CN100344280C - 3－羟基丁酸及其衍生物的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了3-羟基丁酸及其衍生物和类似物的新用途。本发明发明人通过体内、外实验证实，3-羟基丁酸及其衍生物可以调整骨代谢，具有疗效确切、无毒副作用等优点，可以用于防治骨质减少(osteopenia)、骨质疏松症、重度骨质疏松症以及相关骨折等骨质疏松症的食品添加剂或药物。

Description

3-羟基丁酸及其衍生物的新用途

技术领域

本发明涉及3-羟基丁酸及其衍生物在医药或食品添加剂领域的新用途。

背景技术

随着世界人口结构的老龄化，老年人的医疗保健正日益受到社会的广泛重视。世界卫生组织的统计表明，目前骨质疏松症的发病率已在世界常见多发病中跃居到第7位，世界上患者总数超过2亿人，其中仅美国、西欧和日本就有7500多万人，每年治疗及住院费用高达250亿美元(Consensus Development Conference：Prophylaxisand Treatment of osteoporosis.Am J Med 90(1991)107-110)。而据我国流行病学调查报告，骨质疏松症50-60岁发病率为21％，60-70岁发病率为58％，70-80岁发病率为100％。尤其是绝经后妇女，骨质疏松症和骨折并发症发病率更高，男女比率约1∶8(朱汉民.老年骨质疏松症在我国的流行趋势.实用老年医学14(2000)115-118)。目前，骨质疏松症已经成为包括我国在内的各个国家面临的严峻问题。世界健康组织已经宣布2000-2010年这十年为骨和关节疾病的十年。

骨质疏松症是由于人体骨质吸收和骨质形成失衡所产生的一组疾病，其特征为骨量减少、骨的微观结构退化，根据其产生的主要病因分为老年性骨质疏松症和绝经后妇女骨质疏松症二类。目前治疗骨质疏松症常使用的药物主要有

1)抑制骨吸收的药物：主要有钙剂、雌激素、降钙素、维生素D、异丙氧黄酮类和二磷酸盐类药物等；

2)促进骨形成的药物：包括有甲状旁腺激素、生长激素及某些生长因子、氟化物、维生素K2、雄激素和蛋白同化激素等；

3)中药类：目前国内使用较多的为滋阴补肾类药物(郭世绂，罗先正，邱贵兴主编，骨质疏松基础与临床天津科学技术出版社2001)。

西欧国家的一项研究表明：在经诊断患骨质疏松症病人中的接受人群中，48.5％采用补钙；25％使用降钙素；19％服用双膦酸盐类；9％采用激素替代治疗。但是这些疗法目前都存在或多或少的问题，比如雌激素诱发肿瘤，双膦酸盐不能促进成骨，补钙剂的吸收以及增加骨的脆性问题等等，使得当前寻找一种方便有效、副作用小的治疗骨质疏松药物成为迫在眉睫的任务。

(R)-3-羟基丁酸((R)-3-hydroxybutyrate)是哺乳动物体内由肝脏内的长链脂肪酸代谢而产生的，作为主要的酮体存在于血浆和外周组织中，人体血浆和组织内的(R)-3-羟基丁酸水平正常情况下保持在0.1mM(Robinson，AM，Williamson，DH.Physiol Rev 60(1980)143-187)。很长时间内(R)-3-羟基丁酸被公认为体内重要的能量代谢和利用的中间产物之一(Mackey，EM.J Clin Endocrinol 3(1943)101-110)，后来(R)-3-羟基丁酸就被发现与体内能量代谢紊乱、糖尿病等重大疾病密切相关(Manfred J.Muller，et al.J.Clin.Invest.74(1984)249-261；BarbaraPlecko，et al.Pediatric Research 52(2002)301-306)。因为(R)-3-羟基丁酸具有很好的穿透性并且能快速地扩散到外周组织，已有文献报道使用外源的(R)-3-羟基丁酸(口服或者注射)来治疗一些疾病及损伤，如出血性休克(Katayama，M，Hiraide，A，Sugimoto，H，Yoshioka，T，Sugimoto，T.JPEN J Parenter Enteral Nutr18(1994)442-446；Hiraide，A，Katayama，M，Mizobata，Y，Sugimoto，H，Yoshioka，T，Sugimoto，T.Eur Surg Res 23(1991)250-255)，心肌损伤(Zhitian Zou，et al.Am J Physiol Heart Circ Physiol 283(2002)H1968-H1974)，大面积烧伤(Mizobata，Y，Hiraide，A，Katayama，M，Sugimoto，H，Yoshioka，T，Sugimoto，T.Surg Today26(1996)173-178)和脑供氧不足，缺氧症以及缺血症(Suzuki，M，Suzuki，M，Sato，K，et al.Jpn J Pharmacol 87(2001)143-150)。在这些情况下，(R)-3-羟基丁酸改善了组织损伤，蛋白代谢以及代谢紊乱。另有报道说(R)-3-羟基丁酸可以校正线粒体能量产生的缺陷，并且估计(R)-3-羟基丁酸不是通过减轻线粒体复合物I的抑制，而是通过一种依赖线粒体复合物II(琥珀酸-泛醌氧化还原酶)的机理来加强氧化磷酸化实现的(Kim T.et al.J.Clin.Invest.112(2003)892-901)。这些证据都表明(R)-3-羟基丁酸对于压力诱导的不同疾病的可能的治疗功效(Veech，RL，Chance，B，Kashiwaya，Y，Lardy，HA，Cahill，GF，Jr.IUBMB Life 51(2001)241-247)。而且，已有实验表明(R)-3-羟基丁酸可以减少人类阿尔兹默症和帕金森症模式的神经细胞系的细胞死亡(Kashiwaya，Y.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.97(2000)5440-5444)。体内血浆中(R)-3-羟基丁酸水平的提高可以改善患有记忆紊乱相关疾病(如阿尔兹默症和帕金森症)老年人的认知功能(Mark A.Reger，et al.Neurobiology of Aging 25(2004)311-314)。另外，(R)-3-羟基丁酸还被发现可以通过抑制细胞凋亡来改善角膜上皮的损伤(Shigeru N.et al.IOVS 44(2003)4682-4688)。近期的一篇专利(WO2004108740)描述了(R)-3-羟基丁酸除了具有营养功能之外，还具有治疗许多疾病的作用，该专利将(R)-3-羟基丁酸的作用概括如下：

1、可以治疗许多得益于酮体水平提高的疾病(如包括癫痫和肌阵挛的神经紊乱疾病以及包括阿尔兹默症和痴呆等的神经退化性疾病)；

2、通过氧化辅酶Q来减少自由基伤害(如缺血症)；

3、加强代谢效率(提高训练效率以及运动成绩，治疗供养不足、心绞痛、心肌梗塞等)；

4、治疗如癌症尤其是脑癌(如星细胞瘤等)相关的疾病；

5、对于糖代谢紊乱(如I型糖尿病、II型糖尿病、低血糖低酮体症等)具有很好的疗效。

发明内容

本发明的目的是提供3-羟基丁酸及其衍生物的新用途。

本发明发明人通过实验证实，3-羟基丁酸，3-羟基丁酸盐，3-羟基丁酸衍生物，和/或3-羟基丁酸类似物在体外具有促进成骨细胞骨形成的活性；体内动物实验表明，给药组与模型组大鼠相比，大鼠的骨密度明显增加，血清骨钙素，雌二醇水平有明显的提高，结果表明该药物可有效抑制过高的骨转换率，促进骨形成而发挥抗骨质疏松作用；给药组大鼠的骨钙、骨磷含量与模型组相比均显著增加，结果表明该药物可促进骨矿物质在骨的沉积，提高大鼠骨矿含量和骨密度，而且可以促进骨结构的再建，改善骨的内部结构，从而使骨组织的承载能力增强而降低骨折的发生，说明3-羟基丁酸，3-羟基丁酸盐，3-羟基丁酸衍生物，和/或3-羟基丁酸类似物能用于制备为防治骨质疏松症的药物或食品添加剂。

其中，3-羟基丁酸及其药用盐可以是单一立体结构的化合物，也可以使用(R)和(S)构型的混合物，比如外消旋的混合物；其中，优选为(R)-3-羟基丁酸。所述3-羟基丁酸盐主要为3-羟基丁酸钠和3-羟基丁酸钾等，而且由于3-羟基丁酸的酸性使得3-羟基丁酸的摄入会导致体内酸过多现象，因此，优选使用3-羟基丁酸盐。

3-羟基丁酸衍生物包括单纯寡聚物或共聚寡聚物或所述单纯寡聚物和共聚寡聚物的混合物(100个单体以内，最好平均分子量不超过1000g/mol)、单纯聚合物(如聚(R)-3-羟基丁酸酯PHB)或共聚物(如(R)-3-羟基丁酸与(R)-3-羟基戊酸、(R)-3-羟基己酸和(R)-3-羟基癸酸的共聚物)或所述单纯聚合物和共聚物的混合物：3-羟基丁酸的这些衍生物被称为是生酮膳食，在体内可以降解为单体3-羟基丁酸而发挥作用(参见WO0004895、MXPA01000632)。

3-羟基丁酸类似物包括3-羟基戊酸、3-羟基己酸、3-羟基癸酸等的单一立体结构的化合物、R和S型的混合物(包括外消旋结构的化合物)，单纯寡聚物或共聚寡聚物或所述单纯寡聚物和共聚寡聚物的混合物、单纯聚合物或共聚物或所述单纯聚合物和共聚物的混合物；优选为(R)-3-羟基戊酸、(R)-3-羟基己酸、(R)-3-羟基癸酸。

需要的时候，可以在上述药物中加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。或者，直接将3-羟基丁酸及其衍生物添加到食品中，制成功能性食品。这些药物或食品的有效剂量为30～1000mg/kg体重/d。

本发明的(R)-3-羟基丁酸及其类似物的单纯聚合物或共聚物或所述单纯聚合物和共聚物的混合物，可以通过基因工程微生物发酵方法获得(席建忠.微生物方法合成手性羟基脂肪酸.清华大学硕士论文(2000)；Gao HJ，Wu Q，Chen GQ.FEMSMicrobiol Lett 213(2002)59-65；Zhao K，Tian G，Zheng Z，Chen JC，Chen GQ.FEMS Microbiol Lett 218(2003)59-64；Zheng Z，Zhang MJ，Zhang G and Chen GQ.Antonie van Leeuwenhoek 2(2004)93-101)。(R)-3-羟基丁酸及其类似物的单体、单纯寡聚物或共聚寡聚物或所述单纯寡聚物和共聚寡聚物的混合物可以通过水解或酶解相应聚合物的方法获得；也可以直接通过化学合成的方法合成(Sang Yup Lee，Young Lee，Fulai Wang，Biotechnology and Bioengineering 65(1999)363-368；Seebach，et al.，Angew.Chem.Int.Eng.Ed.，4(1992)434-435；Seebach，etal.，Helv.Chim.Acta.，1(1988)155-167；Seebach，etal.，Helv.Chim.Acta.72(1989)1704-1717；and Mueller，et al.，Chimia 45(1991)376。)

本发明3-羟基丁酸及其衍生物和类似物具有疗效确切、无毒副作用等优点，可以用于防治骨质减少(osteopenia)、骨质疏松症、重度骨质疏松症以及相关骨折等骨质疏松症的食品添加剂或药物。

附图说明

图1为(R)-3-羟基丁酸对MC3T3-E1细胞活性的影响；

图2为(R)-3-羟基丁酸对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶的影响；

图3为(R)-3-羟基丁酸对MC3T3-E1细胞凋亡的保护作用。

具体实施方式

实施例1、(R)-3-羟基丁酸和其类似物的制备

一、(R)-3-羟基丁酸的制备

可采取降解酶降解聚合物聚(R)-3-羟基丁酸酯(PHB)(购自汕头联亿公司)的方法来制备(R)-3-羟基丁酸，具体方法如下：

1)胞外降解酶的提取：

Pseudomonas lemoignei(ATCC 17989)在琥珀酸钠矿物培养基中30℃、200rpm培养36h；菌液于11000rpm、4℃离心30min，弃去沉淀；冰浴条件下，向上清中加入75％饱和浓度的(NH₄)₂SO₄，11000rpm、4℃离心30min，弃去上清；沉淀溶于10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.2-7.4)中，4℃保存。

2)胞外降解酶降解PHB：

上述胞外提取物的缓冲溶液30ml，加入0.5g PHB，30℃、200rpm，降解72h。

3)(R)-3-羟基丁酸的提取：

降解产物于2000rpm离心10min，弃去沉淀，上清液经0.45μm的过滤器(上海兴亚净化材料厂)过滤后，加入5kD超滤管(Millipore)，3200rpm离心60min。将过滤后的溶液冰冻干燥。

其中，所用的琥珀酸钠矿物培养基配方如下：

NaOOCCH₂CH₂COONa·6H₂O           6.67g

NH₄Cl                              1.00g

MgSO₄·7H₂O                       0.50g

FeCl₃·6H₂O                       0.10g

KH₂PO₄                            2.30g

Na₂HPO₄·12H₂O                   5.80g

CaCl₂·2H₂O                       0.005g

H₂O                                1L。

10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.2-7.4)配方如下：

10mM Tris-HCl

1mM CaCl₂

5％甘油。

二、(R)-3-羟基丁酸类似物的制备

(R)-3-羟基丁酸类似物：(R)-3-羟基戊酸、(R)-3-羟基己酸、(R)-3-羟基癸酸可以采用与(R)-3-羟基丁酸相同的制备方法，即采取降解酶降解(R)-3-羟基丁酸和其类似物的共聚物PHBV、PHBHHx、PHBHO的方法来获得(R)-3-羟基丁酸和其类似物的单体，然后采用柱分离的方法分离(R)-3-羟基丁酸和其类似物从而获得(R)-3-羟基丁酸的类似物(R)-3-羟基戊酸、(R)-3-羟基己酸、(R)-3-羟基癸酸。所用的PHBV、PHBHHx、PHBHO购自于汕头联亿公司。降解、提取过程与步骤一相同，产物采用柱分离方法分离得到(R)-3-羟基丁酸和其类似物(R)-3-羟基戊酸、(R)-3-羟基己酸、(R)-3-羟基癸酸(Sang Yup Lee，Young Lee，Fulai Wang，Biotechnology and Bioengineering 65(1999)363-368))。

实施例2、(R)-3-羟基丁酸对成骨细胞系MC3T3-E1细胞活性的影响

MTT[3-(4，5dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一种淡黄色唑氮盐，是线粒体脱氢酶的作用底物，经活细胞作用后还原为不溶于水的蓝紫色甲臢(formazan)结晶，用裂解液如二甲基亚砜(DMSO)溶解后在550～610nm较宽范围内有一个最大吸收峰，用分光光度计可测定其含量。MTT法测定成骨细胞存活和增殖具有简便、迅速、准确、安全等优点。

细胞系：成骨细胞MC3T3-E1(购自RIKEN Cell Bank(RCB1126))。

培养基：DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(购自Gibco公司)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/L二羟乙基呱嗪乙烷磺酸(Hepes)，2g/L碳酸氢钠，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，10％胎牛血清(FBS)。

无血清培养基：DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/L Hepes，2g/L碳酸氢钠，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素。

消化液：DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/LHepes，2g/L NaHCO₃，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，0.2％胰蛋白酶(Trypsin)，0.02％二乙胺四乙酸(EDTA)。

冲洗液：磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline或PBS)(8.0g/L氯化钠、0.20g/L氯化钾、1.44g/L磷酸氢二钠、0.24g/L磷酸二氢钾)，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，pH 7.2。

MTT染液：5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS，购自Ameresco)。

裂解液：DMSO。

(R)-3-羟基丁酸：由实施例1制备。

(R)-3-羟基丁酸的添加浓度均分别为：0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L，0.2g/L，0.5g/L，1g/L。

培养条件：37℃，5％CO₂恒温培养箱，接种量为10⁴个/孔(48孔细胞培养板)

用MTT法测定细胞的活性：

1)染色：将成骨细胞MC3T3-E1在48孔板中培养3d后，吸去培养液，加入无菌的PBS荡洗3次。再加入0.05ml MTT染液(5mg/ml)和0.45ml不含血清的培养基，置于培养箱中保存4小时；

2)吸去上清，加入0.5ml DMSO，室温下放置30分钟，使颜色颗粒充分溶解；

3)取0.2ml待测液加入到96孔酶标板中，酶标仪550nm下测定吸光度值。

全部数据用 x±s表示，使用SPSS10.0统计软件(购自SPSS公司)，用t检验来分析组间差异，p＜0.05有差异，p＜0.01有显著性差异，下同。

结果如图1所示，表明在添加了(R)-3-羟基丁酸(3HB)后，均产生一定的促进成骨细胞生长的作用，最佳添加浓度范围为0.1～0.5g/L。

实施例3、(R)-3-羟基丁酸对成骨细胞MC3T3-E1的碱性磷酸酶活性的影响

成骨细胞含丰富的碱性磷酸酶(ALP)，碱性磷酸酶是成骨细胞的特异标志酶，功能活跃时活性增高，可以利用碱性磷酸酶(ALP)染色法测定(R)-3-羟基丁酸对成骨细胞MC3T3-E1的碱性磷酸酶活性的影响。

细胞培养方法同实施例2，培养6天后，以对硝基酚磷酸盐(PNPP)(购自Sigma)作底物，在pH 10.5、37℃条件下，ALP使PNPP转化为黄色的对硝基酚(PNP)，应用分光光度计405nm波长测定吸收值，结果如图2所示。

结果表明，(R)-3-羟基丁酸(3HB)可以促进成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的活性，最佳浓度为0.1g/L。

实施例4、(R)-3-羟基丁酸对成骨细胞系MC3T3-E1的钙化现象的影响

成骨细胞培养一定的时间后具有形成矿化结节的能力，是成骨细胞的重要标志。矿化结节形成代表了成骨细胞分化成熟，行使成骨功能的阶段，是成骨功能的形态表现。它是由于成骨细胞分泌的碱性磷酸酶促进有机磷分解为磷酸盐，使钙盐沉积，形成矿化结节，可以采用茜素红染色法来进行测定。

细胞培养同实施例2，培养18天后，细胞经95％酒精固定，0.1％茜素红液(购自北京化学试剂公司)染色。以橘红色结节、边界清晰、＞200μm为标准，在40倍光镜下作结节计数(Toyonobu Maeda，et al.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 280(2001)874-877)，结果如表1所示。

表1(R)-3-羟基丁酸对成骨细胞MC3T3-E1钙化的影响(*p＜0.05)

组别	钙化节的数量(个/视野)
		对照3HB0.001g/L3HB0.01g/L	1.50±0.761.50±0.381.59±0.74*

3HB0.1g/L3HB1g/L

1.63±0.72*1.65±0.65*

由表1的统计可以看出，随着浓度的升高，(R)-3-羟基丁酸有明显的促进成骨细胞钙化的能力。

实施例5、(R)-3-羟基丁酸对成骨细胞MC3T3-E1细胞凋亡的抑制作用

血清饥饿培养法诱导细胞凋亡，加入(R)-3-羟基丁酸后，利用MTT法检测活细胞的量，并用Hoechst33342染色法(Schmid I，et al.Cytometry 15(1994)12-20)鉴定(R)-3-羟基丁酸对成骨细胞MC3T3-E1细胞凋亡的抑制作用。

有文献报道血清饥饿培养可以诱导成骨细胞MC3T3-E1的凋亡，而大豆的乙醇提取物可以抑制这种凋亡(Choi E.M.，et al.Phytochemistry 56(2001)733-739)。

细胞培养过程同实施例2，培养2天至细胞接近融合。PBS洗2遍，培养液换成DMEM+10％FBS，DMEM+0.1％牛血清白蛋白(BSA)以及DMEM+0.1％BSA+0.001，0.01，0.1，1g/L 3-羟基丁酸，继续培养2天。用实施例2的MTT法检测细胞活性，结果如图3。

图3的结果显示，血清饥饿培养的条件下，几乎50％的细胞发生了凋亡。而(R)-3-羟基丁酸可以抑制这种血清饥饿诱导的成骨细胞凋亡，这种抑制作用的最佳浓度也是0.1g/L。

将按上述过程培养的细胞用PBS荡洗2遍，用1％戊二醛固定后，8mg/ml的Hoechst33342染液染色30分钟，荧光显微镜下鉴定细胞调亡。结果表明，血清饥饿条件下的细胞胞质固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核碎裂或形成凋亡小体(Keishi Hata，et al.Biol.Pharm.Bull.25(2002)1040-1044)。

实施例6、(R)-3-羟基丁酸(R3HB)和(R)-3-羟基丁酸钠盐(R3HBNa)的动物实验

一、材料与方法

实验动物为清洁级雌性Wistar大鼠84只(体重250g左右，3月龄，未曾交配)，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物购进后，饲养于环境温度为25℃左右的清洁级实验动物室，自由进食饲料，饮用自来水，适应性喂养1周后用于实验。

骨质疏松大鼠模型的建立采用双侧卵巢摘除法：通过向各组大鼠腹腔内注射戊巴比妥(50mg/kg体重)进行麻醉，并进行双测卵巢摘除(OVX)的手术。假性手术(Sham)是通过戊巴比妥麻醉，并以镊子触动双测卵巢，假性手术组12只。术后7天将卵巢切除者按体重随机分为6组(每组12只)、即模型空白组、(R)-3-羟基丁酸给药低剂量组、(R)-3-羟基丁酸钠盐给药低剂量组、(R)-3-羟基丁酸钠盐给药中剂量组、(R)-3-羟基丁酸钠盐给药高剂量组、阳性对照组(尼尔雌醇)。

(R)-3-羟基丁酸根据实施例1的方法制备；

(R)-3-羟基丁酸钠盐购自Sigma；

尼尔雌醇购自北京四环制药厂，批号20040702。

术后7天开始给药：给药低剂量为30mg/kg体重/d，给药中剂量为150mg/kg体重/d，给药高剂量为750mg/kg体重/d，灌胃(药物溶于生理盐水中)，各组给药容积为1ml/100g体重，每日一次；尼尔雌醇1.5mg/kg体重，同样溶于生理盐水，一周灌胃一次；假手术组和模型空白组每天灌胃相应体积的生理盐水。每周称量体重一次，调整给药量，连续给药12周。存活动物在最后一次给药后24小时，称重后处死，并收集以下标本进行测量。

1、骨密度测定

取大鼠下肢左侧股骨，剔尽肌肉及筋膜，放入4℃保存。测量时取出，使用双能X射线吸收法(Dual Energy X-ray Absorptionmetry，DEXA)进行平均骨密度(BMD)的测定(Yoshiko Iwasaki-Ishizuka，et al.Life Sciences 76(2005)1721-1734)。

2、骨生物力学分析

取大鼠下肢右侧股骨，尽量剔除肌肉及筋膜，并注意勿伤及骨膜。用沾满生理盐水的纱布包裹，放入-20℃保存。测量时取出放入生理盐水中，室温20℃下浸泡复温3～4小时。用电子万能试验机测定最大负荷及破坏挠度(秦腊梅等  中国临床康复7(2003)1370-1372)。

3、血清生化指标的测定及子宫称重

由腹主动脉抽取全血，3000转每分钟离心5分钟，分离血清，-35℃保存。用血清钙、磷、碱性磷酸酶试剂盒(德国贝克曼公司)，雌二醇放免试剂盒(购自天津得普公司)检测血清中钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)、雌二醇(E2)的含量，观察组间的测试变化，摘除子宫并测定其重量(秦腊梅等  中国临床康复7(2003)1370-1372)。

二、结果与分析

1、骨质疏松症大鼠模型

骨质疏松症大鼠模型成立，模型评价：(1)子宫指数明显降低；(2)离体股骨骨密度显著下降；(3)骨代谢生化指标等有典型骨质疏松症表现。

2、(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基丁酸钠盐可明显提高骨密度，结果如表2。

                                   表2、各组药物对骨质疏松大鼠骨密度的影响

组别	N	骨密度(mg/cm2)	最大负荷(kg)	破坏挠度(mm)	体重(g)
						假手术组模型对照组R3HB低剂量组R3HBNa低剂量组R3HBNa中剂量组R3HBNa高剂量组尼尔雌醇组	12121212121212	2.81±0.122.69±0.09##2.73±0.09*2.72±0.07*2.75±0.07**2.77±0.06*2.73±0.08*	111.75±5.69104.56±6.36##102.98±6.98102.80±7.92116.25±12.34*105.76±9.76106.01±10.39	0.8288±0.05460.7222±0.0721#0.7721±0.1021*0.7630±0.1002*0.8260±0.0989*0.7320±0.09210.7370±0.0611*	347.1±21.5382.9±19.9##383.0±22.9380.1±21.2389.8±17.6*385.4±28.1*390.2±29.7**

(与模型对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01。与假手术组比较#p＜0.05，##p＜0.01。)

3、(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基丁酸钠盐可增加子宫指数，但差异不明显；可以提高血清中钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)、雌二醇(E2)的含量，结果如表3。

                              表3、各组药物对骨质疏松大鼠血清生化指标及体重与子宫湿重的影响

组别	N	Ca(mmol/L)	P(mmol/L)	ALP(IU/L)	E2(pg/L)	子宫湿重(g)
							假手术组模型对照组R3HB低剂量组R3HBNa低剂量组R3HBNa中剂量组R3HBNa高剂量组尼尔雌醇组	12121212121212	2.49±0.062.44±0.10#2.51±0.102.49±0.082.53±0.11*2.51±0.16*2.55±0.05**	2.35±0.492.05±0.33#2.41±0.41*2.39±0.38*2.40±0.80*2.39±0.692.41±0.51*	74.6±24.584.2±17.9#122.0±27.2**121.7±30.5**129.1±29.9**127.3±34.9**129.6±39.2**	19.1±5.68.1±1.3##8.9±1.2*8.9±1.6*9.3±2.6**9.9±4.19.9±3.3*	0.67±0.120.21±0.06##0.26±0.10*0.26±0.11*0.25±0.09*0.23±0.06*0.32±0.10**

(与模型对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01。与假手术组比较#p＜0.05，##p＜0.01。)

(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基丁酸钠盐具有提高骨密度、改善骨代谢、促进骨形成、抑制骨吸收等作用，因而对骨质疏松症有良好的防治效果。给药组大鼠的骨钙、骨磷含量与模型组相比均显著增加，表明该药物可促进骨矿物质在骨的沉积，提高大鼠骨矿含量和骨密度，而且可以促进骨结构的再建，改善骨的内部结构，从而使骨组织的承载能力增强而降低骨折的发生。

实施例7、(R)-3-羟基丁酸的衍生物及类似物的动物实验

一、材料与方法

(R)-3-羟基丁酸根据实施例1的方法降解PHB获得；

(R)-3-羟基戊酸根据实施例1的方法降解PHBV获得；

(R)-3-羟基己酸根据实施例1的方法降解PHBHHx获得；

(R)-3-羟基癸酸根据实施例1的方法降解PHBHD获得；

(S)-3-羟基丁酸购自Sigma公司；

实验用OHB采用降解PHB的方法获得，具体方法为：

1)将150g PHB加热溶解于2L冰醋酸和盐酸中；

2)慢慢将350ml水加入上述粘性溶液中形成均一相；

3)回流加热反应混合物18个小时；

4)降温至55℃左右后，将反应混合物倒入9L水中，并快速搅拌；

5)收集白色沉淀，并用水洗，干燥后可产生92g OHB，经NMR鉴定分子量大约为200g/mol。

实验用PHB和PHBHHx的纳米颗粒制备方法如下：

1)将1体积的5％(w/v)聚合物的氯仿溶液于60℃蒸馏20分钟；

2)慢慢地将有机溶液加入20体积的5mM十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(购自北京化学试剂公司)水溶液中；

3)超声振荡4分钟(高能，0℃)获得颗粒的悬浮液；

4)使用旋转蒸发仪蒸发掉氯仿；

5)离心，弃上清液以除去CTAB；

6)将颗粒(60～70nm)沉淀制成PBS的悬浮液，90℃灭菌40分钟。

所用PHB和PHBHHx购自于汕头联亿公司。

实验动物为清洁级雌性Wistar大鼠80只，采用与实施例6相同的方法——双侧卵巢摘除法建立骨质疏松大鼠模型。假性手术组8只，卵巢切除组按体重随机分为9组(每组8只)：模型空白组、OHB给药组、PHB给药组、PHBHHx给药组、(R)-3-羟基丁酸(R3HB)给药组、(S)-3-羟基丁酸(S3HB)给药组、(R)-3-羟基戊酸(R3HV)给药组、(R)-3-羟基己酸(R3HHx)给药组、(R)-3-羟基癸酸(R3HO)给药组。

术后7天开始给药：(R)-3-羟基丁酸给药组给药剂量为150mg/kg体重/d，(S)-3-羟基丁酸给药组给药剂量为150mg/kg体重/d，(R)-3-羟基戊酸(R3HV)给药组给药剂量为150mg/kg体重/d，(R)-3-羟基己酸给药组给药剂量为150mg/kg体重/d，(R)-3-羟基癸酸(R3HO)给药组给药剂量为150mg/kg体重/d，OHB给药组给药剂量为150mg/kg体重/d，PHB给药组给药剂量为150mg/kg体重/d，PHBHHx给药剂量为150mg/kg体重/d。然后，进行骨密度测定、骨生物力学分析等，方法同实施例6。

二、结果与分析

1、各给药组的骨密度有明显提高，结果见表4。

                                   表4、各组药物对骨质疏松大鼠骨密度的影响

组别	N	骨密度(mg/cm2)	最大负荷(kg)	破坏挠度(mm)	体重(g)
						假手术组模型对照组OHB给药组PHB给药组PHBHHx给药组R3HB给药组S3HB给药组R3HV给药组R3HHx给药组R3HO给药组	8888888888	2.80±0.112.70±0.05##2.74±0.07**2.74±0.09*2.71±0.08*2.75±0.04**2.69±0.232.73±0.07*2.72±0.10*2.71±0.12*	112.10±6.32105.05±5.45##113.33±5.81*112.80±9.01*106.86±9.65116.09±10.98*106.09±7.21110.27±7.29*107.98±6.95*107.23±8.56*	0.8721±0.06420.7212±0.0879#0.8045±0.0721**0.8023±0.0978*0.7587±0.0915*0.8268±0.0667**0.7565±0.10720.7869±0.1121*0.7677±0.1095*0.7700±0.0998*	349.1±21.9385.0±23.2##388.3±20.2385.1±21.2385.2±27.1387.9±18.9385.9±20.9384.9±21.1385.4±22.8385.7±24.2

(与模型对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01。与假手术组比较#p＜0.05，##p＜0.01。)

2、各给药组的子宫指数有所增加，但差异不明显；血清中钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)、雌二醇(E2)的含量也有不同程度的提高，结果见表5。

                           表5、各组药物对骨质疏松大鼠血清生化指标及体重与子宫湿重的影响

组别	N	Ca(mmol/L)	P(mmol/L)	ALP(IU/L)	E2(pg/L)	子宫湿重(g)
							假手术组模型对照组OHB给药组PHB给药组PHBHHx给药组R3HB给药组S3HB给药组R3HV给药组R3HHx给药组R3HO给药组	8888888888	2.50±0.152.41±0.08#2.51±0.12*2.49±0.08*2.48±0.172.50±0.10*2.43±0.152.48±0.06*2.47±0.09*2.47±0.17	2.35±0.512.07±0.39#2.38±0.54*2.38±0.35*2.36±0.492.39±0.37*2.21±0.35*2.37±0.672.37±0.502.35±0.60	76.6±20.987.3±20.1#127.2±29.1**124.7±30.1**122.6±33.3**128.9±27.2**105.7±31.1*121.9±27.9**122.3±30.9**122.4±32.1**	19.9±6.19.1±1.9##10.0±1.7*9.9±2.1*9.2±2.110.5±1.6*9.2±2.29.1±1.99.3±2.09.2±1.8	0.65±0.090.24±0.05##0.26±0.08*0.26±0.04*0.25±0.04*0.27±0.09*0.24±0.120.25±0.07*0.25±0.110.25±0.09*

(与模型对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01。与假手术组比较#p＜0.05，##p＜0.01。)

实验结果表明，(R)-3-羟基丁酸及其衍生物和类似物具有提高骨密度、改善骨代谢、促进骨形成、抑制骨吸收等作用，因而对骨质疏松症有良好的防治效果。给药组大鼠的骨钙、骨磷含量与模型组相比均显著增加，表明该药物组合物可促进骨矿物质在骨的沉积，提高大鼠骨矿含量和骨密度，而且可以促进骨结构的再建，改善骨的内部结构，从而使骨组织的承载能力增强而降低骨折的发生。

Claims (7)

1、(R)-3-羟基丁酸，(R)-3-羟基丁酸盐，(R)-3-羟基丁酸类似物，和/或(R)-3-羟基丁酸衍生物在制备防治骨质疏松症的药物或食品添加剂中的应用；

其中，所述(R)-3-羟基丁酸类似物为(R)-3-羟基戊酸、(R)-3-羟基己酸或(R)-3-羟基癸酸；

所述3-羟基丁酸衍生物选自(R)-3-羟基丁酸的单纯寡聚物、聚(R)-3-羟基丁酸酯，和(R)-3-羟基丁酸共聚物中的一种或几种；所述(R)-3-羟基丁酸共聚物为(R)-3-羟基丁酸与(R)-3-羟基戊酸、(R)-3-羟基己酸或(R)-3-羟基癸酸的共聚物。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述(R)-3-羟基丁酸共聚物为(R)-3-羟基丁酸共聚寡聚物，所述(R)-3-羟基丁酸共聚寡聚物为(R)-3-羟基丁酸与(R)-3-羟基戊酸、(R)-3-羟基己酸或(R)-3-羟基癸酸的共聚寡聚物。

3、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述(R)-3-羟基丁酸的单纯寡聚物中单体数量小于100个。

4、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述共聚寡聚物或所述共聚寡聚物和单纯寡聚物的混合物中单体数量小于100个。

5、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述(R)-3-羟基丁酸的单纯寡聚物的平均分子量不超过1000g/mol。

6、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述共聚寡聚物或所述单纯寡聚物和共聚寡聚物的混合物中，寡聚物的平均分子量不超过1000g/mol。

7、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述3-羟基丁酸盐为3-羟基丁酸钠或3-羟基丁酸钾。

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