TW201607553A - 包含長效胰島素類似物接合物及長效促胰島素肽接合物之治療糖尿病組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明乃有關用於預防或治療糖尿病之包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物之組成物，及用於治療糖尿病之方法。更具體而言，長效類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之同步給藥，抑制由於胰島素給藥之體重增加及由於促胰島素肽給藥之嘔吐與噁心，且亦減少胰島素之需要劑量，從而顯著增進藥物順從性。此外，本發明係有關給藥糖尿病病患減少胰臟β細胞副作用之包含長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽類似物接合物之醫藥組成物，及有關減少糖尿病病患胰臟β細胞副作用之包括給藥該組成物之步驟之方法。具體而言，本發明之特徵在於減少例如與糖尿病進展相關之胰臟β細胞功能異常、胰臟β細胞質量減少、脂質毒性、或葡萄糖毒性之副作用。

Description

包含長效胰島素類似物接合物及長效促胰島素肽接合物之治療糖尿病組成物
本發明乃有關用於預防或治療糖尿病之包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物之組成物，及有關包括給藥該組成物步驟之用於治療糖尿病之方法。
此外，本發明係有關給藥糖尿病病患用於減少胰臟β細胞副作用之包含長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之醫藥組成物，及有關用於減少糖尿病病患胰臟β細胞副作用之包括給藥該組成物之步驟之方法。具體而言，本發明之特徵在於減少例如與糖尿病進展相關之胰臟β細胞功能異常、胰臟β細胞減少、及脂質毒性或葡萄糖毒性之副作用。
[背景技藝]
胰島素係由胰臟β細胞所分泌之肽，於體內血糖值(blood glucose level)之調控上扮演重要角色。與 由於胰島素分泌不足或胰島素功能異常之血糖值升高相關之代謝性疾病稱為糖尿病。當血糖值升高係由於胰臟胰島素分泌衰竭時，稱為第一型糖尿病，而血糖值升高係由於體內胰島素分泌異常或分泌胰島素之功能異常時，稱為第二型糖尿病。第二型糖尿病病患通常使用具有化學物質為主要成分之口服降血糖劑治療，且於若干情況下，給予胰島素；而第一型糖尿病病患則實質上需要胰島素治療。
目前最常見可用之胰島素療法為於膳食前及/或後注射胰島素。目前，注射用胰島素為市售可得，原則上，係皮下注射給予。給藥方法視其作用時程而不同。胰島素注射顯示比經口給藥更迅速之降血糖功效，且當經口給藥不可行時，可安全使用。又，胰島素之使用無劑量限制。然而，一天三次之長期使用胰島素會導致例如厭惡注射針、注射裝置操作困難、低血糖症、與由於長期使用胰島素而體重增加之缺點。體重增加可能增加心血管疾病之風險與胰島素抗性之副作用。同時，已有許多藉由維持胰島素肽藥物被人體吸收後之長期、升高量，使其功效最大化之努力。舉例而言，長效胰島素調配劑，例如蘭德仕(Lantus)[甘精胰島素(Insulin glargine)；Sanofi Aventis]與瑞和密爾諾易筆(Levemir)[地特胰島素(Insulin detemir)；Novo Nordisk]，已被開發及市售可得。與NPH胰島素[赫氏中性魚精蛋白胰島素(Neutral Protamine Hagedorn)]不同地，該等長效藥物降低睡眠期間低血糖症之風險，特別是，瑞和密爾諾易筆與體重增加的稍微減少相關。然而，該等藥物調 配劑亦具有一天必須給予一次或兩次之缺點。
同時，一種促胰島素肽，類升糖素肽-1(GLP-1)，係由迴腸與結腸之L細胞分泌之腸促胰島素激素。類升糖素肽-1具有擴大胰島素釋出及誘發葡萄糖依賴性分泌以防止低血糖發作之功能。由於此特性，其受到關注以作為第二型糖尿病之潛在治療。然而，使用GLP-1作為治療劑之主要障礙為其於血漿中少於2分鐘之極短半衰期。目前，作為類升糖素肽-1受體促效劑之艾塞那肽-4(exendin-4)係市售可得，其為從吉拉毒蜥(gila monster)之唾液腺純化之類升糖素肽-1類似物。艾塞那肽-4對DPP IV(二肽基肽酶-4)具抗性，生理活性比類升糖素肽-1高。結果，其具有2至4小時之活體內半衰期，比類升糖素肽-1之半衰期長(美國專利案No.5,424,286)。然而，以只對DPP IV抗性增強之方法，無法預期可支撐充分生理活性，舉例而言，於市售可得艾塞那肽-4[依克那肽(exenatide)]之情形下，仍存在必須給藥病患一天兩次之問題，且其給藥引起為病患顯著負擔之例如嘔吐與噁心之不良事件。
雖有時間上之差異，該等糖尿病相關之疾病由於胰臟β細胞之功能喪失及細胞凋亡，通常誘發胰臟β細胞質量減少。
當血糖值持續增加時，胰臟β細胞基於其功能增強及為了維持活體內血糖值而增加β細胞質量，即增加胰島素分泌，惟此類分泌增加作用受到限制。亦即，若維持活體內正常血糖值所需之胰島素量大於胰臟β細胞 能生產之胰島素量，結果血糖值最後增加，則第二型糖尿病之進展變得嚴重。
臨床上，第二型糖尿病係依胰島素抗性、胰島素分泌減少、及胰臟β細胞功能異常與胰臟β細胞質量減少之順序進展。特別是，β細胞之功能異常與胰臟β細胞之質量減少受增加血液脂質與葡萄糖所促進。此等血液脂質與葡萄糖之濃度將誘發脂質毒性及/或葡萄糖毒性，因此減弱β細胞之功能以及胰島素之作用兩者，最後惡化第二型糖尿病之預後。因此，經由β細胞功能與質量之保留以及經由胰島素抗性之改善，抑制脂質毒性與葡萄糖毒性可顯著緩和第二型糖尿病之進展。
胰島素係從胰臟β細胞分泌之肽，於體內血糖值之調控上扮演角色。因此，胰島素功能之異常與β細胞質量之減少與由於體內胰島素量下降之血糖值增加有密切關聯。因而，帶有胰島素分泌減少之糖尿病病患可使用外源胰島素治療。根據先前之研究，已知外源胰島素之給藥不僅於改善血糖值上展現優異功效，亦抑制由於胰臟β細胞過度分泌胰島素之壓力(stress)發生。
然而，外源胰島素之給藥具有誘發體重增加之主要缺點，且此類體重增加涉及血液脂質量之增加。因此，很可能使糖尿病之初期發育惡化。
類升糖素肽-1(GLP-1)受體促效劑，一種包含艾塞那肽-4之促胰島素肽，已知具有調控血糖值與減少體重之功效。再者，GLP-1受體促效劑可經由調控β細胞 之新生、增殖、與分化以及β細胞之細胞凋亡，而增加β細胞質量。
實際上，於誘發第二型糖尿病之囓齒動物模式中，已證實GLP-1或艾塞那肽-4之給藥刺激β細胞之生長與分化，因而增加β細胞質量。然而，GLP-1受體促效劑持續刺激胰臟β細胞中之胰島素分泌，因此涉及由於β細胞壓力增加而被潛在降解之可能性。
為了解決上述問題，本發明人等提出一種長效蛋白質接合物，其係經由作為連接子之非肽基聚合物以共價鍵連接生理活性多肽與免疫球蛋白Fc區所製備，從而同時維持該蛋白質藥物之活性及增進其穩定性(韓國專利案No.10-0725315)。特別是，發明人人等發現各個長效胰島素接合物與長效艾塞那肽-4接合物發揮顯著增加之活體內功效(韓國專利案No.10-1058209與No.10-1330868)。
然而，當胰島素或艾塞那肽-4以維持穩定血糖值之量注射時，仍存在體重增加、或嘔吐與噁心之問題。因此，對於以較低劑量及較不頻繁使用之藥物，對糖尿病顯現優異治療功效之治療方法之開發有迫切需求。此外，此等研究係集中於增加該生理活性多肽之活體內半衰期，且針對能逆轉由於胰臟β細胞功能喪失及/或細胞凋亡而使胰臟β細胞質量減少之導致病患之糖尿病不良預後副作用之方法之研究並未完成。
於此背景下，本發明人等已進行許多研究與實驗，以開發同時具有持久治療功效與降低如嘔吐與噁心之不良事件之糖尿病用治療劑；及具有胰臟β細胞功能，可維持與增加細胞質量，並為潛在β細胞壓力提供安全性之糖尿病用治療劑。發明人等試圖進行同時刺激類升糖素肽-1受體與胰島素受體之長效艾塞那肽-4接合物與長效胰島素類似物接合物之同步給藥。結果他們發現，長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步給藥增進活體內功效之持續時間與穩定性，且顯著減少兩種藥物之劑量，導致穩定之血糖值。發明人等亦發現，其改善由類升糖素肽-1促效劑與艾塞那肽-4或其衍生物誘發之例如嘔吐與噁心之不良事件，且長效艾塞那肽-4接合物之使用減少由使用胰島素引起之體重增加。再者，發明人等發現，其可顯著地減少為降低β細胞功能與質量主要原因之脂質毒性與葡萄糖毒性，且可緩和糖尿病之進展。基於該等發現，得以完成本發明。
本發明之目的在於提供用於預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物。
本發明之另一目的在於提供用於預防或治療糖尿病之方法，該方法包括對罹患糖尿病或具罹患糖尿病風險之對象(subject)給藥該組成物。
本發明之又另一目的在於提供用於在糖尿 病病患中減少選自由脂質毒性、葡萄糖毒性、胰臟β細胞功能異常與胰臟β細胞減少所成組群之一或多種胰臟β細胞副作用之醫藥組成物，其包含長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物。
本發明之又另一目的在於提供用於在糖尿病對象中減少選自由脂質毒性、葡萄糖毒性、胰臟β細胞功能異常與胰臟β細胞質量減少所成組群之一或多種胰臟β細胞副作用之方法，該方法包括對罹患糖尿病或具罹患糖尿病風險之對象給藥該組成物之步驟。
本發明之長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物針對糖尿病顯現優異之治療效果，特別是，其同步給藥同時刺激胰島素受體與類升糖素肽-1受體，以改善其活體內功效之持續時間與穩定性，並顯著減少藥物所需劑量及穩定調控血糖於穩定值，而導致低血糖症及體重增加的改善。此外，其抑制嘔吐與噁心，並增進作為糖尿病治療劑之藥物順從性。特別是，其具顯著改善之血液中穩定性及活體內之功效持續時間，容許減少治療頻率，而有助於病患便利性。
再者，根據本發明之長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物展現優異之糖尿病治療效果，尤其是當組合給藥時，且同時刺激胰島素受體與類升糖素肽-1受體，因而增強活體內持久性與穩定性，並進一步經由減少由於糖尿病進展產生之脂質毒性與葡萄糖毒性 之副作用，改善β細胞功能與增加其質量。此外，本發明可提供一種組成物，其中該胰島素製劑之缺點已藉由緩和低血糖值與體重增加而減少。
第1圖係顯示糖化血色素(HbA1c)值之圖，該值經測量以檢驗經由同步對db/db小鼠給藥長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之血糖調控[相對於媒劑(vehicle)，利用鄧尼特氏MC檢定(Dunnet’s MC test)，* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001](相對於長效胰島素類似物接合物之單一給藥，利用鄧尼特氏MC檢定，P<0.05、 P<0.01、 P<0.001)；及第2圖係顯示同步對db/db小鼠給藥長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物後之體重(BW)變化圖(利用鄧尼特氏MC檢定，* P<0.05、** P<0.01、***P<0.001)(相對於長效胰島素類似物之單一給藥，利用鄧尼特氏MC檢定， P<0.05、 P<0.01、 P<0.001)。
第3圖係以數值顯示經由同步對db/db給藥長效胰島素類似物接合物(長效胰島素衍生物接合物)與長效艾塞那肽-4接合物，增加β細胞質量之效果(相對於媒劑，利用ANOVA檢定，* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001)。
第4圖係顯示經由12週同步對db/db給藥長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物，血清中之三酸甘油酯值圖(相對於媒劑，利用ANOVA檢定，* P<0.05、** P< 0.01、*** P<0.001)。
第5圖係顯示糖化血色素(HbA1c)值之圖，該值經測量以檢驗經由同步對db/db小鼠給藥長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之血糖調控。
[最佳模式]
於一態樣中，本發明提供用於預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含具有相似之活體內半衰期之長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物。本發明組成物之特徵在於同步給藥長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物。
詳言之，該組成物可為用於預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包括經由連接子或共價鍵連接胰島素類似物與能延長其活性持續時間之生物相容性物料所形成之長效胰島素類似物接合物；及經由連接子或共價鍵連接促胰島素肽與能延長其活性持續時間之生物相容性物料所形成之長效促胰島素肽接合物。
於另一態樣中，本發明提供用於在糖尿病病患中減少選自由脂質毒性、葡萄糖毒性、胰臟β細胞功能異常與胰臟β細胞質量減少所成組群之一或多種胰臟β細胞副作用之醫藥組成物，其含有具相似之活體內半衰期之長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物。本發明組成物之特徵在於同步給藥長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物。
具體而言，本發明之組成物可為用於在糖尿病病患中減少選自由脂質毒性、葡萄糖毒性、胰臟β細胞功能異常與胰臟β細胞質量減少所成組群之一或多種胰臟β細胞副作用之醫藥組成物，其含有：經由連接子或共價鏈結連接胰島素類似物與能延長該胰島素類似物活性持續時間之生物相容性物料所形成之長效胰島素類似物接合物，與經由連接子或共價鏈結連接促胰島素肽與能延長該促胰島素肽活性持續時間之生物相容性物料所形成之長效促胰島素肽接合物。
本發明之組成物可同時減少脂質毒性、葡萄糖毒性、胰臟β細胞功能異常與胰臟β細胞質量減少。
由於促胰島素肽，例如胰島素類似物與類升糖素肽-1，經由不同作用機制調控血糖值，僅有以其作為調控血糖值之治療劑用途之研究已被進行，其係基於發現共同給藥時其等功效可被最大化。然而，尚無研究證實，經由脂質毒性與葡萄糖毒性之下降與互補作用，同步給藥改善β細胞之功能與質量，從而減少單一給藥胰島素或促胰島素肽可發生之胰臟β細胞之副作用。本發明人等首先開發上述新穎用途。
本發明組成物之特徵在於，其不僅可減少胰臟β細胞之副作用，亦可降低血液中三酸甘油酯濃度從而減少脂質毒性，調控血糖功能從而減少葡萄糖毒性，及維持及/或增加胰臟β細胞質量從而抑制糖尿病之進展。因 此，本發明組成物可緩和糖尿病之進展。
上述組成物之特徵在於，其於經給藥該組成物之糖尿病對象中，改良糖尿病之預後。
於該組成物中，長效促胰島素肽接合物：胰島素類似物接合物之莫耳比可在1：0.01至1：50之範圍內。促胰島素肽接合物之實例可為艾塞那肽接合物，惟不受此限。
本文所用之“長效胰島素類似物接合物”或“長效促胰島素肽接合物”之詞，係指經由共價鍵或非共價鍵連接胰島素類似物或促胰島素肽與生物相容性物料或載劑(carrier)所形成之接合物，相較於未經接合之肽，該接合物之形成延長了對應胰島素類似物或促胰島素肽之活性持續時間。
相較於原態胰島素，長效胰島素類似物接合物之給藥降低藥物所需劑量，亦緩和例如體重增加、嘔吐與噁心之不良事件。
本發明中，能增加胰島素類似物與促胰島素肽之半衰期與生體可利用率或維持其等活性之藥劑，可為經由共價鍵直接結合於胰島素類似物與促胰島素肽之載劑，或係指即使不直接形成共價鍵，亦能增加胰島素類似物活體內活性之藥劑。
本文所用之“生物相容性物料或載劑”一詞係指於其經由共價或非共價鍵連接於對應類似物或肽以形成接合物時，能延長胰島素類似物或促胰島素肽之活性 持續時間之物料。舉例而言，經由形成接合物能延長對應類似物或肽之活體內半衰期之物料，可為根據本發明之生物相容性物料或載劑。該能結合於胰島素類似物與促胰島素肽之生物相容性物料，可由各種生物相容性物料例示，包括聚乙二醇、脂肪酸、膽固醇、白蛋白與其片段、白蛋白結合物料、特定胺基酸序列重複單元之聚合物、抗體、抗體片段、FcRn結合物料、結締組織、核苷酸、纖維結合素、運鐵蛋白、醣類、或聚合物，其形成共價或非共價鍵，以延長活體內半衰期。再者，胰島素類似物或促胰島素肽與能延長活體內半衰期之生物相容性物料間之鏈結，包括基因重組與使用高或低分子量化合物之活體外接合，惟不受限於任何鏈結方法。該FcRn結合物料可能為免疫球蛋白Fc區。
本文所用之“胰島素類似物”一詞係指具有原態序列之一或多個胺基酸改變之肽。
相較於原態胰島素，胰島素類似物可為於胰島素之B鏈或A鏈中具有胺基酸改變，及具有降低之胰島素力價及/或降低之胰島素受體結合能力之胰島素類似物。原態胰島素之胺基酸序列如下。
A鏈：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO：37)
B鏈：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu -Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO：38)
本發明實施例中所用之胰島素可為利用基因重組技術產生之胰島素類似物，惟本發明不受此限。該胰島素包括具有降低之活體外力價及/或降低之胰島素受體結合能力之所有胰島素。較佳為，該胰島素包括反轉胰島素(inverted insulin)、胰島素變異體、胰島素片段等，及其可利用固相方法以及基因重組方法製備，惟不受此限。
胰島素類似物為保留等同於胰島素之調控體內血糖值功能之肽，此類肽包括胰島素促效劑、衍生物、片段、變異體等。
本發明之胰島素促效劑係指結合於胰島素受體以顯現等同於胰島素之生物活性之化合物，其與胰島素結構無關。
本發明之胰島素類似物係指與原態胰島素之A鏈與B鏈個別胺基酸序列具同源性(homology)之肽，其可經由選自由取代(例如，α-甲基化、α-羥基化)、缺失(例如，去胺化)、修飾(例如，N-甲基化)、及其組合所成組群之變化而具有至少一個胺基酸殘基改變，並具有調節體內血糖值之功能。
於本發明中，胰島素類似物係指肽模擬物或結合於胰島素受體以調節血糖值之低或高分子量化合物(即使其胺基酸序列與原態胰島素無同源性)。
本發明之胰島素片段係指於胰島素具有經 添加或刪除一或多個胺基酸之片段，其中該添加之胺基酸可為非天然存在之胺基酸(例如，D型胺基酸)，且此胰島素片段具有調節體內血糖值之功能。
本發明之胰島素變異體為具有與胰島素之序列不同於一或多個胺基酸序列之肽，及其係指保留調節體內血糖值功能之肽。
本發明胰島素之促效劑、衍生物、片段、與變異體之各個製法可單獨或組合使用。舉例而言，本發明包括具有一或多個不同胺基酸及N終端胺基酸殘基去胺化，且具有調節體內血糖值功能之肽。
具體而言，胰島素類似物可經由將選自由B鏈位置1、2、3、5、8、10、12、16、23、24、25、26、27、28、29、與30及A鏈位置1、2、5、8、10、12、14、16、17、18、19與21所成胺基酸組群之一或多個胺基酸，以其他胺基酸(較佳為丙胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、異白胺酸、纈胺酸、麩胺醯胺、甘胺酸、離胺酸、組胺酸、半胱胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸)置換予以製備。再者，具一或多個胺基酸缺失之胰島素類似物亦可涵蓋於本發明範圍之內，惟於胰島素類似物並無限制。
較佳之胰島素類似物為其與生物相容性物料或載劑結合時，具有比原態胰島素更高之半衰期之胰島素類似物。該胰島素類似物可為揭示於韓國專利案No.2014-0022909與2014-0006938中之胰島素類似物，惟不受 此限。
本文所用之“長效促胰島素肽接合物”一詞係指經由非肽連接子與免疫球蛋白Fc區連接之促胰島素肽。
本文所用之“促胰島素肽”一詞係指保留釋出胰島素功能及刺激胰臟β細胞中胰島素之合成或表現之肽。較佳為，該促胰島素肽係GLP(類升糖素肽)-1、艾塞那肽-3、或艾塞那肽-4，惟不受此限。該促胰島素肽包括原態促胰島素肽、其前驅物、其促效劑、其衍生物、其片段、與其變異體。
本發明之促胰島素肽衍生物可包括其中刪除促胰島素肽N終端胺基之去胺基-組胺醯基衍生物；其中以羥基取代胺基之β-羥基咪唑丙醯基衍生物；其中胺基經兩個甲基修飾之二甲基組胺醯基衍生物；其中以羧基取代N終端胺基之β-羧基咪唑丙醯基衍生物；或其中刪除N終端組胺酸殘基之α碳，只保留咪唑乙醯基，胺基之正電荷因而被移除之咪唑乙醯基衍生物等。其他N終端胺基經突變(-mutated)之衍生物均涵蓋於本發明範圍之內。
於本發明中，促胰島素肽衍生物更佳為具化學突變之N終端胺基或胺基酸殘基之艾塞那肽-4衍生物，又更佳為經由移除或取代存在艾塞那肽-4N終端His1殘基α碳上之α胺基，或經由移除或取代該α碳製備之艾塞那肽-4衍生物。再更佳為，移除N終端胺基之去胺基組胺醯基-艾塞那肽-4(DA-艾塞那肽-4)、經由以羥基取代胺基 製備之β-羥基咪唑丙基-艾塞那肽-4(HY-艾塞那肽-4)、經由以羧基取代胺基製備之β-羧基咪唑丙基-艾塞那肽-4(CX-艾塞那肽-4)、經由以兩個甲基殘基修飾胺基製備之二甲基-組胺醯基-艾塞那肽-4(DM-艾塞那肽-4)、或移除N終端組胺酸殘基α碳之咪唑乙醯基-艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)，惟不受此限。
GLP-1係由小腸分泌之激素，且通常促進胰島素之生合成與分泌、抑制升糖素分泌、及促進細胞之葡萄糖攝取。於小腸中，升糖素前驅物分解為三個肽，即升糖素、GLP-1、與GLP-2。於此，GLP-1係指GLP-1(1-37)，原本呈不具促胰島素功能之形式，惟隨後經處理轉變為呈活化之GLP-1(7-37)形式者。GLP-1(7-37)之胺基酸序列如下：
GLP-1(7-37)：
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G(SEQ ID NO：39)
GLP-1衍生物係指展現與GLP-1至少80%胺基酸序列同源性之肽，可呈經化學修飾之形式，及展現至少等同或較GLP-1高之促胰島素功能。
GLP-1片段係指呈於原態GLP-1之N終端或C終端添加或刪除一或多個胺基酸之形式者，其中所添加之胺基酸可能為非天然存在之胺基酸(例如，D型胺基酸)。
GLP-1變異體係指擁有促胰島素功能之肽，其具有與原態GLP-1者不同之一或多個胺基酸序列。
艾塞那肽-3與艾塞那肽-4係由39個胺基酸組成之促胰島素肽，與GLP-1具有53%胺基酸序列同源性。艾塞那肽-3與艾塞那肽-4之胺基酸序列如下：
艾塞那肽-3：
HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID NO：40)
艾塞那肽-4：
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID NO：41)
艾塞那肽促效劑係指於活體內結合艾塞那肽受體，並具有等同於艾塞那肽之生物活性之化合物，其與艾塞那肽之結構無關；艾塞那肽衍生物則係指與原態艾塞那肽具有至少80%胺基酸序列同源性並具有促胰島素功能之肽，其於胺基酸殘基上可能有若干基團被化學取代(例如，α-甲基化、α-羥基化)、刪除(例如，去胺化)、或經修飾(例如，N-甲基化)。
艾塞那肽片段係指具有於原態艾塞那肽之N終端或C終端添加或刪除一或多個胺基酸並具有促胰島素功能之片段，其中可能添加非天然存在之胺基酸(例如，D型胺基酸)。
艾塞那肽變異體係指與原態艾塞那肽者具有至少一個不同之胺基酸序列之肽，其具有促胰島素功能，且該艾塞那肽變異體包括經由以絲胺酸或精胺酸取代艾塞那肽-4位置12之離胺酸所製備之肽。
用於艾塞那肽之促效劑、衍生物、片段、與變異體之各個製法可單獨或組合使用。舉例而言，本發明包括具有至少一個不同胺基酸之胺基酸序列、及具有於N終端去胺化之之胺基酸殘基之促胰島素肽。
於例示具體實例中，本發明所用之原態促胰島素肽與經修飾之促胰島素肽可利用固相合成法合成；及包括原態促胰島素肽之大部分原態肽可利用重組技術產生。
胰島素類似物接合物與促胰島素肽接合物可由下式表示：X-La-F
其中X為胰島素類似物或促胰島素肽，其中該胰島素類似物經由修飾胰島素之B鏈或A鏈之一或多個胺基酸所製備，L為連接子，a為0或自然數(當a為2或更大時，各L獨立)，F係選自聚乙二醇、脂肪酸、膽固醇、白蛋白與其片段、特定胺基酸序列、抗體、其片段、FcRn結合物料、纖維結合素、醣等。
由於免疫球蛋白Fc區係於體內被代謝之生物可降解多肽，因此其可被安全使用作為藥物載劑。又，相較於整個免疫球蛋白分子，免疫球蛋白Fc區具有相對低之分子量，因此，有利於接合物之製備、純化與產率。免疫球蛋白Fc區未含因根據抗體亞型之不同胺基酸序列之高度非同質性Fab片段，因此，可預期該免疫球蛋白Fc區可大幅增加物質之同質性(homogeneity)及為較小抗原 性。
本文所用之“免疫球蛋白Fc區”一詞係指含有免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH2)與重鏈恆定區3，而不包括免疫球蛋白之重鏈與輕鏈變異區、重鏈恆定區1(CH1)與輕鏈恆定區1(CL1)之蛋白質；其可進一步包含於重鏈恆定區之絞鏈區。又，只要具有實質上類似或比原態蛋白質更佳之生理功能，本發明之免疫球蛋白Fc區可含有包括重鏈恆定區1(CH1)及/或輕鏈恆定區1(CL1)，而重鏈與輕鏈變異區除外之部分或全部Fc區。又，免疫球蛋白Fc區可為於相對長部分之CH2及/或CH3胺基酸序列具缺失之區域。
亦即，本發明之免疫球蛋白Fc區可包含1)CH1功能區、CH2功能區、CH3功能區與CH4功能區，2)CH1功能區與CH2功能區，3)CH1功能區與CH3功能區，4)CH2功能區與CH3功能區，5)一或多個功能區與免疫球蛋白絞鏈區(或部分絞鏈區)之組合，及6)重鏈恆定區與輕鏈恆定區之各功能區之二聚體。
本發明之免疫球蛋白Fc區包含原態胺基酸序列及其序列變異體(突變體)。胺基酸序列變異體為由於一或多個胺基酸殘基之缺失、插入、非保守性或保守性取代或其組合，而不同於原態胺基酸序列之序列。舉例而言，於IgG Fc中，已知於結合上重要之位置214至238、297至299、318至322、或327至331之胺基酸殘基，可使用作為供修飾之適當標靶。
又，可能有其他各種變異體，包括能形成雙硫鍵之區域被刪除、或於原態Fc型N終端之特定胺基酸殘基被刪除、或於此添加甲硫胺酸殘基者。再者，欲移除效應子(effector)功能，可於補體結合部位發生缺失，例如C1q-結合部位與ADCC(抗體依賴性細胞傳介之細胞毒性)部位。製備此類免疫球蛋白Fc區序列衍生物之技術揭示於國際專利公告案WO 97/34631與WO 96/32478。
於蛋白質與肽中，通常不改變分子活性之胺基酸交換，為此項技術領域已知(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常見發生之交換為雙向之Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly。
此外，若需要，則Fc區可利用磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙醯化、醯胺化等進行修飾。
前述Fc變異體為具有與本發明Fc區完全相同之生物活性，或改善之結構穩定性(例如對抗熱、pH等)之變異體。
此外，該等Fc區可從單離自人類及包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠與天竺鼠之其他動物之原態形式獲得，或可為從轉形之動物細胞或微生物獲得之其重組體或衍生物。本文中，彼等可得自經由單離自 人類或動物生物之完整免疫球蛋白且經以蛋白分解酵素予以處理之原態免疫球蛋白。木瓜酶將原態免疫球蛋白分解為Fab與Fc區，而胃蛋白酶處理導致pF’c與F(ab)2之生成。該等片段可進行尺寸排阻層析以單離Fc或pF’c。
較佳為，人類衍生之Fc區係得自微生物之重組免疫球蛋白Fc區。
此外，免疫球蛋白Fc區可呈具有原態糖鏈、相較於原態形式糖鏈增加、或相較於原態形式糖鏈減少之形式，或可呈去糖基化之形式。免疫球蛋白Fc糖鏈之增加、減少或移除，可利用此項技術領域中常見之方法達成，例如化學法、酵素法及使用微生物之遺傳工程法。本文中，從Fc區移除糖鏈導致對補體(c1q)結合親和力之急遽下降，及抗體依賴性細胞傳介之細胞毒性或補體依賴性細胞毒性之下降或喪失，從而不誘發不必要之活體內免疫反應。就此而論，呈去糖基化或無糖基化形式之免疫球蛋白Fc，可能更適合本發明目的而作為藥物載劑。
本文所用之去糖基化係指從Fc區酵素性移除糖部分，而無糖基化係指原核生物，較佳為大腸桿菌，所產生之非糖基化形式之Fc區。
同時，免疫球蛋白Fc區可衍生自人類或包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠與天竺鼠之其他動物，較佳為得自人類。此外，免疫球蛋白Fc區可為衍生自IgG、IgA、IgD、IgE與IgM，或由其組合或其雜合體(hybrids)製造之Fc區。較佳地，其係衍生自人類血液中最 豐富蛋白質中之IgG或IgM，及最佳地，衍生自IgG，其已知增強配體結合蛋白之半衰期。
另一方面，本文所用之組合，係指編碼相同來源之單鏈免疫球蛋白Fc區之多肽與不同來源之單鏈多肽間之鏈結，以形成二聚體或多聚體。亦即，二聚體或多聚體可由選自由IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc與IgE Fc片段所成組群之兩個或兩個以上片段形成。
本文所用之“雜合體”一詞係指於單鏈免疫球蛋白Fc區中，存在編碼不同來源的兩個或兩個以上免疫球蛋白Fc區之序列。於本發明中，可能有各種類型之雜合體。亦即，雜合體功能區可由選自由IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc與IgD Fc之CH1、CH2、CH3、與CH4所成組群之一至四個功能區組成，及可包含絞鏈區。
另一方面，IgG分成IgG1、IgG2、IgG3、與IgG4等亞型，本發明包括其組合與雜合體。較佳者為IgG2與IgG4亞型，最佳者為罕見具有例如補體依賴性細胞毒性(CDC)之效應子功能之IgG4的Fc區。亦即，作為本發明之藥物載劑，最佳之免疫球蛋白Fc區為人類IgG4衍生之非糖基化Fc區。人類衍生之Fc區比非人類衍生之Fc區更佳，後者可能於人體內起抗原作用，並引起例如產生對抗該抗原之新抗體等不良免疫反應。
於本發明中，非肽基聚合物係指生物相容性聚合物，其包含由胜肽鍵除外之任何共價鍵彼此連接之兩個或兩個以上重複單元。此類非肽基聚合物可具有兩個 端點或三個端點。
有用於本發明之非肽基聚合物可為選自由例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化之多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯乙醚、聚乳酸(PLA)與聚乳酸-乙醇酸(PLGA)之生物可降解聚合物，脂質聚合物，幾丁質，玻尿酸、與其組合所成組群，及較佳為聚乙二醇。此外，此項技術領域中已知之其衍生物及容易利用此項技術領域中已知方法製備之衍生物，可涵蓋於本發明範圍之內。
利用習知框架內融合法得到之融合蛋白質中所用之肽基連接子，具有於體內容易被蛋白分解酵素切割之缺點，因此如預期無法獲得藉由載劑增加活性藥物血清半衰期之充分功效。然而，於本發明中，可使用非肽連接子以及肽基連接子製備接合物。於非肽基連接子中，可使用對蛋白分解酵素具抗性之聚合物，以維持肽之血清半衰期與載劑類似。因此，可使用任何非肽基聚合物而不受限，只要是具前述功能之聚合物即可，亦即，對體內蛋白分解酵素具抗性之聚合物。該非肽基聚合物具有範圍為1至100kDa，較佳為1至20kDa之分子量。
連接於免疫球蛋白Fc區之本發明非肽基聚合物，可為一種聚合物或不同類型聚合物之組合。
用於本發明之非肽基聚合物具有能結合於免疫球蛋白Fc區與蛋白質藥物之反應性基團。
於該非肽基聚合物兩端皆具有反應性基 團，其較佳為選自由反應性醛基、丙醛基、丁醛基、順丁烯二醯亞胺基與琥珀醯亞胺衍生物所成組群。琥珀醯亞胺衍生物可為琥珀醯亞胺基丙酸酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺羧甲基、或琥珀醯亞胺基碳酸酯。特別是，當非肽基聚合物於其兩端具有反應性醛基時，能有效地以最少之非特異性反應，於兩端連接生理活性多肽與免疫球蛋白。經由醛鍵利用還原性烷化產生之最終產物較經由醯胺鍵所連接者更為穩定。醛反應性基團於低pH選擇性地結合於N端，於高pH(例如pH 9.0)結合於離胺酸殘基，以形成共價鍵。
非肽基聚合物兩端之反應性基團可彼此相同或不同。舉例而言，非肽基聚合物可於一端擁有順丁烯二醯亞胺基，於另一端為醛基、丙醛基或丁醛基。使用其兩端具有反應性羥基之聚乙二醇作為非肽基聚合物時，可利用已知化學反應使羥基活化成為各種反應性基團，或可使用具有市售可得經修飾之反應性基團之聚乙二醇，以製備本發明之接合物。
長效分泌性肽接合物之種類與製法已於韓國專利案No.10-1058290、10-1231431、與10-1058315中詳細說明。
於本發明之具體實例中，以PEG修飾咪唑-乙醯基艾塞那肽-4(CA艾塞那肽-4)之離胺酸(Lys)，且將經PEG修飾之艾塞那肽-4連接於免疫球蛋白Fc，從而製備長效艾塞那肽-4接合物(實施例9)。
本發明之此等長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽顯著增加活體內功效持續時間，且顯示類似之活體內半衰期。因此，其同步給藥有用於治療糖尿病。
本發明之長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之同步給藥，相較於單一給藥，可展現調控血糖值及改善血液脂質之優異效果。於本發明之一具體實例中，證實了長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽(亦即，艾塞那肽-4)接合物之同步給藥，可改善脂質毒性與葡萄糖毒性，因而維持β細胞質量，並進一步抑制糖尿病之進展。此等結果建議，根據本發明之長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之複合組成物，或該等接合物之同步給藥，可顯著減少與血清脂質值增加相關之脂質毒性，及與由於未充分調控血糖值而血糖值增加相關之葡萄糖毒性，彼等為單一給藥胰島素或促胰島素肽後，於一些糖尿病病患中產生之副作用；以及再者經由預防胰臟β細胞功能異常及/或增加胰臟β細胞質量，可顯著緩和糖尿病之進展，從而導致糖尿病之改善、治療、與預防及糖尿病預後之改善。
本發明組成物之特徵在於長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之同步給藥。
進行本發明長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之同步給藥時，長效胰島素類似物接合物作用於胰島素受體，同時長效促胰島素肽接合物作用於類升糖素肽-1受體，俾使相較於單一給藥，血糖值下降 並維持穩定血糖值。該等接合物之同步給藥具有減少可由胰島素單一給藥所誘發之低血糖症與體重增加之風險之效果，及由於促胰島素肽之作用，亦減少總胰島素之劑量。有亦可減少促胰島素肽(例如艾塞那肽-4)之劑量，以防止由艾塞那肽-4之單一給藥引起之例如噁心與嘔吐之不良作用之優點。使用長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物，顯著增加血液半衰期及活體內功效之持續時間，俾使減少治療頻率，而改善受每日注射之苦的慢性病患之生活品質。因此，對於治療糖尿病非常有用。再者，本發明之醫藥組成物顯現優異之活體內功效之持續時間與力價，且於同步給藥時，劑量可大幅減少。
再者，不同於傳統調配劑，本發明組成物之特徵在於可緩和由於糖尿病病患中產生之胰臟β細胞功能喪失或細胞凋亡而胰臟β細胞質量之減少。經由脂質毒性與葡萄糖毒性之下降與互補作用，可降低β細胞功能與質量之減少，因而抑制糖尿病之進展。由此，本發明之組成物可緩和糖尿病病患中胰臟細胞之副作用。
長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物可同時、依序或反向(reversely)給藥，及可呈有效劑量之適當組合同時給藥。較佳地，長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物可分開貯存於個別容器中，然後同時、依序或反向給藥。
再者，為本發明同步給藥組成物之長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物，可呈糖尿病 治療套組之形式，其包含於單一容器或分開在個別容器中之該等接合物。該套組可包含醫藥上可接受之載劑及該套組之使用說明書。
再者，長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物可分別與促胰島素肽和胰島素同步給藥。長效胰島素類似物接合物可與促胰島素肽，如GLP-1促效劑[例如，依克那肽、利拉魯肽(Liraglutide)、利西那肽(Lixisenatide)]同步給藥，以及長效促胰島素肽接合物可與胰島素和胰島素類似物、基礎胰島素同步給藥。
本文所用之“糖尿病”一詞係指由胰島素分泌不足或胰島素功能異常引起之代謝性疾病。進行本發明組成物之同步給藥對象，以調控血糖值，從而治療糖尿病。又，本發明組成物可作為糖尿病治療劑用，俾使具有胰臟β細胞之正常功能，維持與增加細胞質量，及提供對潛在β細胞壓力之安全性。此外，本發明之組成物可顯著減少導致β細胞之功能與質量減少之脂質毒性與葡萄糖毒性，及可緩和糖尿病之進展。
本文所用之“預防”一詞係指藉之經由本發明組成物之同步給藥而遏制或延遲糖尿病發生之所有作用(actions)，而“治療”一詞係指藉之經由本發明組成物之同步給藥而使糖尿病病徵有更佳轉變或有利修正之所有作用。該糖尿病之治療可應用至可能具有糖尿病之任何哺乳動物，其實例包括人類與靈長類動物以及家畜，例如，惟不限於，牛、豬、綿羊、馬、狗、與貓，較佳為人類。
本文所用之“給藥(adminstration)”一詞係指利用特定適當方法引入預定量之物質至病患中。只要能到達所期望之組織，該組成物可經由任何常見途徑給藥。涵蓋多種給藥模式，包括腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、經口、局部、鼻腔、肺內與直腸內，惟本發明不受限於該等例示給藥模式。然而，由於肽類經口給藥後立即消化分解，因此供經口給藥組成物之活性成分必須經塗覆或調配，以保護其對抗於胃中降解。較佳地，該組成物可呈注射用形式給藥。此外，長效試劑可使用能運送活性成分進入標靶細胞之特定裝置給藥。
再者，本發明之醫藥組成物可利用數個相關因素予以決定，該等因素包括欲治療疾病之類型，給藥途徑，病患年齡、性別、體重與疾病嚴重性，以及作為活性成分之藥物類型。
再者，本發明之醫藥組成物可包含醫藥上可接受之載劑。本文所用之“醫藥上可接受之載劑”一詞係指不對生物體引起顯著刺激及不消除所給藥化合物之生物活性與性質之載劑或稀釋劑。用於經口給藥時，醫藥上可接受之載劑可包括黏合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、助溶劑、分散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑、與調味劑。用於注射用製劑時，醫藥上可接受之載劑可包括緩衝劑、保藏劑、止痛劑、助溶劑、等滲劑、與安定劑。用於局部給藥之製劑，醫藥上可接受之載劑可包括基劑、賦形劑、潤滑劑、與保藏劑。本發明醫藥組成物可與上述醫藥上可 接受載劑組合，調配成各種劑型。舉例而言，用於經口給藥時，醫藥組成物可調配成錠劑、片劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或薄片。用於注射用製劑時，醫藥組成物可調配為呈單劑劑量型之安瓿或多劑量容器。醫藥組成物亦可調配成溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊與長效製劑。
另一方面，適用於調配劑之載劑、賦形劑、與稀釋劑之實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、褐藻膠、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂與礦物油。此外，醫藥調配劑可進一步包含填充劑、抗凝聚劑、潤滑劑、潤濕劑、調味劑、與防腐劑。
於另一態樣中，本發明提供用於預防或治療糖尿病之方法，該方法包括給藥具糖尿病或具糖尿病風險之對象包含長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之組成物之步驟。
於一具體實例中，本發明提供用於在糖尿病病患中減少選自由脂質毒性、葡萄糖毒性、胰臟β細胞功能異常與胰臟β細胞質量減少所成組群之一或多種胰臟β細胞副作用之方法，該方法包括給藥罹患糖尿病病患含有長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之該組成物之步驟。
給藥步驟可利用長效胰島素類似物接合物 與長效促胰島素肽接合物之同步給藥進行，惟不受限於，同時、依序或反向，該等接合物可呈有效劑量之適當組合同時給藥。
儘管僅一週給藥一次，包含本發明長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物二者之組成物可展現血糖值之優異改善，且不引起體重增加之副作用，因此該組成物可用於糖尿病之預防或治療。
於一具體實例中，本發明提供用於在糖尿病病患中減少脂質毒性及/或葡萄糖毒性之方法，該方法包括給藥罹患糖尿病病患含有長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之該組成物之步驟。
於一具體實例中，本發明提供用於改良胰臟β細胞功能及/或保護及/或增加胰臟β細胞質量之方法，該方法包括給藥罹患糖尿病病患含有長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之該組成物之步驟。
[發明模式]
下文中，參照實施例更具細節地說明本發明。然而，該等實施例僅供說明用途，本發明不擬受該等實施例所侷限。
實施例1：單鏈胰島素類似物表現載體之製備
為了製備胰島素類似物，各類似物於A鏈或B鏈上具有一個胺基酸改變，乃使用可得到之原態胰島素表現載體作為模板，合成前置與反置寡核苷酸(表2)，進行PCR以 擴增個別類似物基因。
於A鏈或B鏈中經修飾之各胺基酸序列及各個類似物之名稱列於下文表1。亦即，類似物1於A鏈位置1具有丙胺酸取代甘胺酸，及類似物4於B鏈位置8具有丙胺酸取代甘胺酸。
用於胰島素類似物擴增之引子列於下文表2。
用於胰島素類似物擴增之PCR係於95℃，30秒、55℃，30秒、與68℃，6分鐘之條件下進行18個循環。為了呈細胞內包涵體表現該等條件下得到之胰島素類似物片段，乃將彼等各插入至pET22b載體中，如此得到之表現載體分別稱為pET22b-胰島素類似物1至9。該等個別表現載體包含於T7啟動子調控下編碼胰島素類似物1 至9之胺基酸序列之核酸，因此於宿主細胞中分別呈包涵體表現胰島素類似物。
胰島素類似物1至9之DNA序列與蛋白質序列提供於下文表3。
實施例2：重組胰島素類似物融合肽之表現
於T7啟動子調控下，表現重組胰島素類似物。將各個重組胰島素類似物表現載體轉形至大腸桿菌BL21-DE3[大腸桿菌B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)gal DE3；Novagen]中。依照Novagen推薦之程序進行轉形。將用個別重組表現載體轉形之單一菌落接種於含安比西林(ampicillin)(50/ml)之2X盧里亞培養液[Luria Broth(LB)]培養基中，於37℃培養15小時。將重組菌株之各培養液與含30%甘油之2X LB培養基，以1：1(v/v)之比例混合，然後將其各1ml分裝至低溫保存管中，並貯存於-140℃。將該等試樣作為細胞原種(stocks)以供生產重組融合蛋白質用。
為了表現重組胰島素類似物，將各1小瓶之細胞原種解凍，然後接種於500ml之2X盧里亞培養液中，於37℃振盪培養14至16小時。當OD600值達到5.0或更高時，終止培養，並使用該培養液作為種培養。將該種培養接種至含17L發酵培養基之50L發酵槽(MSJ-U2,B.E.MARUBISHI,Japan)中，開始最初之批次式發酵。培養條件維持於37℃，空氣流速20L/min(1vvm)，攪拌速率500rpm及以氨水調整pH至6.70。發酵以培養液中之營養分耗盡時，進一步添加饋料液之饋料批次式模式進行。利用測量OD600監控細胞生長。OD600值高於100或100以上時，引入IPTG至最終濃度為500M。引入後，繼續進行培養約23至25小時。終止培養後，使用離心機收集重組菌株，並貯存於-80℃備用。
實施例3：重組胰島素類似物之回收與再摺疊
為了改變於實施例2中所表現之重組胰島素類似物成為可溶解形式，乃使細胞崩解，隨後再摺疊。使100g(濕重)細胞沈澱物再懸浮於1L溶解緩衝液[50mM Tris-HCl(pH 9.0)、1mM EDTA(pH 8.0)、0.2M NaCl與0.5%Triton X-100]中。使用微射流處理機M-110EH(AC Technology Corp.Model M1475C)，於15,000psi操作壓力下，崩解細胞。使如此崩解之細胞溶解物於7,000rpm與4℃離心20分鐘。丟棄上清液，使沈澱物再懸浮於3L洗滌緩衝液(0.5%Triton X-100與50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2M NaCl、1mM EDTA)中。於7,000rpm與4℃離心20分鐘後，使細胞沈澱物再懸浮於蒸餾水中，隨後以相同方式離心。使如此得到之沈澱物再懸浮於400ml緩衝液(1M甘胺酸、3.78g半胱胺酸-HCl、pH 10.6)中，並於室溫攪拌1小時。為了回收如此再懸浮之重組胰島素類似物，乃添加400mL之8M尿素，於40℃攪拌1小時。為了再摺疊經溶解之重組胰島素類似物，於7,000rpm與4℃進行離心30分鐘，收集上清液。使用蠕動泵，於流速1000ml/hr下，對其添加2L蒸餾水，同時於4℃攪拌16小時。
實施例4：陽離子結合層析法純化
將再摺疊之試樣裝填至已用含45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液平衡之Source S(GE healthcare)管柱上，然後以10倍管柱體積量，線性梯度0%至100%之含 0.5M氯化鉀與45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液溶洗該等胰島素類似物蛋白質。
實施例5：胰蛋白酶與羧肽酶B處理
使用去鹽管柱，從經溶洗之試樣移除鹽類，並以緩衝液(10mM Tris-HCl、pH 8.0)更換其緩衝液。對於所得試樣蛋白質，添加相當於1000莫耳比之胰蛋白酶與相當於2000莫耳比之羧肽酶B，然後於16℃攪拌16小時。使用1M檸檬酸鈉(pH 2.0)使pH降至3.5，以終止反應。
實施例6：陽離子結合層析法純化
將如此反應之試樣裝填至已用含45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液平衡之Source S(GE healthcare)管柱上，然後以10倍管柱體積量，線性梯度0%至100%之含0.5M氯化鉀與45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液溶洗該等胰島素類似物蛋白質。
實施例7：陰離子結合層析法純化
使用去鹽管柱，從經溶洗之試樣移除鹽類，並以緩衝液(10mM Tris-HCl、pH 7.5)更換其緩衝液。為了從實施例6所得試樣中單離純胰島素類似物，乃將該試樣裝填至已用10mM Tris(pH 7.5)緩衝液平衡之陰離子交換管柱(Source Q：GE healthcare)上，以10倍管柱體積量，線性梯度0%至100%之含0.5M氯化鈉之10mM Tris(pH 7.5)緩衝液溶洗該胰島素類似物蛋白質。
利用蛋白質電泳(SDS-PAGE)與高壓層析法(HPLC)分析經如此純化之胰島素類似物之純度，並利用 肽圖譜定位與各波峰之分子量分析鑑定諸胺基酸之修飾。
結果，發現各胰島素類似物於其胺基酸序列中具有期望之改變。
實施例8：長效胰島素類似物之製備
於此實施例中，製備原態胰島素序列類似物(於A鏈位置14為Glu)之長效接合物作為代表性胰島素類似物。
使用3.4K ALD2 PEG(NOF，Japan)，使胰島素類似物β鏈之N端聚乙二醇化；以5mg/ml之胰島素類似物濃度，1：4之胰島素類似物與PEG莫耳比，使胰島素類似物與PEG於4至8℃反應約2小時。就此而論，反應係於pH 6.0之50mM檸檬酸鈉與40至60%異丙醇中進行。添加3.0至20.0mM氰基硼氫化鈉作為還原劑，令其反應。以SP-HP(GE Healthcare，USA)管柱純化反應液，係使用含檸檬酸鈉(pH 3.0)與乙醇之緩衝液及KCl濃度梯度。
為了製備胰島素類似物-免疫球蛋白Fc片段接合物，將該純化之單-聚乙二醇化胰島素類似物與免疫球蛋白Fc片段，以1：1至1：2之莫耳比，總蛋白質濃度約20mg/ml，於25℃反應12至16小時。就此而論，反應緩衝液條件為100mM HEPES，pH 8.2，添加20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。因此，製備出於Fc片段N終端聚乙二醇化(PEG化)之胰島素類似物接合物。
終止反應後，將反應液裝填至Q HP(GE Healthcare，USA)管柱上，以Tris-HCl(pH 7.5)緩衝液及NaCl濃度梯度進行該胰島素類似物-免疫球蛋白-Fc片段接合物 之初步純化。
之後，使用Source 15ISO(GE Healthcare，USA)作為第二管柱，得到胰島素類似物-免疫球蛋白Fc片段接合物。就此而論，係使用含硫酸銨濃度梯度之Tris-HCl(pH 7.5)溶洗該胰島素類似物-免疫球蛋白Fc片段接合物。
實施例9：長效艾塞那肽-4接合物之製備
使用咪唑-乙醯基艾塞那肽-4(CA艾塞那肽-4，AP，USA)，使3.4k PropionALD(2)PEG與CA艾塞那肽-4之離胺酸(Lys)反應。於兩個Lys異構物波峰中，使用具較多反應且容易與N端異構物波峰區別之後一異構物波峰(Lys27之位置異構物)供偶合反應用。
反應在肽：免疫球蛋白Fc之莫耳比1：8，總蛋白質濃度60/，於4℃，進行20小時。該反應係於100mM K-P(pH 6.0)之溶液中進行，添加20mM SCB作為還原劑。通過兩個純化管柱純化偶合反應液。首先，使用SOURCE Q(XK 16mL，Amersham Biosciences)，以移除大量未參與偶合反應之免疫球蛋白Fc。使用20mM Tris(pH 7.5)與具鹽梯度之1M NaCl，先將結合力相對軟弱之免疫球蛋白Fc溶洗出來，然後隨即溶洗出艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc。經由此第一個純化程序，免疫球蛋白Fc已被若干程度地移除，惟由於免疫球蛋白Fc與艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc於離子交換管柱中彼此具有類似之結合力，因此不能完全互相分離。於是，根據此二物料間之疏水性差異，進行第二次純化。於SOURCE ISO(HR 16mL，Amersham Biosciences)中，使用20mM Tris(pH 7.5)與1.5M硫酸銨，使第一次純化之試樣進行偶合，在逐漸減少之硫酸銨濃度下，進行試樣混合物之溶洗。於HIC管柱中，具弱結合力之免疫球蛋白Fc首先被溶洗出來，然後具強結合力之艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc試樣較晚被溶洗出。由於彼等具顯著不同之疏水性，因此比在離子交換管柱中更容易彼此分離。
管柱：SOURCE Q(XK 16，Amersham Biosciences)
流速：2.0/分鐘(min)
梯度：A0→25%70分鐘B(A：20mM Tris pH 7.5，B：A+1M NaCl)
管柱：SOURCE ISO(HR 16，Amersham Biosciences)
流速：7.0/min
梯度：B 100→0%60分鐘B(A：20mM Tris pH 7.5，B：A+1.5M硫酸銨)
實施例10：經由長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步給藥於第二型糖尿病小鼠中調控血糖與體重變化(△體重)之功效
為了測試經由包含實施例8與9製備之長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之該等組成物之給藥，或該長效胰島素類似物接合物與該長效艾塞那肽-4接合物同步給藥之活體內功效，乃使用第二型糖尿病之db/db小鼠。由於db/db小鼠(BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd小鼠)經由移除瘦素受體，顯現類似人類之糖尿病症狀，因而 於此實施例中予以使用。
使用26G注射器，從8週齡db/db小鼠之尾靜脈採取1至2滴血液，然後使用血糖儀(OneTouch Ultra,LifeScan,Inc.,USA)測量血糖值。根據所測量之血糖(350至600/)決定糖尿病之誘發。將已誘發糖尿病之小鼠分成G1、G2、G3、G4、與G5五組，各組5隻或6隻小鼠。
該等群組分成未治療之對照組(媒劑)、長效胰島素類似物接合物治療組(8.8nmol/kg)、長效艾塞那肽-4接合物治療組(0.36nmol/kg)、長效胰島素類似物接合物(2.2nmol/kg)與長效艾塞那肽-4接合物(0.36nmol/kg)治療組、及長效胰島素類似物接合物(8.8nmol/kg)與長效艾塞那肽-4接合物(0.36nmol/kg)治療組。以上述測試物料治療5週後，測量各組之糖化血色素(HbA1c)值。糖化血色素於紅血球中正常地由葡萄糖與血紅素反應而形成。當血糖值維持高值時，糖化血色素值亦增加。小鼠之糖化血色素值反映4至5週之平均血糖值，因此於測試物料有用於降血糖強度之測量。此外，計算試驗動物於藥物治療前與實驗最後一天之體重變化(△BW)。
結果，長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步治療，顯示糖化血色素值減少(第1圖)，相較於長效胰島素類似物接合物或長效艾塞那肽-4接合物之單一給藥，顯著改善。此外，雖然胰島素類似物接合物之給藥劑量降至1/4，仍維持同步給藥之效果。
△體重之測量結果顯示長效胰島素類似物 接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步治療，相較於長效胰島素類似物接合物之單一給藥，顯現緩和體重增加之效果(第2圖)。此外，雖然長效胰島素類似物接合物之給藥劑量降至1/4，仍顯著增加緩和體重增加之效果。
該等結果顯示，相較於單一給藥，本發明長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步給藥展現調控血糖值之優異效果。此外，即使降低胰島素類似物接合物之給藥劑量，仍維持其經由同步給藥之調控血糖值之效果。再者，當長效胰島素類似物接合物之給藥劑量降至1/4時，係顯著減少體重增加，顯示長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步給藥，由於胰島素劑量減少，顯著降低低血糖症以及體重增加之風險。
實施例11：經由長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步給藥於第二型糖尿病小鼠中維持β細胞質量之功效
為了測試經由給藥包含長效艾塞那肽-4接合物之組成物，或經由同步給藥長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物[彼等為長效胰島素類似物接合物(長效胰島素衍生物接合物)與長效艾塞那肽-4接合物之實例]之活體內功效，乃使用第二型糖尿病之db/db小鼠。
用於本實施例之胰島素衍生物接合物，係使用包含表1中之類似物8(A14Y→E)之長效艾塞那肽-4接合物作為胰島素類似物，而咪唑-乙醯基艾塞那肽-4(CA艾塞那肽-4)係用作為長效促胰島素肽。以PEG修飾艾塞那 肽-4之離胺酸，並將經PEG修飾之艾塞那肽-4連接於免疫球蛋白Fc，以製造長效艾塞那肽-4接合物。特別是，CA艾塞那肽-4與胰島素類似物8係以1.01至1：50之莫耳比反應，以製造其接合物。
由於db/db小鼠(BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd小鼠)經由移除瘦素受體，顯現類似人類之糖尿病症狀，因而於此實施例中使用經如此處理之小鼠。
使用26G注射器，從12週齡db/db小鼠之尾靜脈採取1至2滴血液，然後使用血糖儀(OneTouch Ultra,LifeScan,Inc.,USA)測量血糖值。根據所測量之血糖(無糖尿病之正常範圍為約100至150mg/dl；為了實施例之準確性，挑選及使用血糖值大於350mg/dl之小鼠)決定糖尿病之誘發。將已誘發糖尿病之小鼠分成G1、G2、G3、G4、G5、G6與G7七組，各組7隻或8隻小鼠。
該等群組分成未治療之對照組(媒劑)、依劑量(4.2nmol/kg、8.4nmol/kg)之兩組長效胰島素類似物接合物治療組、長效艾塞那肽-4接合物治療組(0.36nmol/kg)、長效胰島素類似物接合物(4.2nmol/kg)與長效艾塞那肽-4接合物(0.36nmol/kg)之同步給藥組、及長效胰島素類似物接合物(8.4nmol/kg)與長效艾塞那肽-4接合物(0.36nmol/kg)治療組之同步給藥組。
以上述劑量間隔2天重複上述測試物料給藥12週後，測量各組之糖化血色素(HbA1c)值。糖化血色素為正常存在紅血球中之結合葡萄糖之血紅素形式。當血 糖值維持高值時，糖化血色素值亦增加。小鼠之糖化血色素值反映4至5週之平均血糖值，因此有用於測試物料降血糖強度之測量。於12週重複藥物給藥後，從小鼠眼靜脈收集血液，從所收集之血清測量血清三酸甘油酯濃度。於各實驗對象之剖檢後，採取胰臟以測量β細胞質量。
結果，長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步給藥，顯示糖化血色素值之減少(第5圖)，相較於長效胰島素類似物接合物或長效艾塞那肽-4接合物之單一給藥，為顯著改善。
測量血清中三酸甘油酯之濃度，結果顯示，於長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步給藥組中，三酸甘油酯之濃度以劑量依賴性方式減少(第4圖)。
各藥物治療組β細胞質量之比較結果證實，相較於對照組，長效胰島素類似物接合物之單一治療組、長效艾塞那肽-4接合物之單一治療組、及該二接合物之同步給藥組，展現增加之β細胞質量(第3圖)。此外，相較於長效胰島素類似物接合物或長效艾塞那肽-4接合物之單一治療組，該二藥物之同步給藥組顯示加乘效應。基於此等結果，經由長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步給藥，降低脂質毒性與葡萄糖毒性。
該等結果顯示，相較於單一給藥，本發明長效胰島素類似物接合物與長效艾塞那肽-4接合物之同步給藥，展現調控血糖值與改良血清脂質之優異效果。此外， 該等結果表明，根據本發明之長效胰島素類似物接合物與長效促胰島素肽接合物之複合組成物，或該二接合物之同步給藥，可顯著減少與血清脂質值增加相關之脂質毒性，及與由於未充分調控血糖值而血糖值增加相關之葡萄糖毒性，彼等為單一給藥胰島素或促胰島素肽後，於一些糖尿病病患中產生之副作用；再者經由預防胰臟β細胞功能異常及/或胰臟β細胞質量增加，可大幅緩和糖尿病之進展，從而導致糖尿病之改善、治療、與預防及糖尿病預後之改善。
根據以上敘述，所屬技術領域中具有通常知識者將理解，本發明可於不改變其技術精神或必要特徵下，以不同具體形式實施。因此，應理解的是，上述具體實例不具限制性，而為所有態樣之說明，衍生自申請專利範圍或其等同物中所界定主題之所有改變與修飾，亦擬涵蓋於本發明範圍之內。
<110> 韓美藥品股份有限公司(HANMI PHARM.CO.,LTD.)
<120> 包含長效胰島素類似物接合物及長效促胰島素肽接合物之治療糖尿病組成物(COMPOSITION FOR TREATING DIABETES COMPRISING LONG-ACTING INSULIN ANALOGUE CONJUGATE AND LONG-ACTING INSULINOTROPIC PEPTIDE CONJUGATE)
<130> KPA140522-KR
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 12
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 類似物9
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 類似物9
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 胰島素A鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 胰島素B鏈
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<213> 人工序列
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<223> GLP-1(7-37)
<400> 39
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<213> 人工序列
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<223> 艾塞那肽-3(exendin-3)
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 艾塞那肽-4(exendin-4)
<400> 41
由於本案的圖為實驗數據圖，並非本案的代表圖。
故本案無指定代表圖。

Claims (26)

  1. 一種用於預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含：經由連接子或共價鍵連接胰島素類似物與能延長胰島素類似物活性持續時間之生物相容性物料形成之長效胰島素類似物接合物；及經由連接子或共價鍵連接促胰島素肽與能延長促胰島素肽活性持續時間之生物相容性物料形成之長效促胰島素肽接合物。
  2. 一種用於在糖尿病病患中減少選自由脂質毒性、葡萄糖毒性、胰臟β細胞功能異常與胰臟β細胞質量減少所成組群之一或多種胰臟β細胞副作用之醫藥組成物，其包含：經由連接子或共價鏈結連接胰島素類似物與能延長胰島素類似物活性持續時間之生物相容性物料形成之長效胰島素類似物接合物；及經由連接子或共價鏈結連接促胰島素肽與能延長促胰島素肽活性持續時間之生物相容性物料形成之長效促胰島素肽接合物。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之組成物，其中該胰島素類似物係原態胰島素之一或多個胺基酸經由選自由取代、加成、缺失、修飾與其組合所成組群之變化所製備之物料。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之組成物，其中該胰島素類似物具有一或多個胺基酸之突變或缺失。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之組成物，其中該胰島素類似物係經由選自由於B鏈位置1、2、3、5、8、10、12、16、23、24、25、26、27、28、29、與30及於A鏈位置1、2、5、8、10、12、14、16、17、18、19與21之胺基酸所成組群之一或多個胺基酸以其他胺基酸取代，或經由其缺失所製備。
  6. 如申請專利範圍第1或2項所述之組成物，其中該促胰島素肽係選自由GLP-1、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、其促效劑、其衍生物、其片段、其變異體、與其組合所成組群。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之組成物，其中該促胰島素肽係經由以選自由去胺基組胺醯基、二甲基組胺醯基、β-羥基咪唑丙醯基、4-咪唑乙醯基、與β-羧基咪唑丙醯基所成組群之物質取代促胰島素肽N終端之組胺酸殘基所製備。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之組成物，其中該促胰島素肽係選自由原態艾塞那肽-4、經由刪除艾塞那肽-4之N終端胺基所製備之艾塞那肽-4衍生物、經由以羥基取代艾塞那肽-4之N終端胺基所製備之艾塞那肽-4衍生物、經由以二甲基修飾艾塞那肽-4之N終端胺基所製備之艾塞那肽-4衍生物、經由刪除艾塞那肽-4第一個胺基酸(組胺酸)之α-碳所製備之艾塞那肽-4衍生物、經由以絲胺酸取代艾塞那肽-4之第12個胺基酸(離胺酸)所製備之艾塞那肽-4變異體、及經由以精胺酸取 代艾塞那肽-4之第12個胺基酸(離胺酸)所製備之艾塞那肽-4變異體所成組群。
  9. 如申請專利範圍第1或2項所述之組成物，其中該長效胰島素類似物接合物係經由作為連接子之非肽基聚合物連接以麩胺酸取代胰島素A鏈位置14之胺基酸所製備之胰島素類似物與免疫球蛋白Fc區所形成，及該長效促胰島素肽接合物係經由作為連接子之非肽基聚合物連接作為促胰島素肽之咪唑-乙醯基艾塞那肽-4與免疫球蛋白Fc區所形成。
  10. 如申請專利範圍第1或2項所述之組成物，其中該生物相容性物料係選自由聚乙二醇、脂肪酸、膽固醇、白蛋白與其片段、白蛋白結合物料、特殊胺基酸序列重複單元之聚合物、抗體、抗體片段、FcRn結合物料、活體結締組織或其衍生物、核苷酸、纖維結合素、運鐵蛋白、糖類、及聚合物所成組群。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之組成物，其中該胰島素類似物或該促胰島素肽係經由選自由聚乙二醇、脂肪酸、糖類、聚合物、低分子量化合物、核苷酸、與其組合所成組群之連接子而連接於該生物相容性物料。
  12. 如申請專利範圍第1或2項所述之組成物，其中該胰島素類似物或該促胰島素肽係經由連接子連接於該生物相容性物料，以及該生物相容性物料係FcRn結合物料，其中該連接子係肽連接子或選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇丙二醇共聚物、聚氧乙基化之多元醇、 聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、與其組合所成組群之非肽連接子。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之組成物，其中該FcRn結合物料包含免疫球蛋白Fc區。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之組成物，其中該非肽連接子之各端分別結合於該生物相容性物料及該胰島素類似物或該促胰島素肽之胺基或硫醇基。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區無糖基化。
  16. 如申請專利範圍第13項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區係由選自由CH1、CH2、CH3、與CH4功能區所成組群之1至4個功能區組成。
  17. 如申請專利範圍第13項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區進一步包含絞鏈區。
  18. 如申請專利範圍第13項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區係衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、或IgM之Fc區。
  19. 如申請專利範圍第13項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區係選自由IgG、IgA、IgD、IgE、與IgM所成組群之不同來源功能區之雜合體(hybrids)。
  20. 如申請專利範圍第13項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區係由相同來源功能區構成之單鏈免疫球蛋白所組成之二聚體或多聚體。
  21. 如申請專利範圍第1或2項所述之組成物，其進一步包含醫藥上可接受之載劑。
  22. 如申請專利範圍第1或2項所述之組成物，其中該長效胰島素接合物與該長效促胰島素肽接合物係同時、依序、或反向(reversely)給藥。
  23. 如申請專利範圍第2項所述之組成物，其中該組成物抑制糖尿病之進展。
  24. 如申請專利範圍第2項所述之組成物，其中該組成物改善罹患糖尿病對象之糖尿病預後。
  25. 一種用於預防或治療糖尿病之方法，該方法包括對罹患糖尿病或具罹患糖尿病風險之對象給藥如申請專利範圍第1項所述之組成物。
  26. 一種用於在不包括人類之糖尿病對象中減少選自由脂質毒性、葡萄糖毒性、胰臟β細胞功能異常與胰臟β細胞質量減少所成組群之一或多種胰臟β細胞副作用之方法，該方法包括給藥如申請專利範圍第2項所述之組成物至罹患糖尿病或具罹患糖尿病風險之該對象之步驟。
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