KR20220061057A - 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지속형 인슐린 아날로그 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 및 당뇨병 치료 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 조성물은 지속형 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 병용 투여를 통하여 인슐린 투여에 따른 체중 증가 억제와 인슐린 분비 펩타이드 투여에 따른 구토 및 메스꺼움 현상을 억제 및 인슐린 투여량을 낮추어 복약 순응도를 월등히 개선할 수 있다. 또한, 본 발명은 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 당뇨병 환자의 췌장 베타세포 부작용의 개선용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 환자의 췌장 베타세포 부작용 개선 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 당뇨 진행에 따른 췌장 베타 세포 기능 이상, 췌장 베타 세포 감소, 지질독성 (lipotoxicity), 당독성 (glucotocity)와 같은 부작용을 개선하는 것을 특징으로 한다.

Description

지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 조성물{Composition for Treating Diabetes Comprising Long-acting Insulin Analogue Conjugate and Long-acting Insulinotropic Peptide Conjugate}
본 발명은 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물, 및 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법에 관한 것이다.또한, 본 발명은 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 당뇨병 환자의 췌장 베타세포 부작용의 개선용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 환자의 췌장 베타세포 부작용 개선 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 당뇨 진행에 따른 췌장 베타 세포 기능 이상, 췌장 베타 세포 감소, 지질독성(lipotoxicity), 당독성(glucotoxicity)과 같은 부작용을 개선하는 것을 특징으로 한다.
인슐린은 췌장의 베타세포에서 분비되는 펩타이드로서 체내의 혈당을 조절하는데 매우 중요한 역할을 담당하는 물질이다. 이러한 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않아 혈중 포도당의 농도가 높아지는 대사질환을 당뇨병이라 한다. 인슐린이 제대로 분비되지 않거나 분비된 인슐린이 체내에서 제대로 작용하지 못하여 체내의 혈당이 조절되지 못하고 상승하는 경우를 제 2형 당뇨병이라고 하며, 췌장에서 인슐린을 분비하지 못하여 혈당이 상승하는 경우를 제 1형 당뇨병이라고 한다. 제 2형 당뇨병의 경우 화학물질을 주성분으로 하는 경구용 혈당 강하제를 이용하여 치료를 하며 일부 환자에는 인슐린을 사용하여 치료하기도 한다. 반면 제 1형 당뇨병의 경우에는 인슐린의 투여가 필수적으로 요구된다.
현재 많이 사용되고 있는 인슐린 치료법은 식사 전, 후에 주사를 통하여 인슐린을 투여하는 방법이다. 인슐린은 현재 주사약으로 나와있으며, 피하주사로 투여하는 것을 원칙으로 하고 있고, 작용 시간에 따라 투여방법이 다르다. 인슐린 주사 투여는 먹는 약에 비해서 혈당 강하 효과가 더 빠르게 나타나고, 먹는 약을 사용할 수 없는 환경에서도 안전하게 사용할 수 있으며, 용량의 제한도 없지만, 하루에 3번씩 지속적으로 사용되어야 하기 때문에 주사침에 대한 거부감, 투여방법의 어려움, 저혈당 증상, 장기적인 인슐린투여에 의해 발생하는 체중증가 현상 등이 단점으로 꼽히고 있다. 체중증가 현상은 심장혈관 질환의 위험도를 높이며, 혈당 조절기능을 저하시키는 부작용으로 이어질 수 있다. 한편, 인슐린 펩타이드 약물이 체내로 흡수된 이후, 약물의 혈중 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔으며, 그 예로 란투스 (Lantus, Insulin glargine; Sanofi Aventis)와 레버미어 (Levemir, Insulin detemir; Novo Nordisk) 등 지속성 인슐린이 개발되어 시판 및 상용화되었다. 상기 지속성 약물들은 인슐린 NPH (Neutral Protamine Hagedorn)와 다르게 수면상태의 저혈당 위험도를 낮추었고, 특히 레버미어의 경우 체중증가 현상을 완화시켰다. 하지만 여전히 하루 1회에서 2회의 투여용법이 단점으로 여겨지고 있다.
한편 인슐린 분비 펩타이드의 일종인 글루카곤 유사 펩타이드-1 (Glucagon like peptide 1, GLP-1)은 회장과 대장의 L-세포에서 분비되는 인크레틴 (incretin) 호르몬이다. 글루카곤 유사 펩타이드-1의 주요한 작용은 인슐린 분비를 증가시키며, 포도당의 농도에 따른 인슐린 분비 (Glucose dependent secretion)가 이루어져 저혈당이 발생하지 않는다. 이런 특징으로 제 2형 당뇨병의 치료방법으로 적용되나, 혈중 반감기가 2분 내외로 매우 짧기 때문에 약제로 개발하는데 큰 제약을 갖고 있다. 이에 따라 개발되어 시판되는 글루카곤 유사 펩타이드-1 (Glucagon like peptide-1) 작용제 (아고니스트)로서는 글리아 몬스터 도마뱀 (glia monster)의 침샘으로부터 정제된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체인 엑센딘(Exendin)-4가 있다. 이는 DPP-IV (Dipeptidyl peptidase-4)에 대한 저항성과 함께 글루카곤 유사 펩타이드-1 보다 높은 생리 활성을 가지며, 따라서 체내 반감기가 2-4시간으로 글루카곤 유사 펩타이드-1에 비해 길어진 체내 반감기를 가진다 (US 5,424,286). 그러나 DPP-IV의 저항성을 증가시키는 방법만으로는 충분한 생리활성의 지속기간을 기대할 수 없는데, 예를 들어 현재 시판되고 있는 엑센딘-4 (엑세나티드, exenatide)의 경우 환자에게 하루 2회 주사를 통해 투여되어야 하며, 투여에 따른 구토유발 및 메스꺼움 현상이 환자에게 큰 부담으로 작용되는 단점이 여전히 남아있다.
이러한 당뇨 질환은 시기적으로 차이는 있지만, 공통적으로 췌장 베타세포의 기능 상실 및 사멸에 의한 췌장 베타세포량(mass)의 감소를 유발한다.
지속적인 혈당 상승 시, 췌장 베타세포는 체내의 혈당을 정상수준으로 유지하기 위해 베타세포의 기능 강화 및 메스 증대를 기반으로 인슐린 분비를 증가시키지만, 이러한 분비 증가 작용에는 한계가 있다. 즉, 체내의 혈당을 정상으로 유지하기 위해 필요한 인슐린의 요구량이 췌장의 베타세포가 생산할 수 있는 인슐린보다 많다면, 결국 혈당이 올라감으로써 제 2형 당뇨의 진행이 심화된다.
임상학적으로 제 2형 당뇨는 인슐린 저항성, 인슐린 분비의 감소, 그리고 췌장 베타세포의 기능 장애 및 메스 감소 순으로 질환이 진행한다. 특히 베타세포의 기능 장애 및 메스 감소는 혈중 증가된 지질 및 당에 의해 촉진된다. 이러한 혈중 지질 및 당의 농도는 지질독성(lipotoxicity) 및/또는 당독성(glucotoxicity)을 유발함으로써 베타세포의 기능은 물론 인슐린의 작용을 약화하고, 긍극적으로는 제 2형 당뇨의 예후를 악화시킨다. 따라서 지질독성과 당독성의 억제는 베타세포 기능 및 메스 보존은 물론, 인슐린 저항성 개선을 통해 제 2형 당뇨의 진행을 획기적으로 완화할 수 있다.
인슐린은 췌장의 베타세포에서 분비되는 펩타이드로서 체내의 혈당을 조절하는 역할을 담당하는 물질이다. 따라서 베타 세포의 기능 이상 및 메스 감소는 체내 인슐린의 양 감소에 따른 혈당 증가와 밀접한 관련이 있다. 이렇게 인슐린의 분비가 저하된 당뇨 환자에게는 외재성 인슐린을 사용하여 치료하기도 한다. 선행 연구에 따르면 외재성 인슐린의 투여는 혈당 개선에 탁월한 효능을 보일 뿐만 아니라 췌장 베타세포의 과도한 인슐린 분비에 따른 스트레스 발생을 억제한다고 알려져 있다. 하지만, 외재성 인슐린의 투여는 체중 증가를 유발하는 큰 단점을 가지고 있는데, 이러한 체중 증가는 혈중 지질 농도 증가를 수반하기 때문에 잠재적으로 당뇨 예후를 악화시킬 가능성이 있다.
한편, 엑센딘-4를 포함하는 인슐린 분비 펩타이드의 일종인 글루카곤 유사 펩타이드-1(Glucagon like peptide 1, GLP-1) 수용체 아고니스트(agonist)는 제 2형 당뇨환자에게서 우수한 혈당 조절 및 체중 감소 효과를 가진 것으로 알려져 있다. 또한, GLP-1 수용체 아고니스트는 베타세포의 신생, 증식 및 분화는 물론, 베타세포의 사멸을 조절함으로써 베타세포량을 증가시킬 수 있다. 실제로 제 2형 당뇨가 유도된 설치류 모델에서 GLP-1 또는 엑센딘-4의 투여가 베타세포의 성장 및 분화를 자극하여 베타세포 메스가 증가되는 것이 확인된 바 있다. 하지만, GLP-1 수용체 아고니스트는 혈당조절을 위해 췌장 베타세포의 인슐린 분비를 지속적으로 자극하기 때문에, 잠재적으로 베타세포 스트레스 증가에 따른 기능저하 가능성 또한 내포하고 있다.
따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 단백질 약물의 활성을 유지하고 안정성 향상을 동시에 달성하는 기술로서, 종래 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 링커로 하여 상호 공유결합에 의해 연결시킨 지속형 단백질 결합체를 제안한 바 있고 (대한민국 등록 특허 제10-0725315호), 특히 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체 각각의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가됨을 확인한 바 있다 (대한민국 등록특허 제10-1058209호 및 제10-1330868호).
그러나, 여전히 안정적인 혈당 변화를 가져오는 양의 인슐린 또는 엑센딘-4의 투여시, 체중 증가 현상이 나타나거나 구토 및 메스꺼움 현상이 나타나는 문제점이 있어, 약물의 투여량과 횟수를 줄이면서도 당뇨병 치료효과가 우수한 치료방법의 개발이 필요하다. 또한, 이와 같은 연구는 생체 내 상기 생리활성 폴리펩타이드의 반감기 증가에 초점이 맞추어져 있었으며, 당뇨병 환자에게서 발생되는 나쁜 예후를 발생시키는 부작용인 췌장 베타세포의 기능 상실 및/또는 사멸에 의한 췌장 베타세포량 감소를 동시에 개선시킬 수 있는 방법에 대한 연구는 미비한 상태이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 당뇨병 치료 지속효과가 증가되는 동시에 구토유발 및 메스꺼움 현상을 줄일 수 있는 당뇨병 치료제 및 베타세포의 기능, 세포량 유지 및 증가와 동시에 잠재적 베타세포 스트레스로부터 안전한 당뇨병 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체와 인슐린 수용체를 동시에 자극하는 지속형 엑센딘-4 결합체와 지속형 인슐린 아날로그 결합체의 병용투여를 시도하였고, 이러한 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체 약물을 함께 사용할 때, 생체 내 지속성 및 안정성이 향상되고 두 약물의 투여 용량을 획기적으로 줄여서 안정적인 혈당 변화를 가져옴을 확인하였다. 또한, 글루카곤 유사 펩타이드-1 아고니스트 및 엑센딘-4, 또는 이의 유도체들의 특징인 구토 및 메스꺼움 현상을 개선하고, 인슐린 투여에 의한 체중 증가 현상을 지속형 엑센딘-4 결합체를 통하여 완화시킬 수 있음을 확인하였다. 더 나아가, 베타 세포의 기능과 메스를 감소시키는 주된 원인인 지질독성과 당독성을 획기적으로 감소시키며 또한 이를 바탕으로 당뇨의 진행을 완화시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 당뇨병에 걸릴 위험이 있거나 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 환자의 지질독성 (lipotoxicity), 당독성 (glucotoxicity), 췌장 베타세포 기능이상 및 췌장 베타세포량 감소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 췌장 베타세포 부작용 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 당뇨병에 걸릴 위험이 있거나 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 환자의 지질독성, 당독성, 췌장 베타세포 기능이상 및 췌장 베타세포량 감소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 췌장 베타세포 부작용을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 생체내 반감기가 유사한 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 병용 투여되는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 조성물은 인슐린 아날로그 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성물질이 링커 또는 공유결합에 의해 연결된, 지속형 인슐린 아날로그 결합체; 및 인슐린 분비 펩타이드 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성물질이 링커 또는 공유결합에 의해 연결된, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 생체내 반감기가 유사한 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 당뇨병 환자의 지질독성, 당독성, 췌장 베타세포 기능이상 및 췌장 베타세포량 감소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 췌장 베타세포 부작용 개선용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 병용 투여되는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 조성물은 인슐린 아날로그 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 링커 또는 공유결합에 의해 연결된, 지속형 인슐린 아날로그 결합체; 및 인슐린 분비 펩타이드 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 링커 또는 공유결합에 의해 연결된, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 당뇨병 환자의 지질독성, 당독성, 췌장 베타세포 기능이상 및 췌장 베타세포량 감소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 췌장 베타세포 부작용 개선용 약학적 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 지질독성, 당독성, 췌장 베타세포 기능 이상 및 췌장 베타세포량 감소를 동시에 개선시킬 수 있다.
인슐린 아날로그와 글루카곤 유사 펩타이드-1과 같은 인슐린 분비 펩타이드는 서로 다른 작용기전을 통해 혈당을 조절하기 때문에 병용 투여 시 그 효능이 극대화될 수 있다는 연구 결과 등을 통해 혈당 조절 치료제로 사용하기 위한 연구만이 지속적으로 이루어져 왔다. 그러나, 병용 투여가 지질독성과 당독성의 개선 및 상보작용을 통해 베타세포의 기능 및 메스를 개선함으로써 당뇨병 환자에게서 인슐린 또는 인슐린 분비 펩타이드 단독 투여시 발생될 수 있는 부작용인 췌장 베타세포 부작용에 대한 연구는 진행된 바가 없었으며, 상기와 같은 새로운 용도는 본 발명자들에 의해 최초로 개발되었다.
상기 조성물은 췌장 베타 세포 부작용을 개선시킬 수 있을 뿐 아니라, 혈액 내 중성 지방의 농도를 감소시켜 지질독성을 감소시키며, 혈당기능을 조절하여 당독성을 감소시킬 수 있으며, 췌장 베타세포량 역시 유지 및/또는 증가시켜 당뇨 진행을 억제시키는 것을 특징으로 한다. 이에, 본원발명의 조성물은 당뇨 진행을 완화시킬 수 있다.
상기 조성물은 투여된 당뇨병 개체의 당뇨 예후를 개선시키는 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체:인슐린 아날로그 결합체가 몰비로 1:0.01~1:50 범위일 수 있다. 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 그 예로 엑센딘 결합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체는 우수한 당뇨병 치료 효능을 나타내며, 특히 병용 투여 시, 인슐린 수용체와 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체를 동시에 자극하여 생체 내 지속성 및 안정성이 향상되고 투여 용량을 획기적으로 줄이면서도 혈당의 안정적인 조절로 저혈당 및 체중증가 양상을 완화 시키고, 구토 및 메스꺼움 현상을 억제 하여 복약 순응도가 개선된 당뇨병 치료제로서 효과가 있으며 특히 획기적으로 개선된 혈중 안정성 및 효력의 지속성으로 투여 빈도를 낮추어 환자의 편의성을 극대화하였다.
또한, 본 발명의 지속형 인슐린 아날로그결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 우수한 당뇨병 치료 효능을 나타내며, 특히 병용 투여 시, 인슐린 수용체와 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체를 동시에 자극하여 생체 내 지속성 및 안정성이 향상되고 당뇨의 진행으로 발생되는 부작용인 지질독성과 당독성의 개선을 통해 베타세포의 기능을 개선하고 메스를 증가시킨다. 또한 혈당의 안정적인 조절로 저혈당 및 체중증가의 양상을 완화시켜 기존 인슐린 제제의 단점을 개선시킨 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은, db/db 마우스에서 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여에 의한 혈당 조절 효력을 당화혈색소(HbA1c) 수치로 나타낸 그래프이다. (* P<0.05, ** P< 0.01, *** P<0.001 by Dunnet's MC test, vehicle군 대비) (†P<0.05, †† P< 0.01, ††† P<0.001 by Dunnet's MC test, 지속형 인슐린 아날로그 결합체 단독 투여군 대비)
도 2는, db/db 마우스에서 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여에 의한 체중변화 값 (BW)의 변화를 나타낸 그래프이다. (* P<0.05, ** P< 0.01, *** P<0.001 by Dunnet's MC test) (†P<0.05, †† P< 0.01, †††P<0.001 by Dunnet's MC test, 지속형 인슐린 아날로그 결합체 단독 투여군 대비)
도 3은, db/db 마우스에서 지속형 인슐린 아날로그 결합체(지속형 인슐린 유도체 결합체)와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여에 의한 베타세포 메스의 증가 효력을 수치로 나타낸 그래프이다 (* P<0.05, ** P< 0.01, *** P<0.001 by ANOVA test, vehicle군 대비).
도 4는, db/db 마우스에서 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 12주간 병용 투여에 의한 혈청 내의 중성지방의 수치를 나타낸 그래프이다 (* P<0.05, ** P< 0.01, *** P<0.001 by ANOVA test, Vehicle군 대비)
도 5은, db/db 마우스에서 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여에 의한 혈당 조절 효력을 당화혈색소(HbA1c) 수치로 나타낸 그래프이다.
본 발명에서 용어, "지속형 인슐린 아날로그 결합체" 및 "지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체"는 인슐린 아날로그와 인슐린 분비 펩타이드가 생체적합성 물질 혹은 캐리어와 공유결합 혹은 비공유 결합을 통하여 연결된 결합체를 형성하는 것을 의미하는데 이렇게 결합체를 형성함으로써 해당 인슐린 아날로그나 인슐린 분비 펩타이드가 결합체를 형성하지 않은 경우와 비교하였을 때 활성을 나타내는 시간이 더 늘어난 것이다.
상기 지속형 인슐린 아날로그 결합체를 투여할 경우, 천연형 인슐린에 비해 약물 투여량을 감소시키면서도 체중의 증가, 구토 및 메스꺼움 현상을 완화시킬 수 있는 효과가 있다.
본 발명에서 인슐린 아날로그와 인슐린 분비 펩타이드의 반감기 증가 및 생체이용율을 증가 혹은 지속적인 활성유지를 할 수 있는 제제란 인슐린 아날로그와 인슐린 분비 펩타이드에 직접 공유결합하는 캐리어 일 수 있으며, 직접 공유결합은 하지 않더라고 인슐린 아날로그의 생체내 활성 유지를 높일 수 있는 제제를 의미한다.
본 발명에서 용어, "생체적합성물질 혹은 캐리어"란 인슐린 아날로그와 인슐린 분비 펩타이드에 공유 또는 비공유 결합으로 연결되어 결합체를 형성했을 때 해당 아날로그 또는 펩타이드의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 물질이다. 예를 들어 결합체를 형성하였을 때 해당 아날로그나 펩타이드의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질은 본 발명에 따른 생체적합성 물질 또는 캐리어가 될 수 있다. 인슐린 아날로그와 인슐린 분비 펩타이드과 결합될 수 있는 것은 다양한 생체적합성 물질, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체단편, FcRn 결합물질, 생체내 결합조직, 뉴클레오 타이드, 파이브로넥틴,Transferrin, saccharide, 고분자 중합체 등과 공유 혹은 비공유 결합하여 생체 내 반감기를 연장하는 생체적합성 물질을 포함한다. 또한 인슐린 아날로그와 인슐린 분비 펩타이드와 생체 내 반감기를 연장할 수 있는 생체적합성 물질의 연결은 유전자 재조합 방법과 고분자 혹은 저분자 화학물질을 이용한 in vitro 결합 등을 포함하며 어느 결합방식에 한정되지 않는다. 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역일 수 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린 아날로그"란 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변형된 것을 의미한다.
상기 인슐린 아날로그는 천연형에 비해 인슐린 역가가 감소 및/또는 인슐린 수용체 결합력이 감소된, 인슐린의 B 쇄 또는 A 쇄의 아미노산이 변이된 인슐린 아날로그일 수 있다. 천연형 인슐린 아미노산 서열은 하기와 같다.
A 쇄 :Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (서열번호 37)
B 쇄 :
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호 38)
본 발명의 실시예에서 사용된 인슐린은 유전자 재조합 기술로 만든 인슐린 아날로그이지만, 본 발명은 이것에만 국한되는 것이 아니라, in-vitro 역가가 감소 및/또는 인슐린 수용체 결합력이 감소된 모든 인슐린을 포함한다. 바람직하게는 역방향 인슐린(inverted insulin), 인슐린 변이체(variants), 인슐린 단편(fragments) 등을 포함하며 제조법으로는 유전자 재조합뿐만 아니라 solid phase 방법으로도 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인슐린 아날로그는 인슐린과 동일한 생체내의 혈당 조절기능을 보유한 펩타이드로서, 이러한 펩타이드는 인슐린 아고니스트(agonist), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 포함한다.
본 발명의 인슐린 아고니스트는 인슐린의 구조와 상관없이 인슐린의 생체내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.
본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 A쇄, B쇄와 각각 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예;deamination) 또는 수식(예; N-methylation), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택하는 변형이 된 형태일 수 있고, 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩타이드를 의미할 수 있다.
본 발명에서 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 아미노산 서열이 전형 상동성이 없어도 인슐린 수용체와 결합하여 혈당을 조절할 수 있는 펩타이드 미믹 및 저분자 혹은 고분자 화합물을 의미할 수 있다.
본 발명의 인슐린 단편은 인슐린에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연 상태에서 존재하지 않는 아미노산 (예; D형 아미노산) 도 가능할 수 있고, 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.
본 발명의 인슐린 변이체는, 인슐린과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
본 발명의 인슐린 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 아미노말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination) 된 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.
구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 B 쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 3번 아미노산, 5번 아미노산, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산, 16번 아미노산, 23번 아미노산, 24번 아미노산, 25번 아미노산, 26번 아미노산, 27번 아미노산, 28번 아미노산, 29번 아미노산, 30번 아미노산, A쇄의 1번, 2번, 5번, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산 14번, 16번 아미노산, 17번 아미노산, 18번 아미노산 19번 및 21번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 바람직하게는 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴, 이소루신, 발린, 글루타민, 글라이신, 라이신, 히스티딘, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 프로린, 세린, 트레오닌, 아스파틱산으로 치환된 것일 수 있다. 또한 하나 이상의 아미노산이 결실(deleltion)된 인슐린 아날로그도 본 발명의 범주에 속하나 인슐린 아날로그는 제한 없이 포함될 수 있다.
바람직한 인슐린 아날로그는 생체적합성 물질 혹은 캐리어와 결합시 천연형 인슐린에 비해 반감기가 증가된 인슐린 아날로그며 이는 대한미국 특허 2014-0022909호와 2014-0006938호에 개시된 인슐린 아날로그일 수 있으나 제한은 없다.
본 발명에서 용어, "지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체"는 인슐린 분비 펩타이드가 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된 것을 의미한다.
본 발명에서 "인슐린 분비 펩타이드"는 인슐린 분비 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 췌장 베타세포의 인슐린의 합성 또는 발현을 자극할 수 있다. 상기 인슐린 분비 펩타이드는 바람직하게는 GLP (Glucagon like 펩타이드)-1, 엑센딘-3 (exendin-3) 또는 엑센딘-4 (exendin-4)이나 이에 제한되지 않는다. 상기 인슐린 분비 펩타이드에는 천연형 인슐린 분비 펩타이드뿐만 아니라, 그의 전구물질 (precursors), 아고니스트 (agonist), 유도체 (derivatives), 단편 (fragments) 및 변이체 (variants) 등을 포함한다.
본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 유도체는 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 아미노 그룹이 제거된 유도체 (Desamino-histidyl 유도체), 아미노 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 유도체 (beta-hydroxy imidazopropionyl-유도체), 아미노 그룹에 2개의 메틸 (methyl) 잔기로 수식된 유도체 (Dimethyl-histidyl-유도체), 아미노 말단의 아미노 그룹을 카복실 그룹으로 치환한 유도체 (beta-carboxyimidazopropionyl-유도체) 또는 아미노 말단 히스티딘 잔기의 알파 카본을 삭제하여 이미다졸아세틸(imidazoacetyl) 그룹만을 남겨두어 아미노 그룹의 양전하(positive charge)를 제거한 유도체(Imidazoacetyl-유도체) 등이 포함될 수 있으며, 또한 기타 다른 형태의 아미노-말단 아미노 그룹 변이 유도체가 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서 인슐린분비 펩타이드 유도체는 더욱 바람직하게는 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹 또는 아미노산 잔기를 화학적으로 변이시킨 유도체이며, 더욱 바람직하게는 엑센딘-4의 아미노 말단의 첫 번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 카본에 존재하는 알파 아미노 그룹 또는 알파 카본을 치환 또는 제거한 엑센딘-4 유도체이며, 더욱 더 바람직하게는 N-말단 아미노 그룹을 제거한 데스아미노-히스티딜-엑센딘-4 (Desamino-histidylexendin-4, DA-엑센딘-4), 하이드록실 그룹 또는 카복실 그룹으로 치환한 베타-히드록시 이미다조프로피오닐-엑센딘-4(beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4, HY-엑센딘-4), 베타-카르복시 이미다조프로필-엑센딘-4 (beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4, CX-엑센딘-4), 2개의 메틸 잔기로 수식한 디메틸-히스티딜-엑센딘-4 (Dimethyl-histidyl-exendin-4, DM-엑센딘-4), 또는 아미노 말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소를 제거한 이미다조아세틸-엑센딘-4(Imidazoacetyl-exendin-4, CA-엑센딘-4)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
GLP-1은 소장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 인슐린 생합성 및 분비를 촉진하고 글루카곤 분비를 억제하며 세포 내 글루코스 흡수를 촉진한다. 소장에서 글루카곤 전구체는 3개의 펩타이드로 분해되는데, 글루카곤, GLP-1, GLP-2이다. 여기서 GLP-1 은 GLP-1(1-37) 을 의미하며 인슐린 분비기능이 없는 형태이고, GLP-1(7-37) 형태로 프로세싱되어 활성형 GLP-1(7-37)이 된다. GLP-1(7-37) 아미노산 서열은 아래와 같다:
GLP-1(7-37):
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G (서열번호 39)
GLP-1 유도체는, GLP-1과 비교 시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 화학적으로 수식된 형태일 수도 있고, 인슐린 분비기능도 최소한 동등 또는 그 이상을 나타내는 펩타이드를 의미한다.
GLP-1 단편은, 천연형 GLP-1 의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산 (예; D형 아미노산)도 가능하다.
GLP-1 변이체는, 천연형 GLP-1 과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
엑센딘-3 와 엑센딘-4는, GLP-1 과 53%의 아미노산 서열 유사성을 보이는 39 개 아미노산으로 이루어진 인슐린분비 펩타이드이며, 엑센딘-3와 엑센딘-4의 아미노산서열은 아래와 같다.
엑센딘-3:
HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (서열번호 40)
엑센딘-4:
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (서열번호 41)
엑센딘 아고니스트는 엑센딘의 구조와 상관없이 엑센딘의 생체 내 수용체에 결합하여 엑센딘과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미하며, 엑센딘 유도체는, 천연형 엑센딘과 비교시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보 이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환 (예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거 (예; deamination) 또는 수식 (예; N-methylation)된 형태일수 있고, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
엑센딘 단편은, 천연형 엑센딘의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 천연에 존재하지 않는 아미노산(예: D-형 아미노산)의 추가도 가능할 수 있고, 이러한 엑센딘 단편은 인슐린 분비기능을 보유한다.
엑센딘 변이체는, 천연형 엑센딘과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 상기 엑센딘 변이체는 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산인 라이신이 세린 (serine) 또는 알지닌 (arginine)으로 치환된 펩타이드를 포함한다.
엑센딘 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화 (deamination)된 인슐린분비 펩타이드도 포함된다.
구체적인 일 실시예로서 본 발명에서 사용한 천연형 인슐린 분비 펩타이드와 변형된 인슐린 분비 펩타이드는 Solid phase 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 천연형 인슐린분비 펩타이드를 포함한 대부분의 천연형 펩타이드는 재조합 방법으로도 생산 가능하다.
상기 인슐린 아날로그 결합체와 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
X-La-F
상기 화학식에서, X는 인슐린 아날로그거나 인슐린 분비 펩타이드이며, 인슐린의 B 쇄 또는 A 쇄의 하나이상의 아미노산이 변이된 인슐린 아날로그이고, L은 링커이고, a는 0 또는 자연수인데, 단 a가 2 이상일 때에는 각각의 L이 서로 독립적이며, F는 폴리에틸렌 글리콜, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 특정 아미노산 서열, 항체, 항체단편, FcRn 결합물질, 파이브로넥틴 saccharide등에서 선택되어 질 수 있다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 변이체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 변이체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 변이체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제WO 96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 변이체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 변이체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 조합(combination)이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다. 즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 비펩타이드성 중합체는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 이와 같은 비펩타이드성 중합체는 양 말단 또는 세 말단을 가질 수 있다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, 올리고뉴클에오타이드 및 이들의 조합으로 구성 된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합 단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 경우, 생체 내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성 약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없을 수도 있으므로, 본 발명에서는 펩타이드 링커 뿐 아니라 비펩타이드 링커를 이용하여 결합체를 제조할 수 있다. 비펩타이드 링커는 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다.
또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체 뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가진다.
상기 비 펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 결합체를 제조할 수 있다.
지속형 분비 펩타이드 결합체의 종류 및 제조방법은 대한민국 등록특허 제10-1058290호, 제10-1231431호와 제10-1058315호에 자세히 기술되어 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4)의 라이신(lysine, Lys)에 PEG로 수식시켰으며, PEG 수식된 엑센딘-4를 면역글로불린 Fc에 연결하여 지속형 엑센딘-4 결합체를 제조하였다 (실시예 9).
이러한 본 발명의 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 인슐린 분비펩타이드는 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가하며 또한 생체내 반감기가 유사하여, 병용투여시 당뇨(Diabetes)의 치료에 유용하다.
또한, 이러한 본 발명의 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 인슐린 분비펩타이 결합체는 단독투여 대비, 우수한 혈당조절 및 혈중 지질의 개선 효력를 나타낼 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드인 엑센딘-4 결합체를 병용투여하면 지질독성과 당독성이 개선됨을 바탕으로 베타세포의 메스를 보존하고 더 나아가 당뇨의 진행을 억제할 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 결과들은 본 발명의 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 복합 조성물, 또는 각 결합체의 병용 투여는 인슐린, 또는 인슐린 분비 펩타이드 단독 투여시 발생할 수 있는 당뇨병 환자에게 일어나는 부작용의 일종인 혈중 지질 농도 증가에 따른 지질 독성, 혈당 조절미비에 의한 혈중 당농도 증가에 따른 당독성을 획기적으로 개선하여, 췌장 베타세포의 기능 장애 방지 및/또는 췌장 베타세포 메스 증가를 통해 당뇨병의 진행을 획기적으로 완화하여 당뇨병 개선, 치료, 예방 및/또는 당뇨병 예후를 좋게 할 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 상기 조성물은 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하는 것을 특징으로 한다.
이러한 본 발명의 상기 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하면 상기 지속형 인슐린 아날로그 결합체는 인슐린 수용체에, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체에 동시에 작용하여 각각의 투여시보다 혈중 당의 농도를 감소시키고, 안정적인 변화추이를 보인다. 또한 상기 결합체를 병용 투여하는 경우, 인슐린 단독투여시 나타날 수 있는 저혈당의 위험을 낮출 수 있으며, 체중을 감소시키는 효과가 있고, 인슐린 분비 펩타이드에 의해 전체 인슐린 투여량을 낮출 수 있다. 또한 엑센딘-4와 같은 인슐린 분비 펩타이드의 용량을 낮출 수 있어 엑센딘-4 단독 치료시 나타날 수 있는 메스꺼움, 구토 등의 부작용을 낮출 수 있는 장점이 있다. 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 사용은 혈중 반감기 및 생체 내 효력 지속 효과의 획기적인 증가로 인해 매일 투여되야 하는 만성환자에게 투여 횟수를 감소시켜 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 큰 장점이 있어 당뇨병의 치료에 큰 도움을 준다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하고 병용투여방법을 이용하여 용량을 현저하게 감소시킬 수 있다.
더욱이, 기존 제제와 달리, 당뇨병 환자에게서 발생되는 췌장 베타세포의 기능 상실 및/또는 사멸에 의한 췌장 베타세포 메스의 감소를 완화시킬 수 있는 특징이 있으며, 이는 지질독성과 당독성의 개선 및 상보작용을 통해 베타세포의 기능 및 메스 감소를 개선함으로써 당뇨 진행을 억제하는 등, 당뇨병 환자의 췌장세포 부작용을 완화시킬 수 있다.
지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 각각 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있으며, 적절한 유효량의 조합으로 동시에 투여될 수 있다. 또한 바람직하게는 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 각각 별도의 용기에 보관된 후 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 병용 투여용 조성물인 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 하나의 용기에 포함된 당뇨병 치료용 키트, 각각 별도의 용기에 보관된 것인 당뇨병 치료용 키트의 형태일 수 있다. 이와 같은 키트는 약학적으로 허용가능한 담체, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
또한, 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 각각 인슐린 분비 펩타이드와 인슐린과 병용투여가 가능할 수 있다. 지속형 인슐린 아날로그 결합체는 인슐린 분비 펩타이드인 GLP-1 agonist들 (예를 들어 Exenatide, Liraglutide, lixisenatide)와 병용투여 할 수 있으며, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 인슐린 및 인슐린 아날로그, basal 인슐린과 병용투여 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "당뇨(Diabetes)병"은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환 (metabolic disease)를 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 병용 투여함으로써, 혈당을 조절하여 당뇨병을 치료할 수 있을 뿐 아니라, 췌장 베타세포의 기능, 메스 보존 및 증가와 동시에 잠재적 베타세포 스트레스와 같은 부작용으로부터 안전한 당뇨병 치료제로 제공될 수 있다. 또한 췌장 베타세포의 기능과 메스를 감소시키는 주된 원인인 지질독성과 당독성을 획기적으로 감소시키며 또한 이를 통해 당뇨의 진행을 완화시킬 수 있는 등, 기존 제제의 부작용을 획기적으로 개선시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 병용투여로 당뇨병을 방지하거나 지연시키는 모든 행위, 또는 췌장세포 부작용을 방지하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 본 발명의 조성물의 병용투여로 당뇨병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위 및 췌장세포 부작용을 개선시키는 모든 행위를 의미한다. 상기 당뇨병 치료 및 췌장베타 세포 부작용 치료 또는 예방은 당뇨병이 발생할 수 있는 임의의 포유 동물에 적용이 가능하며, 그 예로 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등 가축을 제한없이 포함하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물들의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 지속성 제제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 조성물을 당뇨병에 걸릴 위험이 있거나 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 조성물을 당뇨병에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 개체의 지질독성 (lipotoxicity), 당독성 (glucotocity), 췌장 베타세포 기능이상 및 췌장 베타세포 메스 (mass) 감소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 췌장 베타세포 부작용 개선 방법을 제공한다.상기 투여하는 단계는 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하는 것에 의해 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 각각 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있으며, 적절한 유효량의 조합으로 동시에 투여될 수 있다.
지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드를 모두 포함하는 본 발명의 조성물은 주1회의 투여로도 혈당을 우수하게 낮추면서 체중 증가의 부작용을 가지고 오지 않는바, 당뇨병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 조성물을 당뇨병에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 환자의 지질독성 및/또는 당독성을 개선 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 조성물을 당뇨병에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 환자의 췌장 베타세포 기능 개선 및/또는 췌장 베타세포 메스 보존 및/또는 증가시키는 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 단쇄 인슐린 아날로그 발현 벡터의 제작
보유 중인 천연형 인슐린 발현 벡터를 주형으로 하여 A쇄 또는 B쇄의 아미노산을 하나씩 변형시킨 인슐린 아날로그들을 제작하기 위해 순방향 및 역방향 올리고 뉴클레오타이드를 합성한 후(표 2), PCR을 진행하여 각각의 아날로그 유전자를 증폭하였다.
하기 표 1에 각각의 A 쇄 또는 B쇄의 아미노산의 변화 서열 및 아날로그 이름을 나타냈다. 즉, 아날로그 1의 경우 A 쇄의 1번 글리신이 알라닌으로 치환, 아날로그 4의 경우 B쇄의 8번 글리신이 알라닌으로 치환된 형태이다.
Figure pat00001
인슐린 아날로그 증폭을 위한 프라이머는 하기 표 2에 나타냈다.
Figure pat00002
인슐린 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 6분으로 이 과정을 18회 반복하였다. 이와 같은 조건에서 얻어진 인슐린 아날로그 단편은 세포내의 봉입체 형태로 발현시키기 위하여 pET22b 벡터에 삽입되어 있으며 이렇게 얻어진 발현 벡터를 pET22b-인슐린 아날로그 1 내지 9라 명명하였다. 상기 발현 벡터는 T7 프로모터의 조절 하에 인슐린 아날로그 1 내지 9의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하며, 숙주 내에서 인슐린 아날로그 단백질을 봉입체 형태로 발현시켰다.
하기 표 3에 각각의 인슐린 아날로그 1 내지 9의 DNA 서열 및 단백질 서열을 나타냈다.
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
실시예 2: 재조합 인슐린 아날로그 융합 펩타이드의 발현
T7 프로모터 조절하의 재조합 인슐린 아날로그 발현을 수행 하였다. 각각의 재조합 인슐린 아날로그 발현 벡터로 E.coli BL21-DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal DE3); 노바젠)을 형질전환하였다. 형질 전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 따랐다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여 암피실린(50 /ml)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth, LB) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 각 1 ml씩 크라이오-튜브에 분주하고, -140℃에 보관하였다. 이를 재조합 융합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
재조합 인슐린 아날로그들의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알을 녹여 500 ml의 2X 루리아 브로스에 접종하고 37℃에서 14~16시간 동안 진탕 배양하였다. OD600의 값이 5.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 50 L 발효기(MSJ-U2, B.E.MARUBISHI, 일본)를 이용하여 종 배양액을 17 L의 발효 배지에 접종하고 초기 배스(bath) 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 20 L/분(1 vvm), 교반 속도 500 rpm 그리고 30% 암모니아수를 사용하여 pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가배지(feeding solution)를 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하며, OD 값이 100이상에서 최종 농도 500 M의 IPTG로 도입하였다. 배양은 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하며, 배양 종료 후, 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수획하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 재조합 인슐린 아날로그의 회수 및 재접힘 (refolding)
상기 실시예 2에서 발현시킨 재조합 인슐린 아날로그들을 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 리폴딩하였다. 세포 펠렛 100 g(wet weight)을 1 L 용해 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 9.0), 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.2 M NaCl 및 0.5% 트리톤 X-100)에 재부유하였다. 미세용액화(microfluidizer) 프로세서 M-110EH(AC Technology Corp. Model M1475C)를 이용하여 15,000 psi 압력으로 수행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용해물을 7,000 rpm으로 4℃에서 20분 원심분리하여 상층액을 버리고, 3 L 세척완충액(0.5% 트리톤 X-100 및 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA)에 재부유하였다. 7,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛을 증류수에 재부유한 후, 동일한 방법으로 원심분리하였다. 펠렛을 취하여 400 ml의 완충액(1 M Glycine, 3.78 g Cysteine-HCl, pH 10.6)에 재부유하여 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 재부유된 재조합 인슐린 아날로그 회수를 위하여 400 mL의 8M 우레아를 추가한 후 40℃에서 1시간 교반하였다. 가용화된 재조합 인슐린 아날로그의 재접힘(refolding)을 위하여 7,000 rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취한 후 여기에 2 L의 증류수를 연동펌프(peristaltic pump)를 이용하여 1000 ml/hr의 유속으로 넣어주면서 4℃에서 16시간 교반한다.
실시예 4: 양이온 결합 크로마토그래피 정제
45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액으로 평형화된 Source S (GE healthcare사) 컬럼에 재접합이 끝난 시료를 결합시킨 후, 염화칼륨 0.5 M과 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.
실시예 5: 트립신(Trypsin)과 카복시펩티데이즈 B(Carboxypeptidase B) 처리
디솔팅 컬럼(Desalting column)으로 용출된 시료에서 염을 제거하고, 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 교체하였다. 얻어진 시료 단백량의 1000몰비에 해당하는 트립신과 2000몰비에 해당하는 카복시펩티데이즈 B를 첨가한 후, 16℃에서 16시간 교반하였다. 반응을 종료하기 위하여 1 M 소디움 사이트레이트(pH 2.0)를 이용하여 pH를 3.5로 낮추었다.
실시예 6: 양이온 결합 크로마토 그래피 정제
반응이 끝난 시료를 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액으로 평형화된 Source S(GE healthcare사) 컬럼에 다시 결합시킨 후, 염화칼륨 0.5 M과 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트(pH 2.0) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.
실시예 7: 음이온 결합 크로마토 그래피 정제
디솔팅 컬럼(Desalting column)으로 용출된 시료에서 염을 제거하고, 완충용액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 교체하였다. 상기 실시예 6에서 얻어진 시료에서 순수한 인슐린 아날로그를 순수 분리하기 위해 10 mM 트리스 (pH 7.5) 완충액으로 평형화된 음이온 교환 컬럼 (Source Q: GE healthcare사)에 결합시킨 후, 0.5 M 소디움 크롤라이드가 포함된 10 mM 트리스 (pH 7.5) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10컬럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.
정제된 인슐린 아날로그의 순도는 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 및 고압 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였으며, 아미노산의 변경 확인은 펩타이드맵핑과 각 피크의 분자량 분석을 통하여 확인하였다.
그 결과, 각각의 인슐린 아날로그가 목적하는 바에 따라, 아미노산 서열이 변경이 되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 지속형 인슐린 아날로그의 제조
본 실시예에서는 대표적인 인슐린 아날로그인 천연 인슐린의 서열 아날로그(A 쇄 14번에 Glu)의 지속형 결합체를 제조하였다.
인슐린 아날로그 베타 체인의 N-말단에 3.4K ALD2 PEG (NOF, 일본)를 페길화시키기 위하여, 인슐린 아날로그:PEG의 몰 비율을 1:4로, 인슐린 아날로그 농도를 5 mg/ml로 4~8℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이때 반응은 50 mM 소디움 시트레이트(Sodium Citrate) pH 6.0, 40~60% 이소프로판올에서 이루어졌으며, 3.0~20.0 mM 농도의 소디움 시아노보로하이드라이드 환원제를 첨가하여 반응시켰다. 반응 액은 소디움 시트레이트(pH 3.0)에 에탄올이 포함된 버퍼와 KCl 농도 구배를 이용하여 SP-HP(GE Healthcare, 미국) 컬럼을 사용하여 정제하였다.
인슐린 아날로그 -면역글로불린 Fc 단편 결합체를 제조하기 위하여, 위에서 정제된 모노 페길화된(mono-PEGylated) 인슐린 아날로그와 면역글로불린 Fc 단편의 몰비가 1:1 내지 1:2 가 되도록 하고 전체 단백질 농도를 약 20 mg/ml로 하여 25℃에서 약12 ~16시간 반응시켰다. 이때 반응 버퍼 조건은 100 mM HEPES, pH 8.2이며, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하여 Fc 단편의 N-말단에 PEG 수식된 인슐린 아날로그를 결합체를 제조하였다.
반응이 종결된 후 반응액은 Q HP(GE Healthcare, 미국) 컬럼을 이용하여 Tris-HCl (pH 7.5) 버퍼와 NaCl 농도 구배를 사용, 인슐린 아날로그 -면역글로불린 Fc 단편 결합체를 1차로 정제하였다.
이후 Source 15ISO(GE Healthcare, 미국)를 2차 컬럼으로 사용하여 인슐린 아날로그 -면역글로불린 Fc 단편 결합체를 얻었다. 이때, Tris-HCl(pH 7.5)가 포함된 암모늄 설페이트(Ammonium sulfate)의 농도구배를 이용하여 인슐린 아날로그 -면역글로불린 Fc 단편 결합체를 용출하였다.
실시예 9: 지속형 엑센딘-4 결합체의 제조
이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4, AP, 미국)를 이용하여 3.4k PropionALD (2) PEG를 CA 엑센딘-4의 Lys 과 반응시킨 후, 두개의 Lys 이성질체 피크 중 반응이 많이 가고 N-말단 이성질체와 확연히 구분되는 가장 뒤쪽의 이성질체 피크 (Lys27 위치이성체)를 이용하여 커플링을 진행하였다.
펩타이드와 면역글로불린 Fc 몰비를 1:8, 전체단백질 농도를 60 /로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100 mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응액은 두 개의 정제 컬럼을 거쳐 정제되었다. 먼저 커플링 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로불린 Fc를 제거하기 위해여 SOURCE Q (XK-16mL, 아머샴 바이오사이언스)을 이용하였다. 20 mM Tris (pH7.5)에서 1M NaCl을 사용하여 Salt gradient를 주면 상대적으로 결합력이 약한 면역글로불린 Fc가 먼저 용출되고 바로 뒤이어 엑센딘-4-면역글로불린 Fc 가 용출된다. 일차정제를 통하여 어느 정도 면역글로불린 Fc가 제거되지만 이온교환컬럼에서 면역글로불린 Fc와 엑센딘-4-면역글로불린 Fc의 결합력 차이가 크지 않아 완전히 분리되지는 않았다. 따라서 두 물질의 소수성 (Hydrophobicity)을 이용하여 이차 정제를 하였다. SOURCE ISO (HR16 , 아머샴 바이오사이언스)에 20mM Tris(pH7.5) 및 1.5M 황산암모늄을 이용하여 일차 정제된 시료를 결합시킨 후 차츰 황산암모늄 농도를 낮추면서 시료를 용출시켰다. HIC 컬럼에 결합력이 약한 면역글로불린 Fc가 먼저 용출되고 결합력이 강한 엑센딘-4-면역글로불린 Fc 시료가 뒤쪽으로 용출되었다. 이들의 소수성 차이가 커 이온교환 컬럼보다 훨씬 분리가 용이하였다.
컬럼 : SOURCE Q(XK 16 , 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0 /분
구배 : A0 ->25% 70 분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A+ 1M NaCl)
컬럼 : SOURCE ISO(HR 16 , 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 7.0 /분
구배 : B 100→0% 60분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1.5M 황산암모늄)
실시예 10: 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용투여에 따른 2형 당뇨 모델 마우스에서의 혈당조절 효력 및 체중 변화(ΔBody weight) 확인
상기 실시예 8 및 실시예 9에서 제조한 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 포함하는 조성물의 투여 또는 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용투여에 따른 인 비보 (in vivo) 효력을 측정하기 위하여 2형 당뇨 모델인 db/db 마우스를 이용하였다. db/db 마우스 (BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd mouse)는 leptin 수용체 제거를 통해 사람과 유사한 당뇨 증상을 나타내기 때문에 본 실시예에 사용하였다.
8주령의 db/db 마우스 혈당을 미정맥 부분에 26 G 주사기로 찔러서 얻은 1-2 방울의 혈액을 사용하여 혈당분석기 (OneTouch Ultra, LifeScan, Inc., USA)로 측정하였다. 당뇨가 유발되었는지 여부는 측정된 혈당을 기준으로 판단하였다 (350-600 / 사이). 당뇨병이 유도된 마우스를 혈당에 따라 군당 5 혹은 6마리씩 G1, G2, G3, G4 및 G5의 5개 군으로 분리하였다.
상기 군들을 각각 아무것도 투여하지 않은 대조군 (Vehicle), 지속형 인슐린 아날로그 결합체를 투여한 군 (8.8 nmol/kg), 지속형 엑센딘-4 결합체 (0.36 nmol/kg) 투여한 군, 지속형 인슐린 아날로그 결합체 (2.2 nmol/kg) 및 지속형 엑센딘-4 결합체 (0.36 nmol/kg)를 투여한 군, 지속형 인슐린 아날로그 결합체 (8.8 nmol/kg) 및 지속형 엑센딘-4 결합체 (0.36 nmol/kg)를 투여한 군으로 나누었다. 그리고 상기 시험물질을 5주 반복 투여 후 상기 각 군에 대하여 당화혈색소 (HbA1c) 를 측정하였다. 당화혈색소는 적혈구에 정상적으로 존재하는 혈색소에 당이 결합된 형태로, 혈당이 높게 유지되었을 경우에 당화혈색소 수치도 높아진다. 마우스의 당화혈색소는 4~5주 동안의 평균 혈당 수치를 반영하므로 상기 시험물질에 대한 혈당 조절강도를 측정하는데 유용하다. 또한, 약물 투여 전과 최종 시험일에 시험 동물들의 체중변화 값(ΔBody weight)을 계산하였다.
그 결과, 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여군에서 당화혈색소 수치가 낮아진 것을 확인하였다 (도 1). 이는 지속형 인슐린 아날로그 결합체 또는 지속형 엑센딘-4 결합체를 각각 투여한 군에 비해 현저히 개선된 결과였다. 또한, 인슐린 아날로그 결합체의 투여용량이 1/4 감소되었음에도 상기 병용투여 효력이 유지되는 것을 확인하였다.
ΔBody weight 측정 결과, 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 군은 지속형 인슐린 아날로그 결합체 단독 투여 군에 비해 체중증가가 완화되는 것을 확인하였다 (도 2). 또한, 지속형 인슐린 아날로그 결합체의 투여용량이 1/4로 감소된 경우에는 이러한 체중증가 완화효과가 현저하게 증가되는 것을 확인하였다.
이와 같은 결과는 본 발명의 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여하면 단독투여 대비, 우수한 혈당조절 효력를 나타낼 수 있음을 의미한다. 또한, 상기 병용투여에 의한 혈당 조절 효력이 인슐린 아날로그 결합체의 투여용량 감소에도 지속적으로 유지되는 것을 확인하였다. 체중변화에 대해서는 지속형 인슐린 아날로그 결합체의 투여용량이 1/4로 감소됨에 따라 체중증가가 현저하게 저하되는 것을 확인하였다. 이는 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여하면 인슐린 용량감소에 따른 체중증가 부작용은 물론 저혈당 위험도 현저히 감소시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 11: 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용투여에 따른 제 2형 당뇨 모델 마우스에서의 베타세포량 유지 효과
지속형 인슐린 아날로그 결합체(지속형 인슐린 유도체 결합체)와 지속형 인슐린 분비펩타이드의 예인 지속형 엑센딘-4 결합체를 포함하는 조성물의 투여 또는 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용투여에 따른 인 비보 (in vivo) 효력을 측정하기 위하여 2형 당뇨 모델인 db/db 마우스를 이용하였다.
본 실시예에서 사용한 지속형 인슐린 유도체 결합체의 인슐린 아날로그로는 표 1의 아날로그 8(A14Y → E)을, 지속형 인슐린 분비 펩타이드로는 이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4)를 포함하는 지속형 엑센딘-4 결합체를 사용하였다. 엑센딘-4의 라이신에 PEG를 수식시켰으며, PEG 수식된 엑센딘-4를 면역글로불린 Fc에 연결하여 지속형 엑센딘-4 결합체를 제조하였다. 특히, CA 엑센딘-4 : 인슐린 아날로그 8의 결합체는 몰비로 1.01~1:50 범위 일 수 있다.
db/db 마우스 (BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/OlaHsdmouse)는 렙틴(leptin) 수용체 제거를 통해 사람과 유사한 당뇨 증상을 나타내기 때문에 본 실시예에 사용하였다.
12주령의 db/db 마우스 혈당을 미정맥 부분에 26 G 주사기로 찔러서 얻은 1~2 방울의 혈액을 사용하여 혈당분석기(OneTouch Ultra, LifeScan, Inc., USA)로 측정하였다. 당뇨가 유발되었는지 여부는 측정된 혈당량을 기준으로 판단하였다(비당뇨인 정상 범위는 약 100~150 mg/dl이고, 실시예의 정확성을 위해 혈당이 350 mg/dl 이상인 마우스를 선별하여 사용하였다). 당뇨병이 유도된 마우스를 혈당에 따라 군당 7 혹은 8마리씩 G1, G2, G3, G4, G5, G6, 그리고 G7의 7개 군으로 분리하였다.
상기 군들을 각각 아무것도 투여하지 않은 대조군(Vehicle), 지속형 인슐린 아날로그 결합체를 농도별로 투여한 2 개의 군(4.2 nmol/kg, 8.4 nmol/kg), 지속형 엑센딘-4 결합체(0.36 nmol/kg) 투여한 군, 지속형 인슐린 아날로그 결합체(4.2 nmol/kg) 및 지속형 엑센딘-4 결합체(0.36 nmol/kg)를 병용으로 투여한 군, 지속형 인슐린 아날로그 결합체(8.4 nmol/kg) 및 지속형 엑센딘-4 결합체(0.36 nmol/kg)를 병용으로 투여한 군으로 나누었다. 그리고 상기 시험물질을 전술한 용량으로 12주 동안 2일 간격으로반복 투여 후 상기 각 군에 대하여 당화혈색소(HbA1c)의 양을 측정하였다. 당화혈색소는 적혈구에 정상적으로 존재하는 혈색소에 당이 결합된 형태로, 혈당이 높게 유지되었을 경우에 당화혈색소 수치도 높아진다. 마우스의 당화혈색소는 4~5주 동안의 평균 혈당 수치를 반영하므로 상기 시험물질에 대한 혈당 조절강도를 측정하는데 유용하다. 12주 반복 약물 투여 후 마우스의 안와 정맥으로부터 채혈 후 획득한 혈청으로부터 중성 지방의 농도를 측정하였고, 각 개체를 부검한 뒤 췌장을 취하여 베타 세포 메스를 측정하였다.
그 결과, 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여군에서 당화혈색소 수치가 낮아진 것을 확인하였다(도 5). 이는 지속형 인슐린 아날로그 결합체 또는 지속형 엑센딘-4 결합체를 각각 투여한 군에 비해 현저히 개선된 결과였다.
혈청 내에 중성지방의 농도 측정 결과, 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여군에서 중성지방의 농도가 투여 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 4).
각 약물 투여그룹의 베타세포 메스를 비교한 결과, 지속형 인슐린 아날로그 결합체의 단독 투여 그룹, 지속형 엑센딘-4 결합체의 단독 투여 그룹 및 두 결합체의 병용 투여 그룹 모두에서 대조군에 비해 베타 세포량이 증가됨을 확인하였다 (도 3).
또한 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 엑센딘-4 결합체의 단독 투여 그룹과 비교할 때, 두 약물의 병용에 대한 동반 상승효과가 확인되었다. 이러한 결과를 토대로 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여를 통해 지질독성과 당독성이 개선됨을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과는 본 발명의 지속형 인슐린 아날로그결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용투여하면 단독투여 대비, 우수한 혈당조절 및 혈중 지질의 개선 효력을 나타낼 수 있음을 의미한다. 이는 지속형 인슐린 아날로그 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드인 엑센딘-4 결합체를 병용투여하면 지질독성과 당독성의 개선을 바탕으로 베타세포의 메스를 보존하고 더 나아가 당뇨의 진행을 억제할 수 있음을 시사하는 것으로, 본 발명의 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 복합 조성물, 또는 각 결합체의 병용 투여는 인슐린, 또는 인슐린 분비 펩타이드 단독 투여시 발생할 수 있는 당뇨병 환자에게 일어나는 부작용의 일종인 혈중 지질 농도 증가에 따른 지질 독성, 혈당 조절 미비에 의한 혈중 당농도 증가에 따른 당독성을 획기적으로 개선하여, 췌장 베타세포의 기능 장애 방지 및/또는 췌장 베타세포량 증가를 통해 당뇨병의 진행을 획기적으로 완화하여 당뇨병 개선, 치료, 예방 및/또는 당뇨병 예후를 좋게 할 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Composition for Treating Diabetes Comprising Long-acting Insulin Analogue Conjugate and Long-acting Insulinotropic Peptide Conjugate <130> KPA140522-KR-P1D1 <150> KR10-2014-0065072 <151> 2014-05-29 <160> 41 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gggtccctgc agaagcgtgc gattgtggaa caatgctgt 39 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 acagcattgt tccacaatcg cacgcttctg cagggaccc 39 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tccctgcaga agcgtggcgc ggtggaacaa tgctgtacc 39 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggtacagcat tgttccaccg cgccacgctt ctgcaggga 39 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ctctaccagc tggaaaacgc gtgtaactga ggatcc 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggatcctcag ttacacgcgt tttccagctg gtagag 36 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gttaaccaac acttgtgtgc gtcacacctg gtggaagct 39 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 agcttccacc aggtgtgacg cacacaagtg ttggttaac 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ctagtgtgcg gggaacgagc gttcttctac acacccaag 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 cttgggtgtg tagaagaacg ctcgttcccc gcacactag 39 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gtgtgcgggg aacgaggcgc gttctacaca cccaagacc 39 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ggtcttgggt gtgtagaacg cgcctcgttc cccgcacac 39 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tgcggggaac gaggcttcgc gtacacaccc aagacccgc 39 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gcgggtcttg ggtgtgtacg cgaagcctcg ttccccgca 39 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 ccagcatctg ctccctcgaa cagctggaga actactg 37 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 cagtagttct ccagctgttc gagggagcag atgctgg 37 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 cagcatctgc tccctcaacc agctggagaa ctac 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 gtagttctcc agctggttga gggagcagat gctg 34 <210> 19 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 1 <400> 19 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtgcgat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 20 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 1 <400> 20 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Ala Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 21 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 2 <400> 21 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcgc ggtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 22 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 2 <400> 22 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ala Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 23 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 3 <400> 23 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaacg cgtgcaac 258 <210> 24 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 3 <400> 24 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Ala Cys Asn 85 <210> 25 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 4 <400> 25 ttcgttaacc aacacttgtg tgcgtcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 26 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 4 <400> 26 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Ala Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 27 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 5 <400> 27 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgagcgt tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 28 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 5 <400> 28 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Ala Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 29 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 6 <400> 29 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggcg cgttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 30 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 6 <400> 30 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Ala Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 31 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 7 <400> 31 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcgcgtacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 32 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 7 <400> 32 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 33 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 8 <400> 33 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaacag 240 ctggagaact actgcaactg a 261 <210> 34 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 8 <400> 34 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 35 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 9 <400> 35 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcaaccag 240 ctggagaact actgcaactg a 261 <210> 36 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 9 <400> 36 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asn Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 37 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain of insulin <400> 37 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 38 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain of insulin <400> 38 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-37) <400> 39 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 40 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exendin-3 <400> 40 His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 41 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exendin-4 <400> 41 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35

Claims (16)

  1. 인슐린의 A 쇄의 14번 아미노산이 글루탐산으로 치환된 인슐린 아날로그 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체로 연결된 지속형 인슐린 아날로그 결합체; 및
    이미다조-아세틸 엑센딘-4인 인슐린 분비 펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체로 연결된 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 인슐린의 A 쇄의 14번 아미노산이 글루탐산으로 치환된 인슐린 아날로그 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체로 연결된 지속형 인슐린 아날로그 결합체; 및
    이미다조-아세틸 엑센딘-4인 인슐린 분비 펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체로 연결된 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는,
    당뇨병 환자의 지질독성, 당독성, 췌장 베타세포 기능이상 및 췌장 베타세포량 감소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 췌장 베타세포 부작용 개선용 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체의 각 말단이 각각 상기 면역글로불린 Fc 영역과 인슐린 아날로그와 인슐린 분비펩타이드의 아민기 또는 티올 기에 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 것인 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것인 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것인 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 당뇨 진행을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 투여된 당뇨병 개체의 당뇨 예후를 개선시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항의 조성물을 당뇨병에 걸릴 위험이 있거나 걸린 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료 방법.
  16. 제2항의 조성물을 인간을 제외한 당뇨병에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 개체의 지질독성, 당독성, 췌장 베타세포 기능이상 및 췌장 베타세포량 감소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 췌장 베타세포 부작용 개선 방법.
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