CN101120960B

CN101120960B - 南蛇藤茎总萜提取物及其制备方法及用途

Info

Publication number: CN101120960B
Application number: CN2007100253433A
Authority: CN
Inventors: 刘延庆
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2007-07-25
Filing date: 2007-07-25
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2027-07-25
Also published as: CN101120960A

Abstract

本发明公开了一种南蛇藤茎提取物，它是从南蛇藤属植物南蛇藤茎中提取分离而得到的含有南蛇藤茎总二、三萜的提取物。经药效学及毒理学实验证明，该提取物对多种肿瘤具有较好的治疗作用，它的有效成分比较明确，有利于保证药物的安全性和有效性。原料提取得率高，成本低，操作简便，适用于工业化生产，因此具有广阔的工业应用前景。

Description

南蛇藤茎总萜提取物及其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种南蛇藤茎提取物总二、三萜的制备方法，以及该方法制得的提取物在抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

南蛇藤为卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.的干燥藤茎，药性辛温，有小毒，具有祛风除湿、活血消肿解毒的功效，可治疗类风湿性关节炎、跌打损伤、腰腿痛等。近年的药效学研究证明南蛇藤茎提取物具有抗肿瘤活性。南蛇藤茎的主要有效成分为三萜和二萜类成分。

公开号为CN1823870A的中国专利文献，其方法是从南蛇藤的根及其藤茎中利用大孔树脂富集三萜和倍半萜，方法繁琐，流程时间较长。因树脂可能产生毒性残留，《中华人民共和国食品卫生法》规定对申报与审评规定应提供安全性研究资料，建立成品中树脂残留物及裂解产物的检测方法，制订合理的限量。甚至树脂纯化前后的药物按新药药效学研究，必须进行对比研究，以充分保证上柱前与洗脱后药物的“等效性”。

发明内容

本发明的目的在于提供一种南蛇藤茎总萜提取物及其制备方法，该方法对南蛇藤茎的醇提取物采用有机溶剂萃取，有机溶剂的回收简单易行，确保了有效成分最大程度的保留。且避免了已有技术使用大孔树脂后期烦杂的药效学研究。

本发明的另一目的在于南蛇藤茎总萜提取物在抗肿瘤药物中的应用。

本方法采用的技术方案是：一种南蛇藤茎总萜提取物，其总二、三萜含量大于50％。

南蛇藤茎总萜提取物的制备方法是，取南蛇藤茎饮片，用高浓度醇作提取溶剂提取，合并提取液，回收醇；浸膏加水分散后用醚、酯类溶剂依次萃取；收集酯类有机溶剂层用水或低浓度醇作洗涤溶剂洗涤后，减压浓缩，干燥，得南蛇藤茎总二、三萜。

所述提取溶剂高浓度醇是浓度50％～100％的甲醇或乙醇。

所述萃取所用的酯类溶剂为乙酸乙酯。

所述洗涤所用的溶剂低浓度醇为水或浓度30％以下的甲醇或乙醇。

南蛇藤茎总二、三萜提取物在制备用于抗肿瘤药物中的应用。

抗肿瘤药物组合物制剂形式可以是片剂、胶囊、软胶囊、滴丸、颗粒剂、注射剂及粉针剂。

本发明优选的技术方案为：取南蛇藤茎饮片，用6倍量95％乙醇提取2次，合并提取液，回收乙醇，浸膏加水分散后用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，用水洗涤3次后，减压浓缩，干燥，得南蛇藤茎总二、三萜。

所用的酯类有机溶剂优选为乙酸乙酯。

上述发明中的干燥方法可以为烘干或减压干燥或喷雾干燥或冷冻干燥等。

总萜类的含量在50％以上，总萜主要由总三萜和总二萜两部分组成。

上述南蛇藤茎提取物具有抗肿瘤作用，能用于制备抗癌药物，可以制成各种剂型，如片剂、胶囊、软胶囊、滴丸、颗粒剂、注射剂及粉针剂等。

南蛇藤茎提取物总萜类含量测定：

对照品溶液的制备：精密称取105℃下干燥至恒重的乙酰齐墩果酸对照品2mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含乙酰齐墩果酸(0.08mg)。

标准曲线的制备：精密吸取上述对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，分别置具塞试管中，水浴挥去溶剂，冷却，准确加入0.4ml香草醛-冰醋酸溶液和1.8ml高氯酸，混匀，密塞。置70℃恒温水浴中加热20min，取出，放冷，加冰醋酸5ml，摇匀，在540nm处测定吸光度，以试剂为空白。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

含量测定(UV法测定)：供试品溶液的制备：取南蛇藤茎总萜提取物10mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得供试品溶液。精密量取供试品溶液0.4ml按标准曲线制备项下的方法，自“分别置具塞试管中，水浴挥去溶剂”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含乙酰齐墩果酸的量，计算含量。

本发明的有益效果是：南蛇藤茎药材用乙醇提取，成本较低，而且乙醇可反复循环使用，节约了成本。纯化方法较简单，从原料中分离总萜类，收率约2％。避免了大孔树脂的使用，即避免了后期烦杂的药效学研究。对南蛇藤茎的醇提取物采用有机溶剂萃取，有机溶剂的回收简单易行，确保了有效成分最大程度的保留。可在制备过程中富集活性成分，去除大量杂质；同时，本方法的重复性、稳定性好，从而保证了疗效的稳定；原料提取得率高，成本低，操作简便，适用于工业化生产，因此具有广阔的工业应用前景。经药效学及毒理学试验证明，该南蛇藤茎提取物具有较好的抗肿瘤作用，有效成分明确。其主要有效成分为总萜，且总萜含量较高，杂质成分较少，可减少服用量，在一定程度上也可减小副作用，更有利于保证药物的安全性和有效性。

具体实施方式

下面结合实施例及实验例对本发明进一步说明。

实施例1

取南蛇藤茎饮片10kg，加6倍量95％乙醇，浸泡1h，回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇后加水混悬，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分离出乙酸乙酯层，加水洗涤3次后将乙酸乙酯层减压浓缩，干燥，即得南蛇藤茎总萜部位195g，其中总二、三萜含量68.3％。

实施例2

取南蛇藤茎饮片10kg，加6倍量90％乙醇，浸泡1h，回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇后加水混悬，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分离出乙酸乙酯层，加水洗涤3次后将乙酸乙酯层减压浓缩，干燥，即得南蛇藤茎总萜部位212g，其中总二、三萜含量62.5％。

实施例3

取南蛇藤茎饮片10kg，加6倍量90％乙醇，浸泡1h，回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇后加水混悬，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分离出乙酸乙酯层，加20％乙醇洗涤3次后将乙酸乙酯层减压浓缩，干燥，即得南蛇藤茎总萜部位220g，其中总二、三萜含量71.2％。

实施例4

取南蛇藤茎饮片10kg，加6倍量95％乙醇，浸泡1h，回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇后加水混悬，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分离出乙酸乙酯层，加20％乙醇洗涤3次后将乙酸乙酯层减压浓缩，喷雾干燥，即得南蛇藤茎总萜部位204g，其中总二、三萜含量70.7％。

实施例5

取南蛇藤茎饮片10kg，加6倍量甲醇，浸泡1h，回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收甲醇后加水混悬，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分离出乙酸乙酯层，加水洗涤3次后将乙酸乙酯层减压浓缩，喷雾干燥，即得南蛇藤茎总萜部位224g，其中总二、三萜含量62.4％。

南蛇藤茎总萜提取物抗肿瘤药效实验

实验例1：南蛇藤提取物体外对肿瘤细胞抑制作用。

材料与方法

1、细胞株

人肝癌细胞株SMMC-7721；人胃癌细胞株SGC-7901、人宫颈癌细胞株Hela；红白血病细胞株K562及其耐药株K562-A由本院中医药研究室传代保种。

2、药材与试剂

药材：南蛇藤饮片，为卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤的藤茎。

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑(MTT，噻唑蓝)、二甲基亚砜(DMSO)：RMPI-1640培养基干粉、胰蛋白酶。

新生牛血清(NBCS)。

注射用盐酸阿霉素(ADM)。

氟尿嘧啶注射液(5-FU)。

正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、95％乙醇，均为分析纯。

3、仪器与设备

CO2培养箱(RCO3000TVBA)，超净工作台(SW-CJ-1F)，倒置相差显微镜(CKX41-32PH)，酶标仪(Multiskan MK3)，无菌滤器，无菌培养板，真空干燥箱(ZK-82B)，旋转蒸发仪(Senco-R系列)、恒温水浴锅(Senco W201B)。

4、实验内容及方法

4.1药品配制南蛇藤5kg切断粉碎成粉，烘干，95％乙醇加热回流提取3次，旋转蒸发仪回收溶剂得浸膏，拌入硅藻土，真空低温抽干，干燥后装入抽滤漏斗，用乙酸乙酯洗脱至无色，回收溶剂分别得浸膏。取浸膏适量，用生理盐水配成所需浓度，溶解后抽滤除杂除菌。脂溶物用DMSO助溶，其最终浓度小于0.05％，DMSO在此浓度下对细胞的生长无影响。

4.2细胞培养人胃癌SGC-7901、人肝癌SMMC-7721、人子宫颈癌Hela、人红白血病K562：RPMI 1640培养基加12％新生牛血清。

K562/ADM(-ADM)：RPMI 1640培养基加12％新生牛血清中培养2星期以上。

K562/ADM(+ADM)：RPMI 1640培养基加12％新生牛血清、ADM 1mg·L^-1所有细胞均在温度37℃、饱和湿度、5％二氧化碳条件下培养。

4.3体外抑瘤实验取处于指数生长期的细胞，加入适量Trypsin-EDTA液，吹打后使贴壁细胞脱落(K562细胞及耐药株直接吹打)，0.1％台盼蓝染色计数细胞活力在95％以上，细胞计数后用含5％新生牛血清的RPMI 1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔8000个接种于96孔培养板中，[K562及K562/ADM(-ADM)每孔10⁴，K562/ADM(+ADM)每孔接种1.5×10⁴个细胞]，调零孔加等量完全培养基，在37℃，饱和湿度，5％CO2条件下继续培养24h后，每孔加入5个浓度的4个受试组分10ul，每个浓度设四个平行样本。继续孵育48h，然后加入10μlMTT溶液，继续培养。4h后仔细吸去上清液(K562及其耐药株1000rpm离心5min)，每孔加入二甲基亚枫150μL，轻轻振荡以使溴代噻唑蓝完全溶解，约1h后在570n m波长处用酶标仪测其吸光度(A)值，测定时需减去空白对照的A值。细胞生长抑制率(IR％)＝(1-A样品组/A对照组)×100％。

4.4统计学处理所得资料用SPSS 13.0 for windows统计软件分析，数据用x±s表示，组间比较用t检验。

结果

南蛇藤乙酸乙酯提取物对本实验用肿瘤细胞有显著抑制作用，呈明显的量效关系。在抑制K562/ADM(+ADM)时，COE显示了较强的作用，提示其中含有拮抗多药耐药的成分。各种肿瘤细胞以K562及其耐药株较为敏感。高倍镜下可见细胞呈病理性萎缩和不可逆性损坏，随药物浓度增高，可见细胞周围碎片增多，而阴性对照组未见明显病理改变。

实验例2：南蛇藤提取物体外抑瘤作用

材料与方法

1动物与细胞株

清洁级ICR小鼠，体重(21±2)g，雌雄各半，由扬州大学比较医学中心提供，合格证：SCXK(苏)2002-0009；小鼠移植性肿瘤：肉瘤(S₁₈₀)、肝癌(Heps)，均由中国科学院上海药物研究所提供，江苏省肿瘤防治研究所传代保种。

2试剂

环磷酰胺(CTX)，SOD、MDA试剂盒，切片石蜡，无水乙醇，其它常规化学试剂均为分析纯。

3仪器与设备

电热恒温水浴箱，电热恒温水浴锅，低速自动平衡离心机(LDZ5-2)，可见光分光光度计(UV-754)，LEICA-RM2145切片机。

4实验内容及方法

4.1药物用量及配制实验用药物在成年人(按体重60kg计算)的用量为9-15g·d^-1[4]，小鼠口服用药量按公式^[5]dB＝dA×(R_B/R_A)×(W_A/W_B)^1/3计算。dB为小鼠口饲用量(mg·kg^-1)，dA为人体口服用量(mg/kg)；R_A：人体型系数，为100；R_B：小鼠体型系数，为59；W_A：成年人体重，按60kg计算；WB：小鼠体重，按21g计算。取体外抑瘤实验效果较好的南蛇藤乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物浸膏适量，每克浸膏含50克生药，以0.9％NaCl配成所需浓度。

4.2体外抑瘤实验选择肿瘤生长良好的荷瘤小鼠，无菌条件下取出肿瘤，用0.9％NaCl按比例(S₁₈₀1∶3、Heps 1∶4)制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2ml。接种后使用均衡随机法分组(每组雌雄各半，组间平均体重相差不超过1g)，实验组每组10只，对照组每组14只。设阴性对照组(溶媒)、阳性对照组(CTX)，COE、COB给药组各设10、20、40mg·kg^-13个剂量。接种24h后开始灌胃给药，每天固定时间段给药一次并记录小鼠的活动情况，连续10d，末次给药后24h称体重，摘眼球取血后处死，完整剥离肿瘤、肝脏、脾脏、胸腺等组织。

4.3疗效总体评价分别称取各组小鼠瘤质量及肝脏、脾脏、胸腺等器官的质量，并计算其抑瘤率和肝脏、脾脏、胸腺指数。

4.4抗氧化指标摘眼球取血，分离得到血清。采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD，硫代巴比妥酸法测定MDA。

4.4血清SOD测定

测定原理：黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生(O₂ ^-)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈紫红色，而SOD则抑制其反应，根据抑制率的高低计算出SOD的含量。

4.5病理观察：取各组瘤块组织，脱水透明后石蜡包埋，常规病理切片制备，HE染色，光学显微镜下观察。

结果

1、小鼠活动情况观察CTX组小鼠进食量较阴性对照组明显减少，毛发干枯、蓬松、无光泽，且有中度腹泻，体质消瘦，活动迟缓。而COE、COB组小鼠较阴性对照组活动敏捷，进食量增加。

2、疗效总体评价COE、COB 3个剂量组对小鼠S₁₈₀肿瘤均有较强的抑制作用，其高(40mg·kg^-1)、中(20mg·kg^-1)剂量组对小鼠Heps肿瘤也有较强的抑制作用，和阴性对照组相比，均有显著性差异。两种肿瘤的抑制作用均以中剂量组(20mg·kg^-1)效果为好，结果见表2.1、2.2。与阴性对照组比较，COE、COB各处理组小鼠肝、脾、胸腺指数无明显改变，而CTX组脾、胸腺指数明显降低，与阴性对照组比较差异有显著性。

3、对荷瘤鼠血清抗氧化功能的影响

COE、COB中剂量组(20mg/kg)作用的的S₁₈₀、Heps荷瘤小鼠血清SOD活力均有升高，MDA水平均有下降，与阴性对照组对比均差异有显著性。结果见表4.1，4.2。

表4.1COE、COB对荷S₁₈₀小鼠SOD和MDA的影响(x±s，n＝8)

表4.2COE、COB对荷Heps小鼠SOD和MDA的影响(x±s，n＝8)

4、病理：光学显微镜下，CE、CN组瘤结节中坏死较多，肿瘤细胞较小，核分裂数稍少，癌巢内可见大量淋巴细胞浸润。阴性对照组瘤结节中央可见癌性坏死，核分裂多见，坏死灶中有淋巴细胞、浆细胞反应。

讨论

本实验选用与临床结合紧密的人胃癌SGC-7901、人肝癌SMMC-7721、人子宫颈癌Hela、人红白血病K562及其耐药株进行细胞毒试验，提高本次体外筛选的可信度。从实验结果可见，南蛇藤乙酸乙酯提取物对上述细胞均有明显的细胞毒性，在100mg·L^-1时，细胞的抑制率均大于50％，其IC₅₀＜100mg·L^-1。

在体外筛选的基础上我们运用肿瘤动物模型观察了南蛇藤乙酸乙酯提取物、的抑瘤作用。实验结果提示南蛇藤提取物对小鼠移植性肿瘤S₁₈₀、Heps均具有显著的抑制作用，与对照组比，有显著性差异，以中剂量组(20mg·ml^-1·d^-1)效果较好，在发挥抗肿瘤作用的同时，肝、脾、胸腺指数无明显改变，无明显毒副作用。

SOD和MDA是反映机体抗氧化能力的指标，测定方法简单，结果真实可靠。抗氧化特性是许多肿瘤化学防治药物发挥作用的重要机制之一。本实验中南蛇藤乙酸乙酯提取物对于提高荷瘤小鼠血清SOD活力及降低MDA水平有一定作用。结果提示南蛇藤提取物可能通过提高体内抗氧化酶活性和自由基清除剂水平，保护机体免受氧自由基的攻击，起到肿瘤防治作用，但其抑瘤作用与抗氧化活性之间无明显相关性，提示可能存在其他抑瘤机制。

从病理学观察结果分析，CE、CN组肿瘤细胞增殖比率明显减低，肿瘤细胞较小，瘤组织坏死明显，提示南蛇藤提取物具有抑制肿瘤生长和瘤组织分裂繁殖的能力以及对该肿瘤细胞的细胞毒作用。

结论

1、南蛇藤提取物4个组分对体外肿瘤细胞均有一定程度的抑制作用，以乙酸乙酯提取物作用显著，呈明显的量效关系。

2、南蛇藤乙酸乙酯提取物整体实验对小鼠移植性肿瘤有明显的抑制作用。在发挥抗肿瘤作用的同时，肝、脾、胸腺指数无明显改变，无明显毒副作用。

实验例3：南蛇藤提取物体外对幽门螺杆菌抑制作用

材料与方法

1H.pylori菌株

1.1标准菌株

NCTC11637购于中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，NCTC11638、26695来自上海第二医科大学。

1.2临床菌株

将江苏石油勘探局职工总医院胃镜室提供的慢性浅表性胃炎病人、胃溃疡病人、胃癌病人胃粘膜活检标本，直接接种在脑心浸液血液琼脂平板上，经过微氧环境培养，分离出H.pylori菌落，经观察菌落、细菌形态及尿素酶、触酶、氧化酶试验，鉴定为幽门螺杆菌。依次编号为1、2、3，保存备用。

1.3、质控菌株

用NCTC11637(甲硝唑MIC为1mg·L^-1)作为标准的H.pylori质控菌株。

2、试剂

脑心浸液琼脂培养基：美国Becton Dickinson公司

配套试剂：杭州微生物试剂有限公司

无菌脱纤维绵羊血：杭州微生物试剂有限公司

CO₂、N₂，

小牛血清：杭州四季青生物材料工程公司产品

布氏肉汤：北京陆桥技术有限责任公司

快速尿素酶诊断试纸，

过氧化酶、氧化酶试剂。

4、实验内容及方法

4.1H.pylori培养基及培养条件

采用脑心浸液琼脂(含8％-10％的脱纤维羊血+万古霉素、两性霉素、TMP、多粘菌素B)，PH＝7.2。抽气换气法形成微氧环境(N₂85％，CO₂10％，O₂5％)，于恒温培养箱37℃条件下培养。脑心浸液琼脂培养基为美国Becton Dickinson产品。

4.2药物配制

取COH、COE、COB、COA适量，用生理盐水配成所需浓度，脂溶物以二甲基亚枫(DMSO)助溶，DMSO最终浓度小于0.05％。过滤除菌，4℃保存备用。

a)中药培养基制备

用H.pylori培养基将各提取物试验液进行倍比稀释成终浓度为10.24g·L^-1、5.12g·L^-1、2.56g·L^-1、1.28g·L^-1、0.64g·L^-1、0.32g·L^-1、0.16g·L^-1、0.08g·L^-1(编号为1～8)制备成含不同浓度中药的血琼脂平板。同时做空白不含中药的培养基作为对照。

b)甲硝唑培养基制备

按0.25mg·L^-1、0.5mg·L^-1、1mg·L^-1、2mg·L^-1、4mg·L^-1、8mg·L^-1的甲硝唑终浓度制备H.pylori血琼脂平板。

4.5药物抑菌试验

将受试菌在H.pylori培养基血平板上传种三次以保证其纯度及活力，得到的72小时菌龄的菌株，将各菌株用生理盐水洗下，稀释成10⁸CFu·ml^-1(1麦氏浓度)浓度菌液，取1μl菌液涂布药物平皿，每一菌株重复3块平板。其中，含甲硝唑琼脂平板只涂布NCTC11637菌株。于37℃微需氧环境下培养3天。观察细菌生长情况，以不出现菌落的平板上的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)^[20]。

结果

NCTC11637菌株对甲硝唑的MIC为1mg·L^-1，空白对照组6种菌株均生长良好。COH的MIC＞10.24g·L^-1、COE的MIC为0.64g·L^-1、COB的MIC为5.12g·L^-1、COA的MIC＞10.24g·L^-1。结果见表5。

Tab 5南蛇藤提取物体外抑制H.Pylori的实验结果

注：1～8代表药物浓度从高到低；“+”表示菌株被抑制，“-”表示菌株生长

讨论

1、本实验中选用与临床结合紧密的人胃癌SGC-7901、人肝癌SMMC-7721、人子宫颈癌Hela、人红白血病K562及其耐药株进行细胞毒试验，提高本次体外筛选的可信度。从本次实验结果可见，南蛇藤乙酸乙酯提取物对上述细胞均有明显的细胞毒性，在100mg·L^-1时，细胞的抑制率均大于50％，其IC₅₀＜100mg·L^-1，正丁醇提取物对上述细胞也有较强的抑制作用。

2、在体外筛选的基础上我们运用肿瘤动物模型观察了南蛇藤乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物的抑瘤作用。实验结果提示南蛇藤提取物对小鼠移植性肿瘤S₁₈₀、Heps均具有显著的抑制作用，与对照组比，有显著性差异，以中剂量组(20mg·ml^-1·d^-1)效果较好，在发挥抗肿瘤作用的同时，肝、脾、胸腺指数无明显改变，无明显毒副作用。

SOD和MDA是反映机体抗氧化能力的指标，测定方法简单，结果真实可靠。抗氧化特性是许多肿瘤化学防治药物发挥作用的重要机制之一。本实验中南蛇藤提取物对于提高荷瘤小鼠血清SOD活力及降低MDA水平有一定作用。结果提示南蛇藤提取物可能通过提高体内抗氧化酶活性和自由基清除剂水平，保护机体免受氧自由基的攻击，起到肿瘤防治作用，但其抑瘤作用与抗氧化活性之间无明显相关性，提示可能存在其他抑瘤机制。

从病理学观察结果分析，COE、COB处理组肿瘤细胞增殖比率明显减低，肿瘤细胞较小，瘤组织坏死明显，提示南蛇藤提取物具有抑制肿瘤生长和瘤组织分裂繁殖的能力以及对该肿瘤细胞的细胞毒作用。

3H.pylori是定植于胃粘膜表面与粘膜层之间的微需氧革兰氏阴性螺旋状细菌，自1983年澳大利亚学者Warrent和Marshall首次报道从人胃粘膜标本中分离出该菌以来^[21]，其致病性日趋明确。它是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌发生发展中的一个重要致病因子。1994年世界卫生组织正式将H.pylori列为第I类致癌因子^[22]。本实验中选用H.pylori作为生物致癌因子，观察南蛇藤提取物对其作用，结果显示COE、COB处理组可有效抑制H.pylori的生长，以COE处理组效果为好。提示南蛇藤可通过抑制某些生物致癌因子而达到肿瘤预防作用。

结论

1南蛇藤提取物4个组分对体外肿瘤细胞均有一定程度的抑制作用，以乙酸乙酯提取物作用显著，其次为正丁醇提取物，均呈明显的量效关系。

2南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物整体实验对小鼠移植性肿瘤有明显的抑制作用，在发挥抗肿瘤作用的同时，肝、脾、胸腺指数无明显改变，无明显毒副作用。并可通过提高体内抗氧化酶活性和自由基清除剂水平，保护机体免受氧自由基的攻击，起到肿瘤防治作用。

3南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物可有效抑制H.pylori而达到肿瘤预防作用。

Claims

1.一种南蛇藤茎总萜提取物的制备方法，其特征在于，取南蛇藤茎饮片，用醇回流提取，合并提取液，回收醇，浸膏加水分散后依次用醚类、酯类溶剂萃取，收集酯类有机溶剂层，用水或浓度30％以下的甲醇或乙醇洗涤后减压浓缩，得南蛇藤茎总萜提取物，其总萜含量大于50％；且所用提取溶剂为浓度50％～100％的甲醇或乙醇；萃取所用的酯类溶剂为乙酸乙酯。