KR20030085041A - 응고 인자 ⅶ 유도체 - Google Patents

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KR20030085041A
KR20030085041A KR10-2003-7012351A KR20037012351A KR20030085041A KR 20030085041 A KR20030085041 A KR 20030085041A KR 20037012351 A KR20037012351 A KR 20037012351A KR 20030085041 A KR20030085041 A KR 20030085041A
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Abstract

본 발명은 신규 인간 응고 인자 Ⅶ 폴리펩티드, 인자 Ⅶ 유도체는 물론이고 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체, 폴리뉴클레오티드를 포함하고 발현하는 벡터 및 숙주 세포, 약제학적 조성물, 사용 및 치료 방법에 관련된다.

Description

응고 인자 Ⅶ 유도체{COAGULATION FACTOR Ⅶ DERIVATIVES}
응혈은 결국에는 피브린 혈병을 일으키는 다양한 혈액 성분 (또는 인자)의 복잡한 상호작용으로 이루어진 과정이다. 일반적으로, 응혈 "카스케이드"로서 지칭되는 것에 관여하는 혈액 성분은, 활성체 (그 자체가 활성화된 응혈 인자이다)의 작용에 의해 단백질 분해 효소로 전환되는 효소학적으로 비활성인 단백질 (효소전구체 또는 효소원)이다. 이러한 전환을 겪는 응고 인자는 일반적으로 "활성 인자"로서 지칭되며 응고 인자의 명칭에 문자 "a"를 첨가함으로써 표시한다 (예를 들어, 인자 Ⅶa).
지혈 과정의 시작은 혈관벽 손상의 결과로서 노출되는 조직 인자와 인자 Ⅶa 간의 복합체를 형성함으로써 중재된다. 그 다음 이 복합체는 인자 Ⅸ 및 Ⅹ을 그들의 활성 형태로 전환한다. 인자 Ⅹa는 조직 인자-보유 세포 상에서 제한된 양의 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환한다. 트롬빈은 혈소판은 물론이고 인자 Ⅴ 및 Ⅷ을인자 Ⅴa 및 Ⅷa로 활성화하는데, 두 보조인자는 나아가 전체 트롬빈의 폭발적 증가를 일으킨다. 트롬빈은 최종적으로 피브리노겐을 피브린으로 전환하여 피브린 혈병의 형성을 일으킨다.
인자 Ⅶ는 단일-사슬 효소원으로서 혈액에서 순환하는 미량 혈장 글리코단백질이다. 효소원은 촉매적으로 비활성이다. 단일-사슬 인자 Ⅶ는 인자 Ⅹa, 인자 XIIa, 인자 Ⅸa, 인자 Ⅶa 또는 트롬빈에 의해 시험관내에서 2-사슬 인자 Ⅶa로 전환될 수 있다. 효소원 인자 Ⅶ의 활성화된 2-사슬 분자로의 전환은 내부 Arg152-Ile153펩티드 결합의 절단에 의해 발생한다.
피험자에서 응고 카스캐이드를 자극하거나 선택적으로 차단하는 것이 종종 바람직하다. 인자 Ⅶa는 응혈 인자 결핍 (예를 들어, A형 및 B형 혈우병 또는 응고 인자 XI 또는 Ⅶ의 결핍) 또는 응혈 인자 저해제와 같은 몇몇 원인을 갖는 출혈 이상을 제어하는데에 사용되었다. 인자 Ⅶa는 또한 정상적으로 기능하는 혈액 응고 카스케이드를 갖는 (응혈 인자 결핍이 없고 또는 어떤 응고 인자에 대한 저해제도 없는) 피험자에서 발생하는 과다 출혈을 제어하는데에 사용되었다. 이러한 출혈은 예를 들어, 결손 혈소판 기능, 저혈소판증 또는 von Willebrand 병에 의해 야기될 수 있다. 출혈은 또한 수술 및 조직 손상의 다른 형태와 관련하여 주요 문제점이 될 수 있다.
유럽 특허 No. 200,421 (ZymoGenetics)는 인간 인자 Ⅶ을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 포유동물 세포에서 인자 Ⅶ의 재조합 발현에 관련된다.
Dickinson 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA93, 14379-14384, 1996)은 Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 또는 Lys337이 각각 Ala에 의해 대치된 인자 Ⅶ 폴리펩티드에 관련된다. Iwanaga 등 (Thromb. Haemost(1999년 8월호 부록), 466, 요약 1474)은 잔기316-320이 결손되거나 잔기 311-322가 트립신으로부터 상응하는 잔기로 치환된 인자 Ⅶa 변체에 관련된다.
헤파린, 쿠머린, 쿠머린 유도체, 인단디온 유도체, 또는 다른 작용제와 같은 항응고제는, 예를 들어, 신장 투석 도중, 또는 깊은 정맥 혈전증, 분산된 혈관내 응고 (DIC), 및 다른 의학적 이상의 숙주를 치료하기 위하여 피험자 내의 응고 카스캐이드를 선택적으로 차단하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 헤파린 치료 또는 시트르산 이온으로의 체외 치료 (미국 특허 No. 4,500,309)는 치료의 과정 도중 응고를 막기 위해 투석에서 사용될 수 있다. 헤파린은 또한 수술이 행해진 피험자에서 깊은 정맥 혈전증을 예방하는데에 사용된다.
그러나, 헤파린 및 다른 항응고제로의 치료는 바람직하지 않은 부작용을 갖는다. 이용가능한 항응고제는 일반적으로 응혈 부위에서 특이적으로 작용하기 보다는 몸 전체를 통해 작용한다. 예를 들어, 헤파린은 과출혈을 야기할 수 있다. 더욱이, 대략 80 분의 반감기를 갖는 헤파린은 혈액으로부터 신속하게 제거되므로, 빈번한 투여를 필요로 한다. 헤파린은 항트롬빈 Ⅲ (AT Ⅲ)에 대한 보조인자로서 작용하고 AT Ⅲ은 DIC 치료에서 신속하게 고갈되기 때문에, 적당한 헤파린 투약량을 유지하기가 종종 힘들고, AT Ⅲ 및 헤파린 수준을 계속해서 모니터링할 필요가 있다. 헤파린은 또한 AT Ⅲ 고갈이 극심할 경우 효과가 없다. 또한 헤파린의 연장된 사용은 혈소판 집괴를 증가시키고 혈소판 수를 감소시킬 수 있으며, 골다공증의 발달에 관련된다. 인단디온 유도체는 또한 독성 부작용을 갖는다.
상기 간략하게 설명된 항응고제 외에, 몇몇 자연적으로 발생하는 단백질이 항응고제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어, Reutelingsperger (미국 특허 No. 4,736,018)는 소 대동맥 및 인간 탯줄 정맥 동맥으로부터 항응고제를 분리하였다. Maki 등 (미국 특허 No. 4,732,891)은 인간의 췌장-유래 항응고제 단백질을 개시한다. 게다가, AT Ⅲ는 치료적 항응고제로서 제시되었다 (Schipper 등, Lancet 1 (8069): 854-856 (1978); Jordan, 미국 특허 No. 4,386,025; Bock 등, 미국 특허 No. 4,517,294).
혈관성형술, 동맥내막절제술 또는 우회로 조성술에 의해 치료된 환자의 약 30% 이상에서, 혈전증 및/또는 내막에서의 평활근 세포 증식은 혈관의 재-폐쇄 및 재구성 수술의 필연적 실패를 야기한다. 수술 후에 일어나는 혈관의 이러한 폐쇄는 재협착으로서 공지된다. 재협착은 혈소판 침전 및 혈전 형성, 주화성 및 감수분열 유발 인자의 방출, 및 팽창된 동맥 세그먼트의 내막 내로 혈관 평활근 세포의 이주 및 증식을 포함하는 생물학적 과정의 복잡한 상호작용 결과인 것으로 생각된다.
기계적 손상의 상태에서 혈소판 축적의 저해는 인간 피험자에서 재협착의 속도를 제한할 수 있다. 급성 혈관 손상의 상태에서 혈소판 축적이 일어나는 동안, 이들 부위에서의 트롬빈 생성은 혈소판의 활성화 및 그들의 순차적인 축적에 의한 것일 수 있다.
국제 특허 No. WO 92/15686은 활성화 인자 Ⅶa, 활성화 인자 Ⅶa의 생산을 위한 폴리핵산 및 포유동물 세포주, 및 혈액 응고를 저해하기 위한 활성화 인자 Ⅶa를 포함하는 조성물에 관련된다.
국제 특허 No. WO 94/27631은 혈관 재협착의 저해, 조직 인자 활성화, 및 혈소판 침전에 대한 방법에 관련된다.
국제 특허 No. WO 96/12800은 조직 플라스미노겐 활성제 및 스트렙토키나제와 함께 활성화 인자 Ⅶa를 포함하는 조성물을 포함하는 관상 동맥의 급성 폐쇄의 치료 방법에 관련된다.
순환 내로 도입되는 대부분의 단백질은 신장에 의해 포유동물 피험자로부터 신속하게 제거된다. 이 문제는 다량의 단백질을 투여하거나 반복 투여를 통하여 일부 극복될 수 있다. 그러나, 더 많은 단백질의 투약량은 단백질과 결합하여 비활성화시키는 항체를 유도해 낼 수도 있고/또는 피험자의 체내로부터 단백질의 제거를 용이하게 할 수도 있다. 치료적 단백질의 반복 투여는 본질적으로 효과가 없으며 이것이 알레르기 반응을 유도해 낼 수 있기 때문에 위험할 수 있다.
단백질 치료와 연관된 문제를 해결하기 위한 다양한 시도는 미세캡슐화, 리포솜 송달 시스템, 융합 단백질의 투여, 및 화학적 변형을 포함한다. 오늘날 이들 중 가장 유망한 것은 폴리알킬렌 옥시드 폴리머, 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공유 결합에 의한 치료적 단백질의 변형이다. 예를 들어, 미국 특허 No. 4,179,337은 생리학적으로 활성인 비-면역원성 수용성 폴리펩티드 조성물을 제공하기 위해 단백질과 커플링된 PEG 또는 폴리프로필렌 글리콜의 사용을 개시한다.Nucci 등은 PEG의 첨가에 의해 변형된 몇몇 단백질을 설명하고 이는 아데노신 데아미다제, L-아스파라기나제, 인터페론 알파 2b (IFN-a2b), 과산화 디스뮤타제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제 (tPA), 유로키나제, 유리카제, 헤모글로빈, 인터류킨, 인터페론, TGF-베타, EGF, 및 다른 성장 인자를 포함한다 (Nucci 등, 1991,Adv. Drug Delivery Rev.4: 133-151). 이러한 시도는 어느 정도 단백질의 반감기를 연장하고 단백질 면역원성을 감소시켰다.
전형적으로, 단백질의 PEG화는 단백질 표면에 있는 리신 잔기와 반응할 작용기로 PEG를 활성화시키는 단계를 포함한다. 단백질의 변형이 완료되면, 단백질의 활성은 보통 상실된다. 단백질의 부분 PEG화를 허용하는 변형 과정은 보통 약 50%의 활성이 손실되고 혈청 반감기를 크게 증가시켜서, 단백질의 전체 유효량을 감소시킨다.
단백질 PEG화 방법에서의 최근 개발은 단백질의 티올 기와 반응하여, 시스테인에 PEG를 공유 결합시키는 활성화 PEG 시약을 사용하는데, 이 시스테인 잔기는 단백질의 자연 발생 리신의 위치에 삽입된 것이다. Shaw 등 (미국 특허 No. 5,166,322)은 자연 발생 아미노산 서열 내에 있는 특정 부위에 도입된 시스테인을 갖는 IL-3의 특이적 변체를 설명한다. 설프히드릴 반응성 화합물 (예를 들어, 활성 폴리에틸렌 글리콜)은 그 다음 IL-3 변체와의 반응에 의해 이들 시스테인에 부착된다. Katre 등 (미국 특허 No. 5,206,344)은 자연 발생 아미노산 서열 내 특정 부위에 도입된 시스테인을 함유하는 특정 IL-2 변체를 설명한다. IL-2 변체는 순차적으로 활성화 폴리에틸렌 글리콜 시약과 반응하여 이 부분을 시스테인에 부착시킨다.
연장된 프로응고제 또는 항응고제 활성을 갖는 개선된 인자 Ⅶ이 업계에 여전히 필요하다. 특히, 종래 요법과 관련된 응고 시스템의 전신적 활성화 및 출혈과 같은 바람직하지 못한 부작용 없이 증가된 혈청 반감기를 갖고, 상대적으로 낮은 용량으로 투여되어 다량의 단백질의 반복 투여를 회피할 수 있는 인자 Ⅶ 폴리펩티드가 필요하다.
본 발명은 신규 인간 응고 인자 Ⅶ 유도체, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 물론이고, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 구성체, 폴리뉴클레오티드를 포함하고 발현하는 벡터 및 숙주 세포, 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물, 사용 및 치료 방법에 관련된다.
도 1은 감마 카르복실화된 Glu-잔기 (γ) 및 글리코실화 (*)를 갖는, 바르게 프로세싱된 인간 응고 인자 Ⅶ의 아미노산 1 내지 406의 구조를 나타낸다. 아미노산 잔기 152에 있는 화살표는 단일-사슬 인자 Ⅶ가 활성화된 2-사슬 인자 Ⅶ (FⅦa)로 전환되도록 절단되는 부위이다.
도 2는 재조합 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 발현을 위한 플라스미드의 구성체를 나타낸다. 플라스미드 pLN174는 인자 Ⅶ와 자연적으로 결합된 프로펩티드와 함께 인간 인자 Ⅶ을 발현한다.
본 발명은 야생형 인자 Ⅶa에 비하여 동일하거나 또는 증가된 활성을 갖는 신규 응고 인자 Ⅶ 폴리펩티드 및 증가된 혈청 반감기를 갖는 인자 Ⅶ 유도체에 관련된다.
1차 구조가 변화되는 것은 물론이고 다른 변형이 인자 Ⅶa의 생물학적 활성에 영향을 주거나 또는 감소시킴 없이 허용되는 인자 Ⅶa 분자에서의 구역이 확인되었다. 조직 인자 또는 인자 Ⅹ와의 결합에 포함되지 않는 것으로 확인된 인자 Ⅶa의 구조 내 구역은, SEQ ID NO: 1의 247-260 및 393-406 아미노산 위치를 포함한다. 구체적으로 SEQ ID NO: 1 서열의 위치 Q250, R396, 및 P406에 있는 아미노산은, 시스테인 (Cys) 잔기의 도입에 대하여 분석되었다. Cys 잔기의 도입 후, 인자 Ⅶ 유도체의 순환에서 반감기를 증가시키기 위하여 화학기, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)등과 결합된다. 시스테인은 SEQ ID NO: 1의 C-말단 서열 (407C로 지칭됨)에 도입된 후, PEG가 결합된다. 또한 SEQ ID NO: 1의 C-말단 서열에서 시스테인의 이러한 첨가는 인자 Ⅶa 폴리펩티드의 단백질 분해 활성을 감소시키지 않는다. 이들 인자 Ⅶ 유도체 (예를 들어, PEG 분자와 결합된 인자 Ⅶ)는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 연장된 효과가 바람직한 상황, 예를 들어, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 반복 투여 또는 다량 투여가 부적당하거나 문제가 있는 상황에서 치료적으로 유용하다. 더욱이, 도입된 아미노산 (예를 들어, Cys 잔기)을 갖는 본 발명의 인자 Ⅶa 폴리펩티드는 인자 Ⅶ의 어떤 작용기를 도입하는데 사용될 수 있는데, 이 아미노산은 인자 Ⅶa에 있는 위치에서 단백질 분해 활성에 영향을 주지 않는 화학기와 결합될 수 있다.
첫번째 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있으며 여깅서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 실질적으로 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
두번째 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다. SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산은 실질적으로 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성을 감소시키지 않는 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다는 것이 이해된다.
세번째 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396,Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다. R396, Q250 및 P406에 있는 첫번째 문자는 SEQ ID NO : 1의 지적된 위치에 자연적으로 존재하는 아미노산을 표시한다는 것이 이해된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드에 관련되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 서열 또는 그것의 변체의 서열 내에 있는 위치로 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다. 아미노산은 어떤 아미노산의 교체없이 SEQ ID NO: 1의 서열 내로 삽입될 수 있다는 것이 이해된다. 아미노산의 삽입은 SEQ ID NO : 1의 서열 내에 있는 동일한 위치에서 일어날 수 있는데, 여기에서 아미노산은 더욱 치환된다. 따라서, 한 구체예에서 아미노산 삽입 후 아미노산이 치환되거나 또는 그 역이다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드에 관련되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
여기에서 사용될 때 용어 "아미노산"은 하나 이상의 아미노산을 의미한다. 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 아미노산을 대신하거나 여기에 삽입되거나 여기에 첨가되는 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 어떤 화학기와 결합될 수 있다는 것이 이해된다. 화학기와의 이러한 결합은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노에톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공폴리머, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜, 콜로민산 또는 다른 탄수화물 기재 중합체, 아미노산의 중합체, 및 바이오틴 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게 화학기는 생체적합성, 비-독성, 비-면역원성 및 수용성 폴리머이다. 바람직하게 화학기는 모든 부분에서 수용성이다.
이 아미노산 치환, 삽입, 또는 첨가 및 화학기와의 결합은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 인자 Ⅶ 유도체의 활성화 형태의 프로응고 활성을 실질적으로 감소시키지 않는다.
여기에서 사용될 때 용어 "인자 Ⅶ 폴리펩티드"는 천연 인간 인자 Ⅶ (SEQ ID NO: 1) 또는 그것의 변체의 아미노산 서열 1-406을 포함하는 어떤 단백질을 의미한다. 이것은 인간 인자 Ⅶ, 인간 인자 Ⅶa 및 그것의 변체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
여기에서 사용될 때 용어 "인자 Ⅶ", 또는 "FⅦ"은 비활성 형태 (인자 Ⅶ)로 구성된 생성물을 의미한다. 여기에서 사용될 때 용어 "인자 Ⅶa", 또는 "FⅦa"는 활성화 형태 (인자 Ⅶa)로 구성된 생성물을 의미한다. 이것는 천연 인간 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa의 아미노산 서열 1-406을 갖는 단백질을 포함한다. 이것은 또한 단백질이 인자 Ⅶa의 활성을 실질적으로 보유하는 한, 약간 변형된 아미노산 서열, 예를 들어 N-말단 아미노산 결손 또는 첨가를 포함하는 변형된 N-말단을 갖는 단백질을 포함한다. 상기 정의 내에서 "인자 Ⅶ" 또는 "인자 Ⅶa"는 한 개체로부터 다른 것으로 발생할 수 있는 자연적 유전자좌 변이를 또한 포함한다. 또한, 글리코실화 또는 다른 후-번역 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 성질에 의존하여 변화할 수 있다.
여기에서 사용될 때, 용어 "변체" 또는 "변체군"은 SEQ ID NO: 1의 서열을 갖는 인간 인자 Ⅶ을 명시하도록 의도되는데, 여기에서 근원 단백질의 하나 이상의 아미노산은 또다른 아미노산에 의해 치환되고/또는 여기에서 근원 단백질의 하나 이상의 아미노산이 결손되고/또는 하나 이상의 아미노산이 단백질에 삽입되고/또는 하나 이상의 아미노산이 근원 단백질에 첨가된다. 이러한 첨가는 근원 단백질의 N-말단 또는 C-말단 중 한 곳 또는 둘 모두에서 일어날 수 있다.
여기에서 사용될 때, 용어 "재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성"은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa 활성의 70% 이상인 활성을 의미한다. 한 구체예에서, 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa 활성의 80% 이상이다. 또다른 구체예에서 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa 활성의 90% 이상이다. 나아간 구체예에서 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa 활성의 100% 이상이다. 나아간 구체예에서 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa 활성의 120% 이상이다. 나아간 구체예에서 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa 활성의 200% 이상이다. 나아간 구체예에서 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa 활성의 400% 이상이다.
여기에서 사용될 때, 용어 "인자 Ⅶ 유도체"는 SEQ ID NO: 1의 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드 또는 그것의 변체를 명시하도록 의도되는데, 여기에서 근원 펩티드의 하나 이상의 아미노산은 예를 들어, 알킬화, PEG화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의해 화학적으로 변형된다. 이것은 PEG화된 인간 인자 Ⅶa, 시스테인-PEG화된 인간 인자 Ⅶa 및 그것의 변체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "PEG화된 인간 인자 Ⅶa"는 인간 인자 Ⅶa 폴리펩티드의 아미노산에 결합된 PEG 분자를 갖는 인자 Ⅶa를 의미한다.
용어 "시스테인-PEG화된 인간 인자 Ⅶa"는 인간 Factor Ⅶa에 도입된 시스테인의 설프히드릴기에 결합된 PEG 분자를 갖는 인자 Ⅶa를 의미한다.
여기에서 사용될 때, 용어 "상이한 아미노산"은 한 위치에서 자연적으로 존재하는 아미노산과는 상이한 하나 이상의 아미노산을 의미한다. 이것은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있는 아미노산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 상이한 아미노산은 천연 L-형으로 있고 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 특정 예는 L-시스테인 (Cys)이다.
여기에서 사용될 때, "활성"은 인자 Ⅶ 폴리펩티드가 그것의 기질인 인자 Ⅹ을 활성 인자 Ⅹa로 전환하는 능력을 의미한다. 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성은 "시험관내 단백질분해 검정"으로 측정될 수 있다 (실시예 6 참조).
용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 커플링 작용인자, 커플링 또는 활성 부분을 갖거나 갖지 않는 (예를 들어, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지르딘, 옥시란, 또는 바람직하게는 말레이미드 부분을 갖는) 폴리에틸렌 글리콜 화합물 또는 그것의 유도체를 의미한다. 말레이미도 모노메톡시 PEG와 같은 화합물은본 발명의 활성화된 PEG 화합물의 예이다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
여기에서 사용될 때, 용어 "화학기"는 하나 이상의 화학기를 의미한다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 서열 또는 그것의 변체의 서열 내로 삽입되고 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체를 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 증가시키는 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 삽입되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 삽입되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드에 관련되는데, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 그것의 촉매 중심에서 더욱 변형되고, 이 변형은 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해한다. 한 구체예에서, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 세린 프로테아제 저해제로 그것의 촉매 중심에서 변형된다. 나아간 구체예에서, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤, D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤, Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤 및 D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤 및 Dansyl-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드 할로메틴 케톤으로 그것의 촉매 중심에서 변형된다.
여기에서 사용될 때, 용어 "비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드"는 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 능력을 갖지 않는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 의미한다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생 인간 인자 Ⅶa에 비하여 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에서 한 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 있는 한 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 및 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로는, 약제학적으로 허용되는 담체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체에 관련되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체에 관련되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
한 구체예에서 폴리뉴클레오티드 구성체는 벡터이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 5'으로부터 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하며, 천연 공급원으로부터 분리되거나, 시험관내에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 여기에서 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드 (약어로 "nt") 또는 염기쌍 (약어로 "bp")에 의하여 주어진다. 용어 "뉴클레오티드"는 문맥상 허용될 때 단일- 및 이중-가닥 분자 모두에 대하여 사용된다. 용어가 이중-가닥에 적용될 때 이것은 전장을 나타내도록 사용되고 용어 "염기쌍"과 동등한 것으로 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 두 가닥은 길이에서 약간 상이할 수 있고 그것의 말단은 효소 절단의 결과로서 엇갈릴 수 있으며; 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분잦 내의 모든 뉴클레오티드들이 쌍을 형성하지 않을 수도 있따는 것이 당업자에게 인정될 것이다. 이러한 쌍을 이루지 않은 말단은 일반적으로 길이에서 20 nt를 초과하지 않을 것이다.
여기에서 사용될 때, 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 증폭할 수 있는 어떤 핵산 완전체를 의미한다. 따라서, 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체외의 완전체로서 존재하고, 그것의 복제는 염색체 복제에 독립적인 벡터 (예를 들어, 플라스미드)일 수 있다. 대안으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포 게놈 내로 통합되어 그것과 통합된 염색체와 함께 복제하는 것일 수 있다. 벡터의 선택은 종종 그것이 도입될 숙주 세포의 의존할 것이다. 벡터는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 또는 코스미드 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터는 보통 복제 개시점 및 적어도 하나의 선별가능한 유전자, 즉 손쉽게 검출될 수 있는 생성물을 암호화하거나 그것의 존재가 세포 성장에 본질적인 유전자를 포함한다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포에 관련되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포에 관련되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
여기에서 사용될 때, 용어 "진핵 숙주 세포"는 이종 DNA가 발현될 수 있는 어떠한 세포를 나타내며 혼성 세포를 포함한다. 전형적인 숙주 세포는 곤충 세포, 효모 세포, 인간 세포를 포함하고 BHK, CHO, HEK, 및 COS 세포와 같은, 포유동물 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 실험의 실행에서, 배양되는 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포이고, 더욱 바람직하게는 확립된 포유동물 세포주인데, 이는 CHO (예를 들어, ATCC CCL 61), COS-1 (예를 들어, ATCC CRL 1650), 새끼 햄스터 신장 (BHK) 및 HEK293 (예를 들어, ATCC CRL 1573; Graham 등, J. Gen. Virol. 36: 59-72,1977) 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직한 BHK 세포주는 tk-ts13 BHK 세포주 (Waechter and Baserga,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79: 1106-1110,1982)이고, 이하 BHK 570 세포로서 지칭한다. BHK 570 세포주는 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852로부터 구입가능하다 (ATCC 기탁 번호 CRL 10314). tk-ts13 BHK 세포주 또한 ATCC로부터 구입 가능하다 (기탁 번호 CRL 1632).
다른 적절한 세포주는 Rat Hep I (래트 간암; ATCC CRL 1600), Rat Hep Ⅱ (래트 간암; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 인간 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) 및 DUKX 세포 (Urlaub and Chasin,Proc. Natal. Acad. Sci. USA77: 4216-4220, 1980)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한 3T3 세포, Namalwa 세포, 골수종 세포 및 다른 세포와 골수종 세포와의 융합세포가 유용하다. 한 구체예에서, 진핵 숙주 세포는 포유동물 기원의 것이다. 나아간 구체예에서, 진핵 숙주 세포는 CHO 세포, BHK 세포 또는 HEK 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 관련되는데, 여기에서 화학기와 결합도리 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 관련되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물에 관련되는데, 여기에서 화학기와 결합도리 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물에 관련되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 폴리뉴클레오티드 구성체로부터의 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포를 적합한 성장 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 폴리뉴클레오티드 구성체로부터의 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포를 적합한 성장 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 폴리뉴클레오티드 구성체로부터의 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포를 적합한 성장 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 폴리뉴클레오티드 구성체로부터의 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포를 적합한 성장 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 폴리뉴클레오티드 구성체로부터의 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 SEQID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포를 적합한 성장 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 의해 생산되는 우유로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 의해 생산되는 우유로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 의해 생산되는 우유로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 의해 생산되는 우유로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 의해 생산되는 우유로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물의 세포를배양하는 단계, 및 형질전환 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물의 세포를 배양하는 단계, 및 형질전환 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물의 세포를 배양하는 단계, 및 형질전환 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물의 세포를 배양하는 단계, 및 형질전환 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련되고, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물의 세포를 배양하는 단계, 및 형질전환 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
나아간 양태에서, 본 발명은
a) 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 제조하는 단계;
b) 화학기와 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 결합하는 단계;
c) 인자 Ⅶ 유도체를 양이온 교환 크로마토그래피 또는 겔여과 컬럼에 붓는 단계; 및
d) 인자 Ⅶ 유도체를 용리하는 단계를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 제조 방법에 관련된다.
나아간 양태에서, 본 발명은
a) 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 제조하는 단계;
b) 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 그것의 촉매 중심에서 세린 프로테아제 저해제로 변형시키는 단계;
c) 화학기와 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 결합하는 단계;
d) 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 양이온 교환 크로마토그래피 또는 겔여과 컬럼에 붓는 단계; 및
e) 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 용리하는 단계를 포함하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 제조 방법에 관련된다.
본 발명의 한 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포를 폴리뉴클레오티드 구성체로부터의 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 적절한 성장 배지에서 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포를 폴리뉴클레오티드 구성체로부터의 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 적절한 성장 배지에서 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포를 폴리뉴클레오티드 구성체로부터의 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 적절한 성장 배지에서 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포를 폴리뉴클레오티드 구성체로부터의 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 적절한 성장 배지에서 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포를 폴리뉴클레오티드 구성체로부터의 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 적절한 성장 배지에서 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 의해 생산되는 우유로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 의해 생산되는 우유로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 의해 생산되는 우유로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 의해 생산되는 우유로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물에 의해 생산되는 우유로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물의 세포를 배양하는 단계, 및 형질전환 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는증가된 활성을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물의 세포를 배양하는 단계, 및 형질전환 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물의 세포를 배양하는 단계, 및 형질전환 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물의 세포를 배양하는 단계, 및 형질전환 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물의 세포를 배양하는 단계, 및 형질전환 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 치료를 위한 약물 제조 또는 정상 지혈 시스템의 향상에 있어서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
여기에서 사용될 때, 용어 "치료"는 어떤 증상 또는 질병 상태가 발달하는 것을 막는 목적으로 또는 이미 발달된 이러한 증상 또는 질병 상태를 치유하거나 완화시키는 목적으로 본 발명의 치료적으로 활성인 화합물의 유효량의 투여를 의미한다. 따라서 용어 "치료"는 예방 치료를 포함하도록 의도된다.
용어 "정상 지혈 시스템의 향상"은 트롬빈을 생성하는 능력의 향상을 의미한다.
여기에서 사용될 때, 용어 "출혈 이상"은 출혈에서 나타나는 세포 또는 분자 기원의 어떠한 선천적, 후천적 또는 유발성 결함을 반영한다. 응혈 인자 결핍 (예를 들어, A형 및 B형 혈우병 또는 응고 인자 XI 또는 Ⅶ의 결핍), 결손 혈소판 기능, 저혈소판증 또는 von Willebrand병이 그 예이다.
용어 "출혈 에피소드"는 수술 및 다른 형태의 조직 손상 모두에 연관된 주된 문제인, 제어되지 않는 과다 출혈을 포함하도록 의도된다. 제어되지 않는 과다 출혈은 정상 응고 시스템을 갖는 피험자에서 일어날 수도 있고 응고 또는 출혈 이상을 갖는 피험자에서 일어날 수도 있다. 응혈 인자 결핍 (A형 및 B형 혈우병, 응고 인자 XI 또는 Ⅶ의 결핍) 또는 응혈 인자 저해제는 출혈 이상의 원인이 될 수도 있다. 과다 출혈은 또한 정상적으로 기능하는 혈액 응고 카스케이드를 갖는 (응고 인자 결핍 또는 응고 인자 중 어떤 것에 대한 저해제가 없는) 피험자에서 일어날 수도 있고 결손 혈소판 기능, 저혈소판증 또는 von Willebrand병의 원인이 될 수도 있다. 이러한 경우에서, 출혈은 혈우병에 의해 야기되는 출혈과 유사할 수 있는데 이는 혈우병에서와 같이, 지혈 시스템이 주요 출혈을 야기하는 본질적인 응고 "화합물" (예를 들어, 혈소판 또는 von Willebrand 인자 단백질)이 없거나 비정상적인 것을 갖기 때문이다. 수술 또는 거대한 외상과 연관된 광범위한 조직 손상을 경험한 피험자에서, 정상 지혈 기작은 즉각적인 지혈의 요구에 의해 압도될 수 있으며 정상적인 지혈 기작에도 불구하고 출혈을 일으킬 수 있다. 만족스러운 지혈을 성취하는 것 또한 뇌, 내이 영역 및 눈과 같은 기관에서 수술적 지혈에 대한 제한된 가능성을 가지고 발생할 때는 문제가 된다. 다양한 기관 (간, 폐, 종양 조직, 위장관)으로부터의 생검 채취 과정에서는 물론이고 복강경 수술에서 동일한 문제가 일어날 수 있다. 이들 모든 상황에 있어서의 공통점은 수술 기술 (봉합, 결찰 등)에 의해 지혈하기가 어렵다는 것이고 이는 또한 출혈이 확산되는 경우이다 (출혈성 위염 및 자궁 출혈 과다). 급성 및 과다 출혈은 또한 항응고 요법 상에서 주어진 요법에 의해 결손 지혈이 유발된 피험자에서 발생할 수 있다. 이러한 피험자는 항응고 효과가 신속히 상쇄되어야 하는 상황에서 외과적 개입을 필요로 할 수 있다. 근치 치골뒤 전립선절개술은 국소 전립선 암을 갖는 환자에 있어서 통상적으로 수행되는 과정이다. 수술은 현저한 그리고 때때로는 다량의 혈액 손실에 의해 종종 복잡해진다. 전립선절개술 도중의 상당한 혈액 손실은, 외과적 지혈에 있어서 쉽게 접근할 수 없는 다양한 혈관 밀집 부위를 갖는, 넓은 구역으로부터 확산 출혈을 일으킬 수 있는 주로 복잡한 해부학적 상황에 관련된다. 만족스럽지 않은 지혈의 경우에서 문제를 야기할 수 있는 또다른 상황은 정상 지혈 기작을 갖는 피험자에게 혈전 색전증을 예방하기 위하여 항응고제 요법이 주어질 때이다. 이러한 요법은 헤파린, 프로테오글리칸의 다른 형태, 와파린 또는 비타민 K-길항제는 물론이고 아스피린의 다른 형태 및 다른 혈소판 응집 저해제를 포함할 수 있다.
나아간 양태에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 치료를 위한 약물의 제조 또는 정상 지혈 시스템의 향상에 있어서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 치료를 위한 약물의 제조 또는 정상 지혈 시스템의 향상에 있어서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 치료를 위한 약물의 제조 또는 정상 지혈 시스템의 향상에 있어서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 삽입되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 치료를 위한 약물의 제조 또는 정상 지혈 시스템의 향상에 있어서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
본 발명의 한 구체예에서, 출혈은 A형 또는 B형 혈우병에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 후천성 저해제를 갖는 혈우병에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 저혈소판증에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 von Willebrand병에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 심한 조직 손상에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 심한 외상에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 수술에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 복강경 수술에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 출혈성 위염에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 과다 자궁 출혈에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 기계적 지혈에 있어서 제한된 가능성을 갖는 기관에서 발생한다. 또다른 구체예에서, 출혈은 뇌, 내이 영역 또는 눈에서 발생한다. 또다른 구체예에서, 출혈은 생검 채취의 과정에 연관된다. 또다른 구체예에서, 출혈은 항응고제 요법에 연관된다.
여기에서 사용될 때, 용어 "피험자"는 어떤 동물, 특히 인간과 같은 포유동물을 의미하도록 의도되고, 적절한 곳에서 용어 "환자"와 호환적으로 사용될 수 있다.
나아간 양태에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 치료를 위한 약물 제조 또는 정상 지혈 시스템의 향상에 있어서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데,여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 치료를 위한 약물의 제조 또는 정상 지혈 시스템의 향상에 있어서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 치료를 위한 약물의 제조 또는 정상 지혈 시스템의 향상에 있어서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 치료를 위한 약물의 제조 또는 정상 지혈 시스템의 향상에 있어서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 삽입되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 치료를 위한 약물의 제조 또는 정상 지혈 시스템의 향상에 있어서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 피험자에서 출혈 에피소드 또는 출혈 이상의 치료를 위한 또는 정상 지혈 시스템의 향상을 위한 방법에 관련되고, 방법은 이러한 것이 필요한 피험자에게 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 피험자에서 출혈 에피소드 또는 출혈 이상의 치료를 위한 또는 정상 지혈 시스템의 향상을 위한 방법에 관련되고, 방법은 이러한 것이 필요한 피험자에게 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 피험자에서 출혈 에피소드 또는 출혈 이상의 치료를 위한 또는 정상 지혈 시스템의 향상을 위한 방법에 관련되고, 방법은 이러한 것이 필요한 피험자에게 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 피험자에서 출혈 에피소드 또는 출혈 이상의 치료를 위한 또는 정상 지혈 시스템의 향상을 위한 방법에 관련되고, 방법은 이러한 것이 필요한 피험자에게 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 삽입되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 피험자에서 출혈 에피소드 또는 출혈 이상의 치료를 위한 또는 정상 지혈 시스템의 향상을 위한 방법에 관련되고, 방법은 이러한 것이 필요한 피험자에게 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는데, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가되고 여기에서 아미노산은 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶ에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 약물의 제조에 있어서 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 약물의 제조에 있어서 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생 인간 인자 Ⅶa에 비하여 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 약물의 제조에 있어서 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 약물의 제조에 있어서 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 약물의 제조에 있어서 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에서 한 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 약물의 제조에 있어서 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 사용에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성이 의심되는 혈관 부위에 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 국소 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 방법에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성이 의심되는 혈관 부위에 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 국소 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 방법에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생 인간 인자 Ⅶa에 비하여 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성이 의심되는 혈관 부위에 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 국소 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 방법에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성이 의심되는 혈관 부위에 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 국소 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 방법에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성이 의심되는 혈관 부위에 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 국소 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 방법에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에서 한 위치에 삽입되고, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
나아간 양태에서, 본 발명은 환자에서 혈전 형성이 의심되는 혈관 부위에 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 국소 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 방법에 관련되는데, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고, 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 그것의 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는, 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는데, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
본 발명의 한 구체예에서, 화학기는 실질적으로 중성이다.
여기에서 사용될 때, 용어 "중성"은 생체적합성인 화학기를 지칭하며, 이는 비-독성, 비-면역원성 및 수용성인 것을 의미한다. 이 정의 내에서 실질적으로 중성인 화학기는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공폴리머, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜, 콜로민산 또는 다른 탄수화물 기재 중합체, 아미노산의 중합체, 및 바이오틴 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 수용성이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 약 1,000 달톤 내지 약 80,000 달톤의 분자량을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 약 5,000 달톤 내지 약 60,000 달톤의 분자량을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 약 10,000 달톤 내지 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 약 500 달톤 내지 약 20,000 달톤의분자량을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 약 500 달톤 내지 약 5000 달톤의 분자량을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 약 750 달톤 내지 약 5000 달톤의 분자량을 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 폴리에틸렌 글리콜이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 1 내지 6 분자의 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 화학기는 한 분자의 폴리에틸렌 글리콜이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 덱스트란이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 프로필렌 글리콜 단일중합체이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 폴리프로필렌 옥시드이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 폴리프로필렌 글리콜이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 폴리옥시에틸화된 폴리올이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 폴리비닐 알콜이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 콜로민산이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 탄수화물 기재 중합체이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 아미노산의 중합체이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 바이오틴 유도체이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 폴리펩티드에 있거나, 여기에 삽입 또는 첨가된 아미노산에 대하여 치환된 아미노산 상에 존재하는 유리 설프히드릴기에 결합된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기는 시스테인에 결합된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 치환되거나, 삽입되거나 또는 첨가된 아미노산은 화학기와 결합될 수 있다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 유리 설프히드릴기를 갖는 아미노산이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 시스테인이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 치환되거나, 삽입되거나 또는 첨가된 아미노산은 시스테인과 같은 설프히드릴 함유 아미노산이다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 삽입된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 R396에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 Q250에 해당하는아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 P406에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, 화학기와 결합될 수 있는 추가적인 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 삽입되는데, 여기에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, 화학기와 결합될 수 있는 그 이상의 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 C-말단에 첨가된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 N-말단에 첨가된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, 시스테인이 첨가된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, 시스테인이 삽입된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 K157, V158, E296, M298, L305, D334, S336, K337, 및 F374로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이 또다른 아미노산으로 치환되고, 이 아미노산은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 활성을 증가시킨다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 K157에 해당하는아미노산은 G, V, S, T, N, Q, D 및 E로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 V158에 해당하는 아미노산은 S, T, N, Q, D 및 E로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 V158에 해당하는 아미노산은 T 및 D로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 E296에 해당하는 아미노산은 R, K 및 V로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 E296에 해당하는 아미노산은 V로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 M298에 해당하는 아미노산은 R, K, Q 및 N으로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 M298에 해당하는 아미노산은 Q로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 L305에 해당하는 아미노산은 A, V, L, I, M, F, W, P, G, S, T, C, Y, N, E, K, R, H, D 및 Q로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 L305에 해당하는 아미노산은 V로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 D334에 해당하는아미노산은 E로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 S336에 해당하는 아미노산은 G로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 K337에 해당하는 아미노산은 A, G, V, S, T, N, Q, D 및 E로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 K337에 해당하는 아미노산은 A로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 F374에 해당하는 아미노산은 A, V, L, I, M, F, W, P, G, S, T, C, Y, N, E, K, R, H, D 및 Q로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나아간 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 F374에 해당하는 아미노산은 P로 치환된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인간 인자 Ⅶ이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인간 인자 Ⅶa이다.
본 명세서에서, 아미노산은 표 1에 나타난 것과 같이 UPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (CBN)에 의해 공인된 약어를 이용하여 나타낸다. 이름 또는 하기 약어에 의해 표시되는 이성질체를 갖는 아미노산 등은 다른 지적이 없으면 천연 L-형으로 존재한다. 또한, 펩티드의 아미노산의 좌측 및 우측 말단은 다르게 상술되지 않으면 각각 N- 및 C-말단이다.
아미노산 약어
아미노산 3-문자 코드 1-문자 코드
글리신 Gly G프롤린 Pro P알라닌 Ala A발린 Val V류신 Leu L이소류신 Ile I메티오닌 Met M시스테인 Cys C페닐알라닌 Phe F티로신 Tyr Y트립토판 Trp W히스티딘 His H리신 Lys K아르기닌 Arg R글루타민 Gln Q아스파라긴 Asn N글루탐산 Glu E아스파르트산 Asp D
본 발명은 또한 상기 언급된 것과 같이 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법에 관련된다. 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 것이 바람직하다. 이것을 위하여, 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 제조하고 표준 기술 (Sambrook 등,Molecular Cloning : A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 참조)에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 혼성화에 의해 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 스크리닝함으로써 인간 인자 Ⅶ을 암호화하는 DNA 서열이 분리될 수 있다. 본 목적을 위하여, 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 인간 기원, 즉 인간 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 유래된 것이 바람직하다.
인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 또한 확립된 표준 방법,예를 들어, Beaucage 및 Caruthers의Tetrahedron Letters22 (1981), 1859-1869에 의해 설명된 포스포아미디트 방법, 또는 Matthes 등의,EMBO Journal3 (1984), 801-805에 의해 설명된 방법에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 포스포아미디트 방법에 따라, 올리고뉴클레오티드가 합성되고(예를 들어, 전자동 DNA 합성기), 정제되고, 어닐되고, 라이게이션되고, 적합한 벡터에 클로닝된다.
DNA 서열은 또한 예를 들어, 미국 특허 4,683,202, Saiki 등,Science239 (1988), 487-491, 또는 Sambrook 등, 상기에 설명된 것과 같이 특정 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응에 의해 제조될 수 있다.
인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 보통 재조합 DNA 방법에 알맞은 어떠한 벡터도 될 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입되고, 벡터의 선택은 종종 그것이 도입되는 숙주 세포에 의존할 것이다. 따라서, 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체 외에 완전체로서 존재하고, 그것의 복제는 염색체 복제에 독립적인 벡터 (예를 들어, 플라스미드)가 될 수 있다. 대안으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입되면 숙주 세포 게놈 내로 통합되어 그것이 통합된 염색체와 함께 복제되는 것이 될 수 있다.
벡터는 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열이 DNA의 전사에 필요한 추가적인 세그먼트에 작동가능하게 연결된 발현 벡터가 바람직하다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 또는 두 요소를 모두 함유할 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 세그먼트가 그들의 의도된 목적으로 일제히 작용하도록 정렬된 것을 가리킨다 (예를 들어, 전사는 프로모터에서 개시하여 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 통해 진행한다).
프로모터는 어떠한 DNA 서열도 될 수 있는데, 이는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내며 숙주 세포에 대하여 동종 아니면 이종인 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래될 수도 있다.
포유동물 세포에서 인간 인자 Ⅶㄹ 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사를 지시하기 위한 적합한 프로모터의 예는 SV40 프로모터 (Subramani 등,Mol Cell Biol.1 (1981), 854-864), MT-1 (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 (Pafmiter 등,Science222 (1983), 809-814), CMV 프로모터 (Boshart 등,Cell41 : 521-530, 1985) 또는 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터 (Kaufman and Sharp,Mol. Cell Biol.2: 1304-1319, 1982)이다.
곤충 세포에서의 사용에 적합한 프로모터의 예는 폴리헤드린 프로모터 (US 4,745,051; Vasuvedan 등,FEBS Lett.311, (1992) 7-11), P10 프로모터 (J. M. Vlak 등,J. Gen. Virology69,1988, pp. 765-776), 오토그라파 칼리포니카 (Autographa californica) 폴리헤드로시스 바이르스 기초 단백질 프로모터 (EP 397 485), 배큘로바이러스 초기발현 유전자 1 프로모터 (US 5,155,037; US 5,162,222), 또는 배큘로바이러스 39K 지연-초기 유전자 프로모터 (US 5,155,037; US 5,162, 222)이다.
효모 세포에서의 사용에 적합한 프로모터의 예는 효모 해당 유전자 (Hitzeman 등, J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080 ; Alber and Kawasaki,J. Mol. Appl. Gen.1 (1982), 419-434) 또는 알콜 탈수소효소 유전자 (Young 등,Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender 등, 편저), Plenum Press, New York, 1982)로부터 유래된 프로모터, 또는 TPI1 (US 4,599,311) 또는 ADH2-4c (Russell 등,Nature304 (1983), 652-654) 프로모터를 포함한다.
사상 진균 숙주 세포에서의 사용에 적합한 프로모터의 예는 ADH3 프로모터 (McKnight 등,The EMBO J.4 (1985), 2093-2099) 또는 tpiA 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터의 예는 아스파길러스 오리재 (A. oryzae) TAKA 아밀라제, 리조무코 미헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르트산 프로테이나제, 아스파길러스 니거 (A. niger) 중성 α-아밀라제, 아스파길러스 니거 산 안정 α-아밀라제, 아스파길러스 니거 또는 아스파길러스 아와모리 (A. awamori) 글루코아밀라제 (gluA), 리조무코 미세이 리파아제, 아스파길러스 오리재 알칼린 프로테아제, 아스파길러스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라제 또는 아스파길러스 니둘란스 (A. nidulans) 아세타미다제를 암호화하는 유전자로부터 유래되는 것들이다. TAKA-아밀라제 및 gluA 프로모터가 바람직하다. 적합한 프로모터는 예를 들어 EP 238 023 및 EP 383 779에 언급된다.
인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 또한, 필요하다면, 인간 성장 호르몬 종결암호 (Palmiter 등,Science222,1983, pp. 809-814) 또는 TPI1 (Alber and Kawasaki,J. Mol. Appl. Gen.1,1982, pp. 419-434) 또는 ADH3 (McKnight 등,The EMBO J.4,1985, pp. 2093-2099) 종결암호와 같은 적합한 종결암호에 작동가능하게 결합될 수 있다. 벡터는 또한 프로모터로부터는 하류이고 인자 Ⅶ 서열 자체에 대한 삽입 부위로부터는 상류에 위치한 RNA 스플라이싱 부위를 포함한다. 바람직한 RNA 스플라이싱 부위는 아데노바이러스 및/또는 면역 글로불린 유전자로부터 얻을 수 있다. 발현 벡터는 또한 삽입 부위의 하류에 위치한 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 특히 바람직한 폴리아데닐화 신호는 SV40 유래 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호 (Kaufman and Sharp, ibid.), 아데노바이러스 5 Elb 구역 유래 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 유전자 종결신호 (DeNoto 등 Nuc. Acids Res. 9: 3719-3730,1981) 또는 인간 인자 Ⅶ 유전자 또는 소 인자 Ⅶ 유전자 유래 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 발현 벡터는 또한 아데노바이러스 2 세갈래 리더와 같은, 프로모터와 RNA 스플라이싱 부위 사이에 위치한 비코딩 바이러스 리더 서열; 및 SV40 인핸서와 같은 인핸서 서열을 포함할 수 있다.
재조합 벡터는 문제의 숙주 세포에서 벡터가 복제될 수 있게 하는 DNA 서열을 더욱 포함할 수 있다. (숙주 세포가 포유동물 세포일 때) 이러한 서열의 예는 SV40의 복제 개시점이다.
숙주 세포가 효모 세포일 때, 벡터가 복제될 수 있게 하는 적합한 서열은 효모 플라스미드 2μ 복제 유전자 REP 1-3 및 복제 개시점이다.
벡터는 또한 예를 들어, 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)를 코딩하는 유전자 또는 쉬조사카로마이세스 폼브 (Schizosaccharomyces pombe) TPI 유전자 (P. R. Russell,Gene40, 1985, pp. 125-130)와 같이 유전자의 생성물이 숙주 세포에서의 결손을 보충하는 유전자, 또는 암피실린, 가나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 네오마이신, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트 등의 약물에 내성을 부여하는 것과 같은 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 사상 진균에 있어서, 선별가능한마커는amdS, pyrG, argB, niaD또는sC를 포함한다.
본 발명의 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 향하게 하기 위하여, 분비 신호 서열 (리더 서열, 프레프로 서열 또는 프레 서열로도 공지됨)이 재조합 벡터에 제공될 수 있다. 분비 신호 서열은 올바른 리딩 프레임에서 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암화하하는 DNA 서열에 결합된다. 분비 신호 서열은 통상적으로 펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5'에 위치한다. 분비 신호 서열은 정상적으로 단백질과 결합된 것이거나 또는 또다른 분비 단백질을 암호화하는 유전자 유래인 것일 수 있다.
효모 세포로부터의 분비에 있어서, 분비 신호 서열은 어떠한 신호 펩티드를 암호화할 수 있는데, 이는 세포의 분비 경로 내로의 발현된 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 효과적인 지도를 보장한다. 신호 펩티드는 자연적으로 발생하는 신호 펩티드, 또는 그것의 작용 부분일 수도 있고, 또는 합성 펩티드일 수도 있다. 적합한 신호 펩티드는 α-인자 신호 펩티드 (US 4,870,008 참조), 마우스 타액 아밀라제의 신호 펩티드 (O. Hagenbuchle 등,Nature289,1981, pp. 643-646 참조), 변형된 카르복시펩티다제 신호 펩티드 (L. A. Valls 등,Cell48, 1987, pp. 887-897 참조), 효모 BAR1 신호 펩티드 (WO 87/02670 참조), 또는 효모 아스파르트산 프로테아제 3 (YAP3) 신호 펩티드 (M. Egel-Mitani 등,Yeast6, 1990, pp. 127-137 참조)인 것을 밝혀졌다.
효모에서의 효과적인 분비를 위해, 리더 펩티드를 암호화하는 서열 또한 신호 서열의 하류 및 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 상류에 삽입될 수 있다. 리더 펩티드의 기능은 발현된 펩티드가 소포체로부터 골지체로 향하게 하고 나아가 배양 배지 내로의 분비를 위한 분비 비히클로 향하게 하는 것이다 (즉, 세포벽을 통과하거나 또는 적어도 세포막을 통한 효모 세포의 주변 세포질 공간 내로의 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드 방출). 리더 펩티드는 효모 알파-인자 리더일 수 있다 (이것의 사용은 예를 들어, US 4,546,082, US 4,870,008, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 및 EP 163 529에 설명된다). 대안으로, 리더 펩티드는 합성 리더 펩티드일 수 있는데, 이는 다시 말해 자연에서 발견되지 않는 리더 펩티드이다. 합성 리더 펩티드는, 예를 들어 WO 89/02463 또는 WO 92111378에 설명된 것과 같이 구성될 수 있다.
사상 진균에서의 사용을 위해, 신호 펩티드는 아스파길러스 종 아밀라제 또는 글루코아밀라제를 암호화하는 유전자, 리조무코 미헤이 리파아제 또는 프로테아제 또는 휴미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa) 리파아제를 암호화하는 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 신호 펩티드는 아스파길러스 오리재 TAKA 아밀라제, 아스파길러스 니거 중성 α-아밀라제, 아스파길러스 니거 산 안정 아밀라제, 또는 아스파길러스 니거 글루코아밀라제를 암호화하는 유전자로부터 유래되는 것이 바람직하다. 적합한 신호 펩티드는 예를 들어, EP 238 023 및 EP 215 594에 개시된다.
곤충 세포에서의 사용을 위해, 신호 펩티드는 인시목인 만두카 섹스타 (Manduca sexta)의 지질동원 호르몬 전구체 신호 펩티드 (US 5,023,328 참조)와 같은 곤충 유전자 (WO 90/05783 참조)로부터 유래될 수 있다.
인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 프로모터 및 선택적으로는 종결암호 및/또는 분비 신호 서열을 각각 라이게이션하고, 복제에 필요한 정보를 함유한 적적한 벡터 내로 이들을 삽입하는데 사용되는 방법은 당업자에게 공지된다 (예를 들어, Sambrook 등,Molecular Cloning : A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, New York, 1989 참조).
포유동물 세포를 트랜스펙션하고 세포에 도입된 DNA 서열을 발현하는 방법은, 예를 들어 Kaufman and Sharp,J. Mol. Biol.159 (1982), 601-621; Southern and Berg,J. Mol. Appl. Genet.1 (1982), 327-341 ; Loyter 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79 (1982), 422-426; Wigler 등, Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson,Somatic Cell Genetics7 (1981), 603, Graham and van der Eb,Virology52 (1973), 456; 및 Neumann 등,EMBO J.1 (1982), 841-45에 설명된다.
선별가능한 마커는 관심있는 유전자와 동시에 독립된 플라스미드에서 세포로 도입될 수 있거나, 또는 동일한 플라스미드에서 도입될 수도 있다. 동일한 플라스미드일 경우, 선별가능한 마커 및 관심있는 유전자는 상이한 프로모터 또는 동일한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있으며, 후자의 정렬은 2 시스트론 메세지를 생산한다. 이 타입의 구성체는 업계에 공지된다 (예를 들어, Levinson and Simonsen, 미국 특허 No. 4,713,339). 세포 내로 도입된 혼합물에 "담체 DNA"로서 공지된 추가적인 DNA를 첨가하는 것이 또한 이로울 수 있다.
세포가 DNA를 흡수한 후, 관심있는 유전자의 발현을 시작하도록 이들을 적합한 성장 배지에서, 전형적으로는 1-2일 배양한다. 여기에서 사용될 때, 용어 "적합한 성장 배지"는 세포의 성장 및 관심있는 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 발현에 필요한 영양분 및 다른 성분을 함유한 배지를 의미한다. 배지는 일반적으로 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 필수 당, 비타민, 염ㄹ, 인지질, 단백질 및 성장 인자를 포함한다. 감마-카르복실화 단백질의 생산을 위하여, 배지는 비타민 K를, 바람직하게는 약 0.1 ㎍/㎖ 내지 약 5 ㎍/㎖의 농도로 함유할 것이다. 그 다음으로 안정한 방식으로 선별가능한 마커를 발현하는 세포의 성장을 선별하기 위해 약물 선별이 적용된다. 증폭될 수 있는 선별가능한 마커로 트랜스펙션된 세포에 있어서, 약물 농도는 클로닝된 서열의 증가된 카피 수에 대하여 선별되도록 증가됨으로써, 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 안정하게 트랜스펙션된 세포의 클론은 관심있는 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 발현에 대하여 스크리닝된다.
인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열이 도입된 숙주 세포는 어떠한 세포도 될 수 있는데, 이는 후번역 변형된 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 생산할 수 있으며 효모, 진균 및 고등 진핵 세포를 포함한다.
본 발명에서의 사용ㅇㄹ 위한 포유동물 세포주의 예는 COS-1 (ATCC CRL 1650), 새끼 햄스터 신장 (BHK) 및 293 (ATCC CRL 1573 ; Graham 등,J. Gen. Tirol36: 59-72,1977) 세포주이다. 바람직한 BHK 세포주는 tk-ts13 BHK 세포주로서 (Waechter and Baserga,Proc. Nafl. Acad. Sci. USA79: 1106-1110,1982, 참고문헌으로서 여기 포함), 이하 BHK 570 세포로 지칭한다. BHK 570 세포주는 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852에 ATCC 기탁 번호 CRL 10314로 기탁되었다. tk-ts13 BHK 세포주 또한 기탁 번호 CRL1632로 ATCC로부터 구입가능하다. 게다가, 다수의 다른 세포주가 본 발명 내에서 사용될 수 있는데, 이는 Rat Hep I (래트 간암; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (래트 간암; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 인간 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) 및 DUKX 세포 (Urlaub 및 Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA77: 4216-4220,1980)를 포함한다.
적합한 효모 세포의 예는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종 또는 쉬조사카로마이세스 종, 특히 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 사카로마에시스 클루이베리 (Saccharomyces kluyveri)를 포함한다. 이종 DNA로 효소 세포를 트랜스포메이션하고 그로부터 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법은 예를 들어, US 4,599,311, US 4,931,373, US 4,870,008, 5,037,743, 및 US 4,845,075에서 설명되고, 이들 모두는 참고문헌으로서 여기에 포함된다. 트랜스포메이션된 세포는 선별가능한 마커에 의해 결정된 표현형에 의해 선별되는데, 통상적으로는 약물 내성 또는 특정 영양분 (예를 들어, 류신)의 부재 하에서의 성장 능력이다. 효모에서의 사용에 바람직한 벡터는 US 4,931,373에 개시된 POT1 벡터이다. 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 예를 들어, 상기 설명된 것과 같이 신호 서열 및 선택적으로는 리더 서열에 앞설 수 있다. 적합한 효모 세포의 더 나아간 예는 클루이베로마이세스 락티스 (K. lactis)와 같은 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 한세눌라 폴리모르파 (H. polymorpha)와 같은 한세눌라 (Hansenula), 또는 피키아 파스토르스 (P. pastors)와 같은 피키아 (Pichia)의 균주이다 (Gleeson 등,J. Gen. Microbiol.132,1986, pp. 3459-3465; US 4,882,279참조).
다른 진균 세포의 예는 아스파길러스 종, 뉴로스포라 (Neurospora) 종, 푸사리움 (Fusarium) 종, 또는 트리코데르마 (Trichoderma) 종과 같은 사상 진균 세포, 특히 아스파길러스 오리재, 아스파길러스 니둘란스 또는 아스파길러스 니거의 균주이다. 단백질의 발현을 위한 아스파길러스 종의 사용은 예를 들어, EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438에 설명된다. 푸사리움 옥시스포룸 (F. oxysporum)의 트랜스포메이션은 예를 들어, Malardier 등, 1989,Gene78: 147-156에 의해 설명된 것과 같이 수행될 수 있다. 트리코데르마 종의 트랜스포메이션은 예를 들어, EP 244 234에 설명된 것과 같이 수행될 수 있다.
사상 진균이 숙주 세포로서 사용될 때, 숙주 염색체 내에 DNA 구성체를 통합시킴으로써 본 발명의 DNA 구성체로 트랜스포메이션하여 재조합 숙주 세포를 얻을 수 있다. 이러한 통합은 일반적으로 DNA 서열이 세포에서 안정하게 유지될 것이라는 장점이 있는 것으로 생각된다. 숙주 염색체 내로 DNA 구성체의 통합은 예를 들어, 동종 또는 이종 재조합에 의한 종래 방법에 따라 수행될 수 있다.
곤충 세포의 트랜스포메이션 및 여기에서 이종 폴리펩티드의 생산은 US 4,745,051; US 4,879,236; US 5,155,037; 5,162,222; EP 397,485에서 설명된 것과 같이 수행될 수 있고, 이 모두는 참고문헌으로서 여기 포함된다. 숙주로서 사용되는 곤충 세포주는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플러시아 니 (Trichoplusia ni) 세포와 같은 인시류 세포주인 것이 적합할 수 있다 (US 5,077,214 참조). 배양 조건은 예를 들어, WO 89/01029 또는 WO89/01028, 또는 앞서 언급된 참고문헌 중 어떤 것에서 설명된 것과 같다.
그 다음으로 상기 설명된 트랜스포메이션된 또는 트랜스펙션된 숙주 세포는 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 발현이 허용되는 조건 하에서 적합한 영양 배지에서 배양된 후 결과적 펩티드의 일부 또는 전부는 배양물로부터 회수된다. 세포를 배양하는데 사용된 배지는 적절한 첨가물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 어떤 종래의 배지가 될 수 있다. 적합한 배지는 제조 업자로부터 구입가능하거나 공지된 방법 (예를 들어, American Type Culture Collection의 카탈로그)에 따라 제조될 수 있다. 세포에 의해 생산된 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 문제의 폴리펩티드 타입에 의존하여 원심분리 또는 여과에 의한 배지로부터의 숙주 세포 분리, 황산 암모늄과 같은 염에 의한 상청액 또는 여과액의 단백질 성분의 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 겔여과 그로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 정제를 포함하는 종래의 방법에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
재조합 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조에 있어서, 클로닝된 야생형 인자 Ⅶ DNA가 사용된다. 이 서열은 원하는 인자 Ⅶ 변체를 암호화하도록 변형될 수 있다. 인간 인자 Ⅶ에 대한 완전한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 공지된다. 참고문헌으로서 여기 포함된 미국 특허 No. 4,784,950에는, 재조합 인간 인자 Ⅶ의 클로닝 및 발현이 설명된다. 소 인자 Ⅶ 서열은 참고문헌으로서 여기 포함된 Takeya 등,J. Biol. Chem.263: 14868-14872 (1988)에서 설명된다.
아미노산 서열 변경은 다양한 기술에 의해 성취될 수 있다. DNA 서열의 변형은 부위-특이적 돌연변이 유발일 수 있다. 부위-특이적 돌연변이 유발을 위한 기술은 업계에 주지되며 예를 들어, Zoller 및 Smith (DNA3: 479-488,1984)에 의해 설명된다. 따라서, 인자 Ⅶ의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 이용하여, 당업자는 선택된 변경을 도입할 수 있다.
본 발명 내에서의 사용을 위한 DNA 서열은 전형적으로 인자 Ⅶ 단백질의 아미노-말단에서 프레-프로 펩티드를 암호화하여 적당하게 후-번역 프로세싱되고 (예를 들어, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화) 및 숙주 세포로부터 분비될 것이다. 프레-프로 펩티드는 인자 Ⅶ의 것일 수도 있고 또는 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 프로트롬빈, 단백질 C 또는 단백질 S와 같은, 또다른 비타민 K-의존 혈장 단백질의 것일 수도 있다. 당업자에게 명백한 것과 같이, 변형이 응고 인자로서 작용하기 위한 단백질의 능력을 유의하게 손상시키지 않는다면 인자 Ⅶ의 아미노산 서열을 추가적으로 변형할 수 있다. 예를 들어, 세작용기 촉매에서 인자 Ⅶ은 참고문헌으로서 여기 포함된 미국 특허 No. 5,288,629에 일반적으로 설명된 것과 같이, 효소원 인자 Ⅶ이 그것의 활성화된 2-사슬 형태로의 전환을 저해하도록 활성 절단 부위에서 변형될 수 있다.
본 발명 내에서, 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 생산하기 위해 형질전환 동물 공학이 이용될 수 있다. 자성 숙주 포유동물의 유선 내에서 단백질을 생산하는 것이 바람직하다. 유선에서의 발현 및 우유 내로 관심있는 단백질의 이후 분비는 다른 공급원으로부터 단백질을 분리할 때 조우되는 다수의 난제를 극복한다. 우유는 손쉽게 수집되고, 다량으로 이용가능하며 생화학적으로 양호하게 특성결정된다.더욱이, 주요 유단백질은 고농도 (전형적으로는 약 1 내지 15 g/l)로 우유에 존재한다. 상업적 관점에서 볼 때, 큰 우유 수득률을 갖는 종을 숙주로서 사용하는 것이 명백하게 바람직하다. 마우스 및 래트와 같은 소형 동물이 사용될 수 있지만 (그리고 원리의 증명 단계에서는 바람직하지만), 본 발명 내에서는 돼지, 염소, 양 및 소를 포함하되 이에 제한되지 않는 가축류의 포유동물을 사용하는 것이 바람직하다. 양은 이 종에서의 형질전환에 대한 기존의 내력, 우유 수득률, 가격 및 양유 수집용 장치의 손쉬운 이용가능성과 같은 인자들로 인해 특히 바람직하다. 숙주 종의 선택에 영향을 주는 인자의 비교를 위하여 WIPO 공보 WO 88/00239를 참조한다. 이스트 프리즐란드 양과 같이, 낙농용으로 육종된 숙주 동물의 품종을 선택하거나, 또는 최근에 형질전환주의 육종에 의한 낙농용 가축을 도입하는 것이 일반적으로 바람직하다. 모든 사건에서, 공지되고, 건강한 상태의 동물이 사용되어야 한다.
유선에서의 발현을 얻기 위해, 유단백질 유전자 유래의 전사 프로모터가 사용된다. 유단백질 유전자는 카제인 (참고문헌으로서 여기 포함된, 미국 특허 No. 5,304,489 참조), 베타-락토글로불린, 알파-락트알부민, 및 유장 산성 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 베타-락토글로불린 (BLG) 프로모터가 바람직하다. 양의 베타-락토글로불린 유전자의 경우, 유전자의 5' 인접 서열 중 적어도 대략 406 bp 구역이 일반적으로 사용될 것이지만, 예를 들어, 베타-락토글로불린 유전자의 5' 인접 프로모터 및 비-코딩 부분을 포함하는 약 4.25 kbp DNA와 같이, 약 5 kbp까지의 더 큰 5'인접 서열 부분이 바람직하다. Whitelaw 등의,Biochem J.286: 31-39 (1992)을 참조한다. 다른 종으로부터 유래한 프로모터 DNA의 유사한 단편 또한 적합하다.
발현되는 유전자의 게놈 구역과 마찬가지로, 베타-락토글로불린 유전자의 다른 구역 또한 구성체에 포함될 수 있다. 일반적으로 업계에서는 인트론이 없는 구성체는 이러한 DNA 서열을 포함하는 것에 비하여 빈약하게 발현되는 것으로 받아들여진다 (참고문헌으로 여기에 포함된 Brinster 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA85: 836-840 (1988); Palmiter 등,Proc. Nafl. Acad. Sci. USA88: 478-482 (1991); Whitelaw 등,Transgenic Res.1: 3-13 (1991); WO 89/01343 ; 및 WO 91/02318을 참조한다). 이것에 있어서, 가능하다면 관심있는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 천연 인트론의 전부 또는 일부를 포함하는 서열을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하고, 따라서 예를 들어, 베타-락토글로불린 유전자 유래의 적어도 몇몇 인트론을 더욱 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 구역 중 하나는 양의 베타-락토글로불린 유전자의 3' 비-코딩 구역에서 유래된 인트론 스플라이싱 및 RNA 폴리아데닐화를 제공하는 DNA 세그먼트이다. 유전자의 천연 3' 비-코딩 서열로 치환될 때, 이 양의 베타-락토글로불린 세그먼트는 관심있는 단백질 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 향상시킬 뿐만 아니라 안정화시킬 수 있다. 다른 구체예 내에서, 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 개시 ATG 주위 구역은 우유 특이적 단백질 유전자 유래의 상응하는 서열로 교체된다. 이러한 교체는 발현을 향상시키기 위한 추정적인 조직-특이적 개시 환경을 제공한다. 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 전체 프레-프로 서열 및 5' 비-코딩 서열을, 예를 들어 BLG 유전자로교체하는 것이 편리하지만 더 작은 구역이 교체될 수도 있다.
형질전환 동물에서 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 발현을 위해, 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트는 그것의 발현에 필요한 추가적인 DNA 세그먼트에 작동가능하게 연결되어 발현 단위를 생산한다. 이러한 추가적인 세그먼트는 상기 언급된 프로모터는 물론이고, mRNA의 전사 및 폴리아데닐화의 종결을 제공하는 서열을 포함한다. 발현 단위는 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 세그먼트에 작동가능하게 연결된 분비 신호 서열을 암호화하는 DNA 세그먼트를 더욱 포함할 것이다. 분비 신호 서열은 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 천연 분비 신호 서열일 수도 있고 또는 유단백질과 같은 다른 단백질의 것일 수도 있다. 예를 들어, 참고문헌으로서 여기 포함된 von Heinje,Nuc. Acids Res.14: 4683-4690 (1986); 및 Meade 등, 미국 특허 No. 4,873,316을 참조한다.
형질전환 동물에서의 사용을 위한 발현 단위의 구성은 추가적인 DNA 세그먼트를 포함하는 플라스미드 또는 파지 벡터 내로 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 삽입함으로써 알맞게 수행되지만, 발현 단위는 본질적으로 라이게이션의 어떠한 서열에 의해서도 구성될 수 있다. 유단백질을 암호화하는 DNA 세그먼트를 함유한 벡터를 제공하고 유단백질의 코딩 서열을 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 그것과 교체함으로써, 유단백질 유전자의 발현 제어 서열을 포함하는 유전자 융합체를 생성하는 것이 특히 바람직하다. 어떠한 사건에서도, 플라스미드 또는 다른 벡터에서의 발현 단위의 클로닝은 인간 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 증폭을 용이하게 한다. 증폭은 박테리아 숙주 세포 (예를 들어, E.coli)에서 알맞게 수행되므로, 벡터는전형적으로 복제 개시점 및 박테리아 숙주 세포에서 기능하는 선별가능한 마커를 포함할 것이다.
그 다음으로 발현 단위는 선택된 숙주 종의 수정란 (초기-단계 배아 포함)내로 도입된다. 이종 DNA의 도입은 몇몇 경로 중 하나에 의해 성취될 수 있는데, 이는 미세주사 (예를 들어, 미국 특허 No. 4,873,191), 레트로바이러스 주사 (Jaenisch,Science240: 1468-1474 (1988)) 또는 배아 줄기 (ES) 세포를 이용한 부위-특이적 통합 (Bradley 등, BiolTechnology 10: 534-539 (1992)에서 개설)을 포함한다. 그 다음 수정란은 위임신 암컷의 난관 또는 자궁에 이식되어 발생되도록 한다. 도입된 DNA를 생식 계열에 가진 자손은 정상적인 멘델 법칙으로 그들의 자손에게 DNA를 전달하여, 형질전환 개체군의 발생을 허용할 수 있다.
형질전환 동물을 생산하기 위한 일반적인 방법은 업계에 공지된다. 예를 들어, 참고문헌으로서 여기 포함된 Hogan 등,Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons 등,Bio/Technology6 : 179-183 (1988); Wall 등,Biol. Reprod.32: 645-651 (1985); Buhler 등,Bio/Technology8 : 140-143 (1990); Ebert 등,Bio/Technology9 : 835-838 (1991); Krimpenfort 등,Bio/Technology9 : 844-847 (1991); Wall 등,J. Cell. Biochem.49: 113-120 (1992); 미국 특허 No. 4,873,191 및 4,873,316; WIPO 공보 WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; 및 GB 87/00458을 참조한다. 외래 DNA 서열을 포유동물 및 그들의 생식 세포 내로 도입하기 위한 기술은 원래 마우스에서 개발되었다. 예를 들어, Gordon 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:7380-7384 (1980); Gordon and Ruddle,Science214: 1244-1246 (1981) ; Palmiter and Brinster,Cell41 : 343-345 (1985); 및 Brinster 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA82: 4438-4442 (1985)를 참조한다. 이들 기술은 이후에 가축을 포함하는 더 큰 동물로의 사용에 적용된다 (예를 들어, WIPO 공보 WO 88/00239, WO 90/05188, 및 WO 92/11757; 및 Simons 등,Bio/Technology6: 179183 (1988) 참조). 요약하면, 오늘날 형질전환 마우스 또는 가축의 생성에 이용되는 가장 효과적인 방법에서, 수백개의 직선 분자의 관심있는 DNA는 확립된 기술에 따라 수정란의 전핵 중 하나에 주입된다. 접합체의 세포질 내로 DNA를 주입하는 것 또한 이용될 수 있다. 형질전환 식물에서의 생산 또한 이용될 수 있다. 발현은 일반화되거나 또는 괴경과 같은 특정 기관에 지시될 수 있다. Hiatt,Nature344: 469-479 (1990); Edelbaum 등,J. Interferon Res.12: 449-453 (1992); Sijmons 등,Bio/Technology8 : 217-221 (1990); 및 유럽특허청 공보 EP 255, 378을 참조한다.
본 발명에 따라 생산되는 인자 Ⅶ는 항-인자 Ⅶ 항체 컬럼 상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 면역흡착 컬럼은 고-특이성 단일클론 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 참고문헌으로서 여기 포함된 Wakabayashi 등,J. Biol. Chem,261: 11097-11108, (1986) 및 Thim 등,Biochem.27: 7785-7793, (1988)에 설명된 것과 같이, 칼슘-의존 단일클론 항체를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 추가적인 정제는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은, 종래의 화학적 정제 수단에 의해 성취될 수 있다. 시트르산 바륨 침전법을 포함하는 다른 정제 방법이 업계에 공지되며, 여기에서 설명된 인자 Ⅶ의 정제에 적용될 수 있다(Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y., 1982 참조). 약제학적 사용에 있어서 약 90 내지 95%의 균질성을 갖는 실질적으로 순수한 인자 Ⅶ가 바람직하며, 98 내지 99% 이상의 균질성이 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 원하는 균질성까지 정제되면, 그 다음 인자 Ⅶ은 치료적으로 사용될 수 있다.
단일-사슬 인자 Ⅶ을 활성 2-사슬 인자 Ⅶa로 전환하는 것은 Hedner 및 Kisiel (1983,J. Clin. Invest. 71: 1836-1841)에 의해 설명된 것과 같이 인자 XⅡ를 이용하거나, 또는 트립신-유사 특이성을 갖는 다른 프로테아제 (Kisiel and Fujikawa,Behring Inst. Mitt.73: 29-42, 1983)로 성취될 수 있다. 대안으로 인자 Ⅶ은 mono Q. RTM. (Pharmacia Fire Chemicals)등과 같은 이온-교환 컬럼을 통과시킴으로써 자동활성화될 수 있다 (Bjoern 등, 1986,Research Disclosures269: 564-565). 본 발명의 인자 Ⅶ 분자 및 그것의 약제학적 조성물은 혈관내 응고를 포함하는 다양한 조건을 치료하기 위한 인간으로의 투여에 특히 유용하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 바람직한 인자 Ⅶa 폴리펩티드 및 인자 Ⅶa 유도체를 선별하는 적합한 검정법을 제공한다. 이들 검정법은 단순 예비 시험관내 시험으로서 수행될 수 있다.
따라서, 여기 실시예 5는 본 발명의 인자 Ⅶa 폴리펩티드의 활성에 대한 단순 시험 ("시험관내 가수분해 검정법")을 개시한다. 이에 기초하여, 특히 관심있는 인자 Ⅶa 폴리펩티드는, 여기에서 정의된 "시험관내 가수분해 검정법"으로 시험될 때 변체의 활성과 도 1에 나타난 천연 인간 인자 Ⅶ의 활성 간의 비율이 약 1.0 이상인 폴리펩티드이다.
폴리펩티드의 활성은 또한 인자 Ⅹ과 같은 생리학적 기질을 적당하게 100-1000 nM의 농도로 이용하여 측정될 수 있는데 ("시험관내 가수분해 검정법") (실시예 6 참조), 생성된 인자 Ⅹa는 적당한 발색 기질 (예를 들어, S-2765)을 첨가한 후 측정된다. 게다가, 활성 검정은 생리학적 온도에서 실행될 수 있다.
전응고제인 인자 Ⅶa 폴리펩티드의 트롬빈 생성 능력은 또한 생리학적 농도의 모든 관련된 응고 인자 및 저해제 (A형 혈우병을 모방할 시 인자 Ⅷ 제외) 및 (참고문헌으로서 여기 포함된 Monroe 등의 (1997)Brit. J. Haematol.99, 542-547 중 p.543에 설명된 것과 같은) 활성화된 혈소판을 포함하는 검정에서 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 전응고제 인자 Ⅶ 유도체는 응고 인자 결핍 (예를 들어, A형 및 B형 혈우병 또는 응고 인자 XI 또는 Ⅶ의 결핍) 또는 응고 인자 저해제와 같은 몇몇 원인을 갖는 출혈 이상을 제어하는데 사용될 수 있거나, 또는 정상적으로 기능하는 혈액 응고 카스케이드를 갖는 (응고 인자 결핍 또는 어떤 응고 인자에 대한 저해제가 없는) 피험자에서 발생하는 과다 출혈을 제어하는데에 사용될 수 있다. 출혈은 결손 혈소판 기능, 저혈소판증 또는 von Willebrand병에 의해 야기될 수 있다. 이것은 또한 증가된 섬유소분해 활성이 다양한 자극에 의해 유도된 대상에서 나타날 수 있다.
수술 또는 방대한 외상과 연관된 광범위한 조직 손상을 경험한 피험자에서, 지혈 기작은 즉각적인 지혈의 요구에 의해 압도될 수 있으며 정상적인 지혈 기작에도 불구하고 출혈을 일으킬 수 있다. 만족스러운 지혈을 성취하는 것 또한 뇌, 내이 영역 및 눈과 같은 기관에서 수술적 지혈에 대한 제한된 가능성을 가지고 발생할 때는 문제가 된다. 다양한 기관 (간, 폐, 종양 조직, 위장관)으로부터의 생검 채취 과정에서는 물론이고 복강경 수술에서 동일한 문제가 일어날 수 있다. 이들 모든 상황에 있어서의 공통점은 수술 기술 (봉합, 결찰 등)에 의해 지혈하기가 어렵다는 것이고 이는 또한 출혈이 확산되는 경우이다 (출혈성 위염 및 자궁 출혈 과다). 급성 및 과다 출혈은 또한 항응고 요법 상에서 주어진 요법에 의해 결손 지혈이 유발된 피험자에서 발생할 수 있다. 이러한 피험자는 항응고 효과가 신속히 상쇄되어야 하는 상황에서 외과적 개입을 필요로 할 수 있다. 근치 치골뒤 전립선절개술은 국소 전립선 암을 갖는 환자에 있어서 통상적으로 수행되는 과정이다. 수술은 현저한 그리고 때때로는 다량의 혈액 손실에 의해 종종 복잡해진다. 전립선절개술 도중의 상당한 혈액 손실은, 외과적 지혈에 있어서 쉽게 접근할 수 없는 다양한 혈관 밀집 부위를 갖는, 넓은 구역으로부터 확산 출혈을 일으킬 수 있는 주로 복잡한 해부학적 상황에 관련된다. 만족스럽지 않은 지혈의 경우에서 문제를 야기할 수 있는 또다른 상황은 정상 지혈 기작을 갖는 피험자에게 혈전 색전증을 예방하기 위하여 항응고제 요법이 주어질 때이다. 이러한 요법은 헤파린, 프로테오글리칸의 다른 형태, 와파린 또는 비타민 K-길항제는 물론이고 아스피린의 다른 형태 및 다른 혈소판 응집 저해제를 포함할 수 있다.
응고 카스케이드의 전신적 활성화는 산재성 혈관내 응고 (DIC)를 일으킬 수 있다. 그러나, 이러한 합병증은 혈관 벽 손상의 부위에 노출되는 인자 Ⅶa 및 TF 간의 복합체 형성으로 인해 유도되는 일종의 국소화된 지혈 과정 때문에 높은 용량의 재조합 인자 Ⅶa로 치료된 피험자에서는 나타나지 않는다. 본 발명에 따른 전응고제인 인자 Ⅶ 유도체는 따라서 정상 지혈 기작과 연관된 이러한 과다 출혈을 제거하기 위하여 그들의 활성화된 형태로 사용될 수 있다.
신중한 중재에 관련된 치료에 있어서, 본 발명의 전응고제인 인자 Ⅶ은 전형적으로 중재를 수행하기 약 24시간 전에 투여되고 이후로 7일 이상 지속될 것이다. 응고제로서의 투여는 여기에서 설명된 것과 같이 다양한 경로일 수 있다.
인자 Ⅶ 유도체의 용량은, 상태의 심각성에 의존하여 부하 및 유지 용량으로서 70 kg의 피험자에 있어서 약 0.05 mg 내지 500 mg/일, 바람직하게는 약 1 mg 내지 200 mg/일, 그리고 더욱 바람직하게는 약 10 mg 내지 약 175 mg/일의 범위이다.
약제학적 조성물은 예방 및/또는 치료에 있어서 1차적으로 비경구 투여로 의도된다. 바람직하게, 약제학적 조성물은 비경구적, 즉 정맥내, 피하, 또는 근육내로 투여되거나, 또는 연속적 또는 박동성 주입에 의해 투여될 수도 있다. 비경구적 투여를 위한 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 인자 Ⅶ를 포함한다. 물, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 등과 같은 다양한 수성 담체가 사용될 수 있다. 본 발명의 인자 Ⅶ는 또한 손상 부위로의 송달 또는 표적화를 위한 리포솜 제조 내에 조제될 수 있다. 리포솜 제조는 일반적으로 예를 들어, U. S. 4,837,028, U. S. 4,501,728, 및 U. S. 4,975,282에 설명된다. 조성물은 종래의, 주지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 결과적 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건 하에서 여과되어 동결건조될 수 있는데, 동결건조된 제조는 투여에 앞서 멸균 수용액과 결합된다. 조성물은 아세트산 나트륨, 락트산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼륨 등과 같이, 대략의 생리학적 조건에 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 기질 (예를 들어, pH 조절 및 완충제, 근탄력 조절제 등)을 포함할 수 있다.
이 조제물에서 인자 Ⅶ 유도체의 농도는 질량으로 약 0.5% 미만, 보통은 적어도 질량으로 약 1% 내지 질량으로 15 또는 20%로 광범위하게 변화할 수 있고 선택된 투여의 특정 방식에 따라 액체 부피, 점도 등에 의하여 1차적으로 선택될 것이다.
따라서, 정맥내 주입을 위한 전형적인 약제학적 조성물은 250 ml의 멸균 Ringer 액 및 10 mg의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물의 실제 제조 방법은 공지되거나 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어Remington's Pharmaceutical Sciences,18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)에서 보다 상세하게 설명된다.
본 발명의 인자 Ⅶ 유도체를 함유한 조성물은 예방 및/또는 치료적 처치를 위해 투여될 수 있다. 치료적 적용에서, 조성물은 상기 설명된 것과 같은 질병에 이미 걸린 대상에, 질병 및 그것의 합병증을 치유, 완화 또는 일부 억류하기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 성취하기에 충분한 양은 "치료적 유효량"으로서 정의된다. 당업자에게 이해될 것과 같이 이 목적을 위한 유효량은 질병 또는 손상의 심각성은 물론이고 대상의 체중 및 일반 상태에 의존할 것이다. 그러나 일반적으로, 유효량은 70 kg의 피험자에 있어서 1일 당 약 0.05 mg에서 약 500 mg의 범위일 것이고, 1일 당 약 1.0 mg 내지 약 200 mg 인자 Ⅶ 유도체의 투약량이 보다 통상적으로 사용될 것이다.
본 발명의 물질은 일반적으로 심각한 질병 또는 손상 상태, 다시 말해 생명을 위협하거나 또는 잠재적으로 생명을 위협하는 상황에서 사용될 수 있다는 것을 명심해야만 한다. 이러한 경우, 외부 기질의 최소화 및 인간에서 인간 인자 Ⅶ 유도체의 면역원성의 일반적인 결여의 견지에서, 이들 변체 인자 Ⅶ 조성물의 실질적인 과량을 투여하는 것이 가능하며 담당 의사에 의해 바람직한 것으로 여겨질 수도 있다.
예방적 적용에서, 본 발명의 인자 Ⅶ 유도체를 함유한 조성물은 피험자 자신의 응고 능력을 향상시키기 위하여 질병 상태 또는 손상이 있는 것으로 의심되거나 그렇지 않으면 이러한 위험에 처한 피험자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 예방적 적용에서, 정확한 양은 또다시 피험자의 건강 및 체중 상태에 의존하지만, 일반적으로는 70 킬로그램 피험자에 있어서 1일당 약 0.05 mg 내지 약 500 mg이고, 더욱 통상적으로는 70 킬로그램 피험자에 있어서 1일당 약 1.0 mg 내지 약 200 mg의 범위이다.
조성물의 단일 또는 다중 투여는 담당 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 걸을 수 있는 환자에 필요한 1일 유지 수준을 위해, 인자 Ⅶ 유도체는 예를 들어, 이동식 펌프 시스템을 이용한 연속적인 주입에 의해 투여될 수 있다.
예를 들어 국소 적용과 같은, 본 발명의 인자 Ⅶ 유도체의 국부 송달은, 예를 들어 분무, 관류, 이중 풍선 카테터, 스텐트 (stent), 혈관 이식편 또는 스텐트로의 포함, 풍선 카테터를 코팅하는데 사용되는 히드로겔, 또는 다른 확립된 방법에 의해 수행될 수 있다. 모든 사건에서, 약제학적 조성물은 피험자를 치료하기에 충분한 인자 Ⅶ 유도체의 양을 제공해야 한다.
본 발명의 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 세포-표면 조직 인자에 결합할 수 있다. 예를 들어, DEGR-인자 Ⅶa는 야생형 인자 Ⅶa와 동등하거나 더 높은 친화도로 세포-표면 조직 인자와 결합한다. 그러나, DEGR-인자 Ⅶa는 효소 활성이 없지만, 조직 인자에 결합하여 야생형 인자 Ⅶa에 대한 경쟁적 길항제로서 작용함으로써, 트롬빈의 생성을 일으키는 응고의 외래 경로에서 이후의 단계를 저해한다.
비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는 혈관내 응고를 포함하는 다양한 상태를 치료하기 위하여 인간으로의 투여에 특히 유용하다. 예를 들어, 깊은 정맥 혈전증 및 폐 색전증은 종래의 항응고제로도 치료될 수 있지만, 여기에서 설명된 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는 수술을 받은 환자 또는 울혈심부전증을 갖는 환자와 같이, 매우 위험한 환자에서 혈전색전증성 합병증의 발생을 예방하는데 사용될 수 있다. 게다가, 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는 응고의 조직인자-중재 도입에 대한 길항제로서 기능할 수 있고, 따라서 트롬빈의 생성 및 피브린의 이후 확산을 차단한다. 이와 같이, 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는 예를 들어, 혈액 응고의 저해, 혈전증 또는 혈소판 침전에서 발생하는 조직 인자 활성을 저해하는데 유용할 수 있다.
비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는 내막 과다형성, 급성 혈관 손상, 깊은 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 수술후 혈전증, 관상 동맥 우회 이식편 (CABG), 경피 경혈관 심장동맥 성형술 (PTCA), 발작, 암, 종양 전이, 혈관형성, 허혈/재관류, 류마티스관절염, 혈전용해, 동맥경화로 인한 재협착 및 혈관 성형술 후의 재협착, 감염, 패혈 쇼크, 패혈증, 저혈압, 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 파종 혈관내 응고 (DIC), 폐 색전증, 혈소판 침전, 심근경색증과 같은 급성 및 만성 증후의 치료, 또는 혈전증의 위험이 있는 죽경화 혈관을 갖는 포유동물의 예방적 처치에 특히 유용할 수 있다. 급성 혈관 손상은 신속하게 (즉, 수일 내지 수개월에 걸쳐) 발생하는 것으로, 전 생애에 걸쳐 발생하는 만성 혈관 손상 (예를 들어, 죽경화증)과는 대비된다. 급성 혈관 손상은 종종 혈관 재구성과 같은 외과적 방법으로부터 발생하는데, 여기에서 혈관 성형술, 동맥내막절제술, 죽상절제술, 혈관 이식편 설치 등의 기술이 사용된다. 과다형성은 또한 예를 들어, 이식편 설치 또는 기관 이식에 반응하는 지연된 반응으로서 발생할 수 있다. 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는, 손상 부위에 노출된 조직 인자와만 결합하는 헤파린보다 더 민감하기 때문에, 그리고 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는 다른 응고 단백질을 파괴하지 않기 때문에, 깊은 정맥 혈전증의 예방을 위해 사용될 때 헤파린보다 더 효과적이고 출혈 합병증을 덜 야기할 것이다.
조직 인자 결합을 유지하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는 트롬빈의 생성 및 이후 피브린의 침전을 차단함으로써 혈관 손상 부위에서의 혈소판 축적을 저해한다.
급성 혈관 손상 부위에서 트롬빈 생성을 차단하고 혈소판 침전을 제한하는 DEGR-인자 Ⅶ의 능력으로 인해, 조직 인자 결합 활성은 유지하되 인자 Ⅶa 효소 활성은 없는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는, 혈관 재협착을 저해하는데 사용될 수 있다.
비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물은 약제학적 조성물 내에 조제될 때 환자를 치료하는 방법에서 특히 유용하고, 응고-관련 상태를 치료하기 위하여 다양한 질병 상태에 걸린 개인에게 주어질 수 있다. 조직 인자와는 결합할 수 있되 응고 카스케이드에 있는 다른 인자의 활성화를 촉매하는 능력은 실질적으로 감소된 이러한 비활성 인자 Ⅶ 유도체는, 더 긴 혈장 반감기를 가질 수 있고 따라서 다른 항응고제에 비하여 더 장기간 항응고 활성을 갖는다. 주제 조성물에 대한 의학적 징후 중에서 통상적으로 항응고제로 치료되는 것은 예를 들어, 깊은 정맥 혈전증, 폐 색전증, 발작, 파종 혈관내 응고 (DIC), 그람-음성 내독혈증에 연관된 폐 및 신장내 피브린 침전, 및 심근경색증이다. 조성물은 풍선 혈관성형술, 동맥내막절제술, 복원 죽상절제술, 스텐트 설치, 레이져 요법 또는 동맥경화반제거술과 같은 기계적 혈관 손상 후 발생하거나, 또는 혈관 이식편, 스텐트, 우회 이식편 또는 기관 이식체에 2차적으로 발생하는 혈관 재협착을 저해하는데 사용될 수 있다. 따라서 조성물은 혈소판 침전 및 연관된 이상을 저해하는데 사용될 수 있다. 따라서, 응고, 혈관 재협착 또는 혈소판 침전의 저해 방법은 예를 들어, 환자에게 Ser344, Asp242 및 His193의 세작용기 촉매에 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 것과 같은 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물을, 응고, 혈관 재협착 또는 혈소판 침전을 저해하는데 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 방법은 또한 개인에서 관상 동맥의 급성 폐쇄 (예를 들어, 급성 심근경색)의 치료에서의 사용을 밝히는데, 이 방법은 DEGR-인자 Ⅶ 및 FFR-인자 Ⅶ을 포함하고 tPA 유발성혈전용해를 가속화할 수 있는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 조직 플라스미노겐 활성제 또는 스트렙토키나제와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는 조직 플라스미노겐 활성제와 같은 혈전용해제의 투여 전에, 또는 이와 동시에 또는 직후에 주어진다.
비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 조성물은 또한 심장성 색전의 예방 및 혈전성 쇼크의 치료에서 상당한 효용성을 가질 것이다. 출혈 합병증을 야기할 수 있는 낮은 잠재력 및 선택력 때문에, 인자 Ⅶ 유도체는 발작에 걸린 사람에게 주어질 수 있고 폐색 동맥 혈전의 확장을 막을 수 있다. 투여되는 인자 Ⅶ 유도체의 양은 발작의 성질 및 심각성에 의존하여 각 환자에 있어서 변화할 것이지만, 일반적으로 투약량은 하기 제시된 범위 내일 것이다.
비활성화된 인자 Ⅶ 유도체 및 그것의 조성물은 또한 허혈성 재관류에 연관된 해로운 사건을 저해하는데에도 사용될 수 있다. 조직, 기관 또는 사지의 중증 허혈은 혈류에서의 감소로 인한 것일 수도 있고 외상, 외과적 조작, 또는 감소된 혈압과 연관될 수도 있다. 중증 허혈에 연관된 합병증 중 하나는 동맥 시스템에서 조직 인자의 상승 조절이다. 조직 인자의 증가된 발현은 일차적으로 모세혈관계에서 전응고제 반응을 자극하는 것으로 생각된다. 허혈 조직의 재관류 후, 폐쇄성이거나 아니면 비-폐쇄성인 혈전이 생성될 수 있다. 동맥계에서 혈전의 생성, 및 혈전에 따른 혈소판의 침전은 조직에서 허혈의 2차적인 생성을 일으킨다. 혈전의 생성 및 혈소판의 존재는 트롬빈 및 인자 Ⅹ은 물론이고, 활성화된 혈소판으로부터 방출된 인자와 같이 응고 경로로부터 생성된 것들을 포함하는 다수의 생물활성 인자의 생성 및 방출을 야기할 수 있다. 그 다음으로, 이들 인자는 기저 내피 및 평활근 세포에 의한, 또는 인접한 단핵구에 의한 추가적인 인자 (예를 들어, TNF-알파 및 IL-1)의 생성을 유도할 수 있다. 이들 인자는, 그 다음으로, 단핵구 및 호중구 결합에 연관된 다양한 부착 분자의 상승-조절을 일으키는 내피 세포를 활성화할 수 있다. 단핵구 및 호중구의 결합 및 이주, 유리-산소 라디칼의 생성을 포함하는, 이들 세포에 의한 생물활성 화합물의 방출은, 내피 세포 활성화 및 손상의 수준을 악화시킬 수 있다. 궁극적으로, 사건의 카스케이드가 억제되지 않는다면, 전신적 합병증이 일어날 수 있고 다수의 기관 부전을 자극할 가능성이 있다. 조직 인자/인자 Ⅶ 결합(예를 들어, FFR-FⅦa)에 대한 특이적인 저해제를 투여함으로써 본 발명에 따른 조직 인자를 차단하고, 그럼으로써 응고의 외래 경로의 개시를 차단함으로써, 사건의 카스케이드 개시를 막을 수 있고, 그럼으로써 허혈/재관류에 연관된 해로운 사건을 제거 또는 최소화할 수 있다.
깊은 정맥 혈전증의 예방을 위한 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 투약량은 70 kg 환자에 있어서 약 50 ㎍ 내지 500 mg/일, 더욱 전형적으로는 1 mg 내지 200 mg/일, 그리고 더욱 바람직하게는 10 내지 약 175 mg/일의 범위에 있고, 투여는 적어도 수술 약 6시간 전에 시작하여 적어도 환자가 걸을 수 있을 때까지 계속해야 한다. 재협착에 대한 치료에서 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 투약량은 각 환자에서 변화할 것이지만 일반적으로는 상기 제시된 범위에 있을 것이다.
비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물은 전형적으로, 중재를 수행하기에 앞서 약 24시간 내에 투여될 것이며, 이후로 7일 이상 계속될 것이다. 여기에서 더욱 설명된 것과 같이 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물은 또한 문합, 외과적 동맥내막절제술 (전형적으로는 경동맥 동맥내막절제술), 우회 이식편 등의 부위에서 (예를 들어, 코팅 합성 또는 변형된 천연 동맥 혈관 이식편에 의한) 혈관 이식편의 설치를 위하여 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
확립된 깊은 정맥 혈전증 및/또는 폐 색전증의 치료에 있어서, 인자 Ⅶ 유도체의 투약량은 70kg의 환자에 있어서 부하 및 유지 용량으로서, 환자의 체중 및 상태의 심각성에 의존하여 약 50 ㎍ 내지 500 mg/일, 더욱 전형적으로는 1 mg 내지 200 mg/일, 그리고 더욱 바람직하게는 10 mg 내지 약 175 mg/일의 범위이다. 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체로부터의 감소된 출혈 합병증 가능성으로 인해, 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체는 혈전절제술 또는 색전절제술과 함께 수술 도중 또는 후에 헤파린의 투약량을 대신하거나 낮출 수 있다.
급성 균혈증, 내독혈증 또는 DIC의 경우에서, 환자는 70 kg 환자에 있어서 적어도 약 50 ㎍ 내지 500 mg/일, 더욱 전형적으로는 1 mg 내지 200 mg/일, 그리고 더욱 바람직하게는 10 mg 내지 약 175 mg/일의 인자 Ⅶ 유도체의 부하 용량이 주어지고, 70 kg 환자에 있어서 이후로의 유지 용량으로는 50 ㎍ 내지 500 mg/일, 전형적으로는 1 mg 내지 200 mg/일이다.
바람직하게, 인자 Ⅶ 유도체는 이것이 유래된 결합되지 않은 인자 Ⅶ의 반감기에 비하여 향상된 반감기(t1/2)를 갖는다. 바람직하게, 인자 Ⅶ 유도체의 반감기는 변형되지 않은 근원 인자 Ⅶ의 반감기에 비하여 적어도 1.5배 내지 2배, 더욱 바람직하게는 약 2배 내지 3배, 더욱 바람직하게는 약 5배 내지 10배, 선택적으로는 약 100배로 향상되며, 보통은 약 6배이다.
단백질에 폴리에틸렌 글리콜을 부착하는 일반 방법은 1979년 12월 18일에 특허받은 미국 특허 No. 4,179,337에 개시된다 (단백질에 폴리에틸렌 글리콜을 부착하는 방법을 개시한 참고문헌으로서 여기 포함됨). 또한 폴리에틸렌을 부착하기 위한 다른 방법은 1992년 6월 16일 특허받은 미국 특허 No. 5,122,614에 개시되며, 단백질에 폴리에틸렌 글리콜을 부착하는 방법을 개시한 참고문헌으로 여기에 포함된다. 말레이미도-PEG는 시스테인-PEG화에 있어서 가장 유용한 시약인 것으로 생각되지만, 다른 화학 또한 특정 시스테인 변형에 이용가능하다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조로 하여 실시예에서 더욱 상세하게 설명된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 예시되지만, 보호의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지는 않는다. 선행하는 설명 및 하기 실시예에 개시된 특징은, 독립적으로 또는 그것의 어떠한 조합으로, 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 재료가 될 수 있다.
하기 실시예에 사용된 아미노산 치환에 대한 전문용어는 다음과 같다. 첫번째 문자는 SEQ ID NO: 1의 한 위치에 본래 존재하는 아미노산을 표시한다. 다음 숫자는 SEQ ID NO: ㅂ에서의 위치를 나타낸다. 두번째 문자는 본래 아미노산을 치환한 상이한 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, R396C는 SEQ ID NO: 1의 위치 396에 있는 아르기닌이 시스테인으로 교체된 것이다. 또다른 예에서, V158T/M298Q는 동일한 인자 Ⅶ에서 SEQ ID NO: 1의 위치 158에 있는 발린이 트레오닌으로 교체되고 SEQ ID NO: 1의 위치 298에 있는 메티오닌이 글루타민으로 교체된 것이다.
실시예 1
FⅦ-(R396C), FⅦ-(Q250C), FⅦ-(P406C), FⅦ-(407C), FⅦ-(V158T/M298Q), FⅦ-(L305V/M306D/D309S), FⅦ-(K337A), FⅦ-(L305V), 및 FⅦ-(F374P)를 암호화하는 DNA 구성체 :
FⅦ-(R396C), FⅦ-(Q250C), FⅦ-(P406C), FⅦ-(407C) (하나의 추가적인 C-말단 Cys), FⅦ-(M298Q), FⅦ-(L305V/M306D/D309S), FⅦ-(K337A), FⅦ-(L305V), 및 FⅦ-(F374P)를 암호화하는 DNA 구성체는 인간 FⅦ (pLN174)의 삽입체 및 원하는 돌연변이를 함유한 두개의 합성 프라이머를 갖는 초코일된, 이중 가닥 DNA 벡터를 이용한 부위-특이적 돌연변이 유발로써 제조하였다. 하기 프라이머를 사용하였다:
FⅦ-(R396C) 용:
5'-GCG CTC AGA GCC ATG CCC AGG AGT CCT CC-3' (SEQ ID NO: 3)
5'-GGA GGA CTC CTG GGC ATG GCT CTG AGC GC-3' (SEQ ID NO: 4)
FⅦ-(Q250C) 용:
5'-GCT CCG CCT GCA CTG TCC CGT GGT CCT CAC TGA CC-3' (SEQ ID NO: 5)
5'-GGT CAG TGA GGA CCA CGG GAC AGT GCA GGC GGA GC-3' (SEQ ID NO: 6)
FⅦ-(P406C) 용:
5'-GCG AGC CCC ATT TTG CTA GAC TAG AGG ATC TGG G-3' (SEQ ID NO: 7)
5'-CCC AGA TCC TCT AGT CTA GCA AAA TGG GGC TCG C-3' (SEQ ID NO: 8)
FⅦ-(407C) 용:
5'-CCT GCG AGC CCC ATT TCC CTG TTA GAC TAG AGG ATC TGG G-3' (SEQ ID NO: 9)
5'-CCC AGA TCC TCT AGT CTA ACA GGG AAA TGG GGC TCG CAG G-3' (SEQ ID NO: 10)
FⅦ-(M298Q) 용:
5'-GCC CTG GAG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' (SEQ ID NO: 11)
5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CTC CAG GGC-3' (SEQ ID NO: 12)
FⅦ-(L305V) 용:
5'-CGT GCC CCG GGT GAT GAC CCA GGA C-3' (SEQ ID NO: 13)
5'-GTC CTG GGT CAT CAC CCG GGG CAC G-3' (SEQ ID NO: 14)
FⅦ(M306D/D309S) 용:
5'-TCT AGA TAC CCA GTC TTG CCT GCA GCA GTC ACG GAA-3' (SEQ ID NO: 15)
5'-TTC CGT GAC TGC TGC AGG CAA GAC TGG GTA TCT AGA-3' (SEQ ID NO: 16)
FⅦ-(K337A) 용:
5'-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3' (SEQ ID NO: 17)
5'-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3' (SEQ ID NO: 18)
FⅦ- (F374P) 용:
5'-CCG TGG GCC ACC CTG GGG TGT ACA CC-3' (SEQ ID NO: 19)
5'-GGT GTA CAC CCC AGG GTG GCC CAC GG-3' (SEQ ID NO: 20)
벡터 삽입체의 반대 가닥에 각각 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Pfu DNA 중합효소에 의한 온도 사이클 시험 도중 신장하였다. 프라이머를 포함시킨 후, 엇갈린 닉을 함유한 돌연변이 플라스미드를 생성하였다. 온도 사이클 시험 후, 메틸화 및 반메틸화된 DNA에 특이적인 DpnI으로 생성물을 처리하여 본래 DNA 주형을 효소절단하고 돌연변이체-함유 합성 DNA를 선별하였다.
특정 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응을 이용하여 DNA 구성체를 제조하는 방법은 당업자에게 주지된다 (PCR Protocols,1990, Academic ress, San Diego, California, USA 참조).
실시예 2
FⅦ-(R396C) 제조
앞서 설명된 것과 같이 BHK 세포를 트랜스펙션하여 (Thim 등 (1988)Biochemistty27, 7785-7793; Persson 및 Nielsen (1996)FEBS Lett.385, 241-243) 변체 FⅦ-(R396C)의 발현을 획득하였다. 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 다음과 같이 정제하였다 :
조정 배지는 5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10 mM Tris를 첨가하고, pH 8.0로 조절하고 물을 첨가하여 전도성을 10-11 mS/cm로 조절한 후, Q Sepharose Fast Flow의 25-ml 컬럼 (Pharmacia Biotech)에 부하하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 부터 10 mM Tris, 50 mM NaCI, 25 mM Cars, 0.1% Triton X-100, pH 7.5 까지의 구배로 단백질을 용리하였다. FⅦ-(R396C)를 함유한 부분을 모아서, CNBr-활성화 Sepharose 4B (Pharmacia Biotech)에 커플링된 단일클론 항체 F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유한 25-ml 컬럼에 부었다. 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl 및 0.02% Triton X-100을 함유한 50 mM Hepes, pH 7.5로 컬럼을 평형화하였다. 평형 완충액 및 2 M NaCl을 함유한 평형 완충액으로 세척한 후, CaCl2대신 10 mM EDTA를 함유한 평형 완충액으로 결합된 물질을 용리하였다. 사용 또는 저장 전에, EDTA 보다 많은 CaCl2를 첨가하거나 또는 FⅦ-(R396C)를 Ca2+-함유 완충액으로 옮긴다. 인자 Ⅶ ELISA 측정으로 각 단계의 수율을 측정하고 정제된 단백질은 SDS-PAGE로 분석하였다.
실시예 3
FⅦ-(M298Q) 제조
앞서 설명된 것과 같이 BHK 세포를 트랜스펙션하여 (Thim 등 (1988)Biochemistty27, 7785-7793; Persson 및 Nielsen (1996)FEBS Lett.385, 241-243) 변체 FⅦ-(V158T/M298Q)의 발현을 획득하였다. 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 다음과 같이 정제하였다 :
조정 배지는 5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10 mM Tris를 첨가하고, pH 8.0로 조절하고 물을 첨가하여 전도성을 10-11 mS/cm로 조절한 후, Q Sepharose Fast Flow의 25-ml 컬럼 (Pharmacia Biotech)에 부하하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 부터 10 mM Tris, 50 mM NaCI, 25 mM Cars, 0.1% Triton X-100, pH 7.5 까지의 구배로 단백질을 용리하였다. FⅦ-(V158T/M298Q)를 함유한 부분을 모아서, CNBr-활성화 Sepharose 4B (Pharmacia Biotech)에 커플링된 단일클론 항체 F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유한 25-ml 컬럼에 부었다. 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl 및 0.02% Triton X-100을 함유한 50 mM Hepes, pH 7.5로 컬럼을 평형화하였다. 평형 완충액 및 2 M NaCl을 함유한 평형 완충액으로 세척한 후, CaCl2대신 10 mM EDTA를 함유한 평형 완충액으로 결합된 물질을 용리하였다. 사용 또는 저장 전에, EDTA 보다 많은 CaCl2를 첨가하거나 또는 FⅦ-(V158T/ M298Q)를 Ca2+-함유 완충액으로 옮긴다. 인자 Ⅶ ELISA 측정으로 각 단계의 수율을 측정하고 정제된 단백질은 SDS-PAGE로 분석하였다.
실시예 4
FⅦ-(L305V/M306D/D309S) 제조
앞서 설명된 것과 같이 BHK 세포를 트랜스펙션하여 (Thim 등 (1988)Biochemistty27, 7785-7793; Persson 및 Nielsen (1996)FEBS Lett.385, 241-243) 변체 FⅦ-(L305V/M306D/D309S)의 발현을 획득하였다. 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 다음과 같이 정제하였다 :
조정 배지는 5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10 mM Tris를 첨가하고, pH 8.0로 조절하고 물을 첨가하여 전도성을 10-11 mS/cm로 조절한 후, Q Sepharose Fast Flow의 25-ml 컬럼 (Pharmacia Biotech)에 부하하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 부터 10 mM Tris, 50 mM NaCI, 25 mM Cars, 0.1% Triton X-100, pH 7.5 까지의 구배로 단백질을 용리하였다. FⅦ-(L305V/M306D/ D309S)를 함유한 부분을 모아서, CNBr-활성화 Sepharose 4B (Pharmacia Biotech)에 커플링된 단일클론 항체 F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유한 25-ml 컬럼에 부었다. 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl 및 0.02% Triton X-100을 함유한 50 mM Hepes, pH 7.5로 컬럼을 평형화하였다. 평형 완충액 및 2 M NaCl을 함유한 평형 완충액으로 세척한 후, CaCl2대신 10 mM EDTA를 함유한 평형 완충액으로 결합된 물질을 용리하였다. 사용 또는 저장 전에, EDTA 보다 많은 CaCl2를 첨가하거나 또는 FⅦ -(L305V/M306D/D309S)를 Ca2+-함유 완충액으로 옮긴다. 인자 Ⅶ ELISA 측정으로 각 단계의 수율을 측정하고 정제된 단백질은 SDS-PAGE로 분석하였다.
실시예 5
시험관내 가수분해 검정
천연 (야생형) 인자 Ⅶa 및 인자 Ⅶa 변체 (둘 모두 이하 "인자 Ⅶa"로서 지칭)는 그들의 특정 활성을 직접 비교하도록 동시에 검정하였다. 검정은 마이크로티터 플레이트 (MaxiSorp, Nunc, Denmark)에서 수행하였다. 발색 기질인 D-Ile-Pro-Arg-p-니트로아닐리드 (S-2288, Chromogenix, Sweden)는, 최종 농도 1 mM으로, 0.1 M NaCl, 5 mM CaC12 및 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유한 50 mM Hepes 중 인자 Ⅶa (최종 농도 100 nM)에 첨가한다. SpectraMax 340 플레이트 판독기 (Molecular Devices, USA)에서 405 nm에서의 흡광도를 연속적으로 측정한다. 20분 인큐베이션 동안 발생된 흡광도는, 효소를 함유하지 않은 블랭크 웰에서의 흡광도를 감산한 후 변체 및 야생형 인자 Ⅶa의 활성 간의 비율을 계산하는데 사용하였다:
비율 = (A405 nm인자 Ⅶa 변체)/(A405 nm인자 Ⅶa 야생형).
실시예 6
시험관내 가수분해 검정법
천연 (야생형) 인자 Ⅶa 및 인자 Ⅶa 변체 (둘 모두 이하 "인자 Ⅶa"로서 지칭)는 그들의 특정 활성을 직접 비교하도록 동시에 검정하였다. 검정은 마이크로티터 플레이트 (MaxiSorp, Nunc, Denmark)에서 수행하였다. 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2및 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유한 100 μL 50 mM Hepes, pH 7.4 중, 인자 Ⅶa (10 nM) 및 인자 X (0.8 μM)를 15분동안 인큐베이션한다. 그 다음 0.1 M NaCl, 20 mM EDTA 및 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유한 50 μL 50 mM Hepes, pH 7.4를 첨가하여 인자 X 절단을 중지한다. 생성된 인자 Xa의 양은 발색 기질 Z-D-Arg-Gly-Arg-p-니트로아닐리드 (S-2765, Chromogenix, Sweden)를, 최종 농도 0.5mM로 첨가하여 측정한다. SpectraMax 340 플레이트 판독기 (Molecular Devices, USA)에서 405 nm에서의 흡광도를 연속적으로 측정한다. 10분 인큐베이션 동안 발생된 흡광도는, FⅦa를 함유하지 않은 블랭크 웰에서의 흡광도를 감산한 후 변체 및 야생형 인자 Ⅶa의 단백질분해 활성 간의 비율을 계산하는데 사용하였다:
비율 = (A405 nm인자 Ⅶa 변체)/(A405 nm인자 Ⅶa 야생형)
실시예 7
실시예 5 및 6에서 설명된 검정에서 측정한 FⅦa 폴리펩티드의 상대적 활성
실시예 8
FⅦ-(R396C), FⅦ-(Q250C), FⅦ-(P406C), FⅦ-(407C)의 PEG 결합
어떤 언급한 위치(250, 396, 406 또는 407)에 도입된 유리 티올기를 갖는, 실시예 1에서 설명한 것과 같은 인자 Ⅶa 변체는 5배 과량의 몰인 PEG-비닐설폰 또는 PEG-말레이미드와 3시간 동안 완충액에서 반응하여 실질적으로 반응을 완료한다 (대안으로는 어떤 다른 설프히드릴-반응성 PEG 유도체를 사용할 수 있다). PEG 유도체의 분자량은 적어도 10,000이다. 결과적 PEG-FⅦa은 실시예 5 및 6에서 설명한 것과 같이 아미드분해 및 단백질분해에 대하여 시험하고 야생형 인간 FⅦa의 활성을 보유하거나, 또는 만약 증가된 활성을 갖는 FⅦa 변체 내로 Cys을 도입했다면, PEG와 반응 후의 활성은 야생형 인간 FⅦa 보다 더 높은 활성으로 남아있어야 한다. PEG-결합 FⅦa는 Superdex-200 등의 컬럼 상에서 겔 여과와 같은 크로마토그래피에 의해, 미반응 FⅦa 변체 및 유리 PEG 유도체로부터 분리한다.
Cys 잔기에서의 단백질의 PEG 결합은 당업자에게 공지되며 Goodson, R. J. & Katre, N. V. (1990)Bio/Technology8,343 및 Kogan, T. P. (1992)Synthetic Comm.22, 2417 을 포함하는 몇몇 출판물에서 설명된다.

Claims (96)

  1. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드로서, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상기 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있고 여기에서 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  2. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드로서, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  3. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드로서, 여기에서 SEQ ID NO: 1의 R396, Q250 또는 P406으로부터 선택된 아미노산에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 R396에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 Q250에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 R406에 해당하는 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상이한 아미노산은 화학기와 결합될 수 있는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상이한 아미노산은 시스테인인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학기와 결합될 수 있는 추가적인 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  10. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드로서, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열에 있는 위치에 삽입되고, 여기에서 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  11. 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 247 내지 260, 393 내지 405 또는 406으로부터 선택된 위치에 삽입된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학기와 결합될 수 있는 추가의 아미노산이 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  13. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드로서, 여기에서 화학기와 결합될 수 있는 아미노산이 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  14. 제 12 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 C-말단에 첨가된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산은 시스테인인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 K157, V158, E296, M298, L305, D334, S336, K337, 및 F374로부터 선택된 아미노산은 또다른 아미노산으로 치환되고, 아미노산은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  17. 제 16 항에 있어서, K157은 G, V, S, T, N, Q, D 및 E로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  18. 제 16 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, V158은 S, T, N, Q, D 및 E로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, E296은 R, K 및 V로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, M298은 R, K, Q 및 N으로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  21. 제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, L305은 A, V, I, M, F, W, P, G, S, T, C, Y, N, E, K, R, H, D 및 Q로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  22. 제 16 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, D334는 E로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  23. 제 16 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, S336은 G로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  24. 제 16 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, K337은 A, G, V, S, T, N, Q, D 및 E로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  25. 제 16 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, F374는 A, V, L, I, M, W,P, G, S, T, C, Y, N, E, K, R, H, D 및 Q로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인간 인자 Ⅶ인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  27. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인간 인자 Ⅶa인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 폴리펩티드가 그것의 촉매 중심에서 더욱 변형되고, 변형은 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 그것의 촉매 중심에서 세린 프로테아제 저해제로 변형되는 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  30. 제 29 항에 있어서, 프로테아제 저해제는, Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤, D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤 Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤 및 D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤 및 Dansyl-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드 할로메틸 케톤인 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드.
  31. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체로서, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상기 상이한 아미노산은 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 상기 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 제 1 항 내지 제 9 항, 제 11 항 내지 제 12 항, 제 14 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 것임을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  33. 제 31 항에 있어서, 상기 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 247-260, 393-405 또는 406으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산에 해당하는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  34. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체로서, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 서열 내에 삽입되고 여기에서 상기 아미노산은 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 상기 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 제 9 항 내지 제 12 항, 제 14 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 것임을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  36. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체로서, 여기에서 아미노산은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 N- 또는 C-말단에 첨가되고 여기에서 상기 아미노산은 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 상기 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 제 12 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 것임을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 실질적으로 중성인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  39. 제 31 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 인자 Ⅶ 유도체의 실제 분자량을 증가시키는 약 1,000 달톤 내지 약 80,000 달톤인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  40. 제 31 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 인자 Ⅶ 유도체의 실제 분자량을 증가시키는 약 5,000 달톤 내지 약 60,000 달톤인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  41. 제 31 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 인자 Ⅶ 유도체의 실제 분자량을 증가시키는 약 10,000 달톤 내지 약 40,000 달톤인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  42. 제 31 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  43. 제 31 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 1 내지 6 분자의 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 화학기는 한 분자의 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  45. 제 31 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 폴리펩티드에 있는 아미노산을 치환하거나, 여기에 삽입되거나, 또는 여기에 첨가된 아미노산 상에 존재하는 유리 설프히드릴기에 결합되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  46. 제 31 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 시스테인에 결합되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체.
  47. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드가 상기 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 것임을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  49. 제 47 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 실질적으로 중성인 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  50. 제 47 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 실제 분자량을 증가시키는 약 1,000 달톤 내지 약 80,000 달톤인 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  51. 제 47 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 실제 분자량을 증가시키는 약 5,000 달톤 내지 약 60,000 달톤인 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  52. 제 47 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 실제 분자량을 증가시키는 약 10,000 달톤 내지 약 40,000 달톤인 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  53. 제 47 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  54. 제 47 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 1 내지 6 분자의 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 화학기는 한 분자의 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  56. 제 47 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 폴리펩티드에 있는 아미노산을 치환하거나, 여기에 삽입되거나, 또는 여기에 첨가된 아미노산 상에 존재하는 유리 설프히드릴기에 결합되는 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  57. 제 47 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 시스테인에 결합되는 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체.
  58. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물로서, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상기 상이한 아미노산은 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되고 여기에서 상기 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  59. 제 31 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물.
  60. 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물로서, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 펩티드는 상기 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  61. 제 47 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 따른 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물.
  62. SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체; 및 선택적으로는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상기 상이한 아미노산은 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000의 화학기와 결합되고 여기에서 상기 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  63. 제 31 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 유도체; 및 선택적으로는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  64. 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체; 및 선택적으로는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하고 혈장 인자 Ⅹ 또는 Ⅸ를 활성화시키는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 능력을 저해하는 변형을 촉매 중심에 갖는 비활성화된 인자 Ⅶ 펩티드는 상기 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 더욱 결합되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  65. 제 47 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 따른 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체; 및 선택적으로는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  66. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체.
  67. 제 66 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 벡터인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 구성체.
  68. 제 66 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 진핵 숙주 세포.
  69. 제 68 항에 있어서, 진핵 숙주 세포는 포유동물 기원인 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
  70. 제 69 항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포, BHK 세포 또는 HEK 세포인 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
  71. 제 66 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 동물.
  72. 제 66 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 구성체를 발현하는 형질전환 식물.
  73. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 따른 진핵 숙주 세포를 적합한 성장 배지에서 상기 폴리뉴클레오티드 구성체로부터 단백질 합성을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  74. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 제 71 항에 정의된 형질전환 동물에 의해 생산된 우유로부터 상기 인자 Ⅶ 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  75. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 제 72 항에 따른 형질전환 식물의 세포를 배양하는 단계 및 결과 식물로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  76. a) 제 73 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 제조하는 단계;
    b) 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 화학기와 결합시키는 단계;
    c) 인자 Ⅶ 유도체를 양이온 교환 크로마토그래피 또는 겔여과 컬럼에 가하는 단계; 및
    d) 인자 Ⅶ 유도체를 용리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ 유도체의 제조 방법.
  77. a) 제 73 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 제조하는 단계;
    b) 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 그것의 촉매 중심에서 세린 프로테아제 저해제로 변형시키는 단계;
    c) 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 화학기와 결합시키는 단계;
    d) 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 양이온 교환 크로마토그래피 또는 겔여과 컬럼에 가하는 단계; 및
    e) 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 용리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 제조 방법.
  78. 제 76 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 76 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 실질적으로 중성인 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 76 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 약 1,000 달톤 내지 약 80,000 달톤의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 76 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 약 5,000 달톤 내지 약 60,000 달톤의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 76 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 약 10,000 달톤 내지 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 76 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 76 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 1 내지 6 분자의 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 76 항 내지 제 84 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 한 분자의 폴리엔틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 76 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 폴리펩티드에 있는 아미노산을 치환하거나, 여기에 삽입되거나, 또는 여기에 첨가된 아미노산상에 존재하는 유리 설프히드릴기에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제 76 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학기는 시스테인에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 출혈 이상의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 향상을 위한 약물의 제조에 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 사용으로서, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 여기에서 상기 상이한 아미노산은 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기에 결합되고 여기에서 상기 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 사용.
  89. 출혈 이상의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 향상을 위한 약물의 제조에 제 31 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 유도체의 사용.
  90. 제 88 항 내지 제 89 항 중 어느 한 항에 있어서, A형 또는 B형 혈우병의 치료에의 사용.
  91. 피험자에서 출혈 에피소드 또는 출혈 이상의 치료 또는 정상 지혈 시스템의향상 방법으로서, 방법은 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 갖는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 인자 Ⅶ 유도체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는데, 여기에서 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환되고, 상기 상이한 아미노산은 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 단톤의 화학기와 결합되고 여기에서 인자 Ⅶ 유도체는 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa에 비하여 실질적으로 동일한 활성 또는 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 피험자에서 출혈 에피소드 또는 출혈 이상의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 향상 방법으로서, 제 31 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 유도체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 약물의 제조에 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 사용으로서, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 상기 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되는 것을 특징으로 하는 사용.
  94. 환자에서 혈전 형성을 저해하기 위한 약물의 제조에 제 47 항 내지 제 57 항중 어느 한 항에 따른 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체의 사용.
  95. 환자에서 혈전 형성이 의심되는 혈관 부위에 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물의 치료적 유효 용량을 국소적으로 투여하는 단계를 포함하는 환자에서의 혈전 형성 저해 방법으로서, 여기에서 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 변체의 아미노산 서열을 포함하는 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 상기 비활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 실제 분자량을 증가시키는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤의 화학기와 결합되는 것을 특징으로 하는 혈전 형성 저해 방법.
  96. 환자에서 혈전 형성이 의심되는 혈관 부위에 제 47 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 따른 비활성화된 인자 Ⅶ 유도체를 포함하는 조성물의 치료적 유효 용량을 국소적으로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자에서의 혈전 형성 저해 방법.
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