CN1276756C - 一种治疗骨质疏松症的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗骨质疏松症的药物组合物及其制备方法，该药物组合物是由淫羊藿、牡蛎或它们的提取物制成的。本发明制备方法为取淫羊藿叶水煮醇沉，滤液用聚酰胺吸附法精制，得淫羊藿提取物；取牡蛎酸水解得牡蛎水解物；将上述两部分混合，得药物组合物。本发明药物组合物治疗骨质疏松症有确切的疗效。

Description

一种治疗骨质疏松症的药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别是涉及一种治疗骨质疏松症的药物及其制备方法。
背景技术
骨质疏松症是一种骨量减少和骨组织显微结构受损，继而引起骨骼脆性增加和骨折危险度增高的系统性骨骼疾病，临床上常表现为疼痛、身长缩短、驼背、骨折等。
发明内容
本发明目的在于提供一种工艺稳定、质量可控、疗效确切、无毒副作用的治疗骨质疏松症的药物组合物及其制备方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
淫羊藿∶牡蛎15-25∶1-1.5，优选比例为淫羊藿∶牡蛎20∶1；取淫羊藿叶加水煎煮2-4次，每次1-2小时，每次加10-20倍量水，煎液合并，滤过，滤液浓缩至相对密度在60℃时为1.02-1.04的清膏，加乙醇使含醇量为60-80％，静置12-48小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加水至药液∶药材为2∶1，加盐酸至pH＝2-5，冷藏，放置24-72小时，滤过，沉淀干燥，备用；滤液用聚酰胺吸附法精制，聚酰胺柱吸附法条件：径高比为1∶2-5，药液浓度按药材∶药液为1∶1-3，pH＝2-5，比上样量为药材∶聚酰胺2-5∶1，水洗3-6倍柱体积，60-80％乙醇洗脱，至洗脱液颜色加深，开始收集洗脱液，收集1-3倍柱体积，回收乙醇，浓缩、干燥；水洗5-10倍柱体积，洗除乙醇后，重复上样；聚酰胺再生方法：重复上样2-5次后再生1次，用0.5-1％氢氧化钠水溶液2-5倍柱体积洗除吸附杂质后，用pH＝2-4盐酸水溶液洗，至流出液pH＝2-4后重复上样；聚酰胺可再生2次，共上样9次；每公斤聚酰胺可精制淫羊藿15-30公斤；60-80％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为60℃下1.20～1.25的稠膏，干燥；将两部分干膏合并，粉碎，得淫羊藿提取物，备用；取牡蛎，粉碎，过60目筛，加入8-12倍量20-30％的醋酸，加热水解3-6小时，滤过，滤液减压浓缩至半固体，干燥，粉碎，得牡蛎水解物备用。将上述两部分混合，得药物组合物，可将药物组合物直接或加入赋型剂制成临床可接受的剂型，如片剂、胶囊、口服液体制剂、颗粒剂、泡腾剂、口含片等。
本发明药物组合物也可以直接由含有大于50％淫羊藿总黄酮或含有大于15％的淫羊藿苷的淫羊藿有效部位提取物：含有大于75％醋酸钙的牡蛎有效部位水解物1-2∶1-3组成；淫羊藿总黄酮主要含有淫羊藿苷、淫羊藿定C、淫羊藿定B、箭藿苷B、宝藿苷I，宝藿苷II、大花淫羊藿苷C、大花淫羊藿苷F、淫羊藿次苷I等有效成分，其中含有大于15％的淫羊藿苷。优选比例为1∶2。
本发明药物组合物的质量控制方法，其特征在于该方法为：
鉴别：取上述药物组合物0.2g，加硫酸和乙醇各1ml，加热，即发生乙酸乙酯的香气；取上述药物组合物碎过80目筛，称取0.05g，加乙醇10ml，超声4-8分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以8-11∶0.8-1.2∶0.8-1.2∶0.8-1.2乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以8-12％硫酸乙醇液，于100-105℃加热2-4分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色斑点；
含量测定：淫羊藿苷  照高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；26-30∶70-74乙腈-水为流动相；检测波长为270nm；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500；对照品溶液制备：精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成5μg/ml的对照品溶液，即得；供试品溶液制备：取上述药物组合物粉碎过80目筛，精密称取0.1g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入40-60％乙醇45-55ml，密塞，称定重量，超声至溶解，再称定重量，用40-60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液0.5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本发明药物组合物含淫羊藿以淫羊藿苷计，不得少于50mg/g；
醋酸钙  取上述药物组合物粉碎过80目筛，精密称取0.5g置坩埚中，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温；再在500-700℃炽灼3h使完全灰化，放冷，残渣加稀盐酸4-8ml使溶解，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml稀释液加水100ml，0.05％甲基红指示剂1ml，滴加10％氢氧化钾至溶液至浅黄色，再继续多加10ml，加钙黄绿素0.1g，用乙二胺四乙酸二钠滴定液滴定，至溶液的黄绿色荧光消失，并呈橙色，即得；每1ml乙二胺四乙酸二钠滴定液相当于15.8mg的醋酸钙(Ca(Ac)2)；本发明药物组合物含牡蛎以醋酸钙计不得少于0.5g/g。
本发明药物组合物(铸骨胶囊)经药效学研究表明，本药物组合物能抑制大鼠因雌激素水平降低而导致的骨吸收、骨形成异常亢进；抑制灌胃维甲酸而导致的骨吸收亢进，促进骨形成；增加骨量；改善骨组织的显微结构；提高骨组织的生物力学强度；从而具有显著的抗骨质疏松作用。本药物组合物还具有较强的镇痛作用以及抗炎和免疫增强作用。
下列实验例或实施例用于进一步说明本发明。
实验例1、铸骨胶囊对去势大鼠骨质疏松实验模型的影响
分组与给药：取雌性SD大鼠65只。随机选取10只大鼠为假手术组(n＝10)。其余大鼠做卵巢切除术5天后，随机分为：骨质疏松症模型组(n＝11)、阳性对照药骨疏康颗粒组(n＝11)、铸骨胶囊大剂量组(n＝11)、铸骨胶囊中剂量组(n＝11)、铸骨胶囊小剂量组(n＝11)。假手术组、模型组大鼠每天给予浓度为1.33％的β-环糊精水溶液，阳性药组大鼠每天给予骨疏康颗粒2.7g/kg(为成人临床日用量的8倍)，铸骨胶囊大、中、小剂量组大鼠每天分别给予铸骨胶囊剂量分别为400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg(分别为成人临床日用量的8、4、2倍)。连续灌胃给药3个月。
造模方法：各组大鼠用10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，在脊柱两侧正对卵巢的部位切开1.5cm大小的切口，分离背部肌肉，暴露后腹膜，剪开腹膜后取出双侧卵巢。假手术组将卵巢取出后，不做任何处理放回腹腔，缝合创口，消毒；手术组将双侧卵巢结扎后切除，缝合创口，消毒。假手术组给正常饲料，其余五组给低钙饲料，自由饮水。饲养3个月后处死。
观察指标：给药结束，各组动物经10％水合氯醛350mg/kg麻醉，取材。
(1)体重：每周称取一次体重。
(2)脏器指数：大鼠处死后摘取其心、肺、肝、脾、肾、子宫；AND电子天平称重。脏器指数计算公式如下：
Figure C0214947100081
(3)血钙、血磷和血碱性磷酸酶：
颈总动脉插管取血，4℃保存4小时，3000转/分钟离心10分钟，分离血清。血钙测定采用OCPC法，血磷测定采用钼酸法，血清碱性磷酸酶测定采用金氏法，均按试剂盒说明书程序操作，用MD-100自动生化仪测定。血清钙、磷、碱性磷酸酶试剂盒均由北京中生生物工程高技术公司提供。
(4)尿羟脯氨酸(Hydroxyproline，HOP)、肌酐
大鼠处死前一天入代谢笼，禁食，正常饮水，收集其24小时尿液(温度24±2℃、相对湿度50％)。尿羟脯氨酸(Hydroxyproline，HOP)的测定采用改良氯胺-T氧化法测定[2]。羟脯氨酸标准品，由中国科学院上海生化所提供。肌酐测定采用苦味酸法，按试剂盒说明书程序操作，用MD-100自动生化分析仪测定。肌酐试剂盒由北京中生生物工程高技术公司提供。
(5)血清激素(雌二醇、降钙素、骨钙素)：
颈总动脉插管取血，4℃保存4小时，3000转/分钟离心10分钟，分离血清。雌二醇使用雌二醇放免试剂盒(天津德普生物技术和医学产品有限公司提供)，测定按试剂盒说明书操作；降钙素使用降钙素放免药盒(中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所研制、提供)，测定按药盒说明书操作；骨钙素使用骨钙素放免药盒(中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所研制、提供)，测定按药盒说明书操作。
(6)骨密度：
大鼠处死后，剥取其左侧股骨，剔净骨周围肌肉及软组织，用生理盐水擦洗干净，用生理盐水纱布分别包裹，-40℃保存，备测骨密度和骨力学强度。NORLAND X2-36型双能X射线骨密度仪，测股骨骨密度(BoneMineral Density，BMD，g/cm2)。将左侧股骨仰置于有机玻璃板上进行扫描，步距0.5×0.5mm；扫描速度30mm/s；扫描宽度6.55cm。骨密度测定结束后，仍将股骨-40℃保存，送测骨力学强度。
(7)骨力学强度：
将股骨置于WD-1型电子万能试验机作三点弯曲力学试验，跨距25mm，加载速度2mm/min，记录载荷-变形曲线。从曲线上计算最大载荷、最大桡度、抗弯刚度、能量吸收。
(8)骨无机元素含量：
大鼠处死后，剥取其右侧股骨，剔净骨周围肌肉及软组织，用生理盐水擦洗干净。样品送至北京师范大学测试中心，用美国产Jarrell-Ash ICAP9000型电感耦合等离子光谱仪测定骨中钙、磷、镁、锌、铝等无机元素的含量。
(9)椎骨骨组织形态计量学：
大鼠处死前第14天，灌胃四环素(Tetracycline Amersham，购自华美生物工程公司)35～40mg/kg体重，连续两天。相隔10天后，再以同样方法连续灌胃两天四环素。处死后，取第三、四腰椎，经固定、脱水、包埋等处理后，用LEICA 2163型不脱钙骨切片机，制备5μm的纵向不脱钙骨切片，甲苯胺蓝染色。用于荧光观察的切片不作甲苯胺蓝染色。用奥林巴斯BH-2显微镜，JVCPK-C1380图像采集卡观测，采用骨组织计量学分析软件(中国人民解放军总医院骨科研究所研制)对观测指标进行计量和分析。采用的各项参数为：骨小梁表面百分比、骨形成表面百分比、骨吸收表面百分比、平均骨壁厚度及或矿化沉积率。
(10)股骨组织形态结构观察
剥取左侧股骨，剔净骨周围肌肉及软组织，用生理盐水擦洗干净；4℃用4％甲醛溶液固定24小时以上，用EDTA脱钙液脱钙到合适程度，取股骨上端髋关节头最大面积上冠状切面纵行剖开，常规石蜡包埋、切片、HE染色，Olympus显微镜观察，显微照相。
试验结果：试验结果均以平均值±标准差( X±SD)表示，组间比较采用SAS统计软件广义线性模型进行协方差分析，以p＜0.05作为差异具有显著性的标准。N为大鼠数目。实验过程中，由于创口感染导致个别大鼠死亡。故试验结果中大鼠的数目与试验分组时有所不同。
1、体重变化
                            表1 动物体重变化表
组别 给药剂量(g/kg)     给药前(N)(g(只))     给药14周后(N)(g(只))
假手术组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组     --2.70.40.20.1   282.0±14.6(10)286.4±16.6(11)280.5±12.1(11)285.0±13.4(11)288.6±15.0(11)286.8±18.1(11)   366.0±29.5(10)*** △△△440.0±54.8(10)*** ○394.4±55.4(9)*** △387.5±19.1(8)*** △411.9±50.4(8)***420.0±28.6(9)***
注：①给药前各组间比较，p＞0.05。
    ②给药后与给药前相比，***p＜0.001。
    ③给药后与模型组相比，△△△p＜0.001，△p＜0.05；与大剂量组相比，○p＜0.05。
上表表明：各组大鼠给药前体重无显著性差异，组间有可比性。大鼠切除卵巢后，由于雌激素水平迅速下降，造成皮下脂肪的迅速堆积，因此，体重迅速增长。给予铸骨胶囊大剂量后，大鼠体重迅速增长的趋势得到控制，表明铸骨胶囊在一定程度上可抑制大鼠去卵巢后皮下脂肪的堆积。
2、各组大鼠脏器指数的比较
表2 各组大鼠脏器指数(g/100g)
组别     剂量 N 心 肺 肝 脾 肾 子宫
  假手术组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组     --2.70.40.20.1     10109889     0.25±0.040.24±0.030.24±0.030.25±0.050.23±0.040.24±0.03     0.30±0.030.29±0.040.27±0.040.28±0.060.28±0.050.30±0.04     2.28±0.472.11±0.262.11±0.362.16±0.362.23±0.442.14±0.33     0.14±0.020.14±0.030.15±0.040.15±0.020.14±0.030.16±0.03  0.45±0.070.44±0.050.44±0.030.46±0.060.43±0.050.47±0.05  0.069±0.013*** △△△0.018±0.005△○○○0.022±0.004○○○0.025±0.008* ○○○0.021±0.006○○○0.019±0.005○○○
注：①与模型组相比，***p＜0.001；*p＜0.05。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜0.001；△p＜0.05。
    ③与空白组相比：○○○p＜0.001。
去除卵巢可导致大鼠子宫萎缩，子宫指数明显降低。与模型组比较铸骨胶囊各给药组能够不同程度改善去卵巢大鼠的子宫指数；大剂量组有显著性差异。
3、血清钙、磷、碱性磷酸酶和尿脯氨酸/肌酐
表3 药物对模型大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶和尿脯氨酸/肌酐的影响
组别   剂量(g/kg)     N(只)     Ca(mmol/L)     P(mmol/L)     ALP(U/L) HOP/Cr
  假手术组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组   --2.70.40.20.1     10109889  2.70±0.352.53±0.352.70±0.332.74±0.262.54±0.252.64±0.26   1.38±0.191.40±0.161.44±0.181.40±0.191.40±0.131.43±0.18   49.0±5.6***68.7±5.8△△△57.9±6.0***53.3±6.8***60.6±7.6** △66.8±4.8△△△  0.92±0.11***2.34±0.30△△△1.27±0.12*** △△1.00±0.13***1.78±0.25*** △△△1.94±0.20*** △△△
注：①与模型组相比，***p＜0.001；**p＜0.01。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜0.001；△△p＜0.01；△p＜0.05。
模型组大鼠的血清碱性磷酸酶活性(ALP)与尿羟脯氨酸/肌酐(HOP/Cr)均比空白组升高，有显著性差异。表明去势引起骨形成与骨吸收作用同时增强，但骨吸收相对大于骨形成，骨量不能维持平衡而导致大鼠骨质疏松。
铸骨胶囊大、中剂量组及骨疏康能使碱性磷酸酶活性比模型组降低；铸骨胶囊大、中、小剂量组及骨疏康均能使尿羟脯氨酸/肌酐比模型组降低；均有显著性差异。铸骨胶囊大剂量组的作用比其他治疗组强，有显著性差异。
提示铸骨胶囊可改善去势骨质疏松模型大鼠的碱性碱性磷酸酶与尿羟脯氨酸/肌酐的异常增长。
4、血清激素
表4 药物对大鼠激素水平的影响
组别   剂量(g/kg)   N(只)     雌二醇(ng/L)     降钙素(ng/L)     骨钙素(μg/L)
  假手术组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组   --2.70.40.20.1   10109889   14.11±1.46*** △△7.01±0.99△△△11.52±1.65***12.42±1.23***8.40±0.87* △△△7.73±1.01△△△  238.4±19.3*** △△△156.8±22.7△△△184.2±18.2** △205.5±21.6***173.4±16.9△△167.8±18.4△△△  1.45±0.17*** △△△0.82±0.09△△△1.05±0.13*** △△1.23±0.10***0.89±0.11△△△0.84±0.05△△△
注：①与模型组相比，***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.05。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜0.001；△△p＜0.01；△p＜0.05。
模型组大鼠的上述三项血清激素水平比空白组降低，有显著性差异。
铸骨胶囊大、中剂量组及骨疏康组能使血清雌二醇含量比模型组升高；铸骨胶囊大剂量组及骨疏康组能使血清降钙素、骨钙素含量比模型组升高；均有显著性差异。铸骨胶囊大剂量组对雌二醇的治疗作用好于其中、小剂量组，铸骨胶囊大剂量组对血清降钙素、骨钙素的改善作用好于其它治疗组。此结果提示铸骨胶囊与骨疏康均能提高骨质疏松模型大鼠的血清激素水平。
5、股骨骨密度
表5 药物对大鼠股骨骨密度的影响
  组别   剂量(g/kg)     N(只)     骨密度(g/cm2)
  假手术组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组     --2.70.40.20.1     10109889 0.1597±0.0033*** △0.1443±0.0068△△0.1525±0.0052**0.1536±0.0065**0.1494±0.00560.1480±0.0064△
注：①与模型组相比，***p＜0.001；**p＜0.01。
    ②与大剂量组相比，△△p＜0.01；△p＜0.05。
大鼠去势可引起骨密度明显降低，形成骨质疏松，表明模型成功。
经铸骨胶囊大剂量和骨疏康治疗后，均比模型组大鼠的骨密度显著升高。
此结果提示铸骨胶囊与骨疏康均能增加去势骨质疏松模型大鼠的骨密度。
6、股骨无机元素
表6 药物对大鼠股骨无机元素含量的影响
组别 剂量(g/kg)   N(只)     Ca(mg/g)     P(mg/g)     Zn(μg/g)     Mg(mg/g)
  假手术组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组 --2.70.40.20.1   10109889 198.2±7.9***178.7±7.9△△△189.0±4.7** △195.8±3.4***187.8±6.8** △184.5±7.8△△   64.1±2.362.0±3.663.9±4.263.9±1.464.3±3.063.6±2.7   214.7±5.1*** △△191.2±4.3△△△201.6±12.1**204.5±6.9***199.7±10.0*195.7±7.3△   3.47±0.27***2.32±0.32△△△3.04±0.15*** △3.40±0.28***2.99±0.32*** △△2.81±0.33*** △△△
注：①与模型组相比，***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.05。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜0.001；△△p＜0.01；△p＜0.05。
去卵巢所致的骨质疏松大鼠，骨组织中钙、镁、锌的含量均显著降低。
铸骨胶囊大、中剂量组及骨疏康组能明显提高骨钙、锌的含量；铸骨胶囊大、中、小剂量组及骨疏康组能明显提高骨镁的含量；均有显著性差异。铸骨胶囊大剂量组提高骨钙、骨镁的作用明显优于其它治疗组。
提示铸骨胶囊具有能抑制骨吸收，减少骨丢失；能促进机体对钙的吸收和利用；并提供镁、锌等多种无机元素，以有利于钙磷代谢及骨矿的沉积等作用。
7、股骨生物力学
表7 药物对大鼠股骨生物力学强度的影响
组别   剂量(g/kg)   N(只)   最大载荷(N)     最大桡度(mm)     抗弯刚度(N/mm)     能量吸收(N·mm)
  假手术组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组   --2.70.40.20.1   10109889   118.1±9.9***91.3±8.0△△△101.2±8.5* △110.6±10.3***99.0±7.4△96.9±8.7△△   0.84±0.08***0.63±0.04△△△0.73±0.07** △0.81±0.06***0.71±0.09* △△0.69±0.08△△   180.3±23.8***146.1±12.5△△△163.2±17.2*175.9±22.0***160.0±12.7151.5±14.4△△   43.5±5.6***25.5±3.1△△△35.3±3.9*** △△41.5±5.3***32.2±3.8** △△△27.6±3.0△△△
  铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组   0.40.20.1   889   110.6±10.3***99.0±7.4△96.9±8.7△△   0.81±0.06***0.71±0.09* △△0.69±0.08△△ 175.9±22.0***160.0±12.7151.1±14.4△△   41.5±5.3***32.2±3.8** △△△27.6±3.0△△△
注：①与模型组相比，***p＜0.001：**p＜0.01；*p＜0.05。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜0.001：△△p＜0.01；△p＜0.05。
模型组大鼠的上述各项指标均显著低于空白对照组，较小的外力和能量即可使骨折发生，表明去卵巢使大鼠骨质疏松，骨组织结构改变，弹性下降，骨折危险性增加。
铸骨胶囊大剂量组及骨疏康能提高最大载荷、抗弯刚度；铸骨胶囊大、中剂量组及骨疏康组能提高最大桡度、能量吸收；均有显著性差异。而铸骨胶囊大剂量组在提高最大载荷、最大桡度、能量吸收方面显著优于其它治疗组。
表明铸骨胶囊能明显改善骨质疏松大鼠骨组织的力学性能，降低骨折危险性。这与铸骨胶囊能升高骨密度，增加骨矿盐含量，增加骨量有关。
8、骨组织形态计量学
表8 药物对大鼠骨组织形态计量学参数的影响
组别    剂量 N  骨小梁表面百分比(％)   骨吸收表面百分比(％)   骨形成表面百分比(％)   平均骨壁厚度(μm)   矿化沉积率(μm/d)
假手术组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组 --2.70.40.20.1 666666 55.7±2.7*** △△35.3±4.5△△△42.8±5.7** △48.8±4.5***41.0±3.5* △△37.4±3.9△△△ 4.55±0.67*** △△11.81±1.71△△△8.62±0.91*** △△6.64±0.84***8.91±1.27*** △△10.59±1.19△△△ 10.7±1.1***21.1±2.9△△△16.3±1.9*** △△12.2±1.6***16.8±2.2** △△△20.2±2.3△△△ 4.03±0.58***2.82±0.34△△△3.35±0.36* △3.85±0.28***3.27±0.40△3.10±0.30△△ 0.44±0.03*** △△△0.24±0.02△△△0.31±0.03*** △△0.37±0.03***0.28±0.03** △△△0.25±0.03△△△
注：①与模型组相比，***p＜0.001；**P＜0.01；*p＜0.05。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜O.001；△△p＜0.01；△p＜0.05。
实验结果显示，大鼠去势后，骨小梁及其形态发生明显改变，骨小梁表面百分比、平均骨壁厚度和矿化沉积率均显著低于空白对照组，骨形成表面百分比、骨吸收表面百分比明显增加，骨小梁数目减少，变细，稀疏，骨小梁间隙增大，表明大鼠去势后，骨形成与骨吸收均亢进，但骨吸收相对大于骨形成，导致骨量丢失而致骨质疏松。
铸骨胶囊大、中剂量组及骨疏康组能使骨小梁表面百分比、矿化沉积率比模型组提高，显著降低骨形成表面百分比、骨吸收表面百分比；铸骨胶囊大剂量组及骨疏康组能使平均骨壁厚度增加；均有显著性差异。铸骨胶囊大剂量组在上述五个指标方面均优于其它剂量组。
表明铸骨胶囊能明显促进骨质疏松大鼠类骨质的形成和矿化，并抑制骨吸收、骨形成的异常增长，能在一定程度上改善骨的显微结构，从而既增加了骨量，又改善了骨结构，因此使骨的力学性能大大提高。
实验例2：铸骨胶囊对去势大鼠股骨组织形态结构的影响
脱钙骨切片HE染色后，显微镜下观察可见，铸骨胶囊治疗组比模型组骨小梁增粗，断裂点减少，骨小梁条数增多，排列较整齐；胶原纤维排列整齐，连续性较好。
实验例3：铸骨胶囊对维甲酸大鼠骨质疏松实验模型的影响
分组及给药：取大鼠60只。按体重随机分为6组。空白对照组(n＝10)，骨质疏松症模型组(n＝10)，阳性对照药骨疏康颗粒组(n＝10)，铸骨胶囊大剂量组(n＝10)，铸骨胶囊中剂量组(n＝10)，铸骨胶囊小剂量组(n＝10)。空白组、模型组大鼠每天给予浓度为1.33％的β-环糊精水溶液，阳性药组大鼠每天给予骨疏康颗粒2.7g/kg(为成人临床日用量的8倍)，铸骨胶囊大、中、小剂量组大鼠每天分别给予铸骨胶囊剂量分别为400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg(分别为成人临床日用量的8、4、2倍)。连续灌胃给药4周(即停用维甲酸后继续使用两周)。
造模方法：以1％羧甲基纤维素钠为溶媒，将维甲酸配制成0.7％的混悬液，4℃避光保存，备用。除空白组以外的其它6组大鼠均用0.7％维甲酸混悬液每天给予70mg/kg灌胃，连续2周后停用。
观察指标：
(3)尿羟脯氨酸(Hydroxyproline，HOP)、肌酐的测定：测定方法同实验一。
(4)骨密度测定：测定方法同实验一。
(5)骨力学强度测定：测定方法同实验一。
(6)骨无机元素含量：测定方法同实验一。
(7)椎骨组织形态计量学测定：
按实验一方法制备5μm的横向不脱钙骨切片，观察、测定。
(8)股骨组织形态结构观察：方法同实验一。
试验结果：
试验结果均以平均值±标准差( X±SD)表示，组间比较采用SAS统计软件广义线性模型进行协方差分析，以p＜0.05作为差异具有显著性的标准。
N为大鼠数目。实验过程中，由于维甲酸的毒性导致个别大鼠死亡。故试验结果中大鼠的数目与试验分组时有所不同。
9、体重变化
表9 动物体重变化表
组别   给药剂量(g/kg)     给药前(g(只))     给药4周后(g(只))
  空白组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组     --2.70.40.20.1    200.1±12.2(10)198.6±10.2(10)201.2±12.3(10)201.6±13.2(10)203.6±9.6(10)200.8±11.7(10)  281.8±17.9(10)*** △△△204.0±33.1(8)○○○284.8±13.2(9)*** △△△290.1±20.8(8)*** △△△290.1±9.9(9)*** △△△286.6±17.1(9)*** △△△
注：①给药前各组间比较，p＞0.05。
    ②给药后与给药前相比，***p＜0.001。
    ③给药后与模型组相比，△△△p＜0.001；与大剂量组相比，○○○p＜0.001。
上表表明：各组给药前体重无显著性差异，各组有可比性。维甲酸的毒性可引起大鼠体重增长减缓甚至负增长。而铸骨胶囊及骨疏康均可抑制维甲酸的毒性，从而使之得到改善。
10、血清钙、磷、碱性磷酸酶和尿脯氨酸/肌酐
表10 药物对模型大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶和尿脯氨酸/肌酐的影响
组别 剂量(g/kg)   N(只)     Ca(mmol/L)     P(mmol/L)     ALP(U/L) HOP/Cr
  空白组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组   --2.70.40.20.1   1089899   12.8±1.611.8±1.312.0±1.611.8±1.711.9±1.011.8±0.9   7.41±0.788.16±1.148.14±0.988.17±1.187.48±1.007.22±0.93   140.8±17.3***107.3±8.7△△△131.1±15.0***138.6±15.8***121.3±10.9* △108.4±8.9△△△  0.86±0.08*** △△2.40±0.31△△△1.31±0.18*** △1.11±0.10***1.35±0.15*** △△1.70±0.17*** △△△
注：①与模型组相比，***p＜0.001；*p＜0.05。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜0.001；△△p＜0.01；△p＜0.05。
试验表明大鼠灌胃维甲酸后，与空白组相比，可导致血清碱性磷酸酶降低，尿羟脯氨酸与肌酐的比值升高，进而导致骨形成降低，骨吸收亢进。
铸骨胶囊大、中剂量组及骨疏康能使碱性磷酸酶活性比模型组升高；铸骨胶囊大、中、小剂量组及骨疏康均能使尿羟脯氨酸/肌酐比模型组降低；均有显著性差异。铸骨胶囊大剂量组的作用明显好于其他治疗组。
表明铸骨胶囊能够改善维甲酸导致的血清碱性磷酸酶和尿羟脯氨酸/肌酐的异常变化。
11、股骨骨密度
表11 药物对模型大鼠股骨骨密度的影响
    组别   剂量(g/kg)     N(只)     BMD(g/cm2)
    空白组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组     --2.70.40.20.1     1089899   0.1611±0.0074i*** △0.1442±0.0060△△0.1521±0.0050*0.1545±0.0090**0.1496±0.00580.1456±0.0063△△
注：①与模型组相比，***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.05。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜0.001；△△p＜0.01；△p＜0.05。
维甲酸骨质疏松大鼠模型组，与正常组相比骨密度显著降低。表明灌胃维甲酸会导致骨质破坏。
铸骨胶囊大剂量组、骨疏康组可使骨密度比模型组显著升高，有显著性差异。
表明铸骨胶囊能对抗灌胃维甲酸导致的大鼠股骨骨密度降低。
12、股骨无机元素
表12 药物对大鼠股骨无机元素含量的影响
组别    剂量(g/kg)     N(只)     Ca(mg/g)     P(mg/g)     Zn(μg/g)     Mg(mg/g)
  空白组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组     --2.70.40.20.1     1089899  198.4±5.4***176.2±4.3△△△188.6±5.9*** △195.1±6.0***188.4±3.3*** △△182.8±5.2* △△△   115.6±7.1115.2±3.8115.5±4.2116.7±3.7115.4±2.8114.7±3.2  237.9±15.1***216.1±3.1△△△245.7±11.8***239.4±9.8***235.1±13.8**234.3±10.5**  3.99±0.16***3.72±0.12△△△3.85±0.12* △3.97±0.12***3.82±0.08△3.77±0.10△△△
注：①与模型组相比，***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.05。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜0.001；△△p＜0.01；△p＜0.05。
维甲酸所致的骨质疏松大鼠，骨组织中部分无机元素的含量也会显著降低。
铸骨胶囊大、中、小剂量组及骨疏康组能明显提高骨钙、锌的含量；铸骨胶囊大剂量组及骨疏康组能明显提高骨镁的含量；均有显著性差异。铸骨胶囊大剂量组提高骨钙、骨镁的作用明显优于骨疏康及其中、小剂量。
表明铸骨胶囊对灌胃维甲酸导致的大鼠骨组织无机元素丢失，有明显的改善。
13、股骨生物力学
表13 药物对大鼠股骨生物力学强度的影响
组别   剂量(g/kg)    N(只)   最大载荷(N)   最大桡度(mm)   抗弯刚度(N/mm)     能量吸收(N·mm)
  空白组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组     --2.70.40.20.1     1089899  95.4±11.0***74.1±8.3△△△84.6±9.5* △93.7±7.9***83.4±3.8* △80.9±10.0△△   1.01±0.11***0.74±0.10△△△0.87±0.10** △0.98±0.09***0.79±0.08△△△0.76±0.08△△△   176.8±16.0***150.7±13.5△△166.6±15.3*175.1±14.6**162.4±15.7153.8±13.8△△    25.2±2.2***13.9±1.5△△△21.7±2.6*** △24.1±1.9***20.1±2.1*** △△△16.9±2.2** △△△
注：①与模型组相比，***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.05。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜0.001；△△p＜0.01；△p＜0.05。
结果表明维甲酸可导致大鼠股骨生物力学指标显著降低，增加骨折的危险性。
铸骨胶囊大、中剂量组及骨疏康能提高最大载荷；铸骨胶囊大剂量组及骨疏康组能提高最大桡度、抗弯刚度，铸骨胶囊大、中、小剂量组及骨疏康能提高能量吸收；均有显著性差异。而铸骨胶囊大剂量组在提高最大载荷、最大桡度、能量吸收方面显著优于其它治疗组。
表明铸骨胶囊能明显改善维甲酸骨质疏松大鼠骨组织的力学性能，降低骨折的危险性。
14、骨组织计量学
表14 药物对大鼠骨组织形态计量学参数的影响
组别   剂量 N   骨小梁面积百分比(％)   骨吸收面积百分比(％)   骨形成面积百分比(％)   平均骨壁厚度(μm)     矿化率(μm/d)
空白组模型组骨疏康颗粒组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组 --2.70.40.20.1 1089899 42.5±4.2*** △29.2±3.3△△△33.2±2.3* △△38.2±3.8***32.5±2.7△△30.3±1.9△△△ 4.79±0.55***18.54±2.50△△△8.54±0.85*** △△5.69±0.70***10.30±1.23*** △△△16.28±2.16* △△△ 19.48±1.37*** △△△5.05±0.70△△△13.48±1.42*** △△16.04±2.02***11.44±1.54*** △△△9.46±1.33*** △△△ 4.69±0.65***2.96±0.39△△△3.96±0.21*** △4.55±0.52***3.60±0.48* △△3.07±0.35△△△ 0.37±0.05*** △△0.16±0.02△△△0.26±0.03*** △030±0.04***0.25±0.03*** △△0.18±0.02△△△
注：①与模型组相比，***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.05。
    ②与大剂量组相比，△△△p＜0.001；△△p＜0.01；△p＜0.05。
大鼠灌胃维甲酸后，会导致骨形成减少，骨吸收亢进，破坏骨小梁。
与模型组相比，铸骨胶囊大剂量组及骨疏康组能增加骨小梁面积百分比；铸骨胶囊大、中、小剂量组及骨疏康组均能增加骨形成面积百分比，降低骨吸收面积百分比。铸骨胶囊大、中剂量组及骨疏康组能增加骨壁厚度、矿化沉积率。铸骨胶囊大剂量组各项指标均优于其它治疗组。
表明铸骨胶囊能对抗维甲酸导致的骨形成减少，吸收亢进，修复骨小梁。
15、骨组织形态结构：
铸骨胶囊治疗组比模型组骨小梁增粗，断裂点减少，骨小梁条数增多，排列较整齐；胶原纤维排列整齐，连续性较好。(参见附录VII～VIII页彩图)
实验例3：铸骨胶囊镇痛作用的实验研究(扭体法)
分组及给药：将动物随机分为：空白对照组；阳性药组(元胡止疼片，剂量0.75g/kg，为成人临床日用量的10倍)；铸骨胶囊大剂量(500mg/kg)、中剂量(250mg/kg)、小剂量(125mg/kg)3个剂量组，分别相当于临床人日用量的10、5、2.5倍；每组14只，雌雄各半。
小鼠灌胃药物，对照组给予同等容量β-环糊精水溶液(浓度0.83％)，1日1次，连续7日。第7日给药后1小时腹腔注射0.6％醋酸，0.2ml/只。记录每只小鼠出现扭体反应的潜伏期，以及0～10分、10～20分、20～30分内的扭体次数。
试验结果：试验结果均以平均值±标准差( X±SD)表示。N为动物数。组间比较采用SAS统计软件广义线性模型进行协方差分析，以p＜0.05作为差异具有显著性的标准。(结果见表15)
表15 铸骨胶囊对醋酸致小鼠扭体反应的影响
  组别  剂量g/kg  N     体重(g)     潜伏期(分)     扭体次数(次)
0～10分 10～20分 20～30分
  对照组元胡止疼片组铸骨胶囊组铸骨胶囊组铸骨胶囊组  -0.750.50.250.125  1414141414  22.7±2.0123.23±2.1922.44±2.0223.43±1.9123.17±1.57   8.66±5.9019.19±8.83**18.29±10.18**18.18±10.19**12.17±7.24   5.78±6.530.36±0.89**0.71±1.53*1.86±3.482.93±5.09  11.0±8.322.86±4.10**2.86±4.79**4.71±9.259.07±9.42   10.57±10.543.86±4.64*2.21±2.54**6.43±12.508.0±7.14
注：与模型组比较：**p＜0.01；*p＜0.05。
试验结果显示，铸骨胶囊大剂量组、中剂量组及阳性药组均可不同程度地抑制腹腔注射醋酸引起的小鼠扭体反应。表现为铸骨胶囊大、中剂量组及阳性药组能延长扭体反应潜伏期，铸骨胶囊大剂量组及骨疏康能够减少单位时间内动物扭体次数；均有显著性差异。提示铸骨胶囊与元胡止疼片均有明显镇痛作用。
实验例4：铸骨胶囊抗炎症实验研究
分组与给药：实验用大鼠50只，随机分为对照组(灌胃等体积1.33％的β-环糊精水溶液)、地塞米松治疗组(灌胃地塞米松0.1mg/kg，相当于人日用量的8倍)、铸骨胶囊大、中、小剂量组(分别灌胃铸骨胶囊400mg/kg、200mg/kg和100mg/kg，分别相当于临床人日用量的8、4、2倍)，每组10只。连续给药3天，末次给药30分钟后造模。
造模方法：末次给药后30分钟，先测定其左后足跖容积并记录。随后分别在各组大鼠左后足跖皮下注射1％角叉菜胶混悬液0.1ml/只。随后每隔1小时测一次左后足跖容积并记录，连续测量6次。记录结果，并按下式计算肿胀率和抑制率。
Figure C0214947100212
试验结果表明
铸骨胶囊大、中剂量组能显著抑制大鼠注射角叉菜胶所致的足跖肿胀，大剂量组在造模1小时～4小时、中剂量在造模1小时～3小时与对照组比较有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)。铸骨胶囊小剂量组也有一定的抑制趋势。
实验例5：铸骨胶囊对小鼠免疫功能影响的实验研究
1、铸骨胶囊对小鼠脾脏淋巴细胞增殖影响
60只Balb/C小鼠随机分为5组，分别为正常对照组；多抗甲素组，剂量为0.03mg/kg；铸骨胶囊组，剂量分别为500mg/kg(相当于人日用量10倍)、250mg/kg(相当于人日用量5倍)、125mg/kg(相当于人日用量2.5倍)。每日给药一次，连续10天，正常对照组给予相同体积0.83％的β-环糊精水溶液。
结果表明：铸骨胶囊大、中、小剂量均能显著增强正常小鼠脾T、B淋巴细胞的增殖，与对照组比较(p＜0.05，p＜0.01)。阳性对照药多抗甲素组能显著增强正常小鼠脾T、B淋巴细胞的增殖(p＜0.01)。
2、铸骨胶囊对小鼠血清凝集素的影响：
分组与给药：同1。
结果表明：铸骨胶囊大、中剂量均能显著提高正常小鼠血清中凝集素的含量，与对照组比较(p＜0.05，p＜0.01)。小剂量也有一定的增强效果。铸骨胶囊三个剂量组有较好的量效关系。
3、铸骨胶囊对小鼠迟发性超敏反应的影响
分组与给药：72只Balb/c小鼠随机分为正常对照组(灌胃给等体积0.83％的β-环糊精水溶液)；DTH模型组(灌胃给等体积0.83％的β-环糊精水溶液)；多抗甲素组(灌胃给0.03mg/kg)；铸骨胶囊组，灌胃给药，剂量分别为125mg/kg、250mg/kg、500mg/kg(分别相当于临床人日用量的2.5、5、10倍)，连续给药8天。
结果表明：DTH对照组小鼠右耳较正常对照组显著增厚，表明DTH模型制备成功。铸骨胶囊大、中、小剂量组均能显著增强二硝基氟苯所致小鼠迟发超敏反应，与DTH对照组比较p＜0.01。且有较好的量效关系。
下列实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1：
取淫羊藿叶4000g加水煎煮三次，每次1小时，第一次加20倍量水，第二、三次各加16倍量水，煎液合并，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.04(60℃)的清膏，加乙醇使含醇量为70％，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加水至药液∶药材为2∶1，加盐酸至pH＝3，冷藏，放置72小时，滤过，沉淀干燥，备用；滤液用聚酰胺吸附法精制，聚酰胺柱吸附法条件：径高比为1∶3，药液浓度按药材∶药液为1∶2，pH＝3，比上样量按药材∶聚酰胺为2.5∶1，水洗4倍柱体积，70％乙醇洗脱，至洗脱液颜色加深，开始收集洗脱液，收集1倍柱体积，回收乙醇，浓缩、干燥；水洗7倍柱体积，洗除乙醇后，重复上样；聚酰胺再生方法：重复上样3次后再生1次，用0.5％氢氧化钠水溶液3倍柱体积洗除吸附杂质后，用pH＝3盐酸水溶液洗，至流出液pH＝3后重复上样；聚酰胺可再生2次，共上样9次；每公斤聚酰胺可精制淫羊藿22.5公斤；70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)的稠膏，干燥。将两部分干膏合并，粉碎，得淫羊藿提取物，备用。取牡蛎220g，粉碎，过60目筛，加入8倍量30％的醋酸，加热水解4小时，滤过，滤液减压浓缩至半固体，干燥，粉碎，得牡蛎水解物，备用。将上述两部分混合，制粒，装入胶囊，制成1000粒，即得。
实施例2：
将含有大于50％淫羊藿总黄酮或含有大于15％的淫羊藿苷的淫羊藿有效部位提取物167g，含有大于75％醋酸钙的牡蛎有效部位水解物333g，混合，制粒，装入胶囊，制成1000粒，即得。

Claims (10)

1、一种治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下原料药制成的：
淫羊藿∶牡蛎15～25∶1～1.5。
2、如权利要求1所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下原料药制成的：
淫羊藿∶牡蛎为20∶1。
3、一种治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下原料药制成的：
含有大于50％淫羊藿总黄酮或含有大于15％的淫羊藿苷的淫羊藿有效部位提取物：含有大于75％醋酸钙的牡蛎有效部位水解物为1～2∶1～3。
4、如权利要求3所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下原料药制成的：
含有大于50％淫羊藿总黄酮或含有大于15％的淫羊藿苷的淫羊藿有效部位提取物：含有大于75％醋酸钙的牡蛎有效部位水解物为1∶2。
5、如权利要求1、2、3或4所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物直接或加入赋型剂制成临床接受的剂型。
6、如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的剂型为片剂、胶囊、口服液体制剂、颗粒剂、泡腾剂或口含片。
7、如权利要求1或2所述的治疗骨质疏松症的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
取淫羊藿叶加水煎煮2～4次，每次1～2小时，每次加10～20倍量水，煎液合并，滤过，滤液浓缩至相对密度在60℃时为1.02～1.04的清膏，加乙醇使含醇量达60～80％，静置12～48小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加水至药液∶药材为2∶1，加盐酸至pH＝2～5，冷藏，放置24～72小时，滤过，沉淀干燥，备用；滤液用聚酰胺吸附法精制，聚酰胺柱吸附法条件：径高比为1∶2～5，药液浓度按药材∶药液为1∶1～3，pH＝2～5，比上样量为药材∶聚酰胺2～5∶1，水洗3～6倍柱体积，60～80％乙醇洗脱，至洗脱液颜色加深，开始收集洗脱液，收集1～3倍柱体积，回收乙醇，浓缩、干燥；水洗5～10倍柱体积，洗除乙醇后，重复上样；聚酰胺再生方法：重复上样2～5次后再生1次，用0.5～1％氢氧化钠水溶液2～5倍柱体积洗除吸附杂质后，用pH＝2～4盐酸水溶液洗，至流出液pH＝2～4后重复上样；聚酰胺再生2次，共上样9次；每公斤聚酰胺精制淫羊藿15～30公斤；60～80％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为60℃下1.20～1.25的稠膏，干燥；将两部分干膏合并，粉碎，得淫羊藿提取物，备用；取牡蛎，粉碎，过60目筛，加入8～12倍量20～30％的醋酸，加热水解3～6小时，滤过，滤液减压浓缩至半固体，干燥，粉碎，得牡蛎水解物备用；将上述两部分混合，得药物组合物，将药物组合物直接或加入赋型剂制成临床接受的剂型。
8、如权利要求7所述的治疗骨质疏松症的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
取淫羊藿叶加水煎煮三次，每次1小时，第一次加20倍量水，第二、三次各加16倍量水，煎液合并，滤过，滤液浓缩至相对密度在60℃时为1.04的清膏，加乙醇使含醇量达70％，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加水至药液∶药材为2∶1，加盐酸至pH＝3，冷藏，放置72小时，滤过，沉淀干燥，备用；滤液用聚酰胺吸附法精制，聚酰胺柱吸附法条件：径高比为1∶3，药液浓度按药材∶药液为1∶2，pH＝3，比上样量按药材∶聚酰胺为2.5∶1，水洗4倍柱体积，70％乙醇洗脱，至洗脱液颜色加深，开始收集洗脱液，收集1倍柱体积，回收乙醇，浓缩、干燥；水洗7倍柱体积，洗除乙醇后，重复上样；聚酰胺再生方法：重复上样3次后再生1次，用0.5％氢氧化钠水溶液3倍柱体积洗除吸附杂质后，用pH＝3盐酸水溶液洗，至流出液pH＝3后重复上样；聚酰胺再生2次，共上样9次；每公斤聚酰胺精制淫羊藿22.5公斤；70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩至60℃下相对密度为1.20～1.25的稠膏，干燥；将两部分干膏合并，粉碎，得淫羊藿提取物，备用；取牡蛎，粉碎，过60目筛，加入8倍量30％的醋酸，加热水解4小时，滤过，滤液减压浓缩至半固体，干燥，粉碎，得牡蛎水解物，备用；将上述两部分混合，制粒，装入胶囊。
9、如权利要求1、2、3或4所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于该方法为：
鉴别：取上述药物组合物0.2g，加硫酸和乙醇各1ml，加热，即发生乙酸乙酯的香气；取上述药物组合物粉碎过80目筛，称取0.05g，加乙醇10ml，超声4～8分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以8～11∶0.8～1.2∶0.8～1.2∶0.8～1.2乙酸乙酯一丁酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以8～12％硫酸乙醇液，于100～105℃加热2～4分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色斑点；
含量测定：淫羊藿苷照高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；26～30∶70～74乙腈-水为流动相；检测波长为270nm；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500；对照品溶液制备：精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成5μg/ml的对照品溶液，即得；供试品溶液制备：取上述药物组合物粉碎过80目筛，精密称取0.1g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入40～60％乙醇45～55ml，密塞，称定重量，超声至溶解，再称定重量，用40～60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液0.5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本药物组合物含淫羊藿以淫羊藿苷计，不得少于50mg/g；
醋酸钙取上述药物组合物粉碎过80目筛，精密称取0.5g置坩埚中，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温；再在500～700℃炽灼3h使完全灰化，放冷，残渣加稀盐酸4～8ml使溶解，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml稀释液加水100ml，0.05％甲基红指示剂1ml，滴加10％氢氧化钾至溶液至浅黄色，再继续多加10ml，加钙黄绿素0.1g，用乙二胺四乙酸二钠滴定液滴定，至溶液的黄绿色荧光消失，并呈橙色，即得；每1ml乙二胺四乙酸二钠滴定液相当于15.8mg的醋酸钙；本药物组合物含牡蛎以醋酸钙计不得少于0.5g/g。
10、如权利要求1、2、3或4所述的药物组合物在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。
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