與FacVIIa不同及具有活體內凝血活性之胜肽。
除了個別FacVIIa促效劑、衍生物、片段及變異體之外,可使用具有其性質組合之胜肽(例如,胺基酸序列中有一或多個胺基酸殘基不同及其N端胺基酸經去胺化之胜肽),只要其具血液凝集功能即可。
較佳為,本發明FacVIIa錯合物係由非肽基聚合物、免疫球蛋白Fc區及FacVIIa組成,於非肽基聚合物與免疫球蛋白Fc區的一端中,及非肽基聚合物與FacVIIa之N端的另一端中,具有鏈結。
更佳為,於本發明FacVIIa錯合物中,非肽基一端係連接於免疫球蛋白Fc區,另一端連接於FacVIIa輕鏈之N端。
FacVIIa情形下所用之術語"N端"意欲涵蓋含FacVIIa之N端之區域。因此,於本發明FacVIIa錯合物中,只要該FacVIIa錯合物保留所需功能,非肽基聚合物可以就是連接於FacVIIa之N端胺基酸殘基或是連接於離N端有些遠之胺基酸殘基。
由於FacVII於活化前為其中輕鏈與重鏈互相連接之單鏈結構,因此僅有輕鏈之N端暴露出來。轉化FacVII為FacVIIa,位置152之精胺酸與位置153之異白胺酸間裂解,使重鏈之活性部位暴露,位置153之異白胺酸成為重鏈之N端。由於重鏈之N端於FacVIIa活性中扮演重要角色,聚合物必須連接於輕鏈而非重鏈之N端,以增加效價(titer)。
於一具體實例中,PEG連接於免疫球蛋白Fc區N端並選擇性地偶合於FacVII之輕鏈的N端,以得到FacVII-PEG-免疫球蛋白Fc錯合物。其後,實施進一步的活化程序以完成FacVIIa-PEG-免疫球蛋白Fc錯合物。根據本發明製備之FacVIIa-PEG-免疫球蛋白Fc錯合物具有60小時之血清半衰期(較習知治療劑長許多),並於動物模式中展現極佳凝血效果,因此可製備為保留極佳活體內活性之長效型FacVIIa製劑。
免疫球蛋白Fc區為可於活體內代謝之生物可降解多肽,因此可安全地作為藥物載體用。此外,由於相較於整個免疫球蛋白分子,免疫球蛋白Fc區較小,因此就製造、純化及產率而言更為有利。此外,由於各個抗體之胺基酸序列不同,可以預期的是,去除高度異源性Fab將大大增加物質之同源性及降低引發血液抗原性之可能。
本文所用術語"免疫球蛋白Fc區"係指缺乏輕鏈及重鏈可變區、重鏈恒定區(constant region)1(CH1)與輕鏈恒定區1(CL1)之免疫球蛋白片段,亦即,由重鏈恒定區2與3(CH2與CH3)組成之片段。視需要,重鏈恒定區可進一步包含鉸鏈區。又,本發明之免疫球蛋白Fc區可為除了重鏈恒定區2與3(CH2與CH3)之外,包含部分或整個重鏈恒定區1(CH1)及/或輕鏈恒定區1(CL1)之延伸Fc區,只要它顯現實質上與傳統Fc區(只不包括免疫球蛋白輕鏈及重鏈之可變區)相同或更優越之效果即可。再者,本發明之免疫球蛋白Fc區可為其中相應於CH2及/或CH3之相當長部分胺基酸序列被刪除之區域。因此,本發明之免疫球蛋白Fc區可具下述組成:1)CH1功能部位、CH2功能部位、CH3功能部位與CH4功能部位,2)CH1功能部位與CH2功能部位,3)CH1功能部位與CH3功能部位,4)CH2功能部位與CH3功能部位,5)一或多個功能部位與免疫球蛋白鉸鏈區(或部分鉸鏈區)之組合,或6)重鏈各恒定功能部位與輕鏈恒定區之二聚體。
進一步地,本發明免疫球蛋白Fc區可不僅包括野生型Fc,亦包括其胺基酸序列突變體。本文所用術語"胺基酸序列突變體"係指由於一或多個胺基酸殘基之缺失、插入、保守或非保守取代、或其組合,而與野生型不同之胺基酸序列。舉例而言,已知IgG Fc中位置214至238、297至299、318至322、或327至331之胺基酸殘基對於鍵結很重要,可作為用於修飾之合適部位。各種衍生物(例如利用移除雙硫鍵部位、從天然Fc移除數個N端胺基酸、或添加甲硫胺酸至天然Fc之N端而製造者)可能有用。此外,可消除補體固定部位(例如,Clq固定部位、或ADCC部位),以自天然Fc區移除效應子(effector)功能。製備免疫球蛋白Fc區之胺基酸序列突變體之技術揭示於International Patent Publication Nos. WO 97/34631與WO 96/32478等中。
本技術領域悉知蛋白質或胜肽分子中不會改變分子活性之胺基酸取代(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常見之取代發生於Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、及Asp/Gly等胺基酸殘基間。
胺基酸可視需要利用磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、醣化、甲基化、法呢基化(farnesylation)、乙醯化、及醯胺化進行修飾。
上述Fc衍生物與野生型展現相同生物活性,惟於加熱及pH處理時具有增進之結構穩定性。
此等Fc區可自人類或動物例如牛、羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等獲得而為天然Fc區,或可自轉型動物細胞或微生物獲得而為重組或衍生Fc區。天然Fc區可以蛋白酶分解自人類或動物試樣單離之完整免疫球蛋白獲得。免疫球蛋白被木瓜酶裂解為Fab與Fc,被胃蛋白酶裂解為pF’c與F(ab’)2,隨後利用大小排除層析法(size-exclusion chromatography)自其分離Fc或pF’c。
較佳者為自微生物獲得之重組人類Fc區。
用於本發明之免疫球蛋白Fc區可醣化至與天然型相同程度或至較高及較少程度或可去醣化。免疫球蛋白區域醣化之增加或減少或去醣化可利用典型方法達成,例如,使用化學法、酵素法或使用微生物之基因工程法。此處,於去醣化時,免疫球蛋白Fc區之補體(Clq)結合成為顯著下降,而使抗體依賴性細胞毒性或補體依賴性細胞毒性減少或消失,因此不會引發不需要之活體內免疫反應。於此情形下,去醣化或未醣化之免疫球蛋白Fc區與作為藥物載體之用途更加符合。
本文所用術語"去醣化"意欲意指自Fc區以酵素去除糖類。術語"未醣化"與Fc區結合使用時,意指從原核生物(較佳為從大腸桿菌)表現之Fc區無糖類。
免疫球蛋白Fc區可源自人類或動物例如牛、羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等,較佳為源自人類。此外,免疫球蛋白Fc區可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其組合或雜交體(hybrid)。較佳為,Fc區係衍生自人類血液中最豐富之IgG或IgM;最佳為衍生自可增進配體結合蛋白之血清半衰期之IgG。
本文所用之"組合"意指編碼相同來源之單鍵免疫球蛋白Fc區之多肽連接於不同來源之單鏈多肽形成二聚體或多聚體。亦即,二聚體或多聚體可由選自由IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc與IgG4 Fc等片段所組成之組群中的二或多個片段形成。
本文所用術語"雜交體"意指編碼不同來源之二或多個免疫球蛋白Fc片段之序列存在單鏈免疫球蛋白Fc片段中。於本發明中,各種類型之雜交體均可能。亦即,功能部位雜交體可由選自由IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc與IgD Fc之CH1、CH2、CH3與CH4所組成之組群中之一至四個功能部位組成,及可包括鉸鏈區。
IgG分為IgG1、IgG2、IgG3與IgG4等次分類,本發明包括其組合或雜交體。較佳者為IgG2與IgG4次分類,最佳者為少有效應子功能(例如CDC(補體依賴性細胞毒性))的IgG4之Fc區。
亦即,最適合作為本發明藥物載體用之免疫球蛋白Fc區為衍生自人類IgG4之未醣化之Fc區。衍生自人類之Fc區較非衍生自人類之Fc區更佳,後者於人體中具有抗原作用及引起不為所欲之免疫反應(例如產生對抗該抗原之新抗體)。
本文所用術語"非肽基聚合物"係指由肽鍵以外之任何共價鍵結合在一起之至少兩個重複單元組成之生物相容聚合物。非肽基聚合物可具二或三個末端官能基。
就本發明而言,有用之非肽基聚合物可選自聚乙二醇,聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化之多元醇、聚乙烯醇、多醣類、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物例如PLA(聚(乳酸)與PLGA(聚(乳酸-乙醇酸)、脂質聚合物、幾丁質類、玻尿酸及其組合;最佳者為聚乙二醇。彼等之衍生物為本領域所悉知,可使用本領域已知方法容易地製備之衍生物亦隸屬本發明範圍之內。
融合蛋白中所用之以同義融合(in-frame fusion)技術建構之習知肽基聚合物之缺點為彼等於活體內易被蛋白酶裂解,因此無法確保藉由載體延長血清半衰期。相對地,對蛋白酶具抗性之本發明聚合物如載體般能保持胜肽之血清半衰期。因此,只要對活體內蛋白酶具抗性,任何非肽基聚合物均可於本發明中使用而未受侷限。非肽基聚合物之分子量在1至100 kDa之範圍,較佳為1至20 kDa。此外,連接於免疫球蛋白Fc區之非肽基聚合物不僅可為個別聚合物,亦可為不同聚合物之組合物。
用於本發明之非肽基聚合物具有偶合於免疫球蛋白Fc區與蛋白藥物之官能基。
上述非肽基聚合物具有二或三個末端;官能基較佳為選自由醛、丙醛、丁醛、順丁烯二醯亞胺、與琥珀醯亞胺衍生物所組成之組群。關於琥珀醯亞胺,亦可使用其衍生物包括琥珀醯亞胺丙酸酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺羧甲基或琥珀醯亞胺基碳酸酯。特別在非肽基聚合物於其兩端具有醛官能基時,其兩端可以最小之非專一性反應有效地分別連接生理活性多肽及免疫球蛋白。利用經由醛鍵之還原烷化製造之最終產物較經由醯胺鍵連接者更穩定許多。醛官能基於低pH專一性地與胺基末端反應,在高pH(如:pH 9.0)可與離胺酸殘基形成共價鍵。
非肽基聚合物之二或三個末端官能基可相同或不同。舉例而言,非肽基聚合物可於一端具有順丁烯二醯亞胺基而於其他端或另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。使用兩端均為具羥基之聚(乙二醇)作為非肽基聚合物時,於用於本發明之前,可使羥基活化成為上述官能基。或者,可使用市售可得之具修飾官能基之聚(乙二醇)製備本發明之蛋白錯合物。
根據另一態樣,本發明提供包含FacVIIa錯合物之凝血用醫藥組成物。
較佳為,本發明提供用於治療包括血友病、出血、急性腦內出血、創傷及FacVII缺乏症等凝血相關疾病之醫藥組成物。
本文所用術語"投與"意指利用特定適當方法將預定用量物質導入病患。只要能引導錯合物到達標的組織,任何投與途徑均可使用。可考慮使用各種投與方式,包括經腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、經口、局部、鼻內、肺內及直腸內,惟本發明不侷限於此等投與方式。然而,由於胜肽於口服後被分解,因此口服用組成物之活性成分必須經包覆或調製以保護俾使不於胃中降解。較佳為,本發明組成物可呈注射形式投與。此外,本發明之醫藥組成物可使用能輸送活性成分至標的細胞之特定裝置投與。
包含根據本發明錯合物之醫藥組成物可含有醫藥上可接受之載劑。用於口服時,醫藥上可接受之載劑可包括黏合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑與芳香物質。用於注射調配物時,醫藥上可接受之載劑可包括緩衝劑、防腐劑、止痛劑、增溶劑、等張劑與安定劑。用於局部投與調配物時,醫藥上可接受之載劑可包括基質、賦形劑、潤滑劑與防腐劑。本發明醫藥組成物可組合前述醫藥上可接受之載劑以調製為各種劑型。例如,用於口服時,醫藥組成物可調製為片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或薄片(wafer)。用於注射製劑時,醫藥組成物可調製為單位劑型,例如單劑量型安瓿或多劑量容器。醫藥組成物亦可調製為溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊與長效型製劑。
適用於醫藥調配物之載劑、賦形劑及稀釋劑之實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、水、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂與礦油。此外,醫藥製劑可進一步包含填料、抗凝血劑、潤滑劑、潤濕劑、芳香物質與抗菌劑。
本發明醫藥組成物之劑量可由活性成分藥物種類以及由數項相關因素包括欲治療疾病種類、投與途徑、病患年齡、性別、體重及疾病嚴重性而決定。由於本發明醫藥組成物於活體內具有很長作用時間及高效價,因此具有藥物投與頻率大為減少之優點。
根據另一態樣,本發明提供用於治療凝血相關疾病之方法,該方法包括對有其需要之個體投與本發明之FacVIIa錯合物或醫藥組成物。
較佳為,該疾病係由血液凝結不足所引起,可包括,惟不限於,血友病、出血、急性腦內出血、創傷與缺乏FacVII缺乏症。
該個體可為哺乳動物包括,惟不限於,人類、小鼠、豬、牛、狗、羊等,惟以人類較佳。
FacVIIa錯合物、組成物及投藥可如上述。
根據又一態樣,本發明提供用於製備FacVIIa錯合物之方法,該方法包括:
(1)經由共價鍵使具有醛、順丁烯二醯亞胺或琥珀醯亞胺衍生物作為末端官能基之非肽基聚合物連接至免疫球蛋白Fc區之胺基,得到接合物;
(2)從步驟(1)之反應混合物中單離非肽基聚合物-免疫球蛋白Fc區接合物;
(3)使FacVII共價連接至單離接合物之非肽基聚合物之另一端,得到FacVII錯合物,其中非肽基聚合物一端連接於免疫球蛋白Fc區,另一端連接於FacVII;及
(4)使步驟(3)之FacVII錯合物活化成為FacVIIa錯合物,其中FacVIIa經由非肽基聚合物連接於免疫球蛋白Fc區。
根據又另一態樣,本發明提供用於製備FacVIIa錯合物之方法,該方法包括:
(1)於pH 5.0至7.0,經由共價鍵使各末端具有醛基之非肽基聚合物連接至免疫球蛋白Fc之N端,得到免疫球蛋白-非肽基聚合物接合物;
(2)從步驟(1)之反應混合物中單離接合物;
(3)使FacVII共價連接至接合物之非肽基聚合物之另一端,形成FacVII錯合物,其中非肽基聚合物一端連接於免疫球蛋白Fc區,另一端連接於FacVII;
(4)使步驟(3)之FacVII錯合物活化成為FacVIIa錯合物,其中FacVIIa經由非肽基聚合物連接於免疫球蛋白Fc區。
根據又另一態樣,本發明提供用於製備FacVIIa錯合物之方法,該方法包括:
(1)經由共價鍵使各末端具醛基之非肽基聚合物連接至FacVII,得到接合物;
(2)從步驟(1)之反應混合物中單離FacVII-非肽基聚合物接合物;
(3)使免疫球蛋白Fc區共價連接至單離接合物之非肽基聚合物之另一端,得到FacVII錯合物,其中非肽基聚合物一端連接於免疫球蛋白Fc區,另一端連接於FacVII;及
(4)使步驟(3)之FacVII錯合物活化成為FacVIIa錯合物,其中FacVIIa經由非肽基聚合物連接於免疫球蛋白Fc區。
較佳為,使FacVII錯合物附著於陰離子交換管柱,利用管柱活化(自活化作用)使其活化為FacVIIa錯合物。
於此方法中,較佳為使FacVII之N端連接於非肽基聚合物。
更佳為,上文提及之N端係得自FacVII之輕鏈。
於該方法之較佳具體實例中,FacVII為天然FacVII、或FacVII促效劑、前驅物、衍生物、片段或變異體。最佳者為天然FacVII。
於該方法之另一較佳具體實例中,FacVIIa為天然FacVIIa、或FacVIIa促效劑、前驅物、衍生物、片段或變異體。最佳者為天然FacVIIa。
用於本發明方法之非肽聚合物之實例包括聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化之多元醇、聚乙烯醇、多醣類、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物例如PLA(聚(乳酸))與PLGA(聚(乳酸-乙醇酸)、脂質聚合物、幾丁質類與玻尿酸。最佳者為聚乙二醇。
於本發明方法中,較佳為,非肽基聚合物具有醛衍生物作為末端基團,更佳為於三個末端具有醛官能基。
透過下述實施例可更加瞭解本發明;惟該等實施例之提出僅在說明而不擬對本發明構成侷限。
以5K PropionALD(3) PEG(具三個末端丙醛基之PEG,NOF,Japan)使免疫球蛋白Fc之N端聚乙二醇化。就此而言,於4℃,以免疫球蛋白Fc對PEG設定於1:2之莫耳比,使6毫克/毫升(mg/mL)免疫球蛋白Fc與PEG反應4.5小時。於pH 6.0,還原劑20毫莫耳濃度(mM) SCB(NaCNBH3
)存在下,在100 mM磷酸鉀緩衝液中進行反應。裝填反應混合物於SOURCE Q(LRC25 85ml,Pall Corporation)上,以純化經單-聚乙二醇化之免疫球蛋白Fc。其後,於4℃,以1:10(FVII:免疫球蛋白Fc-5K PEG)之莫耳比,使FVII與免疫球蛋白Fc-5K PEG偶合18小時,總蛋白濃度設定於20 mg/mL。此偶合反應係於pH 6.0,還原劑20 mM SCB存在下,在100mM磷酸鉀中進行。使偶合反應混合物通過兩個管柱予以純化。使用SOURCE Q(LRC25 85ml,Pall Corporation)移除仍未偶合之免疫球蛋白Fc-5K PEG接合物。於20mM Tris(pH 7.5)中之1莫耳濃度(M)NaCl鹽梯度下,免疫球蛋白Fc-5K因其相對弱之鍵結而首先自管柱沖提出,接著為免疫球蛋白Fc-3臂PEG-FVII。其後,使用SOURCE ISO(GE Healthcare)管柱進行第二次純化,以自FVII與FVII多聚物不純物中單離免疫球蛋白Fc-3臂PEG-FVII。於此情形下,依序沖提出FVII、免疫球蛋白Fc-3臂PEG-FVII及FVII多聚物不純物。
欲活化時,將免疫球蛋白Fc-3臂PEG-FVII再裝填於SOURCE Q上,隨後於管柱上倒入含有1.75 mM鈣離子之移動相6小時。以35 mM鈣離子進行沖提,得到免疫球蛋白Fc-3臂PEG-FVIIa。
管柱:Source Q(LRC25 85ml,Pall Corporation)
流速:4 ml/分鐘(min)
梯度:A 0→7% 1 min B,7%→40% 80 min B(A:20mM Tris pH7.5,B:A+1M NaCl)
管柱:SOURCE ISO(23ml,16/10 HR管柱,GE Healthcare)
流速:2 ml/min
梯度:B 100→40% 60 min A(A:20mM Tris pH7.5,B:A+1.6M(NH4
)2
SO4
)
管柱:Source Q(15ml,16/10 HR管柱,GE Healthcare)
流速:1 ml/min
移動相:20mM Tris pH7.5+1.75mM CaCl2
+1.25mM NaCl
以20K mPEG丁醛(Nektar,USA)使FVII之N端聚乙二醇化。就此而言,於4℃,以FVII對20K PEG設定於1:5之莫耳比,使5 mg/mL FVII與PEG反應10小時。於pH 5.0,還原劑20mM SCB(NaCNBH3
)存在下,在100 mM乙酸鈉緩衝液中進行反應。通過RESOURCE Q(1ml,預裝填,GE Healthcare),純化經單-聚乙二醇化之FVII。於20mM Tris(pH 7.5)中之1 M NaCl鹽梯度下,該管柱依序溶洗出多-聚乙二醇化之FVII、單-聚乙二醇化之FVII及FVII。其後,使用Superdex_200(Hiroad 16/60,GE Healthcare)管柱進行第二次純化,以自FVII與FVII多聚物不純物中單離經單-聚乙二醇化之FVII。欲活化時,將單-聚乙二醇化之FVII再裝填於SOURCE Q上,隨後於管柱上倒入含有1.75 mM鈣離子之移動相1小時。以35 mM鈣離子進行沖提,得到單-聚乙二醇化之FVIIa。
管柱:RESOURCE Q(1ml,預裝填,GE Healthcare)
流速:0.5 ml/min
梯度:A 0→50% 50 min B(A:20mM Tris pH7.5,B:A+1M NaCl)
管柱:Superdex_200(Hiroad 16/60 HR管柱,GE Healthcare)
流速:1 ml/min
移動相:PBS
管柱:RESOURCE Q(1ml,預裝填,GE Healthcare)
流速:0.5 ml/min
移動相:20mM Tris pH7.5+1.75mM CaCl2
+1.25mM NaCl
以20k mPEG SPA(Nektar,USA)使FVII於離胺酸殘基處聚乙二醇化。就此而言,於室溫,以FVII對20k PEG設定於1:5之莫耳比,使3 mg/mL FVII與20k PEG反應3小時。於pH 8.0,在100 mM磷酸鈉緩衝液中進行反應。通過RESOURCE Q(1m1,預裝填,GE Healthcare),純化經單-聚乙二醇化之FVII。於20mM Tris(pH 7.5)中之1 M NaCl鹽梯度下,該管柱依序沖提出多-聚乙二醇化之FVII、單-聚乙二醇化之FVII及FVII。其後,於Superdex 200(Hiroad 16/60,GE Healthcare)管柱上進行第二次純化,以自FVII與FVII多聚物不純物中單離經單-聚乙二醇化之FVII。欲活化時,將純化後之單-聚乙二醇化之FVII再裝填於SOURCE Q上,隨後於管柱上倒入含有1.75 mM鈣離子之移動相1小時。以35 mM鈣離子進行沖提,得到單-聚乙二醇化之FVIIa。
管柱:SOURCE Q(23ml,HR管柱,GE Healthcare)
流速:2 ml/min
梯度:A 0→50% 50 min B(A:20mM Tris pH7.5,B:A+1M NaCl)
管柱:Superdex_200(Hiroad 16/60 HR管柱,GE Healthcare)
流速:1 ml/min
移動相:PBS
管柱:RESOURCE Q(1ml,預裝填,GE Healthcare)
流速:0.5 ml/min
移動相:20mM Tris pH7.5+1.75mM CaCl2
+1.25mM NaCl
為了評估藥物動力學參數,以劑量各為100微克/公斤(μg/kg)之FVIIa與免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa對正常SD大鼠進行靜脈內注射,隨後進行ELISA分析以獲得血清濃度。
靜脈注射後,投與FVIIa之大鼠於0.25、0.5、1、2、5、10、24與48小時收集0.5 mL血液試樣,及投與免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa之大鼠於0.25、0.5、1、2、5、10、24、48、72、96與120小時收集0.5 mL血液試樣。血液試樣收集於具有檸檬酸鈉之試管中以防止凝結,使用Eppendorf高速微離心機離心5 min以分離血清。使用對FVIIa具專一性之抗體,利用ELISA(IMUBIND,Factor VIIA ELISA Kit,American diagnostic Inc.)測定血清蛋白濃度。
FVIIa與免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa之血清濃度-時間曲線與藥物動力學分析結果示於第1圖及表3。於下表中,Tmax
代表達到藥物最高血清濃度需要的時間,T1/2
代表藥物之血清半衰期,MRT(平均滯留時間)代表藥物分子滯留體內之平均時間。
如表1及第1圖所示,觀察到免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa具有長約60小時之極大血清半衰期。
為了測定天然FVIIa與實施例1製備之免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa之試管內活性,乃以市售可得套組(Chromogenix,COASET)進行顯色試驗。使用Novoseven(自Novo Nordisk購得之重組型FVIIa,其用於血友病患者之出血治療及外科手術中病患止血)作為對照組。
根據見述於歐洲藥典之"2.7.10. ASSAY OF HUMAN COAGULATION FACTOR VII"之操作指南進行活性試驗。以各種濃度之Novoseven、FVIIa及免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa稀釋液處理,使FX活化成為FXa,作為受質之S-2765被FXa水解成為胜肽與pNA(一種顯色基團)。使用經水解pNA之黃色於ELIAS計讀器上測定405 nm之吸光率。以測得之吸光率及藥物處理濃度測定劑量反應曲線及EC50值。結果,觀察到免疫球蛋白Fc-PEG-FacVIIa具有50.72毫微克/毫升(ng/mL)之EC50,比Novoseven高27倍[第2圖]。
於以殺鼠靈(warfarin)預先處理之SD大鼠中,依測試藥物之投與分析FVIIa與免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa的活體內FacVIIa活性。使用Novoseven(自Novo Nordisk購得之重組型FVIIa,用於血友病患者之出血治療及外科手術中病患止血)作為對照組。
於24小時前,先行對SD大鼠投與殺鼠靈(具有抑制維生素K-依賴性凝結因子例如第II、IX、X與VII因子之γ-羧化反應之作用),其後,以250 μg劑量分別對SD大鼠進行Novoseven、FVIIa與免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa之靜脈內注射。靜脈注射0.4、4、24及48小時後,以含檸檬酸鈉之試管,從頸靜脈進行1 mL之血液取樣。使用ACL9000(Werfen集團),從單離血清中測定FVII活性(%)。
結果,觀察到FVIIa及Novoseven具相似之活體內活性。就免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa而言,其活性於投與25分鐘及4小時後較Novoseven低些,惟於投與24小時後,保持較Novoseven高6.5倍之活性(表3,第3圖)。
如前文所述,本發明FacVIIa錯合物確保活體內FacVIIa活性及明顯提高FacVIIa之血清半衰期,因此於可順應於血液不凝結病患角色行為之長效型FacVIIa製劑之開發上具有用途。
茲為說明目的雖已揭示本發明較佳具體實例,惟本領域中具通常知識者咸了解,在不偏離隨附申請專利範圍所揭露之本發明的範疇及精神下,各種修飾、增添與取代均屬可能。
第1圖係圖示於SD大鼠中,FacVIIa及免疫球蛋白Fc-PEG-FacVIIa之血中濃度隨時間之變化;
第2圖係圖示Novoseven、FacVIIa與免疫球蛋白Fc-PEG-FacVIIa之試管內(in vitro)效力試驗的比較結果;及
第3圖係圖示Novoseven、FacVIIa與免疫球蛋白Fc-PEG-FacVIIa之活體內效力試驗的比較結果。
Claims (23)
- 一種FacVIIa錯合物,其包含經由非肽基聚合物連接於免疫球蛋白Fc區之FacVIIa,該非肽基聚合物係選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化之多元醇、聚乙烯醇、多醣類、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質類、玻尿酸及其組合所組成之群組,其中,該非肽基聚合物係連接於FacVIIa之輕鏈的N端。
- 如申請專利範圍第1項所述之FacVIIa錯合物,其中該非肽基聚合物之各末端係連接於該免疫球蛋白Fc區及FacVIIa輕鏈之N端。
- 如申請專利範圍第1項所述之FacVIIa錯合物,其中該免疫球蛋白Fc區未醣化。
- 如申請專利範圍第1項所述之FacVIIa錯合物,其中該免疫球蛋白Fc區包括選自由CH1、CH2、CH3與CH4功能部位所組成之組群的一至四個功能部位。
- 如申請專利範圍第4項所述之FacVIIa錯合物,其中該免疫球蛋白Fc區進一步包含鉸鏈區。
- 如申請專利範圍第1項所述之FacVIIa錯合物,其中該免疫球蛋白Fc區係衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。
- 如申請專利範圍第6項所述之FacVIIa錯合物,其中該免疫球蛋白Fc區係選自由IgG、IgA、IgD、IgE與IgM所組成之組群的二或多個功能部位之雜交體,該功 能部位具有衍生自免疫球蛋白之不同來源。
- 如申請專利範圍第6項所述之FacVIIa錯合物,其中該免疫球蛋白Fc區係由相同來源之功能部位組成之單鏈免疫球蛋白之二聚體或多聚體。
- 如申請專利範圍第6項所述之FacVIIa錯合物,其中該免疫球蛋白Fc區係IgG4 Fc區。
- 如申請專利範圍第9項所述之FacVIIa錯合物,其中該免疫球蛋白Fc區為未醣化之人類IgG4 Fc區。
- 如申請專利範圍第1項所述之FacVIIa錯合物,其中該非肽基聚合物具有選自由醛、丙醛、丁醛、順丁烯二醯亞胺與琥珀醯亞胺衍生物所組成之組群之官能基。
- 如申請專利範圍第11項所述之FacVIIa錯合物,其中該琥珀醯亞胺衍生物為琥珀醯亞胺丙酸酯、琥珀醯亞胺羧甲基、羥基琥珀醯亞胺基或琥珀醯亞胺基碳酸酯。
- 如申請專利範圍第11項所述之FacVIIa錯合物,其中該非肽基聚合物於二或三個末端具有反應性醛基作為官能基。
- 如申請專利範圍第11項所述之FacVIIa錯合物,其中該非肽基聚合物於各末端具有反應性醛基作為官能基。
- 如申請專利範圍第14項所述之FacVIIa錯合物,其中該非肽基聚合物為聚乙二醇。
- 一種凝血用醫藥組成物,其包括如申請專利範圍第1 至15項之任一項所述之FacVIIa錯合物。
- 一種用於製備如申請專利範圍第1至15項之任一項所述之FacVIIa錯合物之方法,該方法包括:(1)經由共價鍵使末端具有醛、順丁烯二醯亞胺或琥珀醯亞胺衍生物作為官能基之非肽基聚合物連接至免疫球蛋白Fc區之胺或硫醇基,得到接合物;(2)從步驟(1)之反應混合物中單離非肽基聚合物-免疫球蛋白Fc區接合物;(3)使FacVII共價連接至單離接合物之非肽基聚合物之另一端,得到FacVII錯合物,其中該非肽基聚合物一端連接於該免疫球蛋白Fc區,且另一端連接於FacVII之輕鏈的N端;及(4)使步驟(3)之該FacVII錯合物活化成為FacVIIa錯合物,其中FacVIIa經由該非肽基聚合物連接於該免疫球蛋白Fc區。
- 一種用於製備如申請專利範圍第1至15項之任一項所述之FacVIIa錯合物之方法,該方法包括:(1)於pH 5.0至7.0,經由共價鍵使各末端具有醛基之非肽基聚合物連接至免疫球蛋白Fc之N端,得到免疫球蛋白-非肽基聚合物接合物;(2)從步驟(1)之反應混合物中單離該接合物;(3)使FacVII共價連接至該接合物之非肽基聚合物之另一端,形成FacVII錯合物,其中該非肽基聚合物一端連接於該免疫球蛋白Fc區,且另一端連接於 FacVII之輕鏈的N端;(4)使步驟(3)之該FacVII錯合物活化成為FacVIIa錯合物,其中FacVIIa經由該非肽基聚合物連接於該免疫球蛋白Fc區。
- 如申請專利範圍第17或18項所述之方法,其中該非肽基聚合物於各末端具有醛基。
- 如申請專利範圍第17或18項所述之方法,其中該FacVII之N端共價連接於該非肽基聚合物。
- 如申請專利範圍第17或18項所述之方法,其中該FacVII錯合物係利用管柱(on-column)活化或溶液中活化而被活化。
- 如申請專利範圍第17或18項所述之方法,其中該FacVII及該FacVIIa各自為天然FacVII及天然FacVIIa。
- 如申請專利範圍第17或18項所述之方法,其中該非肽基聚合物為聚乙二醇。
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Families Citing this family (6)
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Family Cites Families (7)
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ATE522548T1 (de) * | 2003-11-13 | 2011-09-15 | Hanmi Holdings Co Ltd | Verfahren zur massenproduktion der konstanten region von immunglobulin |
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