CN113929762B - 3-羟基丁酰化和/或3-羟基戊酰化修饰胰岛素及其应用 - Google Patents
3-羟基丁酰化和/或3-羟基戊酰化修饰胰岛素及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种经修饰的胰岛素，该胰岛素对还原剂的抗性高、对细胞摄取葡萄糖的能力强，而且在动物体内的作用时间长，在科研和临床方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质修饰技术领域，具体涉及3-羟基丁酰化和/或3-羟基戊酰化修饰胰岛素及其在医药领域的应用。
背景技术
3-羟基丁酰化是一种新型的蛋白质修饰类型。2016年，芝加哥大学的赵英明教授实验组首先在组蛋白上发现该种修饰。该修饰在多种细胞组蛋白上广泛存在，主要底物为酮体之一，3-羟基丁酸，以下我们简称3HB(Xie, Z. et al. Metabolic Regulation ofGene Expression by Histone Lysine β-Hydroxybutyrylation. Mol. Cell. 2016)。3-羟基丁酸是人体的代谢产物，是人体在饥饿和剧烈运动情况下肝脏利用脂肪酸产生的化合物，作为替代葡萄糖的能量来源。近年来随着研究的不断深入，发现3-羟基丁酸不仅仅可以作为能量分子，还可以发挥重要的信号分子作用(Newman, J.C. and E. Verdin, beta-Hydroxybutyrate: A Signaling Metabolite. Annu Rev Nutr, 2017)。3-羟基丁酸可以发挥抗酒精性脂肪肝的作用，还可以有效改善高血压、神经变性疾病、癫痫、心血管疾病等（Mierziak, J., M. Burgberger, and W. Wojtasik, 3-Hydroxybutyrate as aMetabolite and a Signal Molecule Regulating Processes of Living Organisms.Biomolecules, 2021）。2019年，北京大学基础医学院的赵文会教授课题组首次在非组蛋白p53上发现3-羟基丁酰化修饰。p53赖氨酸的3-羟基丁酰化（以下简称Kbhb）修饰可以降低该蛋白其乙酰化水平，降低其转录活性，并减弱p53介导的细胞生长停滞和凋亡的功能(Liu,K., et al., p53 beta-hydroxybutyrylation attenuates p53 activity. Cell DeathDis, 2019)。
本申请提供了一种胰岛素进行3-羟基丁酰化及其类似物的修饰，并且这种修饰可以影响胰岛素对还原剂DTT的敏感性，在体外和体内改善胰岛素功能。
发明内容
本发明提供了一种将氨基修饰为酰胺基的胰岛素，其具有更高的抵抗还原剂的能力，对细胞葡萄糖摄取的能力更高，同时，提供胰岛素在体内的稳定性和长效性。具体的，
本发明的第一方面，提供了一种经修饰的胰岛素，所述的胰岛素的氨基修饰为酰胺基。
优选的，所述的胰岛素采用式I所示的化合物进行修饰：
式I；
其中，R1为H、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、环烷基或芳基；优选的，所述的R1为直链或支链C1-C4的烷基。进一步优选的，R1为甲基。
R2为H、直链或支链的烷基、环烷基、芳基或金属离子；优选的，R2为直链或支链C1-C9的烷基、钙离子、钠离子或钾离子。进一步优选的，R2为甲基、氢、钙离子、钠离子或钾离子。
n为≥1的自然数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17等等。优选的，n=1-10的自然数。
在本发明的一个具体实施方式中，n=1，R1为甲基且R2为甲基。
在本发明的一个具体实施方式中，n=1，R1为甲基且R2为氢。
优选的，所述的胰岛素采用3-羟基丁酸或其类似物、3-羟基戊酸或其类似物或者3-羟基己酸或其类似物进行修饰。所述的3-羟基丁酸类似物选自3-羟基丁酸寡聚物、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯或3-羟基丁酸盐（例如钠盐、钾盐、钙盐等）。3-羟基戊酸类似物选自3-羟基戊酸寡聚物、3-羟基戊酸甲酯、3-羟基戊酸乙酯或3-羟基戊酸盐（例如钠盐、钾盐、钙盐等）。3-羟基己酸或其类似物选自3-羟基己酸寡聚物、3-羟基己酸甲酯、3-羟基己酸乙酯或3-羟基己酸盐（例如钠盐、钾盐、钙盐等）。所述的3-羟基丁酸或其类似物、3-羟基戊酸或其类似物或者3-羟基己酸或其类似物为D型、L型或者D型与L型的混合物。
优选的，所述的3-羟基丁酸或其类似物、3-羟基戊酸或其类似物或者3-羟基己酸或其类似物可以为人工合成或通过聚羟基脂肪酸（PHA）的水解和醇解（具体方法可参考文献Chen, G.Q. and Q. Wu, Microbial production and applications of chiralhydroxyalkanoates. ApplMicrobiolBiotechnol, 2005）获得。其中，经过水解和醇解获得3-羟基丁酸或其类似物、3-羟基戊酸或其类似物或者3-羟基己酸或其类似物还经过蒸馏纯化，通过GC分析确认纯度极高，没有双键等危害细胞生长的副产物。
优选的，胰岛素的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个以上的氨基修饰为酰胺基。
优选的，所述的氨基为游离氨基。
优选的，经修饰的胰岛素的氨基可以为A链和/或B链中任一氨基酸的氨基。
进一步优选的，经修饰的胰岛素的氨基可以为甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、组氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸或赖氨酸中任一个或两个以上的氨基。
更进一步优选的，所述的经修饰的胰岛素的氨基为赖氨酸和/或丝氨酸的氨基。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的经修饰的胰岛素的氨基为B链第29位赖氨酸的氨基。
在本发明的一个具体实施方式中，被修饰胰岛素的肽段为GFFYTPK，其赖氨酸（K）发生酰胺化修饰。
优选的，所述的胰岛素还包含其他修饰或氨基酸的突变，且保留其与胰岛素相同或相似的活性。包括但不限于A链和/或B链中两个氨基酸调换顺序，A链和/或B链中任一个或两个以上的氨基酸突变为其他氨基酸，A链和/或B链中N端和/C端增加一个或多个氨基酸，A链和/或B链中N端和/C端氨基酸截断，对A链和/或B链中任一个或两个以上的氨基酸的氨基和/或羧基修饰等等。
优选的，所述的胰岛素为动物来源胰岛素或胰岛素类似物。其中，动物来源胰岛素包括但不限于人胰岛素、牛胰岛素、羊胰岛素或猪胰岛素。所述的胰岛素类似物为以动物来源胰岛素为基础，进行氨基酸的修饰，氨基酸的重新排列，或者氨基酸的突变等等。其包括但不限于赖脯胰岛素（将人胰岛素的B28和B29位的脯氨酸与赖氨酸顺序调换）、门冬胰岛素（将人胰岛素B28位脯氨酸由天冬氨酸代替）、甘精胰岛素（用甘氨酸代替A链第21位的天冬氨酸，并在B链末端增加两个精氨酸）或地特胰岛素（在B链第29位连接一个C14游离脂肪酸，同时去掉B30位氨基酸）等等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述胰岛素采用3-羟基丁酸或者3-羟基戊酸将赖氨酸的氨基修饰为酰胺基。其中，所述3-羟基丁酸或者3-羟基戊酸为D型、L型或者D型与L型的混合物。
本发明的第二方面，提供了一种上述的胰岛素的制备方法，所述的制备方法包括将式I所示化合物与胰岛素发生缩合反应；
式I；
其中，R1为H、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、环烷基或芳基；优选的，所述的R1为直链或支链C1-C4的烷基。进一步优选的，R1为甲基。
R2为H、直链或支链的烷基、环烷基、芳基或金属离子；优选的，R2为直链或支链C1-C9的烷基、钙离子、钠离子或钾离子。进一步优选的，R2为甲基、氢、钙离子、钠离子或钾离子。
n为≥1的自然数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17等等。优选的，n=1-10的自然数。
在本发明的一个具体实施方式中，n=1，R1为甲基且R2为甲基。
在本发明的一个具体实施方式中，n=1，R1为甲基且R2为氢。
优选的，所述的制备方法包括将3-羟基丁酸或其类似物、3-羟基戊酸或其类似物或者3-羟基己酸或其类似物，与胰岛素发生缩合反应。所述的3-羟基丁酸类似物选自3-羟基丁酸寡聚物、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯或3-羟基丁酸盐（例如钠盐、钾盐、钙盐等）；3-羟基戊酸类似物选自3-羟基戊酸寡聚物、3-羟基戊酸甲酯、3-羟基戊酸乙酯或3-羟基戊酸盐（例如钠盐、钾盐、钙盐等）；3-羟基己酸或其类似物选自3-羟基己酸寡聚物、3-羟基己酸甲酯、3-羟基己酸乙酯或3-羟基己酸盐（例如钠盐、钾盐、钙盐等）。所述的3-羟基丁酸或其类似物、3-羟基戊酸或其类似物或者3-羟基己酸或其类似物为D型、L型或者D型与L型的混合物。
优选的，所述的3-羟基丁酸或其类似物、3-羟基戊酸或其类似物或者3-羟基己酸或其类似物可以为人工合成或通过聚羟基脂肪酸（PHA）的水解和醇解（具体方法可参考文献Chen, G.Q. and Q. Wu, Microbial production and applications of chiralhydroxyalkanoates. ApplMicrobiolBiotechnol, 2005）获得。其中，经过水解和醇解获得3-羟基丁酸或其类似物、3-羟基戊酸或其类似物或者3-羟基己酸或其类似物还经过蒸馏纯化，通过GC分析确认纯度极高，没有双键等危害细胞生长的副产物。
优选的，所述的缩合反应为氨基与羧基脱水缩合。
优选的，所述的制备方法还包括羧基活化的步骤。
在本发明的一个具体实施方式中，利用化学缩合剂（优选1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐），使3-羟基丁酸、3-羟基戊酸的羧基和胰岛素上赖氨酸的游离氨基反应，生成3-羟基丁酰化或3-羟基戊酰化修饰的胰岛素。
优选的，所述的胰岛素为动物来源胰岛素或胰岛素类似物。其中，动物来源胰岛素包括但不限于人胰岛素、牛胰岛素、羊胰岛素或猪胰岛素。所述的胰岛素类似物为以动物来源胰岛素为基础，进行氨基酸的修饰，氨基酸的重新排列，或者氨基酸的突变等等。其包括但不限于赖脯胰岛素（将人胰岛素的B28和B29位的脯氨酸与赖氨酸顺序调换）、门冬胰岛素（将人胰岛素B28位脯氨酸由天冬氨酸代替）、甘精胰岛素（用甘氨酸代替A链第21位的天冬氨酸，并在B链末端增加两个精氨酸）或地特胰岛素（在B链第29位连接一个C14游离脂肪酸，同时去掉B30位氨基酸）等等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的胰岛素的制备方法包括将3-羟基丁酸或者3-羟基戊酸与胰岛素发生缩合反应。
本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含上述的胰岛素，以及药学上可接受的载体。
本发明的第四方面，提供了一种上述的胰岛素或上述的药物组合物的应用，所述的应用选自：
a）在制备治疗和/或预防糖尿病的药物中的应用；
b）在促进脂肪细胞摄取葡萄糖中的应用；
c）在降低血糖中的应用；或者，
d）在抵抗还原剂中的应用。
本发明的第五方面，提供了一种上述的胰岛素或上述的药物组合物在治疗疾病中的应用。优选的，所述的疾病包括但不限于糖尿病，特别是胰岛素依赖型糖尿病，包括重型、消瘦、营养不良者；轻、中型经饮食和口服降血糖药治疗无效者；合并严重代谢紊乱（如酮症酸中毒、高渗性昏迷或乳酸酸中毒）、重度感染、消耗性疾病（如肺结核、肝硬变）和进行性视网膜、肾、神经等病变以及急性心肌梗塞、脑血管意外者；合并妊娠、分娩及大手术者。也可用于纠正细胞内缺钾。
本发明的第六方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述的方法包括向个体施加上述的胰岛素或上述的药物组合物。
优选的，所述的施加方式可以为注射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入个体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入个体。
优选的，所述的胰岛素或所述的药物组合物可以制成各种常规的剂型，例如注射液、片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊等。上述各种剂型的胰岛素或药物组合物均可以按照药学领域的常规方法制备。
优选的，所述的疾病包括但不限于糖尿病，特别是胰岛素依赖型糖尿病，包括重型、消瘦、营养不良者；轻、中型经饮食和口服降血糖药治疗无效者；合并严重代谢紊乱（如酮症酸中毒、高渗性昏迷或乳酸酸中毒）、重度感染、消耗性疾病（如肺结核、肝硬变）和进行性视网膜、肾、神经等病变以及急性心肌梗塞、脑血管意外者；合并妊娠、分娩及大手术者。也可用于纠正细胞内缺钾。
本发明所述经修饰的胰岛素，增强内源性的3-羟基丁酰辅酶A、3-羟基戊酰辅酶A的水平，可以调控胰岛素的稳定性，使胰岛素对还原剂二硫苏糖醇（Dithiothreitol，简称DTT）的抗性提高。3-羟基丁酰化及3-羟基戊酰化修饰提高胰岛素对细胞葡萄糖摄取的促进能力，并显著延长胰岛素在动物体内的作用时间，平缓而更长效地降低糖尿病小鼠血糖水平。即，胰岛素经修饰后可显著提高胰岛素的血浆半衰期，延长胰岛素的治疗时间，减少给药剂量或是频次。这不仅能显著降低胰岛素的治疗成本，还能够大大提高糖尿病患者的生存质量，提高患者生活信心。
本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述的“个体”可以为人或非人动物，所述的非人动物为哺乳动物，例如鼠、牛、羊、兔、猪、猴等非人哺乳动物。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本问列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“药学上可接受的”是指既不显著刺激生物体也不抑制所施用的产品的活性物质的生物学活性及特性。所述的“药学上可接受的载体”，为药学领域常规的包括但不限于稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和/或润湿剂等等。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：胰岛素修饰及纯化结果鉴定。其中，图A为3-羟基丁酸修饰胰岛素原理及3-羟基丁酰化胰岛素结构示意图（K-BHB Insulin，3HB-Insulin）；图B为3-羟基戊酰化胰岛素结构示意图（K-BHV Insulin，3-HV-Insulin）；图C为斑点免疫分析鉴定胰岛素修饰结果图，赖氨酸修饰肽段（K-bhb peptide）为阳性参照，未修饰胰岛素（Insulin）为阴性参照。
图2：质谱测定胰岛素3-羟基丁酰化修饰及3-羟基戊酰化修饰。其中，图A为3-羟基丁酰化修饰胰岛素质二级质谱分析图；图B为3-羟基戊酰化修饰胰岛素质二级质谱分析图。
图3：3-羟基丁酰化及3-羟基戊酰化修饰胰岛素的还原剂抵抗实验。
图4：3-羟基丁酰化及3-羟基戊酰化修饰胰岛素促进脂肪细胞葡萄糖摄取。
图5：3-羟基丁酰化及3-羟基戊酰化修饰改善胰岛素降血糖能力。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本申请所述的“TBST”为TBS+Tween-20的缩写，TBS缓冲液是生物学中常使用的等渗缓冲盐溶液，由Tris-HCl形成稳定的PH缓冲体系，NaCl提供等渗条件。
本申请所述的“PVDF膜”即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
本申请所述的“3HB”为3-羟基丁酸（3-hydroxybutyric acid）。
本申请所述的“3HV”为3-羟基戊酸（3-hydroxyvaleric acid）。
本申请使用的“赖氨酸3-羟基丁酰化抗体”来源于杭州景杰生物，货号分别为PTM-1204。
实施例1：胰岛素的3-羟基丁酰化修饰及纯化
1、修饰原理见图1A：在体外反应体系中，利用EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，sigma E7750）活化(R)-3-羟基丁酸的羧基，使其与肽链中赖氨酸残基末端的氨基形成酰胺键，达到3-羟基丁酰化修饰胰岛素赖氨酸的目的。(R)-3-羟基丁酸的寡聚物同样可以使用此方法进行目的蛋白赖氨酸位点多聚3-羟基丁酰化修饰。
2、准备试剂：
1)EDC：称取0.0192gEDC，溶于100μL去离子水中，配成1mol/L储液。使用时在体系中稀释100倍，工作浓度为10mM。
2)3HB：配置1mol/L储液。使用时在体系中稀释100倍，工作浓度为10mM。
3)3HV：配制1mol/L储液。由于已有3HV为液体酸，所以用枪头吸取0.118g液体酸，用1mol/L NaOH中和溶解。溶解后检测溶液pH值，尽量趋于中性。
4)胰岛素：在pH 2.0的稀盐酸中配置12.5mg/mL储液。使用时在体系中稀释12.5倍，工作浓度为1mg/mL。
5)NaOH：配制1mol/L溶液，称取4g NaOH粉末溶于100mL去离子水。
6)稀盐酸：配制pH 2.0稀盐酸，取浓盐酸（12mol/L）100μL稀释至120mL。
3、反应步骤：取EDC、3HB各10μL，胰岛素溶液80μL，加入到970μL去离子水中，充分混合均匀。吸取少量检测pH值，若接近中性，则直接室温孵育2h。若偏弱酸性，则加入0.8μL1 mol/L NaOH溶液中和后再进行室温孵育。
4、胰岛素纯化：
1）用13mL去离子水将1mL反应液稀释后加入到15mL 3K蛋白超滤管（Merckmillipore，UFC900396）中，4℃下5000g离心20min。离心结束后检测超滤管中剩余液量，若明显高于200μL，则适当加长离心时间。
2）倾倒收集管中液体，再加入14mL pH 1.0的稀盐酸溶液到包含上述200μL滤液的超滤管中，继续离心若干时间，使超滤管中剩余200μL液体后，重复本步骤一次。
3）将上一步骤中获得的200μL滤液移入1.5mL离心管中。取200μL pH 1.0的稀盐酸溶液清洗超滤管，并将超滤管倒扣入新的离心管中，离心10s后取出，将离心获得的清洗液与滤液混合，得到400μL浓度约2.5mg/mL的被修饰胰岛素溶液。
实施例2：免疫斑点法检测胰岛素3-羟基丁酰化修饰情况：
1、用甲醇和TBST活化PVDF膜，并用滤纸吸净水分。若使用尼龙膜则省去活化步骤。
2、取相同浓度未修饰胰岛素溶液（阴性参照）、赖氨酸3-羟基丁酰化肽段溶液（阳性参照），肽段为GFFYTPK、赖氨酸3-羟基丁酰化胰岛素（实施例1制备获得）溶液，调节pH值至约7.4。如胰岛素溶液pH值约1.0，加入等量1mol/L NaOH溶液中和胰岛素浓度约1.25μg/μL。
3、每组样品上样量为10μg，故取8μL阴性参照、阳性参照及被修饰的胰岛素溶液滴加在活化的PVDF膜或尼龙膜上。静置20min使蛋白溶液被PVDF膜充分吸收。
4、将PVDF膜或尼龙膜置于含5%脱脂牛奶的封闭液中室温封闭1h，用TBST洗涤液清洗3次。
5、用赖氨酸3-羟基丁酰化抗体（1:1000）孵育膜，室温下2h或4℃过夜。用TBST洗涤液清洗3次。
6、用辣根过氧化酶标记的兔二抗（1:5000）于室温下孵育膜1h后，用TBST洗涤液清洗3次后进行发光检测。
实验结果见图1C，表明胰岛素3-羟基丁酰化修饰成功。
实施例3：胰岛素的3-羟基戊酰化修饰及纯化
1、按照实施例1中方法准备各项试剂，取EDC、3HV各10μL，胰岛素溶液80μL，加入到970μL去离子水中，充分混合均匀。吸取少量检测pH值，若接近中性，则直接室温孵育2h。若偏弱酸性，则加入0.8μL 1mol/L NaOH溶液中和后再进行室温孵育。
2、反应结束后按照实施例1中方法对3-羟基戊酰化修饰胰岛素进行纯化，获得的3-羟基戊酰化修饰胰岛素结构见图1B。
实施例4：免疫斑点法检测胰岛素3-羟基戊酰化修饰情况：
1、用甲醇和TBST活化PVDF膜，并用滤纸吸净水分。若使用尼龙膜则省去活化步骤。
2、取相同浓度未修饰胰岛素溶液（阴性参照）、赖氨酸3-羟基戊酰化肽段溶液（阳性参照）、肽段为GFFYTPK，赖氨酸3-羟基戊酰化胰岛素（实施例3制备获得）溶液，调节pH值至约7.4。如胰岛素溶液pH值约1.0，加入等量1mol/L NaOH溶液中和胰岛素浓度约1.25μg/μL。
3、每组样品上样量为10μg，故取8μL阴性参照、阳性参照及被修饰的胰岛素溶液滴加在活化的PVDF膜或尼龙膜上。静置20min使蛋白溶液被PVDF膜充分吸收，封闭并清洗尼龙膜。
4、由于3-羟基丁酰化抗体可检测到3-羟基戊酰化信号，选用赖氨酸3-羟基丁酰化抗体（1:1000）孵育膜，室温下2h或4℃过夜。用TBST洗涤液清洗后用辣根过氧化酶标记的兔二抗（1:5000）于室温下孵育膜1h并进行发光检测。
实验结果见图1C，表明胰岛素3-羟基戊酰化修饰成功。
实施例5：胰岛素的3-羟基丁酸寡聚物酰化修饰及纯化
1、按照实施例1中方法准备各项试剂，取EDC、3-羟基丁酸寡聚物各10μL，胰岛素溶液80μL，加入到970μL去离子水中，充分混合均匀。吸取少量检测pH值，若接近中性，则直接室温孵育2h。若偏弱酸性，则加入0.8μL 1mol/L NaOH溶液中和后再进行室温孵育。
2、反应结束后按照实施例1中方法对3-羟基丁酸寡聚物酰化修饰胰岛素进行纯化。
实施例6：胰岛素的3-羟基戊酸寡聚物酰化修饰及纯化
1、按照实施例1中方法准备各项试剂，取EDC、3-羟基戊酸寡聚物各10μL，胰岛素溶液80μL，加入到970μL去离子水中，充分混合均匀。吸取少量检测pH值，若接近中性，则直接室温孵育2h。若偏弱酸性，则加入0.8μL 1mol/L NaOH溶液中和后再进行室温孵育。
2、反应结束后按照实施例1中方法对3-羟基戊酸寡聚物酰化修饰胰岛素进行纯化。
实施例7：胰岛素的3-羟基丁酸、3-羟基戊酸及其寡聚物混合物修饰及纯化
1、按照实施例1中方法准备各项试剂，取3-羟基丁酸、3-羟基戊酸及其寡聚物各10μL，EDC 40μL，胰岛素溶液320μL，加入到600μL去离子水中，充分混合均匀。吸取少量检测pH值，若接近中性，则直接室温孵育2h。若偏弱酸性，则加入3.2μL 1mol/L NaOH溶液中和后再进行室温孵育。
2、反应结束后按照实施例1中方法对上述混合物酰化修饰胰岛素进行纯化。
实施例8：质谱检测修饰后的胰岛素中赖氨酸修饰情况
1、取20μL实例1、3、5、6、7中获得的被修饰胰岛素溶液，分别用去离子水稀释至500μL后再用3K蛋白超滤浓缩（Merck millipore，UFC500324）浓缩至5μL。重复清洗4次以充分清除溶液中的各种离子及未反应的化合物，获得50μL修饰胰岛素水溶液。
2、用0.1%甲酸溶液将经过脱盐的抗体配成0.2mg/mL的胰岛素溶液，用于流动注射分析。用于LC-MS分析的胰岛素样品直接用超纯水配制，每次进样2μL，设定流速为1μL/min吸取蛋白质样品采集质谱信号，采集时间2min。
3、由流动注射或LC-MS分析得到的多电荷谱图，再经ProMass软件去卷积后得到样品相对分子质量信息，检索胰岛素赖氨酸上3-羟基丁酰化、3-羟基戊酰化及其寡聚酰化修饰存在情况。
实验结果见表1-2及图2，表明胰岛素GFFYTPK中赖氨酸（K）发生3-羟基丁酰化、3-羟基戊酰化修饰。
表1 图2A质谱b、y离子
表2 图2B质谱b、y离子
实施例9：3-羟基丁酰化及3-羟基戊酰化修饰胰岛素的还原剂抵抗实验
1、实验原理：胰岛素由A、B两条肽链组成，当加入还原剂二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）时，A、B链断裂，B链发生聚集。此时对溶液在360nm处的吸光度进行检测，可反映胰岛素聚集程度，以体现胰岛素在还原剂存在情况下的变性程度。
2、实验材料及反应体系见表3：
表3 实验材料及反应体系
3、设置分组，以混合缓冲液为空白对照，按照加入胰岛素种类分为insulin组、3HB-insulin组（实施例1制备获得）、3HV-Iinulin组（实施例3制备获得）。按照上述反应体系，依次向1.5mL离心管中加入反应组分，注意胰岛素最后加入。
4、将各组反应体系充分混匀，取200μL加入到96孔盘中，每组设置三个平行样本。在酶标仪软件中设置检测程序，每10s检测反应物在360nm处吸光度，以反映胰岛素的聚集程度，每组检测14min。
5、用测得的OD360值绘制曲线，观察不同组胰岛素的聚集曲线。曲线较低组胰岛素聚集水平更低。
实验结果见图3，表明3-羟基丁酰化及3-羟基戊酰化修饰均能提高胰岛素对还原剂DTT的抵抗能力，增强胰岛素稳定性。
实施例10：3-羟基丁酰化及3-羟基戊酰化修饰胰岛素促进脂肪细胞葡萄糖摄取
1、用六孔盘培养及诱导3T3-L1成熟脂肪细胞，提前24h更换全培养基。
2、实验前2h，移除细胞培养基，更换无糖无血清无双抗培养基对细胞进行脱葡萄糖处理。
3、移除上述培养基，并用室温PBS小心清洗细胞。充分吸干PBS后，加入含10μg/mL胰岛素或修饰胰岛素的PBS 1mL。充分覆盖住细胞后，将培养板移入37℃、5%CO2培养箱中激活细胞15min。
4、使用Promega葡萄糖摄取检测试剂盒，提前1h将2DG6P反应液配置好。按照100μL/样本体积量，按照说明书提供的各试剂比例进行配置。
5、配置细胞反应液：移除培养盘中胰岛素溶液，并用PBS小心清洗一遍。每孔细胞加入1mL 1mM 2DG（2-脱氧葡萄糖）溶液，于37℃、5% CO2培养箱孵育20min。孵育结束后，加入500μL终止液。充分裂解细胞后加入500μL中和液。收集细胞板中液体，移入1.5mL离心管中，于室温12000g离心5min，充分去除细胞碎片后收集上清。
6、将100μL2DG6P反应液与100μL细胞反应液在96孔盘中充分混合，于室温下避光孵育1h，随机在多模式微孔板检测仪中检测荧光强度。荧光强度越高，证明细胞摄取葡萄糖能力越强。
实验结果见图4，表明3-羟基丁酰化（实施例1制备获得）及3-羟基戊酰化（实施例3制备获得）修饰后的胰岛素具有更显著的促进细胞摄取葡萄糖的能力。
实施例11：3-羟基丁酰化及3-羟基戊酰化修饰改善胰岛素降血糖能力
1、选取4周零db/db小鼠（二型糖尿病小鼠），给予高脂饮食喂养4周后检测小鼠空腹血糖水平。若空腹血糖水平达7.8mmol/L以上，则表明2型糖尿病小鼠模型成功。
2、选取db/db（2型糖尿病小鼠）三组，每组大于等于5只小鼠。分别给予皮下注射0.2mg/kg未修饰胰岛素（Insulin）、3HB修饰胰岛素（3HB-Insulin，实施例1制备获得）、3HV修饰胰岛素（3HV-Insulin，实施例3制备获得），在注射后第0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、9小时检测小鼠血糖值。
3、以第0小时基础血糖为基数，注射胰岛素后每个时间点血糖值与第0小时血糖值做比值，获得相对血糖值并绘制曲线，可直观表示胰岛素降血糖效果。
实验结果见图5，表明3-羟基丁酰化及3-羟基戊酰化修饰后的胰岛素在2型糖尿病小鼠体内具有更平稳更长效的降血糖效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (5)
1.一种经修饰的胰岛素，其特征在于，所述胰岛素采用(R)-3-羟基丁酸或其寡聚物，或者，(R)-3-羟基戊酸或其寡聚物将赖氨酸的氨基修饰为酰胺基，所述的胰岛素为人胰岛素。
2.一种权利要求1所述的胰岛素的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将(R)-3-羟基丁酸或其寡聚物，或者，(R)-3-羟基戊酸或其寡聚物与胰岛素发生缩合反应，所述的胰岛素为人胰岛素。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求1所述的胰岛素，以及药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润湿剂中的一种或两种以上的组合。
5.一种权利要求1所述的胰岛素或权利要求3-4任一所述的药物组合物的应用，其特征在于，所述的应用选自：
a）在制备治疗和/或预防糖尿病的药物中的应用；
b）在促进脂肪细胞摄取葡萄糖中的应用，所述的应用为非疾病的治疗方法；
c）在降低血糖中的应用，所述的应用为非疾病的治疗方法；或者，
d）在抵抗还原剂中的应用，所述的应用为非疾病的治疗方法。
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