CN1823870A - 一种南蛇藤中成药及其在抗类风湿关节炎中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南蛇藤中成药，它是从卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤中提取分离而得到含有南蛇藤总萜类的提取物。经药效学及毒理学实验证明，该提取物对类风湿关节炎具有较好的治疗作用，同时具有多种抗炎、镇痛、调节机体免疫等作用；它的有效成分比较明确，服用量较少，减小毒副作用，有利于保证药物的安全性和有效性。

Description

一种南蛇藤中成药及其在抗类风湿关节炎中的应用

技术领域

本发明涉及一种中成药，更具体地说，本发明涉及一种从南蛇藤中提取的中成药及其在抗类风湿关节炎中的应用。

背景技术

南蛇藤系卫矛科南蛇藤属植物，又名过山风、黄藤、苦树皮等。药用部位为其根和藤茎。主要分布于我国的东北、华北、华东、西北、西南、广东及两湖地区，朝鲜和日本亦有分布。自从1949年首次报道从南蛇藤叶中提取分离得到黄酮苷类化合物以来，已从南蛇藤种子、根皮、叶及地上部分中分离得到40多种成分，其主要活性成分为倍半萜、三萜、黄酮等成分。传统中医认为南蛇藤具有清热、祛风、除湿、活血、解毒、消肿的功效，常用于治疗风湿积累风湿性关节炎、腰腿痛、筋骨痛、牙痛、闭经、痢疾、跌打损伤、肠风痔漏、毒蛇咬伤、疮疡、痈疖等症，现代药理研究表明南蛇藤具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗生育、昆虫拒食及毒杀等活性，目前多用于治疗类风湿性关节炎、关节炎、血液病及皮肤病，也用作农用杀虫剂；南蛇藤有毒，服用后有胃肠道反应，表现为轻度的胃部不适、恶心、呕吐等。目前，南蛇藤的这些药理作用研究及临床应用都是使用南蛇藤的传统水煎剂或乙醇粗提取物，不仅服用量较大、有效成分不清楚，且副作用较大，作用强度不够，疗效不理想。尽管也有南蛇藤单体成分的药理作用研究，但由于含量低、分离困难，不能规模化生产。有关提取精制南蛇藤有效部位、合理开发利用南蛇藤提取物的产品，特别是含南蛇藤总萜类的提取物产品还未见报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有南蛇藤药用存在的问题，提供一种疗效高、毒副作用低、服用剂量小的南蛇藤中成药。

本发明的另一个目的是提供上述南蛇藤中成药在制备用于抗类风湿关节炎、镇痛、抗炎、调节机体免疫功能的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种南蛇藤中成药，是一种从卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤中提取分离而得到含有南蛇藤总萜类的提取物，该南蛇藤提取物是由如下方法制备而成：

(1)制备南蛇藤粗提物：取原料药材南蛇藤或粉碎后的南蛇藤，用水提醇沉法或乙醇提取法进行提取，得提取液，将此提取液浓缩成稀浸膏，即得南蛇藤粗提物；其中乙醇提取法所用的乙醇是浓度为50-95％的乙醇；

(2)精制：将(1)步制得的南蛇藤粗提物过大孔吸附树脂，先用水或1％-30％的低浓度乙醇洗脱，将该水或低浓度乙醇的洗脱液弃去不用，除去溶于极性溶剂的杂质，再用70％-95％的较高浓度乙醇洗脱，收集此较高浓度乙醇洗脱液，将回收乙醇后的较高浓度乙醇洗脱液干燥，即得含总萜类的南蛇藤提取物。

总萜类的含量在50％以上有较好的效果，总萜类主要由总三萜类成分和总倍半萜类成分二部分组成，总三萜类成分含量在15％以上，总倍半萜含量在35％以上有较好的效果。

如有必要，经上述(2)步精制制得的含总萜类的南蛇藤提取物，可用正丁醇或醋酸乙酯进一步纯化处理，以制得总萜类含量较高的南蛇藤提取物。

其中(2)步中所述的大孔吸附树脂为弱低极性或非极性的大孔吸附树脂，如AB-8、Diaion HP10、Diaion HP20、Diaion HP30、Diaion HP40、Diaion HP50、X-5等。

其中(2)步中所述的干燥方法可以为烘干或减压干燥或喷雾干燥或冷冻干燥等。

上述南蛇藤提取物能抗类风湿关节炎、镇痛、抗炎、调节机体免疫功能，能用于制备抗类风湿关节炎、镇痛、抗炎、调节机体免疫功能的药物，可以制成各种剂型，如注射乳剂、滴丸、片剂、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂等等。

南蛇藤提取物总萜类含量测定方法：

1、南蛇藤提取物总三萜类含量测定：

对照品溶液的制备精密称取105℃下干燥至恒重的扁朔藤素对照品2mg，置于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含扁朔藤素0.08mg)。

标准曲线的制备精密吸取上述对照液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，分别置具塞试管中，水浴挥去溶剂，冷却，准确加入0.4ml的5％香草醛-冰醋酸溶液和1.8ml高氯酸，混匀，密塞。置70℃恒温水浴中加热20min，取出，冷却至室温，加冰醋酸5ml，摇匀，在540nm处测定吸光度，以试剂为空白。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

含量测定供试品溶液的制备：取南蛇藤提取物20mg，加用石油醚∶乙酸乙酯8∶2的混合溶液10ml使溶解，加于处理好的的硅胶柱(100～200目，10g，内径15mm)上，用石油醚∶乙酸乙酯为80∶20的溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇50m，溶解，即得供试品溶液(1)，备用；以石油醚∶乙酸乙酯为80∶20的溶液洗脱后的硅胶柱继续以乙酸乙酯120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇100ml溶解，即得供试品溶液(2)，备用。精密量取供试品溶液(1)0.4ml，按标准曲线制备项下的方法，自“分别置具塞试管中，水浴挥去溶剂”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液(1)中含扁朔藤素量，计算含量。

2、南蛇藤提取物总倍半萜类含量测定

对照品溶液的制备精密称取105℃下干燥至恒重的二氢沉香呋喃倍半萜(emarginatine)对照品2.5mg，置于100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml中含二氢沉香呋喃倍半萜(emarginatine)0.025mg。

标准曲线的制备精密吸取上述对照液各1、2、3、4、5ml，分别用甲醇定容至10ml，以甲醇为空白，于275nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

含量测定精密量取总三萜含量测定中的供试品溶液(2)1ml，按标准曲线制备项下的方法，自“分别用甲醇定容至10ml，”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液(2)中含二氢沉香呋喃倍半萜(emarginatine)量，计算含量。

南蛇藤提取物中总萜类含量为总三萜类含量与总倍半萜类含量之和。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：经药效学及毒理学试验证明，该南蛇藤提取物具有较好的抗类风湿关节炎、镇痛、抗炎、调节机体免疫功能等作用，副作用较小，有效成分明确。其中所含的总萜类，且总萜类含量越高，其他杂质成分则越少，可减少服用量，在一定程度上也可减小毒副作用，更有利于保证药物的安全性和有效性。本发明的提纯工艺中，南蛇藤药材用乙醇液提取，成本较低，而且乙醇可反复循环使用，节约了成本。纯化方法相对简单，从原料中分离总萜类，直接采用大孔吸附树脂富集总萜类，手段先进，收率较高，在3％以上。

附图说明

图1为南蛇藤提取物对AA大鼠关节炎的预防作用效果图；

图2为南蛇藤提取物对AA大鼠关节炎的治疗作用效果图；

图3为给南蛇藤提取物14天后对LEW大鼠关节炎症的抑制作用效果图。

具体实施方式

实施例1

取南蛇藤药材10kg，加95％乙醇80kg，回流提取1小时，滤过，滤液备用，药渣再加95％乙醇70kg，回流提取1小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩成相对密度为1.08的稀浸膏，将此稀浸膏过AB-8大孔吸附树脂，先用30％乙醇洗脱至无色，将此30％乙醇洗脱液弃去，再用95％乙醇洗脱至无色，收集此95％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的95％乙醇洗脱液浓缩成相对密度为1.11的稠浸膏，将此稠浸膏喷雾干燥，得到含总萜类65％(总三萜类成分21％以上，总倍半萜类成分44％)的南蛇藤提取物。

实施例2

取南蛇藤药材10kg，加85％乙醇90kg，回流提取2小时，滤过，滤液备用，药渣再加85％乙醇90kg，回流提取1小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩至相对密度为1.05，将此稀浸膏过AB-8大孔吸附树脂，先用20％乙醇洗脱至无色，将此水洗脱液弃去，再用90％乙醇洗脱至无色，收集此90％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的90％乙醇洗脱液浓缩成相对密度为1.10的稠浸膏，将此稠浸膏减压干燥，加入5倍量的水，加热使溶解，再加入正丁醇萃取3次，每次正丁醇用量与水量相等，合并萃取液，将合并后的萃取液回收正丁醇后干燥，得到含总萜类59％(总三萜类成分19％以上，总倍半萜类成分40％)的南蛇藤提取物。

实施例3

取南蛇藤药材10kg，加70％乙醇100kg煮沸提取2小时，滤过，滤液备用，药渣再加70％乙醇90kg，煮沸提取1小时，滤过，滤过，合并二次滤液，将合并后的滤液浓缩至相对密度为1.05的稀浸膏，将此稀浸膏过Diaion HP20大孔吸附树脂，先用10％乙醇洗脱至无色，将此10％乙醇洗脱液弃去，再用70％乙醇洗脱至无色，收集此70％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的70％乙醇洗脱液浓缩成相对密度为1.09的稠浸膏，将此稠浸膏减压干燥，得到含总萜类55％(总三萜类成分17％以上，总倍半萜类成分38％)的南蛇藤提取物。

实施例4

取南蛇藤药材10kg，加60％乙醇70kg，回流提取1.5小时，滤过，滤液备用，药渣再加60％乙醇70kg，回流提取1.5小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩在相对密度为1.05的稀浸膏，将此稀浸膏过Diaion HP30大孔吸附树脂，先用5％乙醇洗脱至无色，将此5％乙醇洗脱液弃去，再用70％乙醇洗脱至无色，收集此70％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的70％乙醇洗脱液浓缩成相对密度为1.10的稠浸膏，将此稠浸膏喷雾干燥，得到含总萜类52％(总三萜类成分16％以上，总倍半萜类成分36％)的南蛇藤提取物。

实施例5

取南蛇藤荮材10kg，加95％乙醇80kg，回流提取1.5小时，滤过，滤液备用，药渣再加95％乙醇70kg，回流提取1.5小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩在相对密度为1.06的稀浸膏，将此稀浸膏过Diaion HP40大孔吸附树脂，先用30％乙醇洗脱至无色，将此30％乙醇洗脱液弃去，再用95％乙醇洗脱至无色，收集此95％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的95％乙醇洗脱液浓缩成相对密度为1.35的稠浸膏，将此稠浸膏烘干，得到含总萜类61％(总三萜类成分18％以上，总倍半萜类成分43％)的南蛇藤提取物。

实施例6

取南蛇藤药材10kg，加90％乙醇70kg，回流提取1.5小时，滤过，滤液备用，药渣再加90％乙醇70kg，回流提取1.5小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液回收乙醇成相对密度为1.08的稀浸膏，将此稀浸膏过X-5大孔吸附树脂，先用1％乙醇洗脱至无色，将此1％乙醇洗脱液弃去，再用85％乙醇洗脱至无色，收集此85％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的85％乙醇洗脱液浓缩成相对密度为1.13的稠浸膏，将此稠浸膏喷雾干燥，加入5倍量的水，加热使溶解，再加入醋酸乙酯萃取3次，每次醋酸乙酯用量与水量相等，合并萃取液，将合并后的萃取液回收醋酸乙酯后干燥，得到含总萜类69％(总三萜类成分22％以上，总倍半萜类成分47％)的南蛇藤提取物。

实施例7南蛇藤提取物注射乳剂制备

将南蛇藤提取物粉碎，使南蛇藤提取物的粒径小于80μm，称取已粉碎的南蛇藤提取物1500mg投入到容器中；加入注射用大豆油200g、中长链脂肪酸酯50g，投入到容器中，将该容器置于水浴中，加热至80℃左右，搅拌至药物分散，降温至60℃。然后加入25g卵磷脂、维生素E 100mg搅拌至磷脂溶解形成均匀混和相。将注射用水650ml置于另一容器中，加入聚维酮30g、甘油25g、及卵磷脂25g于80℃搅拌溶解形成水相。将含有熊果酸、大豆油和卵磷脂的混和液在60℃机械搅拌下与上述水相混和，并调节pH值至6.5～7.0，再加注射用水至1000ml，并在60℃下继续机械搅拌1个小时制成初乳。将制得的初乳经高速分散机分散，移入高压均质机，匀化到乳滴粒径检查合格为止；再将初乳乳液经微孔滤膜过滤，灌装，通氮、熔封；用旋转高压灭菌器进行100℃，F0为20的条件下灭菌。灭菌完毕后，冲热水逐渐冷却。在室温下贮存。即得南蛇藤提取物肪乳静脉注射液制剂。

实施例8：南蛇藤提取物滴丸剂制备

南蛇藤提取物    50g

聚乙二醇(6000)  350g

泊洛沙姆(188)   25g

将聚乙二醇6000 350g、泊洛沙姆188 25g置于水浴上加热，使之熔融；加南蛇藤提取物，搅拌均匀，加入药用无水乙醇30ml，搅拌助溶，持续搅拌，挥发乙醇，95℃保温待用；将滴丸机预热，贮液室恒温为95±2℃，冷却剂二甲基硅油预冷至10-12℃，调节滴嘴与冷却液面的距离，将药液倒入贮液室，启动阀门，将药液逐滴滴入冷却剂中，滴速约为80滴/分，打开收集口阀门，收集滴丸，纱布滤除冷却剂，并吸除表面残余油渍，摊开，晾干，经检验合格后，包装即得成品。

实施例9：南蛇藤提取物胶囊剂制备

南蛇藤提取物    100g

可溶淀粉        900g

取含南蛇藤提取物粉末100g，加入可溶淀粉900g混匀，喷洒95％食用乙醇20ml制成软材，置制粒机内制成颗粒(一号筛大小)，于60℃下烘干至含水份量3-5％，用一号筛整粒，装3号胶囊，装瓶，经检验合格后，包装即得成品。

实施例10：南蛇藤提取物片剂的制备

南蛇藤提取物        90g

淀粉                900g

阿拉伯胶            4g

羟丙基甲基纤维素钠  4g

硬脂酸镁            3g

取南蛇藤提取物粉末90g，加入淀粉900g、阿拉伯胶4g、羟丙基甲基纤维素钠4g，混匀，喷洒95％食用乙醇20ml制成软材，置制粒机内制成颗粒(一号筛大小)，于60℃下烘干至含水份量3-5％，经上述干燥整粒后，加入润滑剂硬脂酸镁，充分混合均匀，上压片机压制成0.25g/片，装瓶，经检验合格后，包装即得成品。

实施例11：南蛇藤提取物软胶囊剂的制备

南蛇藤提取物        300g

食用豆油            900g

明胶                500g

甘油                150g

水                  适量

取所述的含有总萜类和总黄酮的南蛇藤提取物300g，加入食用豆油900g，混匀，过胶体磨三次，使成均匀的匀浆；另取明胶、甘油和水制成囊壳材料溶液；将含南蛇藤提取物匀浆与囊壳材料溶液分别置于软胶囊，压制成软胶囊，然后洗粒、风干、选粒、包装，即制得含有南蛇藤提取物的软胶囊剂。

实施例12：南蛇藤提取物缓释片剂的制备

南蛇藤提取物        100g

PEG 6000            50g

EC                  50g

乳糖                200g

硬脂酸钙            25g

50％乙醇水溶液      适量。

将南蛇藤提取物、乳糖、PEG6000分别过4号筛，用等量递增法混匀。搅拌下加入硬脂酸钙12.5g，加热约60℃熔融，加入10％EC的乙醇水溶液湿法制粒，过20目筛，将湿颗粒于50℃干燥，再过16目筛整粒。加入12.5g硬脂酸钙，混匀后于单冲压片机上压制1000片，片重约410.0mg，即制得每片含南蛇藤提取物100mg的缓释片剂。

实施例13：蛇藤提取物对Lewis大鼠关节炎的预防作用和治疗作用

1、材料和方法：

试验药物 南蛇藤提取物，按本发明研究方法制备。热杀死Mtb(heat-killedM.tuberculosis H37Ra)由美国Difco实验室提供。

动物 Lewis(LEW)大鼠，雄性，5-6周龄，体重130-160g，美国Harlan SpragueDawley提供，饲养在美国马里兰大学医学院动物中心。

2、实验方法：

大鼠佐剂性关节炎模型的制备和评价LEW大鼠由尾根部注射Mtb 200ul(1mg/ml)，然后定期观察关节炎的临床信号(足趾肿胀程度)，大鼠每只脚积分从0-4，每只大鼠最大临床积分为16分。

分组及给药方法LEW大鼠随即分为3组，南蛇藤高剂量(3g/kg)和低剂量组(1.5g/kg)及模型对照组(同体积生理盐水)。预防组提前4d灌胃南蛇藤提取物，模型对照组给同体积的生理盐水。4d后，模型组及给药组大鼠由尾根部注射Mtb以诱导大鼠佐剂型关节炎，一周后，记录大鼠的关节肿胀积分。治疗组大鼠在灌胃南蛇藤提取物的同时，进行Mtb注射，一周后，按上述记分方法，记录大鼠的关节症状积分，所有大鼠的观察周期为4周。

3、实验结果：

连续给药4周后，预防组大鼠的关节炎的发病程度与模型对照组比较显著降低，南蛇藤提取物预防组及治疗组大鼠关节肿胀度从10天开始显著减轻，关节的肿胀程度与模型组比较受到显著抑制。关节肿胀的峰值为第16，模型组的积分已经达到7，而南蛇藤提取物给药组只有3左右，具有非常显著的统计学差异。(图1、2、3)

实验结果表明，南蛇藤提取物高、低两个剂量组对Mtb诱导的大鼠关节炎模型具有显著的抑制作用，这种抑制作用从给药后10天开始，持续到实验观察结束22天。南蛇藤提取物对大鼠关节炎的抑制作用与阳性对照组(甲氨蝶苓)比较，没有显著性差异。

实施例14：南蛇藤提取物对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用

1、材料和方法

试验药物南蛇藤提取物，按本发明研究方法制备。完全弗氏佐剂Sigma公司生产，批号(9701-11-82)；TNF-a放免试剂盒和IL-β放免试剂盒，北京东亚生物技术研究所提供。

动物健康成年清洁级雄性Wistar大鼠，购买于南方医科大学实验动物中心，体重170±12g。

仪器自制排水体积足体积测量器；奥林巴斯显微镜，日本。

2、方法和结果大鼠40只，随机分为模型组(生理盐水)、南蛇藤高剂量(3g/kg)、低剂量组(1.5g/kg)。灌胃给药

2.1对AA大鼠原发和继发性炎症的影响给药半小时后于每只动物右后足跖皮内注射完全弗氏佐剂0.1ml，分别测量致炎前的注射足和注射足对侧的足体积。测量致炎后6h、18h、24h、6d、9d、12d、15d、18d、21d、24d注射足的足体积，按照足肿胀度＝致炎后足体积—致炎前足体积/致炎前足体积公式计算足肿胀度。此值反映原发性炎症病变情况。于致炎后第15d开始再次给药，并分别于第15d、18d、21d、24d测量注射足对侧的足体积，计算非致炎足肿胀度，此值反映继发性炎症病变情况。结果见表1、2。

表1南蛇藤提取物对弗氏完全佐剂所致大鼠关节炎原发性炎症的影( x±s)

组别	剂量(g/kg)	致炎后肿胀度
								6h	18h	24h	6d	9d	12d
		南蛇藤南蛇藤模型	31.5NS	0.30±0.11#0.35±0.09#0.67±0.14	0.48±0.17#0.46±0.15#0.76±0.15	0.43±0.19#0.41±0.13#0.70±0.18	0.53±0.150.49±0.13*0..62±0.18							0.36±0.17*0.45±0.010.54±0.14	0.39±0.18*0.35±0.10*0.56±0.13

注：#与模型组相比，P＜0.01；^*与模型组相比P＜0.05。n＝8-10

组别	剂量(g/kg)	致炎后肿胀度
						15d	18d	21d	24d
		南蛇藤南蛇藤模型	31.5NS	0.46±0.15*0.49±0.12*0.65±0.14	0.50±0.180.51±0.140.64±0.13					0.49±0.190.38±0.12*0.64±0.13	0.44±0.16*0.36±0.11*0.65±0.15

注：^*与模型组相比P＜0.05。n＝8-10

实验结果表明，从致炎后6h到24d，南蛇藤高、低剂量组与模型组比较对大鼠原发性炎症具有较好的抑制作用。均能够使动物原发性病变的足肿胀度减轻，与模型对照组相比较有显著性统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。

表2南蛇藤提取物对弗氏完全佐剂所致大鼠关节炎继发性炎症的影响( x±s)

组别	剂量(g/kg)	致炎后肿胀度
						15d	18d	21d	24d
		南蛇藤南蛇藤模型	31.5NS	0.15±0.110.11±0.060.15±0.09	0.19±0.070.12±0.08*0.35±0.14					0.16±0.060.11±0.07*0.22±0.07	0.09±0.08*0.15±0.080.22±0.07

注：^*与模型组相比，P＜0.05。n＝8-10

结果表明南蛇藤提取物低剂量组对继发性炎症有抑制作用，大剂量组在后期(24d)能减轻足肿胀度。

实施例15：对关节炎模型大鼠免疫功能的影响

1、对AA大鼠免疫器官的影响连续给药14d后即致炎后第29d，末次给药1h后，腹主动脉取血，处死动物后取出脾和胸腺称重。结果见表3

表3南蛇藤提取物对弗氏完全佐剂致大鼠关节炎免疫器官重量的影响( x±s)

组别	剂量(g/kg)	脾重量(mg/100g体重)	胸腺重量(mg/100g体重)
				南蛇藤南蛇藤模型正常	52.5NSNS	263.56±43.25*337.18±114.58332.84±91.11290.86±33.21	98.40±26.80114.70±26.87*89.26±22.2989.09±29.25

注：^*与模型组相比，P＜0.05。n＝8-10

结果表明模型组动物的脾重量相对于正常组动物有增加的趋势，但没有显著性差异。模型组动物的胸腺重量与正常组动物相比，没有明显差异。南蛇藤高剂量组脾及胸腺重量与正常对照组相近，低剂量组胸腺重量增加。

2、对大鼠血清中TNF-a、IL-1β含量的影响选择注射佐剂造模前、造模后第15d给药前和最后给药1h后采集血液样本。除最后一次为腹主动脉取血外其余两次均采用乙醚浅麻醉，断尾取血。每次采集1ml左右，操作时注意避免溶血发生。将得到的不同时间的血液样本进行血清分离，-20℃保存备用。按照试剂盒要求分别用放免法检测IL-1β、TNF-a的含量。结果见表4、5。

     表4造模前大鼠血清中TNF-a、IL-1的含量( x±s)

组别	剂量(g/kg)	TNF-a(ng/ml)	IL-1(ng/ml)
				南蛇藤南蛇藤模型正常	52.5NSNS	1.31±0.311.29±0.611.33±0.441.28±0.54	0.31±0.210.27±0.120.33±0.210.29±0.10

n＝6-8

表5给药14d后大鼠血清中TNF-a、IL-1的含量( x±s)

组别	剂量(g/kg)	TNF-a(ng/ml)	IL-1(ng/ml)
				南蛇藤南蛇藤模型正常	52.5NSNS	2.55±0.40*2.65±0.67*2.71±0.63*1.85±0.33	1.64±0.64※1.73±0.80#1.89±0.60#0.80±0.34

注：与正常组比较，#P＜0.01；与模型组比较，1P＜0.05。n＝6-8

结果表明造模后模型组大鼠血清TNF-a、IL-1β含量明显增加，与正常对照组比较差异有显著性意义(P＜0.01、P＜0.05)。在给药治疗后南蛇藤提取物5g/kg治疗组动物血清中的IL-1β含量明显减低，与模型组动物相比有显著性意义(P＜0.05)。其余剂量组中TNF-a、IL-1β的含量相对于模型组动物也有减少的趋势但差异没有显著性意义。

实施例16：南蛇藤提取物的镇痛作用研究

1、小鼠扭体实验

实验动物清洁级NIH小鼠，雌雄各半，18-22g。

主要试剂及试剂的配制南蛇藤提取物；阿司匹林片：徐州恩华药业集团有限责任公司，批号：20031107

方法与结果

清洁级小鼠按性别和体重随机分为4组，每组10只。按前述给药剂量，实验组灌胃南蛇藤提取物，正常对照组灌胃等容积蒸馏水，阳性对照组于实验前灌胃阿司匹林片药液，均给药一次。各组动物给药60min后，i.p 0.7％醋酸溶液0.2ml/只。以腹部内凹，臀部抬高，伸展后肢为扭体指标，观察注射后10min内扭体反应次数和第一次扭体出现时间(潜伏期)，并按下式计算镇痛率，结果见表6。实验结果：阳性药阿司匹林组和南蛇藤提取物高、低剂量组小鼠扭体反应次数减少，与模型对照组相比有显著性意义(P＜0.05)。

      表6南蛇藤提取物对小鼠扭体实验的影响( x±s)

组别	剂量(g/kg)	10min内扭体次数(次)	镇痛率(％)
				模型阿司匹林南蛇藤高南蛇藤低	NS0.012831.5	25±1710±10*12±11*14±10*	60.252.544.0

与模型组相比，*P＜0.05。

实施例17：南蛇藤提取物抗炎作用实验研究

1、对急性炎症动物模型的作用

大鼠角叉菜足肿胀实验

实验动物清洁级Wistar大鼠，雄，130-170g。

实验仪器及试剂排水体积测量器；BA110S万分之一电子天平；南蛇藤提取物；角叉菜胶：Sigma公司；吲哚美辛(消炎痛)：临汾奇林药业有限公司，批号：20031118。

方法与结果

将动物随机分为模型对照组、阳性对照组(吲哚美辛)、南蛇藤高剂量组(5g/kg)、南蛇藤低剂量组(2.5g/kg)，每组8只。口服灌胃给药(模型对照组给予等体积生理盐水)，1次/d，连续5d。于造模当天给药前测量每组动物右足体积，然后给药，1h后在各组动物右足足跖底部注射1％角叉菜溶液0.1mL致炎。方法是将动物固定，右后肢拉直，使用0.5mL注射器先自足跖中部皮下向上注入一部分，然后掉转针头向下注射完。分别于致炎后1h、2h、4h、6h、8h、12h测量致炎足体积，根据下式计算其肿胀度(率)，肿胀度(率)＝(致炎后足跖体积-致炎前足跖体积)/致炎前足跖体积。

实验结果：南蛇藤提取物高剂量在致炎后2h、4h、6h、8h、12h能够使大鼠足肿胀度减小，与模型对照组相比差异有显著性意义(P＜0.01)，模型组动物肿胀度在致炎后4h到6h间达到峰值。阳性对照组在致炎后1h、2h、4h、6h、8h、12h能够使大鼠足肿胀度减小，与模型对照组相比有显著性意义(P＜0.01)。统计结果见表7

表7南蛇藤提取物对角叉菜致大鼠足肿胀的影响( x±s)

组别	剂量(g/kg)	致炎后足肿胀(％)
								1h	2h	4h	6h	8h	12h
		模型吲哚美辛南蛇藤南蛇藤	NS0.00667552.5	0.24±0.130.08±0.08#0.15±0.060.16±0.16	0.44±0.190.17±0.12#0.24±0.06#0.47±0.14	0.44±0.110.27±0.13#0.31±0.10*0.41±0.17	0.43±0.120.26±0.12#0.23±0.11#0.34±0.14							0.32±0.110.22±0.08*0.18±0.09#0.24±0.13	0.28±0.100.17±0.14#0.08±0.08#0.18±0.15

与模型组比较，*P＜0.05；#P＜0.01。

2、小鼠醋酸急性腹膜炎实验

实验动物清洁级昆明小鼠，雌雄各半，18-22g。

主要仪器及试剂LD5-2A低速离心机，北京医用离心机厂；UV-754紫外可见分光光度计，上海第二分析仪器厂；BA110S万分之一电子天平；阿司匹林肠溶片：徐州恩华药业集团有限责任公司，批号：20031107；伊文斯兰

方法与结果

将动物随机分为模型对照组、阳性对照组(阿斯匹林)、南蛇藤高剂量组(5g/kg)、南蛇藤低剂量组(2.5g/kg)，每组12只。口服灌胃给药(模型对照组给予等体积生理盐水)，1次/d，连续3d。末次给药1h后，尾静脉注射0.5％伊文斯兰(0.1ml/10g体重)，随即腹腔注射0.6％醋酸2ml/只，20min后脱颈椎处死，然后腹腔注射5ml生理盐水，轻轻揉捏后剪开腹腔吸出腹腔中液体。离心1000转/min×5min，取上清液在590nm下测其OD值。

实验结果：南蛇藤提取物高、低剂量组和阳性对照组，均能使醋酸致小鼠急性腹膜炎的腹腔渗出液的光密度值减少，与模型对照组相比有显著性意义(P＜0.05)。结果见表8。

表8南蛇藤提取物对小鼠毛细血管通透性的影响( x±s)

组别	剂量(g/kg)	OD590nm值
			模型对照组阿司匹林南蛇藤南蛇藤	NS0.012832.5	0.162±0.1280.090±0.061*0.091±0.044*0.093±0.045

与模型组相比，*P＜0.0

上述实验结果表明，南蛇藤提取物具有较好的抗炎和镇痛作用，这种作用与药物剂量呈正相关。

实施例18：南蛇藤提取物的免疫调节作用

1、小鼠单核巨噬细胞吞噬实验

实验动物清洁级昆明小鼠，雌雄各半，18-22g。

主要试剂及实验仪器UV-754紫外可见分光光度计，上海第二分析仪器厂BA110S万分之一电子天平；碳酸钠；印度墨汁；南蛇藤提取物；雷公藤多苷片方法与结果将动物随机分为模型对照组、阳性对照组(雷公藤多苷干预)、南蛇藤高剂量组(5g/kg)、南蛇藤低剂量组(2.g/kg)。口服灌胃给药(模型组给予等体积的生理盐水)，1次/d，连续7d。末次给药30min后，尾静脉注射印度墨汁(0.1ml/10g体重)。注射前按印度墨汁1ml加入生理盐水4ml稀释。墨汁一经注入立即计时。分别于注射后1min、10min从动物内眦静脉丛取血20ul。将取得的血加入2ml0.1％碳酸钠溶液中摇匀。约2h后用分光光度计在650nm处测定光密度值(OD值)。

按下列公式计算廓清指数，

廓清指数K＝logOD₁-logOD₂/T₁₀-T₁

OD₁：T₁(动物注射印度墨汁1min)时的OD值

OD₂：T₁₀(动物注射印度墨汁10min)时的OD值

实验结果：南蛇藤提取物大剂量能使小鼠碳廓清指数降低，与模型对照组相比差异有显著性意义。统计结果见表9

表9南蛇藤提取物对小鼠廓清指数的影响( x±s)

组别	n	剂量(g/kg)	廓清指数K
				模型雷公藤南蛇藤南蛇藤	9957	NS0.0134452.5	0.037±0.0050.034±0.040.029±0.0076*0.035±0.009

与模型组比较，*P＜0.05

2、小鼠溶血素实验

实验动物清洁级NIH小鼠，雄性，18-22g。

主要试剂及实验仪器电热三用水箱；BA110S万分之一电子天平；葡萄糖柠檬酸钠；氯化钠；阿氏液；都氏试剂；南蛇藤提取物；雷公藤多甙片。

10％补体的配制：将3只豚鼠血清混合，然后将压积SRBC与豚鼠血清按照1∶4的体积比混合，于4℃冰箱中放置30min以除去非特异性补体参与的溶血，离心吸取上清，-20℃保存备用，临用前用生理盐水稀释成10％溶解。

绵羊红细胞(SRBC)悬液的配制：选用健康绵羊，从绵羊颈静脉无菌取血，将血液样本放入有玻璃珠的无菌三角烧瓶中，盖上瓶塞用手朝同一个方向摇动，经充分混合直至凝快完全形成，去除纤维蛋白。把血液样本移入含有阿氏液的三角烧瓶中，轻轻摇匀置4℃冰箱保存备用。使用前取适量抗凝羊血用无菌生理盐水洗涤3次，每次2000r/min离心10min，将压积SRBC与无菌生理盐水按照体积比1∶50配成细胞悬液(有溶血现象的不能使用)。

方法与结果

实验分组及给药剂量同上。给药第3d，每只动物腹腔注射2％绵羊红细胞(SRBC)悬液0.2ml。于第7d(免疫第4d)末次给药1h后，眼球取血，处死动物。取胸腺和脾脏称重，脏器重量以(mg/10g体重) x±s表示。将得到的血液样本经2000r/min离心10min分离血清。取血清10ul+生理盐水1ml+5％SRBC0.5ml+10％补体1ml置于37℃恒温水浴，同时另设一管不加血清的对照管置于37℃恒温水浴保温30min，移至冰浴中终止反应。以2000r/min离心10min，取上清1ml+3ml配好的都氏试剂，摇匀放置10min于540nm处测定比色值。按照下列公式计算血清半数溶血值(HC50)。

绵羊红细胞(SRBC)半数溶血OD值：取5％SRBC0.25ml+都氏试剂3.75ml，540nm处读取OD值。

血清半数溶血值(HC50)＝样品OD值/SRBC半数溶血OD值×稀释倍数

实验结果：南蛇藤提取物高、低剂量对绵羊红细胞免疫小鼠溶血素抗体的生成与模型对照组相比有减少的趋势，但没有统计学的意义。药物组干预均能使动物胸腺重量降低，与模型对照组相比有显著性意义(P＜0.05)。见表10。

表10南蛇藤提取物对绵羊红细胞免疫小鼠溶血素抗体和免疫器官指数的影响( x±s)

组别	剂量(g/kg)	n	HC50	胸腺重量mg/10g体重	脾重量mg/10g体重
						模型雷公藤南蛇藤南蛇藤	NS0.013446020	67117	80.18±3.5869.61±22.2473.78±18.6673.60±14.31	3.52±0.882.59±0.32*2.45±0.87*2.56±0.67*	5.11±1.114.59±0.573.90±0.669.12±2.20*

注：与模型对照相比，^*P＜0.05

实施例19：南蛇藤提取物的毒性实验

为考察南蛇藤提取物的毒副作用，发明人对南蛇藤提取物进行了急性毒理学考察研究。所采用的研究方法及试验结果如下：

方法：取昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重18-22g，由南方医科大学实验动物中心提供。将小鼠随即为6组，根据预实验结果配制不同剂量灌胃小鼠，观察给药后24小时，小鼠的死亡数，按改进寇氏法(参照《中药药理研究方法学》第113页，人民卫生出版社，第1版，陈奇主编)计算LD50。存活动物继续观察7天。

样品：南蛇藤提取物

实验结果：小鼠口服南蛇藤提取物LD50为15.59±2.79g/kg，95％的可信限为11.54～18.98g/kg。

由以上药效学及毒理学研究结果，可得出以下结论：南蛇藤总萜类为南蛇藤提取物中抗类风湿型关节炎及其它炎症、镇痛及调节免疫功能的有效成分；且随提取物中总萜类的含量增高其效用增强。南蛇藤提取物LD₅₀为15.59±2.79g/kg，毒性较低。

Claims (7)

1、一种南蛇藤中成药，其特征是一种南蛇藤提取物，所述南蛇藤提取物是由如下方法制备而成：

(1)制备南蛇藤粗提物：取原料药材南蛇藤或粉碎后的南蛇藤，用水提醇沉法或乙醇提取法进行提取，得提取液，将此提取液浓缩成稀浸膏，即得南蛇藤粗提物：

(2)精制：将(1)步制得的南蛇藤粗提物过大孔吸附树脂，先用水或1％-30％乙醇洗脱，洗脱液弃去不用，除去溶于极性溶剂的杂质，再用70％-95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；将乙醇洗脱液回收乙醇后干燥，即得南蛇藤提取物。

2、根据权利要求1所述的南蛇藤中成药，其特征在于：经(2)步精制制得的南蛇藤提取物，可用正丁醇或醋酸乙酯进一步纯化处理。

3、根据权利要求1所述的南蛇藤中成药，其特征在于：(1)步制备南蛇藤粗提物中乙醇提取法所用的乙醇是浓度为50-95％的乙醇。

4、根据权利要求1所述的南蛇藤中成药，其特征在于：(2)步精制中所述的大孔吸附树脂为弱极性或非极性的大孔吸附树脂。

5、根据权利要求4所述的南蛇藤中成药，其特征在于所述弱极性或非极性的大孔吸附树脂为AB-8、Diaion HP10、Diaion HP20、Diaion HP30、DiaionHP40、Diaion HP50、X-5。

6、权利要求1所述南蛇藤中成药在制备用于抗类风湿关节炎、镇痛、抗炎、调节机体免疫功能的药物中的应用。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述南蛇藤中成药的剂型可以是注射乳剂、滴丸、片剂、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂或颗粒剂。

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