CN1415364A - 中药绵萆薢的新医药用途及其提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是中药绵萆薢的新医药用途及其提取物的制备方法，绵萆薢经适当的工艺处理得到的提取物，可作为制备治疗和预防骨质疏松症的药物，也可作为制备提高椎骨骨密度、抑制骨吸收活性、抑制破骨细胞形成和促成骨细胞增殖活性的药物。以中药绵萆薢或者新鲜采集的绵萆薢的干燥块茎为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法等工艺中的一种或者多种工艺，并结合浓缩干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等常用干燥方法可制备成含有一种或多种有效成分的提取物。
Description
本发明涉及医药技术领域，确切地说它是中药绵萆用于预防和治疗骨质疏松症的新医药用途及其提取物的制备方法。
背景技术：
骨质疏松症(Osteoporosis简称OP)是以骨量减少，骨组织微细结构破坏导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病。也是一种以骨密度低下为主要症状的一种骨代谢失调的全身性疾病。骨质疏松症是一种中老年人的常见病、多发病。国际医学界已将骨质疏松症与糖尿病、心血管病等并列为严重危害老年人健康的重大疾病。世界卫生组织已将每年10月20日定为全世界的＂骨质疏松＂日，并于1998年7月成立了世界卫生组织骨质疏松专题小组。据有关部门统计[高素强等，淫羊藿及其复方防治骨质疏松的研究；中国中药杂志，1999，24(4)：]，1997年中国骨质疏松症的患者人数约为8390万人，发生率占全国总人口数的6.6％，到2010年约为1140万人，占8.2％。上海调查资料显示，老年人骨质疏松患病率男性为60.7％，女性为90.5％。我国的骨质疏松症及其骨质疏松性骨折的发病率已呈明显的递增趋势。骨质疏松症所造成的影响相当严重，骨质疏松症每年会导致150万例骨折，有50％的妇女会因骨质疏松症而骨折。现代医学对骨质疏松的病因尚不十分清楚，但目前研究认为与雌激素缺乏，钙摄入不足，体力活动减少、阳光照射不足、维生素D缺乏及不良嗜好有关。是多种病因、多个环节共同作用的结果，且与人体的衰老密切相关。其主要症状为腰膝酸软、胸背疼痛、肢体麻木、疼痛、头晕、乏力等。目前尚无特效药物能够治愈此病，用于防治骨质疏松症的药物目前主要有三类，第一类是抗骨吸收药物，包括雌激素、降钙素、二磷酸盐等；第二类是促进骨形成药物，如氟化物、促进合成代谢的类固醇等；第三类是矿化作用药物，如钙制剂和维生素D等〔朱建民。骨质疏松症的发病原因及防治。中华内科杂志1992；11(31)：714〕。虽然激素类、生化类药物在治疗骨质疏松症上已取得了很大进展，但由于副作用的存在及治疗费用过高限制了它的长期使用[Christiansen C.，Fertil Steril..，1994，62(6)1528-1531]。治疗骨质疏松症需要很高的费用，如仅1995年，美国45岁以上妇女花在骨质疏松性骨折上的医疗费用就高达110亿美元。
中医中药立足于辩证施治，整体调节，在骨质疏松的治疗方面取得了不少成就[李润德《中国骨伤》1992，5，6，31-34梁立《中医杂志》1992，33(11)：36吴林生，张云岐，郭如意《中国骨质疏松杂志》1995，1，2]。《素问·五藏生成篇》中说：“肾之合骨也，其荣发。”《素问·六节藏象论》中说：“肾者主蛰，封藏之本，精之所处也，其充在骨。”按中医基础理论，“肾之在体为骨、主骨生髓，其华在发”，“齿为骨之余”，也明确指出肾中精气盛衰在齿、骨、发的生长中的作用。而这种肾气盛衰的规律与现代生理中骨的代谢极其吻合。即，骨骼的生长在20岁最为迅速，24岁进入持平期；40岁后骨代谢异常，骨质日渐疏松；50岁后骨总量可减少30％，因而肾的盛衰史其实亦是骨的盛衰史。中医理论认为肾藏精，精气得到较好的闭藏才能在人体内充分发挥其应有的生理效应，达到强筋健骨的作用。所以中医认为，补肾治疗可以强骨壮筋，防治骨质疏松。流行病学调查表明：经中医辨证为肾虚者的尺、桡骨的骨矿含量，明显低于健康人。现代生理的研究也表明，补肾能增加肾脏对活性维生素D的转化，促进机体对钙的吸收；避免钙在细胞内沉积，维持血钙的稳定。补肾还能增强生成骨细胞的作用，阻遏钙的脱失，从而达到控制骨质丢失，预防和治疗骨质疏松。近年来大量的研究证实和临床应用补肾壮骨中药治疗骨质疏松取得了满意的效果，且毒副作用少，价格适中，可长期服用。然而，目前用于骨质疏松症治疗的中药也明显存在着用药量大，有效成分不明确，难以进行必要的质量控制以及无法用现代医学理论进行解释等问题。因此开发抗骨质疏松的现代中药以及对具有抗骨质疏松作用的中药进行中药现代化的研究，寻找其中的活性成分并研究其作用机理就显得非常迫切和必要。
由于骨质疏松是成骨与破骨不平衡的结果，破骨细胞的作用远远大于成骨细胞的作用，从而造成骨量下降，骨质疏松及脱钙。因此，在寻找抗骨质疏松中药中的活性成分及其作用机理时，需要同时关注其对成骨细胞、破骨细胞及矿化的影响情况，采用多指标方法，包括促进成骨细胞的活性，抑制破骨细胞的活性以及对骨矿化的影响，才有可能筛选出有效的抗骨质疏松活性成分。为了寻找这些抗骨质疏松中药中的活性成分及其作用机理，我们运用了较先进的细胞、组织器官培养模型筛选方法及机制研究手段，动物体内实验为验证方法，并运用较先进的实验设备如Liquid sicillition counter，PQCT等，筛选具有抗骨质疏松作用的中药活性成分并研究其作用机理，具有非常重要的理论与现实意义的。可用于指导同类中药的开发以及开发具有疗效高、副作用小、针对性强、目标专一的现代中药制剂。
绵萆：又名白萆、川萆、棉萆。为植物绵萆的干燥根茎。绵萆的植物来源为薯蓣科绵萆Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蓣Dioscorea futschauensis Uline exR.Knuth和七裂叶萆Dioscorea septemloba Thunb.。其化学成分包含薯蓣皂甙(dioscin)、纤细薯蓣皂甙(gracillin)，另含有原薯蓣皂甙(protodioscin)、原纤细薯蓣皂甙(protogracillin，kikubasaponin)及甲基原纤细薯蓣皂甙。性平、味苦。功能主治：利湿去浊，祛风通痹。用于淋病白浊、白带过多、湿热疮毒、腰膝痹痛。目前对萆的药理研究文献较少，近二十年来仅有的一篇关于棉萆总皂苷的文献(张克锦等，棉萆总皂甙对实验性鹌鹑动脉粥样硬化的预防作用，中草药1990，Vol.21(11)：25-27)其总皂苷的植物来为纤细薯蓣Dioscoreagracillima，与本发明的植物来源不同。本发明开发了绵萆治疗和预防骨质疏松症的新医药用途及提取物的制备方法。
发明内容：本发明的目的是提供中药绵萆的新医药用途及其提取物的制备方法。绵萆经适当的工艺处理得到的提取物，可作为制备治疗和预防骨质疏松症的药物，也可作为制备提高椎骨骨密度、抑制骨吸收活性、抑制破骨细胞形成和促成骨细胞增殖活性的药物。绵萆其植物来源为下列植物中的一种或多种：薯蓣科绵萆Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蓣Dioscorea futschauensis Uline ex R.Knuth和Dioscorea septemlobaThunb.。所述提取物为绵萆水或醇的简单提取物、绵萆的水或醇的简单提取物通过吸附树脂经水-醇混合溶剂洗脱得到的不同比例水-醇混合溶剂洗脱物、绵萆总皂苷以及从绵萆中提取得到的用于制备抗骨质疏松症的药物的其它提取物。所述的醇通常具有以下通式的饱合一元醇或不饱合一元醇：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；在混合洗脱溶剂中，醇在所占的百分含量在40-95％之间。所列绵萆的其它提取物，指含有下列中的一种或多种化合物，并用于制备治疗骨质疏松症的药物的提取物：化合物2：绵萆素B(spongiosinB)；3：绵萆素C(spongiosin C)；4：piperitol；5：sesaminone；7：hypoglaucin G；8：薯蓣皂甙(dioscin)；11：纤细薯蓣皂甙(gracilin)14：pregna-5，16-diene-1β-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside；20：(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3β，22，26-triol26-O-β-D-glucopyranoside；22：(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyrano-syl-(1→2)]-D-glucopyranosylfu-rost-5-ene-3，22，26-triol26-O--D-gl-ucopyranoside；26：(R)-3-hydro-xyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopy-ranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside等11个化合物。以中药绵萆或者新鲜采集的绵萆的干燥块茎为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法等工艺中的一种或者多种工艺，并结合浓缩干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等常用干燥方法可制备成以上所述的11种化合物中的一种或多种成分的提取物，使之作为抗骨质疏松活性成分与赋形剂相结合，按照常规方法制成的口服给药的内用剂型及非口服给药的注射剂和外用剂型。所列的溶剂为下列溶剂中的一种或几种：不多于10个碳原子的卤代烷、醇、酮、酯或其混合溶剂等，其中卤代烷具有以下通式：CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇类溶剂具有以下通式：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮类溶剂具有以下通式：CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯类溶剂具有以下通式：CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)，溶剂洗脱方式包括单一或混合溶剂的正相、反相或梯度洗脱。所列的吸附树脂为苯乙烯类、丙烯酸酯类、丙烯酰胺类或氧化氮类大孔吸附树脂中的一种或多种；柱层析填料为下列种的一种或多种：硅胶、氧化铝、聚酰胺、吸附树脂、葡萄糖凝胶、硅藻土。
1.绵萆治疗和预防骨质疏松症的新医药用途。
本发明中的绵萆经适当工艺制备的提取物包括：绵萆水或醇的简单提取物、绵萆水或醇的简单提取物通过吸附树脂经水-醇混合溶剂洗脱得到的不同比例水-醇混合溶剂洗脱物、绵萆总皂苷以及化合物2、3、4、5、7、8、11、14、20、22、26等11种化合物。我们将绵萆经水或醇简单处理过的提取物与成骨细胞株UMR106共同培养，证实绵萆呈明显的促成骨细胞增殖活性，在随后进行的抑制破骨细胞形成实验中，绵萆也显示了较强的活性。随之将绵萆以OVX大鼠为模型，进行的体内活性实验结果也表明它具有提高椎骨骨密度的作用。又将绵萆的提取物进行促成骨细胞增殖活性，抑制破骨细胞形成，抑制骨吸收模型45Ca释放等实验的活性筛选后，证实绵萆的水或醇提取物通过吸附树脂经水-醇混合溶剂洗脱得到的不同比例水-醇混合溶剂洗脱物为主要活性部位。随后对其主要活性部位及总皂甙进行的体内试验中，它们也显示了较强的活性，并呈良好的量效关系。对其活性部位进行的化学成分研究共分离得到了近30种化合物，对所有的化合物进行了抑制以PTH诱导的45Ca释放的骨吸收模型的活性实验，证实化合物2：绵萆素B(spongiosinB)；3：绵萆素C(spongiosin C)；4：piperitol；5：sesaminone；7：hypoglaucin G；8：薯蓣皂甙(dioscin)；11：纤细薯蓣皂甙(gracilin)14：pregna-5，16-diene-1-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-D-glucopyranoside；20：(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O--D-glucop-yranoside；22：(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]--D-glucopyranosyffurost-5-ene-3，22，26-triol26-O--glucopyranoside；26：(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11个化合物显现了较强的抑制骨吸收活性。
以下公开其体内、体外活性研究方法与结果：
1.1.体外活性实验：
1.1.1.以成骨细胞UMR106为模型促成骨细胞增殖活性
按文献方法对绵萆水或醇的简单提取物进行了促成骨细胞UMR106增殖活性实验[5]。绵萆的水或醇的简单提取物显示了非常强的促成骨样细胞增殖活性(浓度为400μg/ml时，细胞增殖率为55～68.9％)。结果见表1，
表1.绵萆提取物对成骨细胞株UMR106的增殖促进作用
增殖率(％)*
NaF 37.2
绵萆水或醇的简
单提取物 55～68.9*与对照组的百分比NaF：阳性对照组，浓度：1μM.“-”：细胞存活
率小于对照组.
1.1.2.抑制破骨细胞形成活性
按文献方法进行抑制破骨细胞形成实验，首先，我们从乳鼠的头盖骨中消化得到成骨细胞，然后与小鼠胫骨髓细胞及样品，1□，25(OH)2VD3共同培养[7]，考察样品抑制破骨细胞的诱导形成。绵萆的水或醇简单提取物在高浓度时完全抑制了破骨细胞的形成(浓度为200μg/ml时，抑制率为100％，并呈明显的量效关系)，结果见表2。
表2.对破骨细胞的形成抑制作用
浓度g/mL 抑制率
(％)绵萆水或醇的简单 200 100.0提取物
20 20～39.61,25(OH)2VD3(-) 100.01,25(OH)2VD3(+) 0.1 0Elcitonin(阳性对照 2U/ml 70.8药)
1.1.3.绵萆水或醇简单提取物中活性部位的体外实验确定结果
为了进一步确定绵萆水或醇简单提取物中的活性部位及活性成分，将萆的干燥根茎10kg经水或醇回流提取，提取物经非极性吸附大孔树脂柱，用不同比例的水及醇的混合溶剂洗脱，得到不同比例的水-醇混合溶剂洗脱部位(见表3)，将其洗脱部位分别进行促成骨细胞株UMR106增殖作用、抑制破骨细胞形成作用及骨吸收器官培养模型PTH诱导的45Ca释放抑制的实验[8]，发现含40～95％醇部位在200μg/ml的浓度下促成骨细胞株UMR106增殖作用可达66.7～90.6％，并完全抑制了破骨细胞的形成；抑制PTH诱导的45Ca释放达15.9～85.8％(浓度为440μg/ml)。因而含40～95％醇洗脱部位被认定为抗骨质疏松的主要活性部位，随之对它进行了体内活性确定实验。
表3绵萆经非极性大孔树脂以水-醇混合溶剂的洗脱物用体外实验
筛选抗骨质疏松活性的数据
含0～35％醇部 含40～95％醇部位
位刺激成骨细胞株UMR106增 11.2～14.7 66.7～90.6殖率(％)对破骨细胞的形成的抑制率 96.1～100.0 100.0(％)对PTH诱导的45Ca释放的抑 - 15.9～88.8制率(％)
1.1.4.以骨吸收模型45Ca释放抑制对化合物的抗骨质疏松活性进行评价结果
对含40～95％醇的大孔吸附树脂洗脱部位进行了一系列的分离提取工作。将80g的洗脱物，分别利用大孔吸附树脂、硅胶、ODS等柱层析方法进行分离，并运用薄层层析，高效液相，重结晶等方法纯化，得到了近30个化合物，运用核磁共振(NMR)，质谱(MS)，红外(IR)，气相(GC)等光谱、色谱手段，确定了它们的结构。对所有的化合物进行了抑制PTH诱导的45Ca释放的实验。由J.J.Reynold等在1969年建立的骨吸收亢进器官培养法是利用45Ca同位素对乳鼠进行标记后，取其颅骨进行体外培养，在培养过程中加入甲状腺旁素(PTH)，PTH可诱导体外培养的骨组织中45Ca大量释放，使之发生骨吸收亢进现象[19]。这个模型综合考了骨吸收过程中成骨细胞，破骨细胞的协同作用，可较真实地反映骨吸收的过程。表16示部分化合物对PTH诱导的45Ca释放的抑制作用，从数据中可发现，2、3、4、5、7、8、11、14、20、22、26等化合物对PTH诱导的45Ca释放的具有显著的抑制作用。见表4。
表4.所有化合物对由PTH诱导的45Ca释放的抑制作用
45Ca release(％) 45Ca release(％)Comp. Comp.
200□M 20□M 200□M 20□M2 30.5±0.4 18.2±3.1* 14 19.6±1.9 20.3±7.53 19.1±1.6* 18.2±3.2* 20 17.4±1.6** 24.9±1.24 15.1±1.5** 14.7 22 16.4± 18.5±0.2
±0.8** 1.3**5 13.6±1.0** 22.6±2.5 26 25.6±1.1 17.7±1.67 19.2±2.1 22.8±7.9 PTH 25.3±2.68 20.7±4.0 18.8±7.0 Control 15.4±
1.311 30.9±4.5 17.1±2.5 Elcitoni 18.4±
n 0.7**
PTH：乳鼠头盖骨在含PTH(2×10-9M)中的培养液中培养。
Control：乳鼠头盖骨在没有PTH和化合物的培养液中培养。
Elcitonin：乳鼠头盖骨在含PTH和elcitonin (2U/ml)的培养液中培养。
Sample：乳鼠头盖骨在含PTH和化合物的培养液中培养。数值用均值±方差表示。*p＜0.05，**p＜0.001.与PTH对照，显著地抑制了钙的释放。所有化合物的名称见下：2：绵萆素B(spongiosin B)；3：绵萆素C(spongiosin C)；4：piperitol；5：sesaminone；7： hypoglaucin G[(25ξ)3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-□-D-glucopy ranosyl-20，22-seco-furost-5-ene-3□，26-diol 20，22-dione26-O-□-D-glucopyranoside；]8：薯蓣皂甙(dioscin)[(25R)-spirost-5-ene-3□-ol3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-□-D-glucopyranoside]11：纤细薯蓣皂甙(gracilin)[(25R)-spirost-5-ene-3□-ol3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-D-glucopyranosyl-(1→3)]-□-D-glucopyranoside]14： pregna-5，16-diene-1□-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[□L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-□-D-glucopyranoside20：(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-□-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3□，22，26-triol26-O-□-D-glucopyranoside22：(22S，25R)-3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-□-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3□，22，26-triol 26-O-□-D-glucopyranoside26： (R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[□-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-□-D-glucopyranoside
1.2.体内实验：
1.2.1.以OVX大鼠为模型，以DXA为测量手段，对萆水提取物进行的体内实验确定结果
不论是促成骨样细胞增殖活性，还是抑制破骨细胞形成活性，都是体外活性，不能真正地反映骨质疏松机体内的生理病理变化，因此用双侧卵巢摘出所致雌性骨质疏松大鼠骨质疏松模型，以DXA(双能X射线吸收仪)为测量手段，考察了绵萆水或醇的简单提取物对骨质疏松大鼠椎骨的骨密度的影响，实验结果表明，绵萆水或醇的简单提取物可显著改善骨质疏松发生时引起的椎骨骨密度(BMD)降低，结果见Fig.1。模型组雌性大鼠的骨密度(BMD)较正常组明显下降(p＜0.01)，椎骨骨密度降至正常组的86.3％。绵萆水或醇的简单提取物高，低剂量组骨密度分别增加了8.6～13.3％(p＜0.05)，其BMD恢复了95.6～99.4％，可见绵萆水或醇的简单提取物可显著提高骨质疏松大鼠的椎骨骨密度。结果见图1。
1.2.2.以OVX大鼠为模型，PQCT为测量手段的体内试验
上述我们已经证实绵萆水或醇的简单提取物、其水或醇的简单提取物的不同浓度的水-醇洗脱物具有抗骨质疏松活性。为进一步证实这些提取物的抗骨质疏松活性，我们以绵萆的水或醇的简单提取物、水或醇的简单提取物通过大孔吸附树脂经含40～95％不同醇浓度的水-醇混合溶剂洗脱物、总皂苷为例，详细说明其动物实验中对骨质疏松症的改善效果。
将90只6月龄的健康未交配Wister大鼠，经适应性喂养3周后，进行双卵巢切除术或假手术，随机分成9组：(1)卵巢切除14周组(control组)：卵巢切除术后14周处死。(2)假手术组(sham组)：进行手术，但不摘出卵巢，14周后处死。(3)阳性对照组(positive control组)：卵巢切除术后8周经胃肠道给药灌注0.1mg/kg/d 17β-estradiol(购于日本东京化成工业株式会社)，用药6周后处死。(4)绵萆水或醇的简单提物组(D.s water)：卵巢切除术后8周经胃肠道给药灌注萆水或醇的简单提物100mg/kg/d，用药6周后处死。(5)绵萆40～95％不同醇浓度的洗脱部位组(40～90％EtOH)：卵巢切除术后8周经胃肠道给药灌注绵萆40～95％不同醇浓度的洗脱部位100mg/kg/d，用药6周后处死。(7)绵萆总皂甙部位组(T.saponin)：卵巢切除术后8周经胃肠道给药灌注绵萆总皂甙100mg/kg/d，用药6周后处死。所有的动物处死前，麻醉状态下用外周肢体定量计算机断层扫(PQCT)描测量大鼠左侧胫骨近端干骺端生长板下1-5mm范围内的松质骨、皮质骨和全骨，扫描4个断面，数据取自3-4mm处断面[9]。测量指标：全骨矿量(total bone mineralcontent，TOT-CNT，mg/mm)、全骨密度(total bone mineraldensity，TOT-DEN，mg/cm3)、全骨断面积(total bonearea，TOT-A，mm2)、松质骨矿量(trabecular mineralcontent，TRAB-CNT，mg/mm)、松质骨密度(trabecular mineraldensity，TRAB-DEN，mg/cm3)、皮质骨外周周长(periderm ofcortical membrance，PERI-C mm)、内周周长(endoderm ofcortical membrance，ENDO-C mm)、皮质骨矿量(cortical mineralcontent，CRT-CNT，mg/mm)、皮质骨密度(cortical mineral density，CRT-DEN，mg/cm3)、皮质骨厚(cortical thickness，CRT-THK-C，mm)、抗压力(X-axis strength strain index，XSSI)、抗折力(Y-axisstrength strain index，YSSI)、抗扭力(polar-axis strength strainindex，Polar SSI)等。
测量后所有的大鼠被从主动脉中取血，离心后分离血清，-80℃冷冻保存备用。将所有大鼠的子宫取出、称重。
大鼠体重及子宫重量的变化
如表5所示，术后14周与术前相比，除阳性对照组外，各组的体重均有增高，尤其对照组，增高近20％，同时子宫的重量明显下降，说明对照组已呈明显的雌激素缺乏症状，造型成功。而其他各组体重虽然也有增加作用，但与对照组相比，有显著性差异。因而各给药组可能都具有抗雌激素缺乏后造成的体重升高。各给药组与对照组相比虽然子宫重量有增加，但增量很小，并没有显著性差异。而阳性对照组则显著提高了子宫的重量。说明与雌激素类化合物各给药组相比抗雌激素缺乏后造成子宫萎缩作用极微，因而各给药组的作用机制可能与雌激素类化合物不相同。
表5各实验组对大鼠体重及子宫重量的影响实验组 体重(a)(g) 体重(b)(g) 子宫重量(g)对照组 296.6±16.7 351.7±32.6# 0.12±0.01#假手术组 290.3±8.5 303.5±16.3 0.50±0.10阳性对照组 294.4±7.2 265.3±19.6□ 0.36±0.11□D.sp.Water 290.1±10.3 296.6～317.6# 0.14～0.1740～ 299.6±15.3 314.4～338.5# 0.14～0.1895％EtOH总皂甙 292.1±22.5 303.4～334.8# 0.14～0.21
#p＜0.001与伪手术组对照□p＜0.001与对照组对照
对全骨的影响
从表6可发现，control组大鼠胫骨近端全骨的骨矿含量、骨密度都较sham组有明显的降低，并具有显著性差异。虽然全骨断面面积也有微小下降，但不具有显著性差异，说明OVX对全骨断面面积没有明显地影响。阳性对照组组与对照组相比较，较大程度地提高了全骨的骨矿含量、骨密度。40～90％EtOH组也能较大程度地提高了全骨的骨矿含量和骨密度，并且在提高全骨的骨矿含量上，作用强于阳性对照组。虽然各给约组都明显提高了全骨断面面积，但不具显著性差异。
表6各实验组对大鼠胫骨近端全骨的骨矿含量、骨密度及骨面积
的影响实验组 鼠 全骨矿量 全骨密度 全骨断面积
数对照组 10 8.13±0.75# 638.32 ±12.77±1.38
35.05假手术组 10 9.77±1.34 760.25 ±12.85±1.71
20.29#阳性对照组 10 8.94±1.12 709.39 ±12.58±1.20
31.08D.sp.Water 10 8.39～9.17 639.78 ～13.04～14.04
684.7940～95％EtOH 10 8.45～10.03 655.01 ～12.93～14.97
745.76总皂甙 10 8.57～9.42 636.37 ～13.01～14.53
700.49
#p＜0.01与伪手术组对照□p＜0.01与对照组对照
对松质骨的影响
胫骨近端松质骨骨矿含量及骨密度的改变：对照组TRAB-CNT比sham组略有升高，但没有显著性差异，说明OVX对TRAB-CNT没有明显地影响。。而水提物组、40～95％EtOH组及总皂甙量组的TRAB-CNT都有显著增加。但是阳性对照组不能提高TRAB-CNT。对照组TRAB-DEN与sham组相比，有显著性差异，所有给药组的TRAB-DEN都有所提高。其中提高最显著的在40～95％EtOH部位组。由此说明阳性对照组与给药组对胫骨近端松质骨的作用机理也可能是不同的。阳性对照组只对TRAB-DEN有作用，而一些给药组既对TRAB-DEN也对TRAB-CNT有提高作用。
表7各实验组对大鼠胫骨近端松质骨的骨矿含量、骨密度影响
| 实验组 | 松质骨矿量 | 松质骨密度 |
| 对照组 | 0.79±0.16 | 150.9±27.4# |
| 假手术组 | 0.87±0.08 | 208.6±56.9 |
| 阳性对照组 | 0.79±0.13 | 198.3±51.3□□ |
| D.sp.Water | 0.86～1.14 | 172.2～210.2□□□ |
| 40～95％EtOH | 0.97～1.30□ | 193.9～260.2□□□ |
| 总皂甙 | 0.97～1.21□□ | 197.2～227.9□□□ |
#p＜0.05.与伪手术组对照□p＜0.05，□□p＜0.01，□□□p＜0.001
与对照组对照
对皮质骨的影响
1)对皮质骨内、外周周长的影响：由表7所示数据可知，除阳性对照组外，其余各组外周周长均增大，在内周周长组，sham和阳性对照组与control组比下降，而各给药组的内周周长均增大，但都没有显著性差异。
表8各实验组对大鼠胫骨近端皮质骨的内、外膜周长的影响实验组 外膜周长 内膜周长对照组 12.65±0.68 9.59±0.70#假手术组 12.68±0.84 8.92±0.80阳性对照组 12.56±0.59 9.14±0.46*D.sp.Water 12.80～12.85 9.63～9.7640～95％EtOH 12.69～12.88 9.62～9.64总皂甙 12.81～13.07 9.73～9.96
#p＜0.05与伪手术组对照□p＜0.05与对照组对照
2)胫骨近端密质骨骨矿含量、骨密度及皮质骨厚度的变化：对照组中的大鼠胫骨近端，皮质骨骨矿含量CRT-CNT及皮质骨厚度CRT-THK-C较sham组有显著下降，所以OVX也可影响皮质骨。各给药组均提高了CRT-CNT，其中阳性对照组及在40～95％EtOH组中效果最为明显。并且只有这两组提高了CRT-THK-C。因而在对皮质骨的作用上，阳性对照组及40～95％EtOH组作用相似。
表9 各实验组对大鼠胫骨近端皮质骨的骨矿含量、骨密度及皮
质骨厚度的影响实验组 皮质骨骨矿含 皮质骨骨密度 皮质骨厚度
量对照组 5.34±0.41## 1251.58±13.82 0.49±0.03##假手术组 6.09±0.24 1257.85±10.13 0.60±0.02阳性对照组 6.86±0.67** 1291.97±15.76 0.54±0.04**D.sp.Water 6.24～6.78** 1273.78 ～ 0.49～0.53
1314.0340～95％EtOH 6.32～7.06** 1268.60 ～ 0.49～0.55*
1313.06总皂甙 6.25～6.79** 1254.27 ～ 0.49～0.52
1267.03
##p＜0.01与伪手术组对照*p＜0.05，**p＜0.01与对照组对照
骨强度的改变
PQCT能用来测定骨力学指标(与材料力学及构造学的力学特性相关)，是由于材料力学的特性指标弹性系数与皮质骨密度有关，虽然PQCT不能直接用于测定弹性系数，但可以测出皮质骨密度，并且可以用测出的断面二次动量力矩乘以骨断面半径得出构造学的力学特性，从而计算出骨强度(SSI).其中XSSI示抗压力、YSSI示抗折力、Polar SSI示抗扭力。其中XSSI及YSSI受检体测定位置的影响很大，有一定的误差，但Polar SSI几乎不受此影响，有良好的重现度及精度。
由表10可发现，OVX后大鼠胫骨近端的抗压力和抗扭力都显著下降，但抗折力基本不变。说明OVX对抗折力没有明显地影响。在所有的给药组中，阳性对照组显著提高了胫骨的抗压能力，40～95％EtOH组中显著提高了抗扭力。其他各组虽然也提高了抗压力及抗扭力，但没有显著性差异。因而阳性对照组与在49～95％EtOH组中对骨强度的作用机制上也存在不同。
表10各实验组对大鼠胫骨近端骨强度的影响实验组 X轴抗压力 Y轴抗折力 极轴抗扭力对照组 3.51±0.51## 4.47±0.66 7.17±1.25#假手术组 4.87±0.86 4.44±0.97 8.71±1.69阳性对照组 4.15±0.94* 4.26±0.57 7.87±1.27D.sp.Water 3.50～4.18 4.24～5.22 7.40～8.4940～95％EtOH 3.76～4.42 4.54～5.55 7.43～9.41*总皂甙 3.67～4.34 4.40～5.21 7.38～8.53
#p＜0.05，##p＜0.01.与伪手术组对照*p＜0.05，**p＜0.01与对照
组对照
结论
上述数据以绵萆的水或醇简单提取物、水或醇的简单提取物通过大孔吸附树脂经含40～95％的不同浓度醇的水-醇混合溶剂洗脱物、总皂苷为例，证实绵萆水或醇的简单提取物、其水或醇的简单提取物经含40～95％醇的水-醇洗脱物以及绵萆总皂苷无论是在提高OVX大鼠胫骨近端全骨的骨矿含量和骨密度、松质骨的骨矿含量和骨密度、皮质骨的骨矿含量和厚度，还是在改善骨强度方面，都显示了较强的活性。尤其是在提高全骨的骨矿含量和骨密度、松质骨的骨矿含量和骨密度及骨的抗扭力方面，作用强于阳性对照组雌激素类化合物，并且作用机制不同。且含40～95％不同浓度醇的水-醇洗脱物组中存在可显著提高胫骨的抗扭力强度的组分，这是许多抗骨质疏松药物所达不到的[10]。
2.绵萆提取物的制备
绵萆的化学成分及药理研究鲜有报道，其提取物的制备方法研究也是空白。我们以中药绵萆或者新鲜采集的绵萆的干燥块茎为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法等工艺中的一种或者多种工艺，并结合浓缩干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等常用干燥方法可制备成含有化合物2：绵萆素B(spongiosin B)；3：绵萆素C(spongiosin C)；4：piperitol；5：sesaminone；7：hypoglaucin G；8：薯蓣皂甙(dioscin)；11：纤细薯蓣皂甙(gracilin)14：pregna-5，16-diene-1-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；20：(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；22：(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyra-nosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O-D-glucopyranoside；26：(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabin-opyranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside等11个具有抗骨质疏松活性有效成分中的一种或多种成分的提取物。
2.1.绵萆水或醇的简单提取物的制备方法
绵萆水或醇的简单提取物系经过溶剂提取法或溶剂萃取法得到的提取物，其特征在于含有上述经实验证实具有抗骨质疏松活性的6种活性成分中的一种或多种。醇通常具有以下通式的饱合一元醇或不饱合一元醇：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；温度在10-100℃范围之内经过一次或多次提取或萃取得到的简单提取物。使用混合溶剂时，醇在混合溶剂中的所占的百分含量在1-95％之间。
2.2.绵萆的水或醇的简单提取物通过大孔吸附树脂经水-醇混合溶
剂洗脱得到的不同比例水-醇混合溶剂洗脱物的制备方法
绵萆水或醇的简单提取物通过大孔吸附树脂经水-醇混合溶剂洗脱得到的不同比例水-醇混合溶剂洗脱物系指将经过溶剂提取法或溶剂萃取法得到的提取物，装入径：高比为1∶3-1∶7之间的大孔吸附树脂柱，经含不同比列的水-醇混合溶剂洗脱而得到的洗脱物。其特征在于含有化合物2：绵萆素B(spongiosin B)；3：绵萆素C(spongiosin C)；4：piperitol；5：sesaminone；7：hypoglaucin G；8：薯蓣皂甙(dioscin)；11：纤细薯蓣皂甙(gracilin)；14：pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；20：(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O-D-glucopyranoside；22：(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-enc-3，22，26-triol 26-O--D-glucopyranoside；26：(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11个具有抗骨质疏松活性有效成分中的一种或多种成分的提取物。醇通常具有以下通式的饱合一元醇或不饱合一元醇：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；在洗脱溶剂中，醇在所占的百分含量在40-95％之间。其洗脱物已在动物实验中证实具有抗骨质疏松活性。
2.3.绵萆总皂苷及绵萆素B(spongiosin B)；绵萆素C(spongiosin C)；piperitol；sesaminone；hypoglaucin G；薯蓣皂甙(dioscin)；纤细薯蓣皂甙(gracilin)；pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-D-glucopyranoside；(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O--D-glucopyranoside；(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O--D-glucopyranoside；(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside等11个具有抗骨质疏松活性有效成分
以中药绵萆或者新鲜采集的绵萆的干燥块茎为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法等工艺中的一种或者多种工艺，并结合浓缩干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等常用干燥方法可制备。
其中的溶剂包括不多于10个碳原子的卤代烷、醇、酮、酯或其混合溶剂等，其中卤代烷具有以下通式：CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇类溶剂具有以下通式：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮类溶剂具有以下通式：CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯类溶剂具有以下通式：CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)。溶剂洗脱方式包括单一或混合溶剂的正相、反相或梯度洗脱。
树脂括非极性大孔吸附树脂、极性大孔吸附树脂、强极性大孔吸附树脂；
柱层析中的填料包括：聚酰胺、硅胶、葡萄糖凝胶及改性的葡萄糖凝胶如羟丙基葡萄糖凝胶等。
附图说明图1为绵萆水或醇的简单提取物对骨质疏松大鼠椎骨骨密度的影响。
图中Sham：伪手术组；OVX：卵巢摘除组；D.s100，D.s50分别表示卵巢摘除5周后分别灌胃给绵萆水或醇的简单提取物100和50mg/kg/day，给5周。椎骨密度用DXA测量。#p＜0.01，与伪手术组相比有显著性差异；*p＜0.05，与对照组相比有显著性差异。图2为化合物2名称与结构式：
spongiosin B C19H20O3
(3R，5R，7R)-1，7-diphenyl-3，7-epoxy-5-hydroxy-heptanone图3为化合物3名称与结构式：
spongiosin C C19H24O4
(1S，3R，5S，7S)-1，7-diphenyl-1，3，5，7-tetrahydroxyheptane图4为化合物4名称与结构式：
piperitol图5为化合物5名称与结构式：
sesaminone图6为化合物7名称与结构式：
hypoglaucin G or (25ξ)3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosyl-20，22-seco-furost-5-ene-3，26-diol 20，22-dione 26-O-D-glucopyranoside图7为化合物8与化合物11名称与结构式：
化合物8：dioscin or(25R)-spirost-5-ene-3-ol-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyramoside11：gracilin or(25R)-spirost-5-ene-3-ol 3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-D-glucopyranosyl-(1→3)]-D-glucopyranoside纤细薯蓣皂甙图8为化合物14名称与结构式：
pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4]-D-glucopyranoside图9为化合物20与22的名称与结构式：
化合物20：(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)[-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside化合物22：(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside图10为化合物26的名称与结构式：
(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside
具体实施方式：
1、绵萆水或醇的简单提取物的制备方法的实列与活性实验
绵萆水提取物的制备与活性实验：绵萆10克100ml水回流提取二次每次1小时，所得溶剂经减压或冻干提取得到其提取物3.6克，其水提取物显示了非常强的促成骨样细胞增殖活性(浓度为400μg/ml时，细胞增殖率为66.9％)。
表11.绵萆提取物对成骨细胞株UMR106的增殖促进作用
增殖率(％)*
NaF 37.2
绵萆水提取物 66.9*与对照组的百分比NaF：阳性对照组，浓度：1μM. “-”：细胞存活
率小于对照组.
2、绵萆水或醇的简单提取物通过吸附树脂经水-醇混合溶剂洗脱得到的含40～95％醇的水-醇混合溶剂洗脱物制备方法的实列与活性实验
绵萆水提取物中含90％乙醇洗脱物活性部位的制备方法与活性实验：将萆的干燥根茎100g经1000ml水回流提取3次，每次1小时，经减压或冻干得水提取物36克，经Diaion 101柱，用90％乙的醇的混合溶剂洗脱，得到90％乙醇部位1.05克，将这部位进行促成骨细胞株UMR106增殖作用、抑制破骨细胞形成作用及骨吸收器官培养模型PTH诱导的45Ca释放抑制的实验，90％乙醇部位在200μg/ml的浓度下促成骨细胞株UMR106增殖作用可达89.6％，并完全抑制了破骨细胞的形成；抑制PTH诱导的45Ca释放达82.8％(浓度为440μg/ml)，结果见表10。以OVX大鼠为模型，PQCT为测量手段的体内试验表明，含90％乙醇的水醇混合溶剂洗脱部位在提高OVX大鼠胫骨近端全骨的骨矿含量和骨密度、松质骨的骨矿含量和骨密度、皮质骨的骨矿含量和厚度，还是在改善骨强度方面，都显示了较强的活性。尤其是在提高全骨的骨矿含量和骨密度、松质骨的骨矿含量和骨密度及骨的抗扭力方面，作用强于阳性对照组雌激素类化合物，并且作用机制不同结果见表11-表16，实验方法见体内实验部分1.2.2节。从而体内体外实验均证实含90％乙醇水-醇混合溶剂洗脱部位为抗骨质疏松的活性部位之一。
表12萆水提取物的90％乙醇部位体外实验筛选抗骨质疏松活性
的数据
90％
乙醇部
位
刺激成骨细胞株UMR106增 89.5
殖率(％)
对破骨细胞的形成的抑制率 100.0
(％)
对PTH诱导的45Ca释放的抑 82.8
制率(％)
表1390％乙醇部位对大鼠体重及子宫重量的影响实验组 体重(a)(g) 体重(b)(g) 子宫重量(g)对照组 296.6±16.7 351.7±32.6# 0.12±0.01#假手术组 290.3±8.5 303.5±16.3 0.50±0.10阳性对照组 294.4±7.2 265.3±19.6□ 0.36±0.11□90％EtOH 304.4±8.5 319.4±20.1□ 0.14±0.03
#p＜0.001与伪手术组对照□p＜0.001与对照组对照，给药剂
量100mg/kg/d
表1490％乙醇部位对大鼠胫骨近端全骨的骨矿含量、骨密度及
骨面积的影响实验组 鼠 全骨矿量 全骨密度 全骨断面积
数对照组 10 8.13±0.75# 638.32 ±12.77±1.38
35.05假手术组 8 9.77±1.34 760.25 ±12.85±1.71
20.29#阳性对照组 9 8.94±1.12 709.39 ±12.58±1.20
31.0890％EtOH 9 9.17±0.86 695.36 ±13.26±1.71
50.40
#P＜0.01与伪手术组对照□P＜0.01与对照组对照，给药剂量
100mg/kg/d
表1590％乙醇部位对大鼠胫骨近端松质骨的骨矿含量、骨密度
影响
| 实验组 | 松质骨矿量 | 松质骨密度 |
| 对照组 | 0.79±0.16 | 150.9±27.4# |
| 假手术组 | 0.87±0.08 | 208.6±56.9 |
| 阳性对照组 | 0.79±0.13 | 198.3±51.3□□ |
| 90％EtOH | 0.97±0.33□ | 227.0±33.2□□□ |
#p＜0.05.与伪手术组对照□p＜0.05，□□p＜0.01，□□□p＜0.001与对照组对照，给药剂量100mg/kg/d
表1690％乙醇部位对大鼠胫骨近端皮质骨的内、外膜周长
的影响实验组 外膜周长 内膜周长对照组 12.65±0.68 9.59±0.70#假手术组 12.68±0.84 8.92±0.80阳性对照组 12.56±0.59 9.14±0.46*90％EtOH 12.88±0.85 9.62±0.98
#p＜0.05与伪手术组对照□p＜0.05与对照组对照，给药剂量
100mg/kg/d
表1790％乙醇部位对大鼠胫骨近端皮质骨的骨矿含量、骨密度
及皮质骨厚度的影响实验组 皮质骨骨矿含 皮质骨骨密度 皮质骨厚度
量对照组 5.34±0.41## 1251.58±13.82 0.49±0.03##假手术组 6.09±0.24 1257.85±10.13 0.60±0.02阳性对照组 6.86±0.67** 1291.97±15.76 0.54±0.04**90％EtOH 6.62±0.44** 1294.43±18.93 0.52±0.03*
##p＜0.01与伪手术组对照*p＜0.05，**p＜0.01与对照组对照，给
药剂量100mg/kg/d
表18 90％乙醇部位对大鼠胫骨近端骨强度的影响实验组 X轴抗压力 Y轴抗折力 极轴抗扭力对照组 3.51±0.51## 4.47±0.66 7.17±1.25#假手术组 4.87±0.86 4.44±0.97 8.71±1.69阳性对照组 4.15±0.94* 4.26±0.57 7.87±1.2790％EtOH 3.85±0.57 4.87±0.68 8.06±1.35*
#p＜0.05，##p＜0.01.与伪手术组对照*p＜0.05，**p＜0.01与对照
组对照，给药剂量100mg/kg/d
3、绵萆总皂苷及绵萆素B(spongiosin B)；绵萆素C(spongiosin C)；piperitol；sesaminone；hypoglaucin G；薯蓣皂甙(dioscin)；纤细薯蓣皂甙(gracilin)；pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；(22S，25R)-22-O-methy[-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyrmosylfurost-5-enc-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11个具有抗骨质疏松活性有效成分的制备方法的实列与活性实验。
1.绵萆总皂苷的制备方法的实列与活性实验(总皂苷的体内活性实验已列在体内实验部分)
制备方法实例一：绵萆根茎粗粉100克经600毫升的水回流提取2次每次2小时，减压浓缩提取物至小体积，先经氯仿萃取除去脂溶性成分，后经正丁醇萃取，得绵萆总皂苷36.9克。
制备方法实例二：绵萆根茎粗粉100克经600毫升的95％乙醇回流提取2次每次2小时，提取物经减压回收乙醇，得提取物经少量水分散，先经氯仿萃取除去脂溶性成分，后经正丁醇萃取，得绵萆总皂苷36.9克。
制备方法实例三：绵萆根茎粗粉100克经600毫升的95％乙醇回流提取2次每次2小时，提取物经减压回收乙醇，得提取物。将提取物通过非极性大孔吸附树脂，以50％的含水乙醇洗脱，洗脱物经减压回收溶剂，得绵萆总皂苷16.2克。
2.化合物2：绵萆素B(spongiosin B)；3：绵萆素C(spongiosin C)；4：Piperitol；5：sesaminone；7：hypoglaucin G；8：薯蓣皂甙(dioscin)；11：纤细薯蓣皂甙(gracilin)14：pregna-5，16-diene-1-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；20：(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-]-L-rhamno pyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyran osylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；22：(22S，25R)-3-O-]-L-rhamnopyranosyl-(1→2]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；26：(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11个具有抗骨质疏松活性有效成分的制备方法的与活性实验(活性实验已列在体外活性实验中)
制备方法实例：绵萆的干燥根茎10kg水回流提取，水提取物经Diaion 101柱，用90％的乙醇洗脱，得到将104g 90％乙醇部位，硅胶柱，以氯仿∶甲醇混合溶剂(99∶1～1∶99)梯度洗脱，合并相同组分洗脱物，再经ODS柱、高效液相(HPLC)、重结晶等方法纯化，得到了近30个化合物，其中的11个经实验证实具有抗骨质疏松活性，分别为化合物2：绵萆素B(spongiosin B)；3：绵萆素C(spongiosin C)；4：piperitol；5：sesaminone；7：hypoglaucin G；8：薯蓣皂甙(dioscin)；11：纤细薯蓣皂甙(gracilin)；14：pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-D-glucopyranoside；20：(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O--D-glu-copyranoside；22：(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O-D-glucopyranosid-e；26：(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11等，并运用核磁共振(NMR)，质谱(MS)，红外(IR)，气相(GC)等光谱、色谱手段，确定了它们的结构、相对及绝对构型。
Claims (8)
1、中药绵萆的新医药用途及其提取物的制备方法，其特征在于：绵萆经适当的工艺处理得到的提取物，可作为制备治疗和预防骨质疏松症的药物，也可作为制备提高椎骨骨密度、抑制骨吸收活性、抑制破骨细胞形成和促成骨细胞增殖活性的药物。
2、根据权利要求1所述的中药绵萆的新医药用途及其提取物的制备方法，其特征在于：绵萆其植物来源为下列植物中的一种或多种：薯蓣科绵萆Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蓣Dioscorea futschauensis Uline ex R.Knuth和Dioscorea septemloba Thunb.。
3、根据权利要求1所述的中药绵萆的新医药用途及其提取物的制备方法，其特征在于：所述提取物为绵萆水或醇的简单提取物、绵萆的水或醇的简单提取物通过吸附树脂经水-醇混合溶剂洗脱得到的不同比例水-醇混合溶剂洗脱物、绵萆总皂苷以及从绵萆中提取得到的用于制备抗骨质疏松症的药物的其它提取物。
4、根据权利要求3所述的中药绵萆的新医药用途及其提取物的制备方法，其特征在于：所述的醇通常具有以下通式的饱合一元醇或不饱合一元醇：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；在混合洗脱溶剂中，醇在所占的百分含量在40-95％之间。
5、根据权利要求3所述的中药绵萆的新医药用途及其提取物的制备方法，其特征在于：所列绵萆的其它提取物，指含有下列中的一种或多种化合物，并用于制备治疗骨质疏松症的药物的提取物：化合物2：绵萆素B(spongiosin B)；3：绵萆素C(spongiosin C)；4：piperitol；5：sesaminone；7：hypoglaucin G；8：薯蓣皂甙(dioscin)；11：纤细薯蓣皂甙(gracilin)14：pregna-5，16-diene-1β-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside；20：(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3β，22，26-triol 26-O-β-D-glucopyranoside；22：(22S，25R)-3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-□-D-glucopyranosylfu-rost-5-ene-3□，22，26-triol26-O-□-D-glucopy ranoside；26：(R)-3-hydro-xyoct-1-ene3-O-[□-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-□-D-glucopyranoside等11个化合物。
6、一种如权利要求1所述的中药绵萆提取物的制备方法，其特征在于：以中药绵萆或者新鲜采集的绵萆的干燥块茎为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法等工艺中的一种或者多种工艺，并结合浓缩干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等常用干燥方法可制备成权利要求5所述的11种化合物中的一种或多种成分的提取物，使之作为抗骨质疏松活性成分与赋形剂相结合，按照常规方法制成的口服给药的内用剂型及非口服给药的注射剂和外用剂型。
7、根据权利要求6所述的中药绵萆提取物的制备方法，其特征在于：所列的溶剂为下列溶剂中的一种或几种：不多于10个碳原子的卤代烷、醇、酮、酯或其混合溶剂等，其中卤代烷具有以下通式：CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇类溶剂具有以下通式：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮类溶剂具有以下通式：CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯类溶剂具有以下通式：CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)，溶剂洗脱方式包括单一或混合溶剂的正相、反相或梯度洗脱。
8、根据权利要求6所述的中药绵萆提取物的制备方法，其特征在于：所列的吸附树脂为苯乙烯类、丙烯酸酯类、丙烯酰胺类或氧化氮类大孔吸附树脂中的一种或多种；柱层析填料为下列种的一种或多种：硅胶、氧化铝、聚酰胺、吸附树脂、葡萄糖凝胶、硅藻土。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1978983A4 (en) * | 2005-11-15 | 2010-05-12 | Univ Nat Yang Ming | EXTRACT OF DIOSCOREA SP. AND ITS MEDICAL USES |
| JP2014076972A (ja) * | 2012-10-11 | 2014-05-01 | House Foods Group Inc | ジオスシンを有効成分とする骨密度減少抑制医薬組成物及び食品添加剤 |
| CN108143883A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-06-12 | 中南民族大学 | 一种绵萆薢总皂苷的提取方法及应用 |
| CN111303231A (zh) * | 2018-12-11 | 2020-06-19 | 沈阳药科大学 | 甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 |
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2002
- 2002-11-18 CN CN 02144850 patent/CN1415364A/zh active Pending
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