CN1927309A - 一种中药组合物及其制备方法和质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗退行性骨关节病的中药组合物，该组合物是以熟地黄8－16重量份、淫羊藿2－4重量份、狗脊3－7重量份、独活2－4重量份、骨碎补2－6重量份、续断3－7重量份、补骨脂2－4重量份、桑寄3－7重量份、鸡血藤2－4重量份、木香2－4重量份、乳香2－4重量份、没药2－4重量份为原料药按特定工艺加工而成，用于治疗退行性骨关节痛、腰肌劳损等症。本发明还公开了该中药组合物的质量控制方法包括鉴别和/或含量测定方法及其制药用途。

Description

一种中药组合物及其制备方法和质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和质量控制方法，特别涉及一种治疗退行性骨关节病的中药组合物及其制备方法和质量控制方法，属中药制药技术领域。

背景技术

退行性骨关节病是一种慢性骨关节疾患，多发于40岁以上的中老年人。病变部位多见于腰椎、颈椎及四肢关节。其主要病理变化是椎间盘、关节软骨、关节囊、韧带发生退行性病变，骨质疏松，椎体边缘骨质增生或局部损伤性炎症等。临床症状以慢性疼痛为主，活动时加剧。西医治疗以休息、服用镇痛药为主。中医认为，退行性骨关节病是由于慢性劳损引起肝肾亏损、营卫失和、气血阻滞、复有外邪侵入所致。发明人基于传统中医理论，以补益肝肾、养血活血为主，辅以祛风通络、理气止痛的原理而发明了一种治疗退行性骨关节病的中药组合物。

发明内容

本发明目的在于提供一种治疗退行性骨关节病的中药组合物；本发明第二个目的在于提供一种该中药组合物的制备方法；本发明的目的还在于提供一种该中药组合物的质量控制方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的。

本发明中药组合物是由如下重量份的原料药组成：

熟地黄 8-16重量份  淫羊藿 2-4重量份   狗脊   3-7重量份

独活   2-4重量份   骨碎补 2-6重量份   续断   3-7重量份

补骨脂 2-4重量份   桑寄生 3-7重量份   鸡血藤 2-4重量份

木香   2-4重量份   乳香   2-4重量份   没药   2-4重量份。

本发明中药组合物原料药优选如下重量份：

熟地黄12重量份     淫羊藿3重量份       狗脊5重量份

独活3重量份        骨碎补4重量份       续断5重量份

补骨脂3重量份     桑寄生5重量份     鸡血藤3重量份

木香  3重量份     乳香  3重量份     没药  3重量份。

本发明中药组合物原料药优选如下重量份：

熟地黄9重量份     淫羊藿3.5重量份   狗脊4重量份

独活  3.5重量份   骨碎补3重量份     续断6重量份

补骨脂2.5重量份   桑寄生6重量份     鸡血藤2.5重量份

木香  3.5重量份   乳香2.5重量份     没药3.5重量份。

本发明中药组合物原料药优选如下重量份：

熟地黄15重量份     淫羊藿2.5重量份     狗脊  6重量份

独活  2.5重量份    骨碎补5重量份       续断  4重量份

补骨脂3.5重量份    桑寄生4重量份       鸡血藤3.5重量份

木香  2.5重量份    乳香  3.5重量份     没药  2.5重量份。

取上述本发明中药组合物原料药，加入或不加入常规辅料，按常规工艺制成临床可接受的口服剂型。所述口服剂可以是口服液、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、酒剂、丸剂或者散剂。

本发明中药组合物的制备工艺如下：

按重量比例称取上述十二味原料药，乳香、没药加6-10倍量水，置多功能提取罐中，煎煮1-3小时，趁热300目滤布过滤，滤液浓缩、烘干为干膏，同时收集馏出的挥发油；其余熟地黄等十味药材加10-14倍水量，置多功能提取罐中，煎煮1-3次，每次1-3小时，同时收集馏出的挥发油，水煎液过滤，浓缩至80-85℃时相对密度为1.05-1.15的浓缩液，加入乙醇使浓缩液含醇量为55％-65％，静置，分取上清液，下层滤过，滤液与上清液合并，减压回收乙醇，浓缩，烘干得干膏；乳香、没药所制干膏与熟地黄等十味所制干膏混合粉碎，过筛，用70％-95％的乙醇制颗粒、干燥、整粒，得颗粒备用；合并上述挥发油，分离脱水，用5-9倍量的β-环糊精包合，35-50℃干燥即得β-环糊精包合物粉末；将β-环糊精包合粉末与所得颗粒一起混匀，加入常规辅料，按常规工艺制成临床接受的口服剂型。

所述包合工艺为取5-9倍挥发油重量的β-环糊精加入蒸馏水制成饱和水溶液后，与1∶1(50％，V/V)的挥发油-无水乙醇溶液混合，35℃恒温搅拌3小时，冷藏24小时后抽滤，包合物于35-50℃干燥，得β-环糊精挥发油包合物粉末。

本发明中药组合物丸剂的制备工艺可以是如下：

按重量比例称取上述十二味原料药，乳香、没药、木香、独活均取半量，补骨脂、续断、熟地黄、鸡血藤均取四分之一量，粉碎成细粉，过100目筛；上述剩余的药材与狗脊等四味加水煎煮，滤过，滤液减压浓缩成60℃相对密度为1.25～1.28的清膏，与上述细粉充分混合均匀，干燥，粉碎成细粉，用水泛丸，打光，制成浓缩水丸；或将上述十二味原料药，粉碎成细粉，过100目筛，混合均匀，用水泛丸，低温干燥，用甘草炭或生地炭包衣，制成水丸，按常规工艺制成为临床可接受的丸剂剂型。

本发明中药组合物制剂的质量控制方法包括如下鉴别和/或含量测定方法中的一种或几种：

鉴别：

A.取本发明中药组合物制剂日服用量的5/9，加入75％乙醇25ml，超声提取20-40min，冷却后滤过，量取滤液10ml，与100-200目硅胶2g混合，置水浴上挥干溶剂，加于已处理好的硅胶H柱(硅胶H柱内径2cm、重5g，以氯仿湿法装柱)上，先以氯仿20ml洗脱，弃去洗脱液，再以4-6∶1-3(体积比)氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，收集黄褐色色谱带洗脱液20ml，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；再取淫羊藿对照药材1g，加水100ml煎煮20-40分钟，滤过，取三分之一的滤液浓缩至1ml，加入无水乙醇6ml，混匀，静置，滤过，滤液浓缩至干，残渣以2ml甲醇溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验(收载于中国药典2000年版一部附录VIB)，吸取供试品溶液5μl，对照药材溶液5μl，对照品溶液3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8-12∶1-3(体积比)氯仿-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1-3∶7-9(体积比)的1％香草醛硫酸-乙醇溶液，于105℃烘烤显色至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

B.取本发明中药组合物制剂日服用量的15/9，加60-90℃石油醚50ml，超声处理15-25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿50ml，超声溶解15-25分钟，滤过，滤液用50ml水洗涤后蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液；另取补骨脂对照药材1g，加水50ml煮沸1小时，滤过，滤液浓缩至原体积的一半后加乙醇使成60％乙醇溶液，静置，滤过，滤液浓缩至干，残渣加醋酸乙酯5ml充分溶解，滤过，滤液浓缩至1ml，作为对照药材溶液；再取补骨脂素、异补骨脂素对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验(收载于中国药典2000年版一部附录VIB)，吸取上述三种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以9-7∶1-3(体积比)正己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％氢氧化钾-甲醇(其中氢氧化钾(重量)∶甲醇(体积)是1∶10)溶液，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

C.取本发明中药组合物制剂日服用量的5/18，加入75％乙醇20ml，超声处理25-35分钟，滤过，滤液置水浴上蒸干；残渣溶于10ml水中，用醋酸乙酯洗涤2-4次，每次10ml，弃去醋酸乙酯洗涤液，水溶液再用水饱和的正丁醇萃取4-6次，每次10ml，合并正丁醇萃取液，再用氢氧化钠试液洗涤2-4次，每次20ml，再用水洗涤一次。弃去洗涤液，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取续断对照药材粗粉0.5g，用75％乙醇20ml回流提取1小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣用丙酮10ml洗涤，弃去洗涤液，挥干丙酮，再用75％乙醇1ml溶解并转移至5ml量瓶中，以无水乙醇稀释至刻度，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验(收载于中国药典2000年版一部附录VIB)，吸取供试品溶液、对照药材溶液各3μl，点于同一硅胶G薄层板上，以63-77∶27-33∶9-11(体积比)氯仿-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开后晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

D.取本发明中药组合物制剂日服用量的15/9，加60-90℃石油醚20ml，超声处理15-25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取乳香对照药材1g，加水50ml煮沸2小时，滤过，滤液加乙醇使成60％乙醇溶液，静置24小时，取上清液以60-90℃石油醚20ml萃取，分取石油醚层蒸干，加无水乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验(收载于中国药典2000年版一部附录VIB)，吸取供试品溶液3μl，对照药材溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10-14∶1(体积比)正己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1-3∶7-9(体积比)的1％香草醛硫酸-乙醇溶液，于105℃烘烤至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

E.取鉴别D项下的供试品溶液作为供试品溶液；另取独活对照药材1g，加水50ml煮沸2小时，滤过，滤液加乙醇使成60％乙醇溶液，静置过夜，滤过，滤液以石油醚(60-90℃)20ml萃取，分取石油醚层蒸干，加无水乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验(收载于中国药典2000年版一部附录VIB)，吸取供试品溶液5μl，对照药材溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以1-3∶1(体积比)石油醚60-90℃-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，365nm置紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

含量测定：照高效液相色谱法测定，中国药典2000版一部附录VID。色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；20-40∶80-60(体积比)乙腈-水为流动相；检测波长为270nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。

对照品溶液的制备，精密称取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备，取本发明中药组合物制剂的内容物，混匀，研细，精密称取1.0克，精密加入75％乙醇20ml，密塞称定；超声提取30分钟，冷至室温后再次称定，用75％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明中药组合物制剂每日服用量含淫羊藿按淫羊藿苷C₃₃H₄₀O₁₅计，不得少于1.60mg。

本发明药物组合物原料药组合中以熟地黄养血滋阴、补精益髓，为治疗肝肾两虚之腰膝酸软等症之要药，为君药。淫羊藿补肾壮阳、祛风除湿，《本草备要》谓之“补命门、益精气、坚筋骨、利小便”，有补肾兼祛风寒湿邪之功效。补骨脂性味辛温、补肾益阳，治腰膝冷痛，与淫羊藿合用能振阳以化阴，加强熟地黄之培补肝肾之力。骨碎补补肾强骨、活血、止痛，《药性论》：“主骨中毒气，风血疼痛”，能破血、止痛，补伤折。续断补肝肾、行血脉、续筋骨，补而不滞，对于外伤所致关节损伤、肾虚之腰膝疼痛、足膝萎痹均能用之。桑寄生祛风湿、补肝肾、强筋骨，与续断同功，专治腰酸背痛，足膝酸软，风湿痹痛，肢节不利。狗脊补肝肾、强腰膝、祛风湿，六药配合君药主治肝肾不足，兼风寒湿邪之症，是为臣。方中取乳香、没药辛散温通，既能活血化瘀，又可行气散滞。鸡血藤行血补血，舒筋活络，以上三味共为佐药。独活辛散温燥，善祛风湿，常与补肝肾药同用，可标本兼治。张石顽谓独活能“升中有降、能通达周身”。木香行气调中，使脾胃运化有力，有益于肝肾气血之通畅，与独活共为方中之佐使。以上诸药共凑补益补肾、养血活血、舒筋活络、理气止痛之功。

本发明中药组合物原料药中含有淫羊藿、狗脊、骨碎补、续断、补骨脂等补肾壮阳之药，用于治疗退行性骨关节痛、腰肌劳损等症，药效学主要以对肾虚证的影响以及消炎、镇痛为主。

1.观察本发明胶囊对肾上腺皮质激素氢化可的松所造成的小鼠肾虚证的防护作用。实验结果表明本发明胶囊可改善小鼠肾虚证症状，阻止肾虚小鼠体重和性器官重量的减轻，具有明显补肾壮阳作用。

2.通过实验观察本发明胶囊对二甲苯所致小白鼠耳部炎症的影响和对大白鼠棉球肉芽肿增生的影响，结果表明本发明胶囊有显著的抗炎消肿作用。

3.通过热板刺激法和化学致痛法实验观察，结果表明本发明胶囊有显著的镇痛作用且呈一定的量效关系。在热板刺激法的试验中，本发明胶囊高剂量组的镇痛作用优于本发明丸剂组。

附图说明：

图1：淫羊藿苷量回归方程曲线图

本发明胶囊治疗退行性骨性关节炎及慢性腰肌劳损有较好的临床疗效，能明显改善患者的临床症状、体征，其疗效与本发明丸剂相当，可用于退行性骨性关节炎(病)及慢性腰肌劳损，且中医辨证属于肝肾不足、筋脉瘀滞证患者的临床治疗。

按本发明制备工艺制备成的本发明胶囊剂具有有效部分含量高，生物利用度高，治疗量小，质量稳定性好，质量可控性强及使用方便等优点。十二味原料药均使用多功能提取罐加水煎煮，去除或破坏了组织物质、部分无效成分、酶等，相应地提高了有效成分的浓度，增强了某些有效成分的稳定性。除乳香、没药外，熟地黄等十味药材的水煎滤液进一步用适宜浓度的醇沉淀，以去除淀粉、鞣质、树脂、蛋白质、粘液质、油脂、脂溶性色素等无效成分。同时利用多功能提取罐的蒸馏冷凝回收装置收集挥发油，挥发油用β-环糊精包合，制成β-环糊精挥发油包合物，以免逸失，避免了有效性挥发油的散失，降低了工艺操作的难度，并使药品在档次上有所提高。作成胶囊剂不仅可以掩盖药物的不良气味，每次两粒，体积小，服用、携带也很方便，更主要的是胶囊剂可以避光，可以增强药物稳定性；在制备工艺上，胶囊剂在制备时不需要加粘合剂和压力，使其在胃肠道中分散快，吸收好。

本发明为了更好地进行质量控制，制订了以对照药材为基础的淫羊藿薄层色谱鉴别，样品经硅胶柱处理后，排除了干扰，使淫羊藿苷斑点清晰，其结果灵敏、可靠，阴性试验无干扰。补骨脂中含补骨脂素等呋喃香豆素类化合物，在365nm下呈蓝色荧光，并遇碱加强；样品用石油醚处理，再用氯仿萃取石油醚溶出物，可最大限度地除去干扰，使结果灵敏、可靠，阴性对照无干扰。续断中含有续断碱、挥发油、皂甙、维生素E类等物质，经过多次试验，建立了以续断皂甙类化合物为基础的鉴别方法；实验结果表明，供试品色谱与对照药材色谱在相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品色谱在相应的位置上无干扰。乳香含有挥发油3～8％，并含乳香萜烯及氧化乳香萜烯等低极性成分；样品用石油醚处理，可有效除去高极性成分的干扰，使结果清晰、可靠，阴性试验无干扰。独活挥发油中含有枞油烯、λ-雪松烯、愈创酚、λ-香柠檬烯等低极性成分；样品用石油醚处理，可有效除去高极性成分的干扰，使结果清晰、可靠，阴性试验无干扰。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1  本发明胶囊对肾虚小鼠的影响

以氢化可的松复制小鼠肾虚模型，观察本发明胶囊对肾虚的作用。在连续10天给予25mg/kg/d氢化可的松肌注造模同时，灌胃给予不同剂量(0.6g/kg、0.3k/kg、0.15g/kg)本发明胶囊混悬液。结果表明：中、高剂量本发明胶囊能明显改善小鼠肾虚表现，使肾虚小鼠体重、性器官重量、自主活动、精神状态等恢复正常。

1外观变化  空白对照组动物毛发光洁，神态，活动正常。模型组动物竖毛，毛发不光洁，神萎、拱背、少动。本发明胶囊三个剂量组、本发明丸剂(按实施例1所述方法制备)组动物自主活动明显增加、蜷曲、拱背现象少见。

2体重变化  各组动物体重变化见表1，从表1可看出，模型组动物在肌注氯可10天后体重未见增长反而降低，与生理盐水对照组相比，差异显著(p＜0.01)结合动物外观与活动的变化，证明用25mg/kg氢化可的松肌注成功复制了小鼠肾虚证模型。与模型组相比，本发明胶囊高、中剂量组的动物体重均有不同程度的增加。

      表1  本发明胶囊对肾虚证动物体重的影响( x±s)

组别	动物数	体重
				给药前	给药后
		生理盐水组氢化可的松模型组本发明丸剂组本发明胶囊组(H)本发明胶囊组(M)本发明胶囊组(L)	161616161616			22.6±1.923.1±1.523.0±1.422.7±1.822.8±1.322.3±1.1	27.7±2.922.0±1.5**26.7±2.1#27.1±2.3#25.1±1.4#22.5±2.2*

注：与生理盐水对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与氢化可的松模型组比较，#P＜0.05。

3对性器官重量的影响

肌注25mg/kg氢化可的松10天后，雌性小鼠子宫重量明显减轻，与生理盐水对照组相比，具有显著性差异(p＜0.01)；雄性小鼠睾丸重量无明显变化，但精液囊及前列腺重量减轻，与生理盐水对照组相比，p＜0.05。本发明胶囊高、中剂量组对氢化可的松所致肾虚动物的子宫和精液囊及前列腺重量较模型组显著升高，接近生理盐水对照组水平。

                      表2本发明胶囊对肾虚动物性器官重量影响( X±S)

组别	动物数	(雌+雄)睾丸(mg/10g)	精液囊+前列腺(mg/10g)	子宫(mg/10g)
					生理盐水组氢化可的松模型组本发明丸组本发明胶囊组(H)本发明胶囊组(M)本发明胶囊组(L)	8+88+88+88+88+88+8	69.7±10.862.6±12.368.7±14.971.3±11.469.2±13.568.0±9.4	42.7±14.430.4±6.3*39.9±9.2##41.8±8.6##42.1±9.0##33.9±8.3*	20.1±5.87.3±3.5***18.8±3.9###19.1±2.5###18.5±3.6###10.7±4.3**

注：与生理盐水对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001：与氢化可的松模型组比较，##P＜0.01，###P＜0.001。

实验例2  本发明胶囊剂消炎作用的实验研究

1本发明胶囊对二甲苯所致小鼠耳部炎症的影响

取18-22克小白鼠50只，随机分成五组，即本发明胶囊0.6g/kg(高)、0.3g/kg(中)、0.15g/kg(低)三个剂量组，分别相当于临床剂量的20、10、5倍；本发明丸剂组(4g/kg)，相当于临床用量的20倍：蒸馏水对照组。灌胃给药，给药2小时后，每鼠左耳用二甲苯0.05毫升致炎，15分钟后，齐耳根剪下小鼠左、右二耳，再将二耳重叠在一起剪修，使二耳外形保持一致、等大。然后称量每只小鼠左、右耳的重量。并以左耳片(致炎耳)重量减去右耳(末致炎耳)重量后的重量作为炎症肿胀度指标，并计算炎症抑制率。数据均以 X±S表示，统计处理用t检验，试验结果见表3：

       表3  本发明胶囊对二甲苯所致小鼠耳部肿胀的影响( X±S)

组别	动物数	肿度	抑制率
				空白对照组本发明丸组本发明胶囊组(H)本发明胶囊组(M)本发明胶囊组(L)	1010101010	7.85±0.702.51±0.53***2.38±0.69***5.82±0.89**7.66±1.01	-68.069.725.9-

与空白对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。下同。

试验结果表明：本发明胶囊有明显的抗炎作用，且呈一定的量效关系。

2本发明胶囊对大鼠棉球肉芽肿增生的影响

2.1对棉球肉芽肿湿重增生的影响

180-225g大白鼠随机分成5组，每组10只。用乙醚麻醉后，各组大白鼠两侧腹部皮下，各埋植20±1mg棉球1个，然后将伤口缝合。灌胃给药，对照组给蒸馏水，各组给药量同上实验。第6日处死大鼠，仔细剥出腔下棉球肉芽肿，称其湿重，比较各组大白鼠每百克体重的棉球肉芽肿的差异。统计处埋采用t检验。试验结果见表4：

    表4  本发明胶囊对大白鼠棉球肉芽肿增生影响( X±S)

组别	动物数	肉芽肿湿重(mg/100g)	抑制率
				空白对照组本发明丸组本发明胶囊组(H)本发明胶囊组(M)本发明胶囊组(L)	1010101010	188.5±17.4161.3±6.9***159.4±9.2***180.2±11.2*182.5±13.2	-14.415.4--

与空白对照组比较：*P＜0.05，***P＜0.001。

2.2对棉球肉芽肿干重增生的影响

方法同上作棉球肉芽肿。于第六日处死大鼠。仔细剥出腔下棉球肉芽肿，置80℃烘箱烤5小时，称重量。计算每百克大鼠体重所植棉球增生的结缔组织干重。数据均以 X±S表示，统计处理用t检验。试验结果见表5。

      表5  本发明胶囊对大白鼠棉球肉芽肿增生的影响( X±S)

组别	动物数	肉芽肿湿重(mg/100g)	抑制率
				空白对照组本发明丸组本发明胶囊组(H)本发明胶囊组(M)本发明胶囊组(L)	1010101010	30.7±2.1315.5±1.95***14.2±2.21***27.5±2.01**28.1±2.10*	-49.5157.0010.42-

与空白对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

试验结果表明本发明胶囊具有明显的抑制棉球肉芽肿增生的作用。且随着剂量的增加，其抑制作用增强。

实验例3  本发明胶囊剂镇痛作用的实验研究

1.热板刺激法试验

将直径为12cm日铝皮筒放于恒温水浴内，便其底部触及水面，调节水温并使之恒定于55±0.5℃，铝皮筒底部受热后作为热刺激致痛物。取18-22g健康雌性小鼠，依次放入铝皮筒内，用秒表测定小鼠从放入筒内至出现舐后足所需的时间作为该鼠痛阈值。选用10-20秒出现痛反应的小白鼠，剔除善跳和迟钝者，试验在17-20℃室内进行。将筛选合格的小鼠50只随机分成5组。分组方法、给药剂量、给药途径同前，给药前再测一次各鼠的痛阈值，以两次痛阈值的平均值作为各鼠给药前痛阈值。给药20分钟后测定各鼠痛阈值2次，其平均值作为各鼠给药后痛阈值。结果见表6。

                   表6  各组小鼠对热刺激反应时间( X±S)

组别	动物数	给药前反应时间(s)	给药20分钟后反应时间(s)
				空白对照组本发明丸组本发明胶囊组(H)本发明胶囊组(M)本发明胶囊组(L)	1010101010	17.2±3.217.1±3.216.8±2.318.1±3.117.6±2.8	17.0±2.924.3±3.8***28.2±3.7***21.1±4.9**18.0±4.8

与空白对照组比较：***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。下同。

与本发明丸组比较：#P＜0.05。

试验结果表明本发明胶囊中、高剂量组有明显提高小白鼠痛阈的作用。给药20分钟后，本发明胶囊高剂量组镇痛的作用明显优于本发明丸组(P＜0.05)。

2.化学法

以小白鼠产生扭体为指标，观察本发明胶囊的镇痛效应。18-22g小白鼠50只，随机分为五组，雄雌各半，禁食12小时。给药方法、剂量同热板法实验。给药20分钟后，各组动物均腹腔注射0.6％乙酸溶液0.2ml/只。观察10分钟内小白鼠发生扭体反应的次数。试验结果见表7。

表7  本发明胶囊对小鼠扭体反应的镇痛作用( X±S)

组别	动物数	出现扭体次数
			空白对照组本发明丸组本发明胶囊组(H)本发明胶囊组(M)本发明胶囊组(L)	1010101010	12.8±3.55.2±2.1***4.1±1.7***8.9±2.9**11.9±2.9

与空白对照组比较：***P＜0.001。

试验结果表明本发明胶囊中、高剂量组有明显的减少小白鼠腹腔注射醋酸后产生扭体次数的作用。

实验例4  本发明中药组合物制备工艺研究

1.水煎煮提取工艺

将上述熟地黄等十味加工成粗粉，按重量比例称取共530.7g，加水12倍量浸泡1小时，煎煮2小时二次，滤过，滤液浓缩成稠膏，烘干，初步测量水煮浸膏得率，按此法分别测量三次，浸膏得率列表8：

           表8  熟地黄等十味水煮浸膏得率

熟地黄等十味总量(g)	水煮浸膏量(g)	水煮浸膏得率(％)
			530.7530.7530.7	119.94117.44117.18	22.6022.1322.08

上述十味份量多，体积大，从表8可知水煮出膏率高达22％，若以此所得干膏粉制胶囊，每次服用量较大。

2.水煮醇沉工艺

为排除淀粉、鞣质、树脂、蛋白质、粘液质、油脂、脂溶性色素等非有效成分，缩小体积，减少服用量，而采用水煮醇沉法，得到较纯的制品。由于木香、独活、淫羊藿、补骨脂含有挥发油，水煮时采用多功能提取罐的蒸馏回收装置蒸馏冷凝回收挥发油。

2.1水煎煮工艺

为了寻找最佳煎煮条件，设计了正交试验，选用溶媒(水)用量、提取次数、提取时间作为水煮工艺的考察因素，以浸膏得率和淫羊藿苷含量为考察指标，选用L₉(3⁴)，因素水平安排于表9：

                    表9  正交试验因素水平表

制备工艺：取上述熟地黄等十味加工成粗粉，加水浸泡1小时，水煎煮，300目滤布滤过，滤液浓缩至相对密度1.10(80-85℃)，得水煮液。试验结果见下表：

                                     表10  正交试验设计表及试验结果

	试验号	A	B	C	D	浸膏得率(％)	淫羊藿苷含量(g)实际×10	淫羊藿苷提取率(％)
									123456789	111222333	123123123	123231312	123312231	18.0022.9625.1617.0627.8622.6619.0020.5629.46	1.322.562.411.822.082.361.832.462.03	35.6869.1265.1449.1956.2263.7849.4666.4654.86
	浸膏得率	IIIIIIIIIIIIR	66.1267.5869.0222.0422.5323.010.97	54.0671.3877.2818.0223.7925.767.74	61.2269.4872.0220.4123.1624.013.60	75.3264.6262.7825.1121.5420.934.18	G＝202.72Y＝22.52CT＝G2/N＝4566.16SS总＝4716.49-4566.16＝150.33f总＝8
淫羊藿苷的含量										IIIIIIIIIIIIR	6.296.266.322.102.092.110.02	4.977.106.801.662.372.270.71	6.146.416.322.052.142.110.09	5.436.756.691.812.252.230.44	G＝18.87Y＝2.10CT＝G2/N＝39.56SS总＝40.83-39.56＝1.27f总＝8

                        表11  浸膏得率方差分析表

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	P
						B误差Sse(A+C+D)	97.1052.23	26	48.558.705	5.58	＜0.05

F_0.10(2，6)＝3.46  F_0.05(2，6)＝5.14

                       表12  淫羊藿甙含量方差分析表

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	P
						B误差Sse(A+C+D)	0.890.38	26	0.4450.0633	7.03	＜0.05

F_0.01(2，6)＝3.46     F_0.05(2，6)＝5.14

表10、11结果表明，因素B(提取次数)，对浸膏得率有显著性影响；而因素A(加水量)和C(提取时间)无显著性影响；程度依次为B＞C＞A。各因素的最佳水平为A₃B₃C₃。

表10、12结果表明，因素B(提取次数)对淫羊藿苷含量有显著性影响：而因素A(加水量)和因素C(提取时间)无显著性影响，程度依次为B＞C＞A，各因素最佳水平为A₃B₂C₂。

综合以上分析，以尽量提取有效成分，减少患者服药量，并从节约能源和工时等方面考虑，在不影响疗效的情况下，而将熟地黄等十味水煮工艺定为：A₁B₂C₂：，即按重量比例取熟地黄等十味粗粉，加12倍量水，浸泡1小时，水煎煮二次，每次2小时，300目滤布滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度为1.10(80-85℃)的水煮液。

2.2醇沉工艺

在确定了水煎煮工艺后，对醇沉时含醇量进行考察，以浸膏得率和淫羊藿苷的保存率为考察指标，分别以醇的含量为50％、60％、70％的浓度进行醇沉。

制备工艺：取上述熟地黄等十味加工成粗粉，加12倍量水浸泡1小时，水煎煮二次，每次2小时，300目滤布滤过，滤液浓缩至相对密度1.10(80-85℃)，加乙醇至沉淀浓度，室温静置24小时后，滤过，得醇水提取液。测定结果见下表：

      表13  水煮醇沉后浸膏得率和淫羊藿甙的保存率

醇沉时醇含量(％)	50	60	70
				浸膏得率(％)淫羊藿甙保存率(％)	11.8765.68	9.7065.14	8.4862.70

从上述结果，以尽量提取有效成分、去除非药用部分、减少患者服用量和节约成本上考虑，我们的工艺选60％乙醇浓度醇沉，从而水煮醇沉工艺为：按重量比例取熟地黄等十味粗粉，加12倍量的水，浸泡1小时，水煎煮二次，每次2小时，300目筛布滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.10(80-85℃)浓缩液，加乙醇使水煮液醇浓度为60％，室温静置24小时后，分取上清液，下层滤过，合并滤液与上清液，减压蒸发回收乙醇，水浴浓缩至稠膏，70℃减压干燥为干膏。

3.挥发油的提取及包合工艺

3.1药材中挥发油的提取情况

处方中几味药材含有挥发油，我们在实验室按《中国药典》2000年版一部附录XD挥发油测定法，对药材中的挥发油含量进行了测定：

量取淫羊藿17.31g，木香17.31g，独活17.31g，乳香17.31g，补骨脂17.31g，没药17.31g，共103.86g药材，放入圆底烧瓶中，加水，上接挥发油测定器，置电热套中缓缓加热至沸，保持微沸5小时，静置，挥发油与水分离，分取挥发油加无水硫酸钠脱水，得挥发油为0.65ml。按本发明胶囊全处方量计算挥发油在药材中的总含量为：

$\frac{0.65\mathrm{ml}\×10}{2999.7g}\×100\%=0.22\%$

3.2挥发油的提取工艺

处方中乳香、没药、补骨脂、木香、淫羊藿、独活等多味药材均含有挥发油。为避免在制剂过程中挥发油的损失，利于与其它组分混匀制备制剂，在采用水煎煮的同时，利用多功能提取罐装置的蒸馏冷凝回收功能，回收挥发油，收集得到的挥发油经脱水后，用β-环糊精(β-CD)包合，使挥发油进入到β-CD分子内部空穴中形成分子包合物。

为考察挥发油提取率与提取时间的关系，将方中全部药材混在一起进行了长时间提取，分别记录收集不同时间段馏出挥发油的量，以确定收集挥发油的最佳时间，实验结果见表14

                            表14  出挥发油率与提取时间的关系

时间(h)	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0	5.0
								出挥发油率(％)	0.01	0.02	0.47	0.56	0.57	0.58	0.58

由表14可见，提取二小时，挥发油馏出基本完全，考虑到节约工时、能源因素，收集挥发油时间定为二小时。即在水煮乳香、没药时，在第一次水煮熟地黄等十味药材时，同时收集馏出的挥发油。

3.3挥发油的包合工艺

挥发油易挥发逸散，为防止挥发油的逸散损失，影响药效，拟采用β-环糊精(β-CD)作包合材料，利用饱和水溶液法包合挥发油。

包合工艺：取一定量的β-环糊精加入适量的(约15倍量)蒸馏水，制成饱和水溶液后，与一定量挥发油无水乙醇溶液(50％，V/V)混合，35℃恒温搅拌3小时，冷藏24小时后抽滤，包合物于45℃干燥，得β-环糊精挥发油包合物，为白色粉末。

β-环糊精与挥发油的比例选择：

采用饱和水溶液法考察了β-环糊精与挥发油不同比例量包合效果。在35℃恒温搅拌3小时，冷藏24小时后，观察水溶液表面是否有油滴，同时感觉挥发油的气味，并取少量表面的水溶液作薄层检查，若水溶液表面无油迹，几无气味，且无挥发油薄层色谱斑点，则证明包合完全。考察结果见表15。

                表15  不同比例β-环糊精与挥发油的包合效果的比较

β-环糊精∶挥发油(g∶ml)	包合效果
		1∶13∶15∶16∶17∶18∶1	表面有少量油滴，气味很浓，薄层检查证明包合不完全表面有少量油滴，气味很浓，薄层检查证明包合不完全表面无油迹，气味较浓，薄层检查证明包合不完全表面无油迹，气味较淡，薄层检查证明包合不完全表面无油迹，儿无气味，薄层检查证明包合完全表面无油迹，儿无气味，薄层检查证明包合完全

由表15结果表明，β-环糊精与挥发油之比7∶1为宜。

在实验中，发现挥发油在用β-环糊精包合后，有少量挥发油是附着于β-环糊精表面，而并未被包合于β-环糊精内部空穴，在冷藏24小时，抽滤后，用无水乙醇洗涤包合物，可洗掉附着于β-环糊精表面的挥发油。由此分别测定了抽滤后未用无水乙醇洗涤包合物和用少量无水乙醇洗涤包合物两种情况下β-环糊精挥发油包合物的挥发油利用率。按《中国药典》2000年版一部附录挥发油测定法测定，读取挥发油提及，即为包合物中挥发油，分别各测定三个样。计算公式为：

结果见表16。

              表16  β-环糊精挥发油包合物的挥发油利用率

NO	抽滤后未用无水乙醇洗涤包合物	抽滤后用无水乙醇洗涤包合物
			123	87.43％86.25％85.86％	64.37％63.21％61.98％

由表16可知，若包合后，用无水乙醇洗涤包合物，挥发油利用率将降低23％左右，由于剂型为胶囊剂，包合物最后被装于空心胶囊中，虽然部分挥发油附着于β-环糊精表面，但亦不会挥散逸失。

挥发油用β-环糊精包合好后，包合物于45℃干燥，由于挥发油有部分是附着于β-环糊精表面，所以在干燥过程中，附着于β-环糊精表面的挥发油有部分逸失。由此测定了干燥后的挥发油包合物的挥发油利用率。分别测定三个样，结果为79.43％、80.08％、78.94％，即在低温干燥过程中，挥发油损失了约8％。所以工艺设计为挥发油包合后，抽滤，45℃干燥，装胶囊。

实验例5  本发明中药组合物的含量测定方法研究

1)仪器与试药：Water510高效液相色谱仪及Water486紫外检测器，乙腈为色谱用试剂，其它试剂均为分析纯。淫羊藿苷对照品由中国药品生物制品检定所提供。色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-水(30∶70)；检测波长：270nm；柱温：室温；流速为0.7ml/min。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。

2)供试品溶液的制备：利用淫羊藿苷易溶于乙醇的特点，用75％乙醇的提出淫羊藿苷。结果表明，此法比较理想。

3)淫羊藿阴性对照溶液的制备：精密称取不含淫羊藿药材的阴性模拟制剂颗粒1.0g，同法制成阴性对照品溶液。

4)线性关系考察：

精密吸取对照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5、15μl，按上述色谱条件测定峰面积。

                              表17  线性关系考察

进样体积(μl)	2.5	5	7.5	10	12.5	15
							进样量(μg)峰面积A	0.21448184	0.42780614	0.631320742	0.841856654	1.052157922	1.262748535

以峰面积积分值为纵坐标，淫羊藿苷量为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程。回归方程曲线图见附图1，结果表明淫羊藿苷量在0.21～1.26μg范围内具有良好的线性关系。

5)精密度试验

精密吸取上述对照品溶液重复进样5次，测量峰面积。结果表明，本方法具有良好的精密度。

                                表18  精密度试验

实验序号	1	2	3	4	5	RSD
							数峰面积	1818782	1802666	1823715	1821854	1795773	0.69％

6)重现性试验

取991021批号本发明胶囊，由同一试验人员在同一实验条件下重复测定三次，其含量测定结果如下。结果表明，本方法具有良好的重现性。

                       表19  重现性试验

实验序号	1	2	3	RSD
					含量(mg/粒)	0.469	0.466	0.474	0.86％

7)回收率试验

精密称取已知含量(0.47mg/粒)的991021批号本发明胶囊内容物约0.5g，精密加入淫羊藿苷对照液10ml(即0.042mg/ml×10ml＝0.42mg淫羊藿苷)，再精密加入75％乙醇10ml，按照供试品溶液的制备方法制备供试液，并按上述色谱条件测定，以下式计算回收率。平行试验五次，结果见下表。结果表明本法具有良好的回收率。

8)样品测定

取本发明中药组合物胶囊十批，由同一组人员照含量测定项下方法测定其淫羊藿苷含量。然后由另一组人员使用不同的色谱柱再次测定，测定结果如下；

样品含量测定结果(mg/粒)

                    表20  样品测定

批号	淫羊藿苷含量	批号	淫羊藿苷含量
				971012971124971128980506980518	0.540.570.540.530.550.550.570.550.580.54	980526990811990915991021991028	0.510.480.460.440.490.470.480.470.460.44

9)含量限度

根据中国药典2000年版对淫羊藿药材中淫羊藿苷的含量规定，结合上述测定结果，确定每粒本发明胶囊含淫羊藿按淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计不得少于0.40mg。这一限量对应的淫羊藿苷保存率约为46％，不低于工艺研究中43.76-45.38％的淫羊藿苷保存率。

实验例6  本发明中药组合物胶囊剂临床疗效观察

本研究采用随机双盲对照试验方法，将本发明胶囊、本发明丸剂及两种安慰剂分别设为本发明I号、本发明II号、本发明III号、本发明IV号，进行本发明胶囊治疗采肌劳损和退行性骨性关节炎属肝肾不足、筋脉瘀滞证的临床试验，以客观评价其临床疗效与安全性。临床试验结束、临床资料数据处理完成后进行双盲编码的揭盲，揭盲结果：治疗组为本发明I号+本发明III号；对照组为本发明II号+本发明IV号。

188例合格受试者中治疗组98例，对照组90例。退行性骨性关节炎治疗组61例，对照组56例，慢性腰肌劳损治疗且37例，对照组34例。

临床总疗效结果表明：退行性骨性关节炎治疗组临床控制为39.3％，显效率为26.2％，有效率为26.2％，无效率为8.2％；对照组临床控制为41.1％，显效率为17.9％，有效率为32.1％，无效率为8.9％。两组比较，差异无显著性意义。慢性腰肌劳损治疗组临床痊愈率为45.9％，显效率为29.7％，有效率为24.3％；对照组临床痊愈率为50.0％，显效率为32.4％，有效率为17.6％。两组比较，差异无显著性意义。提示本发明胶囊治疗退行性骨性关节炎及慢性腰肌劳损属于肝肾不足、筋脉瘀滞证有较好的临床疗效，与对照药相当。

不同部位退行性骨性关节炎临床疗效结果：腰部退行性骨性关节炎治疗组临床控制率为33.3％，显效率为26.7％，有效率为26.7％，无效率为13.3％；对照组临床控制为35.7％，显效率为7.1％，有效率为42.9％，无效率为14.3％。两组比较，差异无显著性意义。膝部退行性骨性关节炎治疗组临床控制为45.2％，显效率为25.8％，有效率为25.8％，无效率为3.2％；对照组临床控制为46.4％，显效率为28.6％，有效率为21.4％，无效率为3.6％.。两组比较，差异无显著性意义。提示本发明胶囊治疗腰、膝部退行性骨性关节炎属于肝肾不足、筋脉瘀滞证有较好的临床疗效，与对照药相当。

临床症状、体征疗效结果表明：两组治疗后退行性骨关节炎患者的腰、膝关节主要临床症状、体征，如腰膝部疼痛、腰膝部活动功能、行走等，以及腰膝酸软、头晕、耳鸣等均有明显改善，但两组比较，差异无显著性意义。两组治疗后慢性腰肌劳损患者的腰痛、屈伸不利、腰部活动功能以及腰膝酸软、头晕、耳鸣等均有明显改善，但两组比较，差异无显著性意义。上述结果提示本发明胶囊能明显改善患者的临床症状、体征，与对照药相当。

对于临床痊愈、临床控制和病人进行了停药二周后随访观察，结果表明：退行性骨性关节炎治疗组24例临床控制患者，停药二周后随访，有22例疗效仍为临床控制，2例显效；对照组23例临床控制患者，停药二周后随访，有20例疗效仍为临床控制，3例为显效。慢性腰肌劳损治疗组17例临床痊愈率患者，停药二周后随访，疗效均仍为临床痊愈；对照组17例临床痊愈率者，停药二周后随访，有16例疗效为临床痊愈，1例显效。

综上所述，本发明胶囊治疗退行性骨性关节炎及慢性腰肌劳损有较好的临床疗效，能明显改善患者的临床症状、体征，其疗效与对照药相当，可用于退行性骨性关节炎(病)及慢性腰肌劳损，且中医辨证属于肝肾不足、筋脉瘀滞证患者的临床治疗。

本发明下述实施例均能实现上述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：本发明丸剂

熟地黄120kg   淫羊藿30kg  狗脊50kg     独活30kg

骨碎补40kg    续断50kg    补骨脂30kg   桑寄生50kg

鸡血藤30kg    木香30kg    乳香30kg     没药30kg。

以上十二味，乳香、没药、木香、独活均半量，补骨脂、续断、熟地黄、鸡血藤均四分之一量，粉碎成细粉，过筛；剩余的药材与其余狗脊等四味加水煎煮，滤过，滤液减压浓缩成相对密度为1.25～1.28(60℃)的清膏，与上述细粉混匀，干燥，粉碎成细粉，用水泛丸，打光，制成浓缩水丸。

实施例2：本发明片剂

熟地黄150kg   淫羊藿25kg    狗脊60kg      独活25kg

骨碎补50kg    续断40kg      补骨脂35kg    桑寄生40kg

鸡血藤35kg    木香25kg      乳香35kg      没药25kg。

以上十二味，粉碎成细粉，过筛，混匀，用水泛丸，低温干燥，用甘草炭(或生地炭)包衣，制成水丸，即得。

实施例3：本发明片剂

熟地黄90kg    淫羊藿35kg    狗脊40kg      独活35kg

骨碎补30kg    续断60kg      补骨脂25kg    桑寄生60kg

鸡血藤25kg    木香35kg      乳香25kg      没药35kg。

以上十二味，加入常规辅料，按常规工艺制备成片剂。一日2次，1次4片

实施例4：本发明口服液

熟地黄150kg   淫羊藿25kg    狗脊60kg     独活25kg

骨碎补50kg    续断40kg      补骨脂35kg   桑寄生40kg

鸡血藤35kg    木香25kg      乳香35kg     没药25kg。

以上十二味，加入常规辅料，按常规工艺制备成口服液。一日2次，1次2支

实施例5：本发明胶囊剂

熟地黄692.1g    淫羊藿173.1g    狗脊288.3g     独活173.1g

骨碎补231.0g    续断288.3g      补骨脂173.1g   桑寄生288.3g

鸡血藤173.1g       木香173.1g    乳香173.1g     没药173.1g

以上十二味，乳香、没药加八倍量水，置多功能提取罐中，煎煮2小时，同时收集馏出的挥发油。水煎液趁热300目滤布滤过，滤液浓缩、干燥成干膏，粉碎，过80目筛，备用。其余熟地黄等十味加十二倍量水，置多功能提取罐中，浸泡1小时，煎煮二次，每次2小时，同时收集馏出的挥发油。水煎液滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10(80-85℃)，加入乙醇使含醇量为60％，静置，分取上清液，下层液压滤，滤液与上清液合并，减压回收乙醇，浓缩，干燥得干膏，粉碎过80目筛，备用。将上述乳香、没药干膏粉、熟地黄等十味干膏粉，混匀，用90％乙醇制颗粒，干燥，得颗粒。合并上述挥发油，分离脱水制成挥发油无水乙醇溶液(50％，V/V)，取七倍量的β-环糊精加入蒸馏水制成饱和水溶液后，与挥发油无水乙醇溶液混合，35℃恒温搅拌3小时，冷藏24小时后抽滤，包合物于35-50℃干燥，得β-环糊精挥发油包合物粉末，45℃干燥，与颗粒混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。每粒装约0.45g。口服，每次两粒，每日两次，早晚饭后服用。

实施例6：本发明胶囊剂的质量控制方法

鉴别：

A.取实施例5制备的胶囊剂内容物1g，加入75％乙醇25ml，超声提取30min，冷却后滤过，量取滤液10ml，与硅胶(100-200目)2g混合，置水浴上挥干溶剂，加于已处理好的硅胶H柱(内径约2cm，5g，以氯仿湿法装柱)上，先以氯仿20ml洗脱，弃去洗脱液，再以氯仿-甲醇(5∶2)混合溶剂洗脱，收集黄褐色色谱带洗脱液约20ml，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成第1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。再取淫羊藿对照药材1g，加水100ml煎煮30分钟，滤过，取三分之一的滤液浓缩至1ml，加入无水乙醇6ml，混匀，静置，滤过，滤液浓缩至干，残渣以2ml甲醇溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验(中国药典2000年版一部附录VIB)，吸取供试品溶液5μl，对照药材溶液5μl，对照品溶液3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(10∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸-乙醇(2∶8)溶液，于105℃烘烤显色至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

B.取实施例5制备的胶囊剂内容物3g，加石油醚(60-90℃)50ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿50ml，超声溶解20分钟，滤过，滤液用50ml水洗涤后蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液。另取补骨脂对照药材1g，加水50ml煮沸1小时，滤过，滤液浓缩至原体积的一半后加乙醇使成60％乙醇溶液，静置，滤过，滤液浓缩至干，残渣加醋酸乙酯5ml充分溶解，滤过，滤液浓缩至1ml，作为对照药材溶液。再取补骨脂素、异补骨脂素对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验(中国药典2000年版一部附录VIB)，吸取上述三种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％氢氧化钾甲醇溶液，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

C.取实施例5制备的胶囊剂内容物0.5g，加入75％乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液置水浴上蒸干。残渣溶于10ml水中，用醋酸乙酯洗涤三次，每次10ml，弃去醋酸乙酯洗涤液，水溶液再用水饱和的正丁醇萃取5次，每次10ml，合并正丁醇萃取液，再用氢氧化钠试液洗涤三次，每次20ml，再用水洗涤一次。弃去洗涤液，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取续断对照药材粗粉0.5g，用75％乙醇20ml回流提取1小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣用丙酮10ml洗涤，弃去洗涤液，挥干丙酮，再用75％乙醇1ml溶解并转移至5ml量瓶中，以无水乙醇稀释至刻度，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验(中国药典2000年版一部附录VIB)，吸取供试品溶液、对照药材溶液各3ml，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(70∶30∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开后晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

D.取实施例5制备的胶囊剂内容物3g，加石油醚(60-90℃)20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取乳香对照药材1g，加水50ml煮沸2小时，滤过，滤液加乙醇使成60％乙醇溶液，静置24小时，取上清液以石油醚(60-90℃)20ml萃取，分取石油醚层蒸干，加无水乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验(中国药典2000年版一部附录VIB)，吸取供试品溶液3μl，对照药材溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸-乙醇(2∶8)溶液，于105℃烘烤至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

E.取鉴别D项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取独活对照药材1g，加水50ml煮沸2小时，滤过，滤液加乙醇使成约60％乙醇溶液，静置过夜，滤过，滤液以石油醚(60-90℃)20ml萃取，分取石油醚层蒸干，加无水乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验(中国药典2000年版一部附录VIB)，吸取供试品溶液5μl，对照药材溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

含量测定：

照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(30∶70)为流动相；检测波长为270nm。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。

对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取实施例5制备的胶囊剂的内容物，精密称定，混匀，研细，精密称取约1.0克，精密加入75％乙醇20ml，密塞称定。超声提取30分钟，冷至室温后再次称定，用75％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明胶囊剂每粒含淫羊藿按淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计，不得少于0.40mg。

Claims (16)

1、一种治疗退行性骨关节病的中药组合物，其特征在于该中药组合物的原料药组成为：

熟地黄8-16重量份     淫羊藿2-4重量份        狗脊3-7重量份

独  活2-4重量份      骨碎补2-6重量份        续断3-7重量份

补骨脂2-4重量份      桑寄生3-7重量份        鸡血藤2-4重量份

木  香2-4重量份      乳  香2-4重量份        没药2-4重量份。

2、如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物的原料药组成为：

熟地黄12重量份     淫羊藿3重量份        狗  脊5重量份

独  活3重量份      骨碎补4重量份        续  断5重量份

补骨脂3重量份      桑寄生5重量份        鸡血藤3重量份

木  香3重量份      乳  香3重量份        没  药3重量份。

3、如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物的原料药组成为：

熟地黄9重量份      淫羊藿3.5重量份      狗  脊4重量份

独活3.5重量份      骨碎补3重量份        续  断6重量份

补骨脂2.5重量份    桑寄生6重量份        鸡血藤2.5重量份

木香3.5重量份      乳香2.5重量份        没  药3.5重量份。

4、如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物的原料药组成为：

熟地黄15重量份     淫羊藿2.5重量份      狗  脊6重量份

独活2.5重量份      骨碎补5重量份        续  断4重量份

补骨脂3.5重量份    桑寄生4重量份        鸡血藤3.5重量份

木香2.5重量份      乳  香3.5重量份      没  药2.5重量份。

5、如权利要求1-4所述的任意一种中药组合物，其特征在于取中药组合物原料药，加入或不加入常规辅料，按常规工艺制成临床接受的口服液、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、酒剂、丸剂或者散剂。

6、如权利要求5所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法为：

按重量比例称取十二味原料药，乳香、没药加6-10倍量水，置多功能提取罐中，煎煮1-3小时，趁热300目滤布过滤，滤液浓缩、烘干为干膏，同时收集馏出的挥发油；其余熟地黄等十味药材加10-14倍水量，置多功能提取罐中，煎煮1-3次，每次1-3小时，同时收集馏出的挥发油，水煎液过滤，浓缩至80-85℃时相对密度为1.05-1.15的浓缩液，加入乙醇使浓缩液含醇量为55％-65％，静置，分取上清液，下层滤过，滤液与上清液合并，减压回收乙醇，浓缩，烘干得干膏；乳香、没药所制干膏与熟地黄等十味所制干膏混合粉碎，过筛，用70％-95％的乙醇制颗粒、干燥、整粒，得颗粒备用；合并上述挥发油，分离脱水，用5-9倍量的β-环糊精包合，35-50℃干燥即得β-环糊精包合物粉末；将β-环糊精包合粉末与所得颗粒一起混匀，加入常规辅料，按常规工艺制成临床接受的口服剂型。

7、如权利要求6所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法所述包合工艺为将挥发油与无水乙醇等体积制成挥发油无水乙醇溶液，取5-9倍挥发油重量的β-环糊精加入蒸馏水制成饱和水溶液后，与挥发油无水乙醇溶液混合，35℃恒温搅拌3小时，冷藏24小时后抽滤，包合物于35-50℃干燥，得β-环糊精挥发油包合物粉末。

8、如权利要求7所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法为：

按重量比例称取十二味原料药，乳香、没药加8倍量水，置多功能提取罐中，煎煮2小时，趁热300目滤布过滤，滤液浓缩、烘干为干膏，同时收集馏出的挥发油；其余熟地黄等十味药材加12倍水量，置多功能提取罐中，煎煮2次，每次2小时，同时收集馏出的挥发油，水煎液过滤，浓缩至80-85℃时相对密度为1.10的浓缩液，加入乙醇使浓缩液含醇量为60％，静置，分取上清液，下层滤过，滤液与上清液合并，减压回收乙醇，浓缩，烘干得干膏；乳香、没药所制干膏与熟地黄等十味所制干膏混合粉碎，过筛，用90％的乙醇制颗粒、干燥、整粒，得颗粒备用；合并上述挥发油，分离脱水，将挥发油与无水乙醇等体积制成挥发油无水乙醇溶液，取7倍挥发油重量的β-环糊精加入蒸馏水制成饱和水溶液后，与挥发油无水乙醇溶液混合，35℃恒温搅拌3小时，冷藏24小时后抽滤，包合物于45℃干燥，得β-环糊精挥发油包合物粉末，与颗粒混匀，装入胶囊，制成胶囊剂。

9、如权利要求5所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法为：

按重量比例称取十二味原料药，乳香、没药、木香、独活均取半量，补骨脂、续断、熟地黄、鸡血藤均取四分之一量，粉碎成细粉，过100目筛；剩余的药材与其余狗脊等四味加水煎煮，滤过，滤液减压浓缩成60℃相对密度为1.25～1.28的清膏，与上述细粉充分混合均匀，干燥，粉碎成细粉，用水泛丸，打光，制成浓缩水丸；或将十二味原料药，粉碎成细粉，过100目筛，混合均匀，用水泛丸，低温干燥，用甘草炭或生地炭包衣，制成水丸，按常规工艺制成为临床可接受的丸剂剂型。

10、如权利要求5所述的中药组合物制剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下含量和/或鉴别方法中的任意一种或几种：

鉴别：

A.取本发明中药组合物制剂日服用量的5/9，加入75％乙醇25ml，超声提取20-40min，冷却后滤过，量取滤液10ml，与100-200目硅胶2g混合，置水浴上挥干溶剂，加于已处理好的硅胶H柱上，硅胶H柱内径2cm、重5g，以氯仿湿法装柱，先以氯仿20ml洗脱，弃去洗脱液，再以4-6∶1-3氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，收集黄褐色色谱带洗脱液20ml，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；再取淫羊藿对照药材1g，加水100ml煎煮20-40分钟，滤过，取三分之一的滤液浓缩至1ml，加入无水乙醇6ml，混匀，静置，滤过，滤液浓缩至干，残渣以2ml甲醇溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5μl，对照药材溶液5μl，对照品溶液3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8-12∶1-3氯仿-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1-3∶7-9的1％香草醛硫酸-乙醇溶液，于105℃烘烤显色至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

B.取本发明中药组合物制剂日服用量的15/9，加60-90℃石油醚50ml，超声处理15-25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿50ml，超声溶解15-25分钟，滤过，滤液用50ml水洗涤后蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液；另取补骨脂对照药材1g，加水50ml煮沸1小时，滤过，滤液浓缩至原体积的一半后加乙醇使成60％乙醇溶液，静置，滤过，滤液浓缩至干，残渣加醋酸乙酯5ml充分溶解，滤过，滤液浓缩至1ml，作为对照药材溶液；再取补骨脂素、异补骨脂素对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以9-7∶1-3正己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％氢氧化钾-甲醇溶液，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑；

C.取本发明中药组合物制剂日服用量的5/18，加入75％乙醇20ml，超声处理25-35分钟，滤过，滤液置水浴上蒸干；残渣溶于10ml水中，用醋酸乙酯洗涤2-4次，每次10ml，弃去醋酸乙酯洗涤液，水溶液再用水饱和的正丁醇萃取4-6次，每次10ml，合并正丁醇萃取液，再用氢氧化钠试液洗涤2-4次，每次20ml，再用水洗涤一次；弃去洗涤液，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取续断对照药材粗粉0.5g，用75％乙醇20ml回流提取1小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣用丙酮10ml洗涤，弃去洗涤液，挥干丙酮，再用75％乙醇1ml溶解并转移至5ml量瓶中，以无水乙醇稀释至刻度，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各3μl，点于同一硅胶G薄层板上，以63-77∶27-33∶9-11氯仿-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开后晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

D.取本发明中药组合物制剂日服用量的15/9，加60-90℃石油醚20ml，超声处理15-25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取乳香对照药材1g，加水50ml煮沸2小时，滤过，滤液加乙醇使成60％乙醇溶液，静置24小时，取上清液以60-90℃石油醚20ml萃取，分取石油醚层蒸干，加无水乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3μl，对照药材溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10-14∶1正己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1-3∶7-9的1％香草醛硫酸-乙醇溶液，于105℃烘烤至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

E.取鉴别D项下的供试品溶液作为供试品溶液；另取独活对照药材1g，加水50ml煮沸2小时，滤过，滤液加乙醇使成60％乙醇溶液，静置过夜，滤过，滤液以60-90℃石油醚20ml萃取，分取石油醚层蒸干，加无水乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5μl，对照药材溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以1-3∶1石油醚60-90℃-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，365nm置紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

含量测定：照高效液相色谱法测定，中国药典2000版一部附录VI D；色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；20-40∶80-60乙腈-水为流动相；检测波长为270nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500；对照品溶液的制备，精密称取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得；供试品溶液的制备，取本发明中药组合物制剂的内容物，混匀，研细，精密称取1.0克，精密加入75％乙醇20ml，密塞称定；超声提取30分钟，冷至室温后再次称定，用75％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本发明中药组合物制剂每日服用量含淫羊藿按淫羊藿苷C₃₃H₄₀O₁₅计，不得少于1.60mg。

11、如权利要求1-4所述的任意一种中药组合物在制备治疗肾虚证的药物中的应用。

12、如权利要求1-4所述的任意一种中药组合物在制备具有消炎作用的药物中的应用。

13、如权利要求1-4所述的任意一种中药组合物在制备具有镇痛作用的药物中的应用。

14、如权利要求1-4所述的任意一种中药组合物在制备治疗退行性骨性关节炎的药物中的应用。

15、如权利要求14所述的应用，其特征在于所述的退行性骨性关节炎是指腰部退行性骨性关节炎和/或膝部退行性骨性关节炎。

16、如权利要求1-4所述的任意一种中药组合物在制备治疗慢性腰肌劳损的药物中的应用。

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