CN100349577C - 黄芩总黄酮提取物及黄芩苷在抗骨质疏松药物制备中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及黄芩总黄酮提取物及黄芩苷在治疗和/或预防骨质疏松药物制备中的用途。黄芩苷即5，6-二羟基黄酮-7-O-葡糖糖醛酸苷。黄芩总黄酮提取物其主要成分是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、黄芩新素等。通过对新生大鼠成骨细胞增殖及分化的影响和新生大鼠破骨细胞功能的影响的药理试验研究，结果表明黄芩苷和黄芩总黄酮提取物对成骨细胞的增殖及分化均有显著的促进作用，对破骨细胞功能有一定剂量依赖性的抑制作用。

Description

黄芩总黄酮提取物及黄芩苷在抗骨质疏松药物制备中的用途

技术领域

本发明涉及一种治疗和/或预防骨质疏松的药物，具体的说涉及黄芩总黄酮提取物及黄芩苷在治疗和/或预防骨质疏松药物制备中的用途。

背景技术

骨质疏松症(有时也简称为骨质疏松)是全身骨骼成分减少的一种骨骼疾病，主要表现为骨组织内单位体积中骨量减少，骨矿物质和骨基质随年龄的增加(或妇女绝经后)等比例的减少，骨组织的显微结构发生改变而致其骨组织的正常荷载功能发生变化。骨质疏松在临床上表现为腰背疼、病理性骨折、椎体变形、体态变形致“龟背”出现，伴有周身骨骼的疼痛等症状。

原发性骨质疏松症占骨质疏松症的90％。它是老年人的一种常见病，一种全身性骨病。主要表现是骨组织的矿物质和骨基质均有减少、骨量低和骨的微细结构有破坏，导致骨的脆性增加和容易发生骨折。女性较男性多见，常见于绝经后妇女和老年人，在轻微外伤或无外伤的情况下都容易发生骨折，75岁以上的妇女骨折发生率高达80％以上。

骨质疏松症是骨骼代谢异常的疾病，它的产生原因至今尚未明确，但医学界认为与下列因素有关：内分泌因素，其中雌激素降低是骨质疏松症发生的主要原因，此外与营养、遗传、营养状况、生活方式等密切相关。

目前临床上用于治疗骨质疏松症的主要药物有维生素D类药物、甲状旁腺素(PHT)、氟化物、同化激素、双磷酸盐类等。这些药物长期应用均产生严重的毒副作用，同时一些患者因禁忌症不能应用这些药物，因此研制安全、有效地治疗骨质疏松症的天然药物具有其重要的社会和经济价值。

黄芩(Scutellaria baicalensi.s Georgi)为常用中药之一，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。其主要有效成分为黄酮类化合物。

目前从黄芩中已发现41种黄酮类化合物，其中含量较高并具有明显药理作用的是黄芩甙、黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩甙。现代药理研究证明黄芩不仅具有明显的抗菌消炎、抗过敏、抗氧化、抗致癌和抗病毒的作用，而且对心血管也具有一定作用。目前，对其药理学的具体研究如下：

1.抗氧化和清除自由基作用

多数黄酮类化合物具有一定的抗氧化作用，黄酮结构中的2，3双键和4位羰基以及3或5位羟基对黄酮的抗氧化作用有重要贡献。黄芩中已知的黄酮大都具有酚羟基结构，因此是较好的抗氧化剂。黄芩素可抑制由铁诱导的鼠肝线粒体脂质过氧化，对前脑匀浆脂质过氧化水平的抑制能力及二苯基苦味肼(DPPH)诱导的自由基的清除能力与槲皮素相当。作为治疗癫痫的日本和汉药TJ-960中的成分之一，黄芩素是其中已知主要成分中最强的自由基清除剂。在鼠肝微粒体脂质过氧化实验中，黄芩素减少了抗坏血酸与FeCL₃体系中硫化巴比妥酸活性物质(TBARs)的产生(Gao D，Sakuraik，kotohM，黄芩素铁复合物对微粒体脂质过氧化反应的抑制作用Biochem Mol Int.1996，39(2)：215)，谭廷华等的研究表明(谭廷华、刘爱芳、王新英等，黄芩甙与芸香甙对·OH的清除作用[J].西安医科大学学报，1997，18(1)：41～43)，黄芩给药剂量为50和100mg·kg时均可显著抑制cch所致小鼠肝脂质过氧化损伤作用。黄芩苷对Fenton反应生成的OH自由基清除率高于·OH自由基特异性清除剂甘露醇。汉黄芩素能够抑制还原型辅酶II(NADPH)和Fe。黄芩甙可抑制大鼠肝线粒体脂质过氧化产物MDA的生成，并对乙酰氨基酚和四氯化碳引起的肝脂质过氧化损伤具有保护作用(参见张永钦，周井炎，徐辉碧.黄芩甙的抗氧化作用[J].华中理工大报，1999，27(4)：111～113)。黄芩甲醇提取物可明显抑制肝脯氨酸和MDA的生成，提示黄芩甲醇提取物可抑制由BDL或cch诱导的大鼠肝纤维化和脂质过氧化(参见Nan J X，Park EJ，Kim Y C，et al，黄芩对胆管结扎及四氯化碳大鼠诱导的肝脏纤维化的抑制作用[J].Pharmacy and pharmacology，2002，54(4)555～563)。

2.抗菌、抗病毒作用

黄芩具有广谱的抗菌和抗病毒作用。吕小迅等(参见吕小迅、周玉珍、吕华冲，黄芩、黄精抗真菌作用活性部位实验研究[J].广东药学院学报，1995，11(3)：180～182)研究了黄芩醇溶性部分和水溶性部分的抗真菌作用，发现黄芩的醇溶性部分对Tr的抑制作用较强，对其他供试菌种抑制作用则较弱；其水溶性部分对Tr，Tg，Ef，Cn和Ca等5种供试菌种均有较强抑制作用；同时证明黄芩的有效成分主要存在于其水溶性部分。

1988年陈鸿珊等首次发现，黄芩甙与黄芩素对人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶的活性有抑制作用，并观察到黄芩甙在H9细胞培养中能抑制HIV-1的复制，此研究结果引起了学者们的关注。近几年来，最令人感兴趣的是黄芩甙和黄芩素的抗艾滋病病毒作用。赵晶的研究发现，黄芩素抑制HIV-RT活性较黄芩甙强(参见赵晶，两种抗人免疫缺陷病毒天然产物结构修饰的研究[D].北京：中国协和医科大学，1998[13])。从黄芩中提取的异黄芩素.8-甲醚能显著抑制流感病毒。黄芩甙对人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)的抑制呈剂量效应关系。因此，黄芩黄酮类化合物有望开发成为新的抗艾滋病药物。

Nagai发现(参见Nagai T.黄芩根中抗流感A(H3N2)和B病毒的黄酮类成分5，7，4′三羟基8甲氧基黄酮F36[J].国外医学中医中药分册，1996，18(3)：46)，黄芩黄酮F36(5，7，4 trihydrox-y-8-methoxyflavone)可抗流感病毒A和B。永井隆之(参见永井隆之.生物中类黄酮药抗流感病毒活性产生的作用机制(2)[J].国外医学中医中药分册，1995，17(6)：40～42)认为，F36对流感病毒(IFV)的唾液酸酶有特异的抑制活性，可有效抑制小鼠感染IFV，并抑制IFV的膜融合及脱壳。

3.抗炎、抗变态作用

致病菌激活宿主免疫细胞产生各种炎性介质，如IL-113、PGE2和LTB4，它们与牙龈炎和牙槽骨吸收有着非常密切的关系。Chung评价了黄芩甲醇提取物及其黄酮类化合物的消炎和激活龈成纤维细胞作用，提示黄芩甲醇提取物、黄芩甙、黄芩素和汉黄芩素均无细胞毒性，可使脂多糖诱导的IL-18的合成降低50％以上。这3种黄酮类化合物对炎症的抑制作用几乎与作为标准抗炎类固醇的强的松龙一样强。Lin和Shieh E报道(参见Lin CC，ShiehDE，The anti-inflammatory activity of Scutellaria rivularis extracts and itsactivator and plas minogen activator-1 prodution in cultured human umbilical veinendothelial cells[J].phytother Res，1997，11(5)：363)，黄芩提取物中的3种主要黄酮(黄芩素、黄芩甙、汉黄芩甙)对由角叉藻胶诱导的爪水肿有强烈的抗炎活性。

4抗肿瘤作用

Shinichi I等(参见Shinichi Ikemoto，kaiunobu Sugimuka，Naomasa Yoshida，et al.黄芩根及其主要成分黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素对膀胱癌细胞珠的抗肿瘤作用[J].Urology，2000，55(6)：951-955)研究了黄芩及其化合物黄芩素、黄芩甙、汉黄芩甙对膀胱癌细胞链的抗肿瘤作用。结果证实，所有药物均可抑制癌细胞的增殖，且存在量效依赖关系，黄芩素表现出最大的抗增殖活性。在活体实验中，C3H/HeN老鼠每天每只口服黄芩甙10mg，可显著抑制肿瘤增长，预示中草药可能成为治疗膀胱癌的有潜力和有前途的药物。袁榴娣等(参见袁榴娣，徐红，杜肇宗.黄芩甙对艾氏腹水瘤细胞影响的初步探讨[J].南京铁道医学院学报，1997，16(4)：231～233)的研究结果显示，黄芩甙可增强小鼠的体液和细胞的免疫功能，抑制荷瘤小鼠腹水脂加氧酶活性。抑制艾氏腹水瘤细胞的生长；但无论是在体内还是体外，对生长后期的瘤细胞的抑制作用均不明显。

5.免疫药理作用

贺海平等(参见贺海平、秦菁、陈明等.一种新的黄芩类黄酮3，5，6，7四羟基2，8二甲氧基黄酮的体外免疫作用[J].广西医科大学学报，2000，17(3)：353～355；贺海平、秦箐、陈明.黄芩类黄酮对人免疫细胞化学发光及淋巴细胞增殖的影响[J].中国免疫学杂志，2000，16(2)：84～86)分别对新发现的一种黄芩类黄酮3，5，6，7-四羟基-2，8-二甲氧基黄酮(TDF)和黄芩中纯化的3，5，6，7-四羟基2，8-二甲氧基黄酮、2，5-二羟基6，6，7，8-四甲氧基黄酮、5，7，8-三羟基黄酮、(2R，3R)-2，3，5，6，7-五羟基黄烷醇、黄芩甙和黄芩酮6种类黄酮成分的免疫药理作用进行了研究，该实验j结果显示黄芩素对PKC有特异性抑制作用，还可改善由右旋糖苷硫酸盐诱导的大肠炎的所有炎性症状。

综上所述，黄芩及其所含黄酮有其广泛的药理作用，但对其抗骨质疏松的研究，在国内外相关文献，均无抗骨质疏松及其相关的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供化合物黄芩苷在制备治疗或预防骨质疏松药物中的用途；

本发明的另一个目的在于提供黄芩总黄酮提取物在制备治疗或预防骨质疏松药物中的用途。

黄芩苷即Baicalin，C₂₁H₁₈O₁₁，分子量为446，为5，6-二羟基黄酮-7-O-葡糖糖醛酸苷。

黄芩总黄酮提取物，即从黄芩中经水提、有机溶剂提取(乙醇、甲醇)的总黄酮提取物或在此基础上进一步经过精制(如大孔树脂、酸碱方法、萃取方法)等所得的总黄酮提取物，其主要成分是黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、汉黄芩素(wogonin)、汉黄芩苷wogonoside)、黄芩新素(neobaicalein)等。

成骨细胞是参与骨代谢的重要细胞，它与破骨细胞共同维持着骨代谢重建的平衡。骨质疏松发生的机制是骨形成落后于骨溶解，在骨的重建过程中无法完全修复破坏的骨质，使其骨量不断减少、骨质量下降。因此，治疗骨质疏松的关键措施之一是促进成骨细胞的成骨过程，缓解破骨细胞的破骨过程。

对骨组织的溶解吸收是破骨细胞主要的生理功能。体外培养一定时间的破骨细胞可在骨片上形成吸收陷窝，吸收陷窝的数量可反映破骨细胞溶解吸收的能力。采用甲苯胺兰染色技术对骨片上产生的吸收陷窝进行显示，可以定量这种溶解吸收能力。

本发明实施例1观察了黄芩苷及黄芩总黄酮提取物对新生大鼠成骨细胞增殖及分化的影响，探讨该药是否存在促进成骨细胞分化、增殖的作用。

结果表明，与对照组相比，10％黄芩总黄酮提取物血清及5％黄芩苷血清对成骨细胞增殖具有显著统计学意义(P＜0.05)；与对照组相比，20％黄芩总黄酮提取物血清及10％黄芩苷血清对成对成骨细胞增殖具有非常显著统计学意义(P＜0.01)；10％、20％含药血清中黄芩总黄酮组及5％、10％的黄芩苷对成骨细胞分泌碱性磷酸酶具有显著促进作用(P＜0.01)。

本发明在成功培养出成骨细胞基础上，观察了大鼠灌胃给药后得到的血清对成骨细胞增殖、分化的影响。AKP约40％～75％由成骨细胞产生，其活性可反映成骨细胞功能的强弱，也是成骨细胞分化的标志之一。结合成骨细胞的生长及分化指标对供试品药物进行了评价，结果是黄芩苷和黄芩总黄酮提取物对成骨细胞的增殖及分化均有显著的促进作用。

本发明实施例2观察了黄芩苷及黄芩总黄酮提取物新生大鼠破骨细胞功能的影响，探讨该药是否存在抑制破骨细胞功能的作用。

与对照组相比，20％黄芩总黄酮提取物血清及10％黄芩苷血清对成骨细胞增殖具有非常显著统计学意义(P＜0.01)；10％、20％中黄芩总黄酮血清组及5％、10％的黄芩苷血清对成骨细胞分泌碱性磷酸酶具有显著促进作用(P＜0.01)；

本发明利用原代培养的破骨细胞进行骨吸收试验。结果显示：黄芩苷和黄芩总黄酮提取物对破骨细胞功能有一定剂量依赖性的抑制作用。

以上通过黄芩苷和黄芩总黄酮提取物对成骨细胞和破骨细胞的研究，表明对成骨细胞的增殖及分化均有显著促进作用及对破骨细胞功能有一定剂量依赖性的抑制作用。从而通过促进成骨细胞的成骨过程，缓解破骨细胞的破骨过程。

本发明的另一方面，以黄芩苷及黄芩总黄酮提取物为药效成分，添加药学上可接受的药用辅料，并通过常规方法可以制备药物组合物或单体制备成药物制剂时，药物制剂的剂型可以是：口服给药的剂型诸如片剂、胶囊(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊和微囊)、粉剂、颗粒剂和糖浆剂；非口服给药的剂型诸如注射剂、栓剂、丸剂、凝胶剂和贴剂。除这些常规剂型外，还可以将口服的速释固体制剂(例如片剂、颗粒剂等)和用于口服或非口服给药的缓释制剂(片剂、颗粒、精细颗粒、丸剂、胶囊、糖浆、乳剂、悬浮液、溶液)。本发明中的制剂可以是包衣或未包衣的形式，视需要而定。

本发明中的药用辅料包括用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、发泡剂、包衣剂等，或用于半固体制剂、液体制剂的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、润肤剂、乳化剂等，此外，也可以根据需要使用其它药用添加剂诸如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂和调味剂等。

附图说明

图1为采用甲苯胺兰染色技术对骨片上产生的吸收陷窝进行显微放大拍照图。原代成骨细胞培养1周，细胞成多角状。

图2为采用甲苯胺兰染色技术对骨片上产生的吸收陷窝进行显微放大拍照图。原代成骨细胞培养3周，可见骨节结形成。

具体实施方式

下面用实施例对本发明作进一步说明，但并不对本发明构成限制。

实施例1黄芩苷及黄芩总黄酮提取物对大鼠成骨细胞生长、分化的影响

1.试验材料

(1)受试药物

供试样品：黄芩苷(大于95％，HPLC法)、黄芩总黄酮提取物I(含量70％，uv法，大孔树脂制备方法)、黄芩总黄酮提取物II(含量50％，uv法，酸碱制备方法)、黄芩总黄酮提取物III(含量30％，uv法，乙醇提取)、黄芩总黄酮提取物IV(含量25％，uv法，水提取)。

性状：均为浅黄色粉末，气微，味苦

保存条件：避光、密闭

配制方法：称取一定量待试药物，用1％羧甲基纤维素钠溶液制成混旋液。

(2)动物

品系：SD大鼠

来源：上海斯莱克实验动物有限公司(中国科学院上海实验动物中心)

体重：200g(三月龄)

性别：雌雄各半

等级：清洁级

合格证号：中科动管第004号；许可证号：SCXK(沪)2002-0010

饲料：中国科学院上海实验动物中心提供。

生产合格证号：中科沪动管字第99-0010号

饲养场所：第二军医大学实验动物中心

等级：清洁级

合格证号：医动字第02-64号。

2、试验方法

(1)含药血清的制备

参见(刘建民、张依山、马锦富，活络骨康丸对成骨细胞作用的研究，中医正骨，2004，16(9)：3-4；张巧艳、秦路平、田野萍等，蛇床子素对新生大鼠颅盖骨成骨细胞的作用，第二军医大学学报，2000，21(10)：935-937)。

选择SD 3月龄大鼠，按体重随机分为8组，即为对照组(CMC)、尼尔雌醇组、强骨胶囊组、黄芩苷组、黄芩总黄酮提取物I组、黄芩总黄酮提取物II组、黄芩总黄酮提取物III组、黄芩总黄酮提取物IV组。尼尔雌醇组、强骨胶囊组。分别给予1％CMC、200mg/kg的黄芩总黄酮提取物组I、220mg/kg黄芩总黄酮提取物II、230mg/kg黄芩总黄酮提取物III、250mg/kg黄芩总黄酮提取物IV、100mg/kg的黄芩苷组、强骨胶囊90mg/kg灌胃给药，每日给药2次，连续给药1周；尼尔雌醇1mg/kg每周给药一次，末次给药1h后，心脏采血，2500r/min离心20min，合并收集同组血清，56℃水浴灭活30min，-20℃保存备用。使用前培养基稀释，过滤膜除菌(滤膜孔径为0.22mm)。

(2)细胞培养

参见(王永东、武晓蓉，黄芪对成骨细胞成骨能力的血清药理学实验，广东药学院学报，2004，20(5)：512-514)。

新生大鼠颅盖骨成骨细胞培养方法。24小时内出生的新生SD大鼠拉颈处死，75％酒精浸泡后取头盖骨，剔除软组织后剪碎，加入0.2％的I型胶原酶，消化5个循环，每次20min，收集第3、4、5次消化的细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀的细胞用10％胎牛血清DMEM培养基重悬，吹打均匀，接种至培养瓶，于37℃5％CO₂孵箱孵育，24小时换液，待细胞60％～70％贴壁后，用0.25％胰酶消化，即为本实验的原代成骨细胞。原代细胞长成致密单层后，用0.25％胰蛋白酶进行消化，以1∶3比例传代，以后每2天换液1次，长成致密单层后用于实验。

(3)细胞鉴定

倒置显微镜下观察：培养第2天大部分细胞贴壁，贴壁后主要为梭形、圆形或鳞片状；3～4天时细胞突起伸展，相互搭连成片，长满瓶底时，细胞为梭形及立方块状，排列紧密，并可见圆形及鳞片状细胞。随着培养时间的延长，可见成骨细胞呈多层生长。

(4)细胞增殖实验

参见(任艳玲、郑洪新、杜松，补肾健脾药物血清对体外培养的成骨细胞增殖与分化的影响。中国中医药信息杂志，2004，11(9)：772-774)。

96孔培养板，每孔加入100μl细胞悬液(1×10⁵个/ml)，在37℃，5％CO₂孵育箱中培养，使细胞贴壁，换含不同浓度、种类的含药血清，继续培养48小时，并于结束培养前4小时，每孔加入10mg/ml的MTT。培养结束后，弃培养液，每孔加入100μl的DMSO，振摇15min，酶标仪于490nm处检测各空OD值。

(5)碱性磷酸酶活性测定

参见(史凤芹.于世凤.体外破骨细胞分离培养方法的建立.中华骨科杂志.1994，14(1)：43-45)。

96孔培养板，每孔加入0.1ml细胞悬液(1×10⁶个/ml)，贴壁后加药方法同前，细胞培养2d后，取细胞培养液50l，各孔均加碱性磷酸酶试剂盒新鲜配制的底物2.55ml，37℃孵育30min，双蒸水空白调零，在722分光光度计520nm波长处检测其吸光度A值。

3.统计处理

各组结果以 x±SD表示，采用ANOVA比较给药前后各组间变化差值的显著性。

4、结果

4.1成骨细胞形态

如图1所示原代成骨细胞培养1周，细胞成多角状。

如图2所示原代成骨细胞培养3周，可见骨节结形成。

4.2供试药物血清对成骨细胞增殖的影响

从表1可以看出，与对照组相比，10％黄芩总黄酮提取物血清I、10％黄芩总黄酮提取物血清II、10％黄芩总黄酮提取物血清III、10％黄芩总黄酮提取物血清IV及5％黄芩苷血清对成骨细胞增殖具有显著统计学意义(P＜0.05)；与对照组相比，20％黄芩总黄酮提取物血清I、20％黄芩总黄酮提取物血清II、20％黄芩总黄酮提取物血清III、20％黄芩总黄酮提取物血清IV及10％黄芩苷血清对成对成骨细胞增殖具有非常显著统计学意义(P＜0.01)。

表1.含供试药物血清对成骨细胞增殖的影响：A_490nm(n＝7， x±SD)

分组	10％黄芩总黄酮血清或5％黄芩苷血清测定结果	20％黄芩总黄酮血清或10％黄芩苷血清测定结果
			对照组黄芩总黄酮提取物I黄芩总黄酮提取物II黄芩总黄酮提取物III黄芩总黄酮提取物IV黄芩苷(B)尼尔雌醇强骨胶囊	0.1±0.010.19±0.03*0.18±0.04**0.17±0.02*0.17±0.03*0.21±0.04**0.1±0.010.18±0.04**	0.19±0.030.30±0.02**0.36±0.02**0.34±0.01*0.35±0.02*0.36±0.05**0.20±0.030.33±0.05**

^*p＜0.05；^**p＜0.01 vs NS；

从表2可以看出，与对照组相比，10％、20％含药血清中黄芩总黄酮各组及黄芩苷对成骨细胞分泌碱性磷酸酶具有显著促进作用(P＜0.01)，在我们的实验条件下，与强骨胶囊的作用相似，比尼尔雌醇稍好。

表2.含供试药物血清对成骨细胞AKP的影响：A_570nm(n＝7， x±s)

分组	10％黄芩总黄酮血清或5％黄芩苷血清测定结果	20％黄芩总黄酮血清或10％黄芩苷血清测定结果
			对照组黄芩总黄酮提取物黄芩总黄酮提取物II黄芩总黄酮提取物III黄芩总黄酮提取物IV黄芩苷尼尔雌醇强骨胶囊	0.09±0.010.14±0.02**0.14±0.02**0.12±0.03*0.13±0.02*0.15±0.03**0.11±0.03*0.14±0.03**	0.09±0.030.16±0.02**0.16±0.02*0.14±0.03**0.14±0.02**0.17±0.02**0.12±0.03*0.16±0.02*

p＜0.05；**p＜0.01 vs对照组

本试验结合成骨细胞的生长及分化指标对黄芩系列药物进行了评价，结果显示：它们对成骨细胞的增殖及分化均有一定的促进作用。

结论：黄芩苷及黄芩总黄酮提取通过促进成骨细胞的增殖和分化，对骨质疏松的防治具有积极意义。

实施例2黄芩苷及黄芩总黄酮提取物对对新生大鼠破骨细胞功能的影响

1、试验材料

(1)受试药物

供试样品：黄芩苷(大于95％，HPLC法)、黄芩总黄酮提取物(大于70％，uv法，大孔树脂制备方法)、黄芩总黄酮提取物II(含量50％，uv法，酸碱制备方法)、黄芩总黄酮提取物III(含量30％，uv法，乙醇提取)、黄芩总黄酮提取物IV(含量25％，uv法，水提取)。

性状：浅黄色粉末，气微，味苦

保存条件：避光、密闭

配制方法：称取一定量待试药物，用1％羧甲基纤维素钠溶液制成混旋液

(2)动物

品系：SD大鼠

来源：上海斯莱克实验动物有限公司(中国科学院上海实验动物中心)

体重：200g(三月龄)

性别：雌雄各半

等级：清洁级

合格证号：中科动管第004号；许可证号：SCXK(沪)2002-0010，

饲料：中国科学院上海实验动物中心提供

生产合格证号：中科沪动管字第99-0010号

饲养场所：第二军医大学实验动物中心

等级：清洁级

合格证号：医动字第02-64号。

2、试验方法

(1)骨磨片的制备：取新鲜牛股骨，用锯式切片机(Leitz 1600)切割成厚度约50mm的薄切片，剪成6mm×6mm大小，于灭菌的双蒸水中超声(SB2200，80w)清洗(50Hz×5min)，连续3次后，紫外灯照射8小时(每面4小时)，备用。参见(张炜真、于世凤、郑麟蕃.大鼠破骨细胞体外分离培养和鉴定.解剖学报.1995，26(3)：291-293；史凤芹.于世凤.张润荃.庞淑珍.大黄对破骨细胞性骨吸收作用的研究.现代口腔医学杂志.1995，9(4)：193-195)

(2)含药血清的制备

选择SD 3月龄大鼠12只，雌雄各半，按体重随机分为5组，即为对照组(CMC)、黄芩苷、黄芩总黄酮提取物组、尼尔雌醇组、强骨胶囊组。分别给予1％CMC、200mg/kg的黄芩总黄酮提取物组I、220mg/kg黄芩总黄酮提取物II、230mg/kg黄芩总黄酮提取物III、250mg/kg黄芩总黄酮提取物IV、100mg/kg的黄芩苷组、强骨胶囊90mg/kg灌胃给药，每日给药2次，连续给药1周；尼尔雌醇1mg/kg每周给药一次，末次给药1h后，心脏采血，2500r/min离心20min，合并收集同组血清，56℃水浴灭活30min，-20℃保存备用。使用前培养基稀释，过滤膜除菌(滤膜孔径为0.22mm)。

(3)破骨细胞分离与培养

参见(任艳玲、郑洪新、杜松，补肾健脾药物血清对体外培养的成骨细胞增殖与分化的影响。中国中医药信息杂志，2004，11(9)：772-774)。

取1日龄SD大鼠，拉颈处死，75％酒精浸泡5min，无菌分离四肢长骨，剔净软组织，用MEM培养液清洗2次，用解剖刀纵向剖开骨干，将骨质内表面刮入培养液(MEM全培养液，含20％胎牛血清，100g/ml硫酸链霉素、100U/ml青霉素钠，pH 7.2)。再以圆头吸管吹打骨碎片5min，静置30s，吸取上层细胞悬液均匀接种于预置有象牙薄片的24孔培养板中，37℃5％CO2孵箱孵育30分钟，以MEM培养液冲去未贴壁的细胞，更换全培养液至每孔2ml，继续培养，3天更换一次培养液。

(4)骨吸收陷窝观察与计数

培养8小时后，更换为加有含药血清或对照血清的培养液，培养至第7天，取出所有象牙薄片，2.5％戊二醛固定，于0.25mol/L氢氧化铵超声波清洗5min×3次，系列梯度酒精脱水，自然晾干，1％甲苯胺蓝染液室温染色，3～4min，蒸馏水清洗，于光镜100倍下对整张象牙薄片上的吸收陷窝计数，结果以陷窝数/片计。

3统计处理

各组结果以 x±SD表示，采用ANOVA比较给药前后各组间变化差值的显著性。

4结果

4.1供试品对破骨细胞骨吸收功能的影响

从表3中可以看出，与对照组相比，20％含药血清黄芩总黄酮提取物各组及10％黄芩苷对成对成骨细胞增殖具有非常显著统计学意义(P＜0.01)；10％、20％含药血清中黄芩总黄酮各组及5％、10％的黄芩苷对成骨细胞分泌碱性磷酸酶具有显著促进作用(P＜0.01)；

表3对骨片骨陷窝计数的影响(n＝6， x±s)

分组	骨陷窝计数
			10％黄芩总黄酮血清或5％黄芩苷血清测定结果	20％黄芩总黄酮血清或10％黄芩苷血清测定结果
	对照黄芩总黄酮提取物黄芩总黄酮提取物II黄芩总黄酮提取物III黄芩总黄酮提取物IV黄芩苷尼尔雌醇强骨胶囊	73±3440±10*41±10*42±1543±2739±10*54±1567±27			99±2635±21**36±27**37±21**38±27**34±27**48±21**51±27*

p＜0.05；**p＜0.01 vs对照组

结果与结论：对骨组织的溶解吸收是破骨细胞主要的生理功能。体外培养一定时间的破骨细胞可在骨片上形成吸收陷窝，吸收陷窝的数量可反映破骨细胞溶解吸收的能力。采用甲苯胺兰染色技术对骨片上产生的吸收陷窝进行显示，可以定量这种溶解吸收能力。破骨细胞与成骨细胞共同维持着骨代谢重建的平衡。骨质疏松发生的机制是骨形成落后于骨溶解，在骨的重建过程中无法完全修复破坏的骨质，使其骨量不断减少、骨质量下降。因此，治疗骨质疏松的关键措施包括促进成骨细胞的成骨过程，缓解破骨细胞的破骨过程等。

总之，成骨细胞是参与骨代谢的重要细胞，它与破骨细胞共同维持着骨代谢重建的平衡。骨质疏松发生的机制是骨形成落后于骨溶解，在骨的重建过程中无法完全修复破坏的骨质，使其骨量不断减少、骨质量下降。因此，治疗骨质疏松的关键措施之一是促进成骨细胞的成骨过程，缓解破骨细胞的破骨过程。

本试验在成功培养出成骨细胞基础上，观察了大鼠灌胃给药后得到的血清对成骨细胞增殖、分化的影响。AKP约40％～75％由成骨细胞产生，其活性可反映成骨细胞功能的强弱，也是成骨细胞分化的标志之一。本试验结合成骨细胞的生长及分化指标对黄芩系列药物进行了评价，结果显示：黄芩总黄酮及黄芩苷对成骨细胞的增殖及分化均有一定的促进作用。

对骨组织的溶解吸收是破骨细胞主要的生理功能。体外培养一定时间的破骨细胞可在骨片上形成吸收陷窝，吸收陷窝的数量可反映破骨细胞溶解吸收的能力。采用甲苯胺兰染色技术对骨片上产生的吸收陷窝进行显示，可以定量这种溶解吸收能力。

因此，治疗骨质疏松的关键措施包括促进成骨细胞的成骨过程，缓解破骨细胞的破骨过程等。

本研究利用原代培养的破骨细胞进行骨吸收试验。结果显示：黄芩总黄酮及黄芩苷对破骨细胞功能有一定剂量依赖性的抑制作用。说明其防治骨质疏松作用，部分是通过抑制破骨细胞的功能实现的。

以上充分说明了黄芩总黄酮提取物及黄芩苷治疗和预防骨质疏松的作用，可开发成抗骨质疏松新药。

Claims (2)

1.黄芩苷在制备治疗或预防骨质疏松症药物中的用途。

2.黄芩总黄酮提取物在制备治疗或预防骨质疏松症药物中的用途。

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