CN1698676A

CN1698676A - 荔枝果皮提取物及其制备方法和用途

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Publication number: CN1698676A
Application number: CNA2004100225590A
Authority: CN
Inventors: 王修杰; 袁淑兰; 魏于全
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2004-05-19
Filing date: 2004-05-19
Publication date: 2005-11-23
Anticipated expiration: 2024-05-19
Also published as: CN100389798C

Abstract

本发明提供了荔枝果皮提取物及其制备方法，本发明还提供了该荔枝果皮提取物在医药、保健食品和化妆品中的应用。该本发明提取方法成本低廉，得率高，来源于食用水果荔枝果皮，无毒副作用，应用广泛，作用明显，原料来源丰富、价廉，制备工艺简单，有较大的经济价值。

Description

荔枝果皮提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及水果果皮提取物及其制备方法和用途，具体地说，是荔枝果皮提取物及其制备方法和用途。

背景技术

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是无患子科常绿植物所结果实。其性味甘、微苦，温，归肝、肾经，具行气散结、祛寒止痛之功效。主治寒疝腹痛、睾丸肿痛，近年临床上常用之治疗非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，效果好。已有研究报道荔枝果仁及提取物具有降血糖、调血脂、抗氧化、抑制乙肝病毒和护肝等药理作用，日本学者研究发现，荔枝核所含的配糖体成分具有多种生理活性作用，如抗癌、抗胶原酶和降糖作用等^[1]。研究发现，荔枝果皮(litchi fruit pericarp)富含多酚及黄酮类，具有很强的抗氧化作用。郑公铭等研究发现，30克猪油中加入0.04％荔枝果皮提取物，其抗氧化作用大于0.02％BHT^[2]。法国Sarni-Manchado等研究结果表明，荔枝鲜果皮提取物的主要成分为单宁(多酚)，4mg/1g鲜果皮，表儿茶素(epicatechin)1.7mg/1g鲜果皮，原花青素A2(procyanidins)0.7mg/1g鲜果皮，原花色素(anthocyanins)与黄酮含量相当，约0.4mg/1g鲜果皮^[3]。荔枝果皮提取物除了体外抗氧化作用 ^[2]之外，有无其他生物活性和药理作用，国内外均无研究报道。

我国荔枝产量大，2002年荔枝产量达139.32万吨，其干果皮可达5万吨，因此，从荔枝果皮中提取有效成分，有重大的经济价值。现有文献^[2，3]，报道，制备荔枝果皮提取物的原料为鲜果皮^[3]，或60℃实验室烘干果皮，用索氏提取器提取或时温浸泡4天提取，所试原料仅2-3克，所用提取溶剂量为乙醇，溶剂(w/w)＝1∶50，其提取得率为9.35％^[2]，提取率低，且使用的溶液量大(为原料的50倍)，提取时间长(需4天)。此外，尚无其它荔枝果皮提取物提取方法的报道。

发明内容

为了解决上述缺陷，本发明所要解决的技术方案是提供了荔枝果皮提取物及其制备方法。本发明还提供了该荔枝果皮提取物在医药、保健食品和化妆品中的应用。

本发明还提供了该荔枝果皮提取物的制备方法，它包括下列步骤：

a、称取荔枝(Litchi chinensis Sonn.)的成熟果皮、生理落果未成熟果皮，干燥；

b、选用乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、水、二氧化碳超临界中的一种溶剂/方法提取，即得本发明荔枝果皮提取物。

其中步骤b选用70％～80％v/v乙醇提取。进一步地，步骤b选用的乙醇用量与a步骤原料用量的重量配比为：6～10∶1。

采用本方法的提取方法时间为36小时。提取时间短，提取效率高。

本发明提供了一种荔枝提取物，它是由所述的荔枝提取物的制备方法制备而成。其中多酚含量为5.0％～6.0％w/w；提取物得率大于20％w/w。其中多酚的分析方法为硅胶G薄层层析法。

所述的荔枝果皮提取物在制备抗癌的药物中的用途。

所述的荔枝果皮提取物在制备抗衰老的药物及化妆品中的用途。

所述的荔枝果皮提取物在制备护肤、防晒的化妆品中的用途。

本发明还提供了一种药物组合物，它包括有效量的所述的荔枝果皮提取物与药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

其中所述的制剂是口服制剂。该口服制剂包括常规的片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液等。

本发明还提供了该药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的用途。

本发明还提供了一种食品或食品添加剂，它包含所述的荔枝果皮提取物制成的食品或食品添加剂。

本发明还提供了一种化妆品，它包含所述的荔枝果皮提取物。

本工艺所用原料为荔枝(Litchi chinensis Sonn.)的成熟果皮、生理落果未成熟果皮，来源广，可节约能源，便于果皮的采集；其中提取的溶剂剂量少，成本低廉；得率为22.76％，得率高。该提取物原料来源于食用水果荔枝果皮，无毒副作用，应用广泛，作用明显；原料来源丰富、价廉，制备工艺简单；制备时间短，得率高，有较大的经济价值。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐述本发明所述提取物的制备工艺。

实施例1本发明荔枝果皮提取物制备工艺

1、荔枝果皮的采集

白蜡荔枝因果实成熟时，果皮蜡白色，故称白蜡荔枝，果皮薄而韧，厚度0.8-1.0毫米，种皮棕褐色，呈光泽。当地水果市场购买白蜡荔枝，去果肉及果核，收集果皮，自然晾干，备用。果皮用开水浸泡后饮用，味甘，微涩。

2、提取工艺

(1)将自然晾干的果皮置80℃进一步烘干，机械粉碎；

(2)用电子天平称取粉粒状果皮100克，加80％乙醇800ml，置磁力搅拌器上，搅拌提取36h。

(3)用Whatman 3MM滤纸过滤，并收集滤液。

(4)将滤纸上滤渣同(2)重复提取一次。

(5)合并2次提取滤液，置60℃恒温水浴，连接真空泵，真空浓缩致100±5ml。

(6)真空冻干，得黑褐色粉末状及部分晶片状提取物，手指研磨呈细粉状。

(7)提取物得率＝提取物重量/原料重量×100％＝22.76克/100克×100％＝22.76％。

上述工艺步骤(2)中还可以采用甲醇、乙酸乙酯、乙醚、水等溶液进行提取，或采用二氧化碳超临界萃取的方法提取，并能达到相同的效果，提取率高，时间短。

3、提取物的一般理化特性

本发明制备的荔枝果皮提取物为黑褐色粉末状及部分晶片状提取物，手指研磨呈细粉状，其中脂溶性成分约占40％，水溶成分约占60％，其水溶液橙黄色，pH＝3.0。脂溶性成分易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。

实施例2本发明荔枝提取物的药物的制备

称取荔枝提取物10g，按常规药物制剂的制备方法，制备成颗粒剂，胶囊剂，片剂，口服液。其中每颗胶囊/片剂含荔枝提取物5-10g；每100g颗粒剂含荔枝提取物5-10g；每ml口服液含荔枝提取物2-5g。

实施例3本发明荔枝提取物食品的制备

果皮提取物10.0％，珍珠粉2.0％，淀粉等85-88％，色素、防腐剂、适量。制备成口服液，该口服液具有美容祛斑的功效。

实施例4本发明荔枝提取物的化妆品制备

霜剂类化妆品，如防晒霜：硬脂酸3.0％，白油44.0％，二乙醇胺1.0％，司班604.0％，原料丙二醇5.0％，精制水40.0％，荔枝果皮提取物5.0％，香料、色素、防腐剂、适量。

根据上述的配伍方式和方法，选用不同剂量的荔枝提取物，可制备成不同规格的药物、食品、化妆品。

以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

实验例1本发明荔枝果皮提取物对肿瘤增殖抑制作用

收获体外培养对数生长期人乳腺癌细胞(MCF-7)及人肝癌细胞(SMMC-7721)分别接种于25ml培养瓶，2.0×10⁵/瓶，共12瓶。24小时后，去原培养液，随机分为4组，每组3瓶。其中1个对照组，继续加入完全培养液培养，3个处理组分别进入含荔枝果皮提取物100、200、400mg.L^-1的完全培养液培养，72小时后，收获细胞，台盼蓝染色，用血球极数板，显微镜下计数每瓶活细胞数。

结果：

(1)本发明荔枝果皮提取物对人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖的抑制作用三个剂量的荔枝果皮提取物(100、200、400mg.L^-1)对人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖的抑制率分别为，15.60％，56.88％，73.39％，有显著性差异(P＜0.05)。

(2)本发明荔枝果皮提取物对人肝癌细胞(SMMC-7721)增殖的抑制作用三个剂量的荔枝果皮提取物(100、200、400mg.L^-1)对人肝癌细胞(SMMC-7721)增殖的抑制率分别为，26.81％，31.16％，42.02％，有显著性差异(P＜0.05)。

实验例2本发明荔枝果皮提取物对肿瘤细胞克隆形成的抑制作用

胰酶消化收获体外培养对数生长期人乳腺癌细胞(MCF-7)及人肝癌细胞(SMMC-7721)，用血球计数板显微镜下计数，调整细胞浓度，以2ml/孔，分别加入2个6孔板(其细胞数为：300/孔)，培养，次日加药，备用，次日分4组，即对照、低、中、高剂量实验组，每组3个孔，实验组加荔枝果皮提取物处理，其剂量分别为100、200、400ug/ml。继续培养12天，终止培养，倾去培养液，用PBS洗2次，Gimesa染色30min.。放大镜下克隆计数。结果如下：

(1)本发明荔枝果皮提取物对人乳腺癌细胞(MCF-7)隆形成的抑制作用三个剂量的荔枝果皮提取物(100、200、400mg.L^-1)对人乳腺癌细胞隆形成的抑制率分别为，29.0％，33.52％，100.00％，有显著性差异(P＜0.05)。

(2)三个剂量的本发明荔枝果皮提取物(100、200、400mg.L^-1)对人肝癌细胞(SMMC-7721)克隆形成的抑制率分别为，11.43％，69.07％，100.00％，有显著性差异(P＜0.05)。

实验例3本发明荔枝果皮提取物的体内抗癌作用

1.本发明荔枝果皮提取物对小鼠肝癌(H₂₂)生长抑制作用

(1)实验材料

①肿瘤细胞株H₂₂肝癌，小鼠H₂₂肝癌，本实验室保种传代。

②实验动物，ICR小鼠购自四川省医科院实验动物中心(合格证号：医动字第01 3072号)全为雌性，体重见表。

③试验药物，荔枝果皮提取物，实施例1制备。

(2)实验方法

①取荷肝癌H₂₂小鼠腹水3ml+N.S 15ml稀释，然后取癌细胞悬液0.1ml+N.S 0.9ml，混匀，显微镜下计数为：204，198，211，212；计算为：2.06×10⁷/ml。

②接种动物，将上述癌细胞悬液稀释为1×10⁷/ml，每鼠接种0.2ml，相当于2.0×10⁶/鼠，右腋皮下接种，喂养观察其肿瘤生长，备用。

③实验分组39只荷瘤小鼠随机分为3组，每组13只，即对照1组，实验2组，各组动物自由饮用自来水。空白对照组，每日灌胃DH₂O0.5ml；高剂量组，每日灌胃6％提取物水溶液0.2ml/10g(1.2g/kg)(每10g小鼠的用量为0.2ml)；低剂量组，每日灌胃1.5％提取物水溶液0.2ml/10g(0.3g/kg)，共处理10天，处死各组动物，称体重，解剖剥离肿瘤，称瘤重，计算肿瘤抑制率。

(3)结果：本发明荔枝果皮提取物对小鼠肝癌H₂₂有明显的抑制作用(见表1)，而对动物体重变化及一般情况无明显影响。经组织病理学观察发现，各组动物肿瘤组织均有不同程度的癌细胞核固缩、片状坏死、出血及炎细胞浸润，实验组明显重于对照组。

表1 荔枝果皮提取物对小鼠肝癌H₂₂的实验治疗作用

组别	剂量(g/kg)	给药方式	动物数		平均体重(g)		平均瘤重(g)( x±s)	抑瘤率P值(％)
			动物数		平均体重(g)				开始	最后	开始	最后
			阴性对照高剂量组低剂量组	DH₂O1.20.3	POPOPO	131313			开始	最后	开始	最后	131313	20.5320.7619.65	22.1422.4623.00	1.04±0.1980.64±0.2700.63±0.128	38.65＜0.0139.90＜0.01

2.本发明荔枝果皮提取物对人乳腺癌生长的抑制作用

(1)建立人乳腺癌模型，取荷人乳腺癌裸鼠，无菌操作取肿瘤组织，置无血清培养液，洗净，选取生长良好的肿瘤组织，切成2-3mm小块，置入穿刺针内，原位植入裸鼠右前第二乳垫，尽量使每只动物接种的肿瘤组织大小体积一致。

(2)实验分组，按体重随机分组对照组2组和实验组2组；对照每组6只，实验组7只。

(3)实验处理：对照组动物自由饮用消毒自来水，实验组动物自由饮用0.3％本发明荔枝果皮提取物水溶液。

(4)肿瘤生长动态观察2组动物每2周称体重，测量肿瘤长、短径(a，b)，按文献^[4]V＝1/2ab²计算肿瘤体积。

(5)肿瘤生长抑制作用观察实验结束时处死各组动物，称体重，解剖剥离肿瘤，称瘤重，计算肿瘤抑制率。

(6)组织病理学观察肿瘤组织用4％多聚甲醛(Sigma公司)固定，石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜检查。

(7)结果：

①动物的一般情况

两组动物活动、摄食等一般情况良好，实验组动物平均体重略低于对照组，但无显著性差异(P＞0.05)。

②本发明荔枝果皮提取物对人乳腺癌的抑制作用

本发明荔枝果皮提取物对人乳腺癌有明显的抑制作用体积增长的抑制率为47.51％，对人乳腺癌肿瘤重量增长的抑制率为34.18％，有显著性差异(P＜0.05)。

③组织病理学观察发现，实验组动物肿瘤组织癌细胞密度低于对照组，对照组肿瘤组织血管生成常见，凋亡细胞少见；本发明荔枝提取物处理组肿瘤组织血管生成，散在凋亡细胞常见，各重要器官未见病理学改变。

上述药效学试验说明，本发明的荔枝提取物具有明显的抗肿瘤作用。

实施例4本发明荔枝果皮提取物在制备保健食品、化妆品中的作用

(1)实验材料

①人乳腺癌细胞(MCF-7)，由中科院上海细胞所细胞库提供，本实验室保种传代。

②试验药物，荔枝果皮提取物，实施例1制备。

(2)实验方法

①细胞培养：人乳腺癌细胞(MCF-7)常规培养于含10％灭活小牛血清、100^U.mL^-1青霉素和100mg.L^-1链霉素的RPMI 1640培养液中，置饱和湿度、CO₂50ml.L^-1，37℃培养箱培养。

处理：接种对数生长期肿瘤细胞2.0×10⁵于25ml培养瓶，24小时后随机分为对照组和处理，各组4瓶，去原培养液，对照组加完全培养液，处理组加分别加入含本发明荔枝提取物100mg.L^-1的完全培养液培养，继续培养72小时后，收获细胞，按1mL/10cm²加入Trizol试剂，置-80℃保存，备用。

②RNA提取及探针制备RNA提取按试剂盒(试剂盒来源于Gibco/BRL公司)说明书进行。总RNA用Micro Bio-Spin Columns(Bio-Rad公司)纯化，电泳及分光光度仪检测260nm和280nm处吸光值，鉴定RNA质量。样品mRNA经逆转录反应合成cDNA，用cy3-dUTP(连接荧光素cy3的脱氧尿嘧啶三核苷酸)标记未处理的MCF-7 mRNA(连接荧光素cy5的脱氧尿嘧啶三核苷酸)，cy5-dUTP(连接荧光素cy5的脱氧尿嘧啶三核苷酸)标记本发明荔枝提取物处理的MCF-7mRNA，逆转录合成带荧光标记的cRNA探针。乙醇沉淀后溶解于20uL含0.2％SDS(十二烷基磺酸钠)和0.1％SSC(核酸杂交试剂，含氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠试剂)杂交液的5×SSC溶液中。

③芯片预杂交：基因芯片置95℃双蒸水中2min，置无水乙醇30s，室温凉干，将杂交试剂滴加于芯片上，盖上盖玻片，置MICRO-4杂交炉(英国)内，封口膜封口，42℃，水平放置预杂交5h。

④杂交与洗涤：将荧光标记探针置95℃水浴中变性2min，将探针加于预杂交过的芯片上，盖玻片封片，置MICRO-4杂交炉内42℃杂交过夜。分别用0.1％SSC加0.2％SDS，0.1％SSC洗涤10min，室温凉干。

⑤荧光扫描和结果分析：用AFFYMETRS 418芯片扫描仪扫描芯片，观察杂交结果；用IMAGENEIV软件分析基因芯片扫描图cy3和cy5两种荧光信号的强度和比值，获得原始数据。

(3)结果判断标准

①有效基因点，表达值为50-50000，②处理细胞(Lit)表达值/细胞(C)表达值＞2为上调表达，处理细胞(Lit)表达值/细胞(C)表达值＜0.5为下调表达；③其差异＞2倍。

(4)结果

HO4基因芯片总点样基因数为3360，经图象扫描，按结果判断标准进行数据分析处理，共筛选出170条差异表达基因。其中，上调表达41条，下调表达129条。上调表达的基因主要为凋亡促进基因BAK1、细胞周期素依赖激酶抑制基因CDKN1A、细胞色素氧化酶基因、超氧化物歧化酶SOD3等；下调表达的基因主要为细胞周期调控基因、细胞周期素依赖激酶、癌基因、细胞因子及生长因子、细胞外基质及黏附分子、整合素、凋亡抑制剂热休克蛋白、白介素8(IL-8)等。

通过上述的对荔枝提取物的机理性试验，说明：

①荔枝果皮提取物抗癌作用机理可能是上调凋亡促进基因BAK1、细胞周期素依赖激酶抑制基因CDKN1A、细胞色素氧化酶基因、超氧化物歧化酶SOD3等基因表达；下调细胞周期调控基因、细胞周期素依赖激酶、癌基因、细胞因子及生长因子、细胞外基质及黏附分子、整合素、凋亡抑制剂热休克蛋白等功能基因表达，从而影响细胞周期进程，诱导癌细胞凋亡，抑制肿瘤细胞体外增殖和体内生长。充分说明本发明荔枝提取物的抗癌功效。

②细胞色素C基因CYBA(Cytochrome b-245)表达增高2.41倍、CYP1A1(Cytochrome P450，subfamily I)表达增高7.04倍，超氧化物酶基因SOD3(Superoxide dismutase 3)表达增高2.41倍。结果提示，荔枝果皮提取物具有抗氧化作用。

③IL8基因表达下调2.34-3.54倍，已有研究报道，在儿童寻常型银屑病中肿瘤环死因子(INF)可能是IL₆、IL₈升高的主要促进因素，用中草药治疗银屑病，随病情好转血清白介素8(IL-8)水平明显下降^[5]；Behcet’s病是一种复发性口腔溃疡伴生殖器反复溃疡，皮肤结节红斑，假性毛囊炎，或脓性丘疹的的非对称性免疫炎性疾病。活动期IL-8(7.2+/-0.4pg/ml)明显高于静止期(5.3+/-0.1pg/ml，)^[6]；紫外线引起皮肤炎症与诱导角化细胞氧化应激和产生细胞因子产生有关，紫外线照射人正常皮肤后，IL8 mRNA和蛋白表达迅速增加^[7-9]。结果提示，荔枝果皮提取物具有抗炎、防晒、美容等皮肤保护作用。

上述药效学试验，说明本发明荔枝提取物作为药物具有抗癌作用，作为化妆品和食品，具有抗氧化作用，进一步的实验说明，抗氧化作用体现在抗炎、防晒等皮肤保护功能，说明本发明荔枝提取物的多种功效，为临床用药、食品、化妆品提供了新的选择。

参考文献

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Claims

1、一种荔枝果皮提取物的制备方法，它包括下列步骤：

a、称取荔枝Litchi chinensis Sonn.的成熟果皮、生理落果未成熟果皮，干燥；

b、选用乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、水、二氧化碳超临界中的一种溶剂/方法提取，即得荔枝果皮提取物。

2、根据权利要求1所述的荔枝果皮提取物的制备方法，其特征在于：步骤b选用70％～80％v/v乙醇提取。

3、根据权利要求1，2所述的荔枝果皮提取物的制备方法，其特征在于：步骤b选用的乙醇用量与a步骤原料用量的重量配比为：6～10∶1。

4、一种荔枝提取物，它是由权利要求1所述的荔枝提取物的制备方法制备而成。

5、根据权利要求4所述的荔枝提取物，其特征在于：多酚含量为5.0％～6.0％w/w；提取物得率大于20％w/w。

6、权利要求4，5所述的荔枝果皮提取物在制备抗癌的药物中的用途。

7、权利要求4，5所述荔枝果皮提取物在制备抗衰老的药物及化妆品中的用途。

8、权利要求4，5所述的荔枝果皮提取物在制备护肤、防晒的化妆品中的用途。

9、一种药物组合物，它包括有效量权利要求4所述的荔枝果皮提取物与药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

10、根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于所述的制剂是口服制剂。

11、权利要求9所述的药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的用途。

12、一种食品或食品添加剂，它包含权利要求4所述的荔枝果皮提取物制成的食品或食品添加剂。

13、一种化妆品，它包含权利要求4所述的荔枝果皮提取物。