CN1785218A - 石榴籽提取物及其制备方法以及在制备药品中的应用 - Google Patents

Abstract

石榴籽提取物及其制备方法以及在制备药品中的应用，属于天然植物的提取物，目的是得到具有保健和多种药用价值的石榴籽油；同时提供其提取分离方法，以提高提取分离效益。本发明石榴籽提取物，以石榴籽为原料经提取分离制备所得，含有重量比为65～95％的石榴酸，1～10％的亚油酸，1～10％的硬脂酸，2～5％的棕榈酸，1～10％的油酸。石榴籽提取物制备方法，步骤依次为：石榴籽洗净干燥、破碎、采用有机溶剂浸提法、微波有机溶剂提取法、超声有机溶剂提取法或者超临界萃取法中的一种提取分离。所述石榴籽提取物应用于制备体内外抗氧化、防治高血脂症和抑制肿瘤的药品或保健食品，可进一步加工成软胶囊、微囊粉剂或乳剂。

Description

石榴籽提取物及其制备方法以及在制备药品中的应用

技术领域

本发明属于天然植物的提取物，特别涉及一种天然植物种子提取物及其制备方法以及在制备药品或保健食品中的应用。

背景技术

石榴(Punica granatuml)属石榴科，自古为药食两用植物，其果皮、花瓣、叶片均可入药。石榴皮在我国历版药典中均有收载，现有药理研究显示其具有防治性病传播、抗菌、抗病毒、抗癌等独特的活性；石榴花中的熊果酸和谷甾醇被用作收敛剂和止血剂，石榴花提取物可明显降低大鼠血糖；石榴叶提取物，可显著提高大鼠的脑微循环血流量。据报道，石榴籽出仁率为29.9％，石榴种仁含油率高达50.9％，并具有很高的食疗价值；然而对石榴籽油的药用性能、其制备方法尚未见报导。石榴深加工后弃之的石榴籽得不到合理利用，造成了资源的浪费。

发明内容

本发明提供一种石榴籽油的提取物及其在制备药品或保健食品中的应用，目的是合理利用资源，得到具有保健和多种药用价值的石榴籽油；同时提供石榴籽油的提取分离方法，以提高天然植物石榴籽的提取分离效益。

本发明的一种石榴籽提取物，以石榴籽为原料经提取分离制备所得，含有重量比为65～95％的石榴酸，1～10％的亚油酸，1～10％的硬脂酸，2～5％的棕榈酸，1～10％的油酸。

所述的石榴籽提取物，其特征是其含有重量比85～95％的石榴酸，1～5％的亚油酸，1～3％的硬脂酸，2～3％的棕榈酸，1～4％的油酸，成为石榴籽精油。

所述的石榴籽提取物制备方法，其步骤依次为：石榴籽洗净干燥、破碎、提取分离，得到石榴籽提取物；提取分离采用有机溶剂浸提法、微波有机溶剂提取法、超声有机溶剂提取法或者超临界萃取法中的一种。

所述的石榴籽提取物制备方法，其特征是：

(1)采用微波有机溶剂提取法时，将粉碎后的石榴籽粉加入有机溶剂，放入微波炉，微波炉功率160～600w，处理次数3～8次，每次30～80s；过滤，收集提取液，真空蒸发回收有机溶剂，得石榴籽油；；

(2)采用超声有机溶剂提取法时，粉碎后的石榴籽粉用有机溶剂浸泡0～6小时，置于超声萃取瓶中，超声频率20～800kHz，超声强度0.3～15W/cm²，石榴籽粉与溶剂的重量体积比为1∶2～20，提取温度20～80℃，萃取0.5～3小时，超声提取后的提取液经过离心或抽滤后，真空蒸发回收有机溶剂，得石榴籽油；

(3)采用超临界萃取法时，粉碎后的石榴籽粉加入到超临界萃取室，抽提压力为10～30Mpa，萃取温度为32～45℃，萃取时间1～6小时，CO₂流量10～40L/h；所得浅黄色油状液体即为石榴籽油；

(4)采用有机溶剂浸提法时，粉碎后的石榴籽粉用有机溶剂浸泡，加热使溶剂微沸，回流1～3小时，过滤，滤渣再加溶剂重复提取一次，过滤，合并滤液，真空蒸发回收有机溶剂，得石榴籽油；

所述的石榴籽提取物制备方法，所用有机溶剂可以为正丁烷、正己烷、环己烷、正庚烷、正戊烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮中的一种或两种的混合溶剂，固液比为1∶2～1∶7；含石榴籽油的提取液采用真空浓缩回收有机溶剂时，其真空度为-0.02～-0.08Mpa，温度为30～85℃。

所述的石榴籽提取物制备方法，得到石榴籽油提取物后，可以将其与等量的无水乙醇混合，在-10℃～-80℃的低温下静置5～15小时后，抽滤，滤液真空减压回收乙醇，得石榴籽精油。

所述的石榴籽提取物可以应用在制备体内外抗氧化的药品或保健食品中。

所述的石榴籽提取物可以应用在制备抗高脂血症的药品或保健食品中。

所述的石榴籽提取物可以应用在制备抑制肿瘤的药品或保健食品中。

申请人采用本发明实施例2提取的石榴籽油进行了体外抗氧化实验；利用实施例5提取的石榴籽油进行急性毒性实验、抗高脂血症、动脉硬化实验；取实施例6所得的石榴籽精油进行抗肿瘤试验，各实验效果如下：

1.体外抗氧化实验：

测定体外抗氧化作用时，于猪油、色拉油中分别加入0.1％～2％石榴籽油，置于50～90℃恒温条件下，每隔一定时间取样测定其过氧化值(POV)。

具体实验方法：按0.5％的加入量在50g猪油和色拉油中分别加入0.25g石榴籽油、维生素E，充分摇匀，对照组不加抗氧化剂，置于60±1℃恒温箱中，每隔12小时取样分析测定比较其过氧化值(POV)，144小时后测定抗氧化效率。

实验结果：抗猪油氧化效果比较：0.5％石榴籽油为38.48％，0.5％维生素E为34.14％；抗色拉油氧化效果比较：0.5％石榴籽油为35.23％，0.5％维生素E为29.30％。可见，0.5％石榴籽油的体外抗氧化效果较0.5％维生素E好。

试验结果评价：石榴籽油在替代维生素E方面有良好的市场潜力。

2急性毒性实验：

试验动物：昆明种小白鼠，体重20±2克，雌雄各半，其40只；

实验方法：取本发明石榴籽油，浓度为100％，按0.2ml/10g体重灌胃，每6小时一次，24小时内灌胃给药总量为1ml/10g。灌胃后连续观察2周。

实验结果：灌胃当天小鼠除食量下降外，无异常。第二天食量即恢复正常，2周内无一只小鼠死亡。

试验结果评价：按中药新药临床前毒理实验方法的毒理评价标准，本发明属实际无毒级。

3.抗高脂血症与脂质过氧化实验：

3.1实验动物和饲料：健康雌性Wistar大鼠50只，体重180～200g；基础饲料：Wistar纯鼠料；高脂饲料：83％基础饲料，10％蛋黄粉，5％猪油，1％胆固醇，0.5％胆酸钠，0.2％丙基硫氧嘧啶；以上均由湖北省实验动物研究中心提供。

3.2实验动物分组及造模：50只大鼠按体重均衡随机分为5组，每组10只：空白对照组、模型对照组、辛伐他汀组、石榴籽油高、低剂量组。空白对照组饲基础饲料；模型对照组及其余组饲高脂饲料。根据文献和预试结果，石榴籽油大、小剂量分别为1g/kg和300mg/kg灌胃(将石榴籽油溶于0.5％CMC中)；辛伐他汀组每天按2mg/kg灌胃辛伐他汀；空白对照组和模型对照组均按10ml/kg灌胃0.5％CMC。各组均饲普通饮水。

3.3观测指标及检测方法：实验12周后，禁食12小时，按30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，摘眼球取血，不抗凝，颈椎脱臼处死大鼠。血样3000r/min，离心15min，分离血清，取1ml，冰箱中4℃保存待测。在每只大鼠肝脏同一部位取1g肝脏，放入液氮中速冻，之后放入-60℃冰箱中保存，用时取出制成10％的肝匀浆。采用全自动生化分析仪，检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、肝匀浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)；按试剂盒测定血清与肝匀浆丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活力。

比较各组HDL-C/TC，动脉硬化指数(AI)：AI＝(TC-HDL-C)/HDL-C。

3.4实验结果：

由表1可知，12周后，血清TC、TG、LDL-C三项指标，高脂模型组均显著高于空白对照组(p＜0.01)；表明所造的高脂模型成功。与高脂模型组相比：石榴籽油大剂量组使血清LDL-C指标下降，有显著性差异(p＜0.05)，其它几项无显著性差异(p＞0.05)；石榴籽油小剂量组使血清TC、TG、LDL-C三项指标均下降，有极显著性差异(p＜0.01)；辛伐他汀组的TC、TG、LDL-C三项指标均下降，有极显著性差异(p＜0.01)。

              表1  各组大鼠血脂含量的比较(mmol/L)

组别	TC	TG	LDL-C	HDL-C
					空白对照组高脂模型组大剂量组小剂量组辛伐他汀组	1.216±0.2851.814±0.320*1.569±0.3641.320±0.302△△1.521±0.166△	0.259±0.1680.332±0.092*0.276±0.0760.219±0.075△0.223±0.075△	0.199±0.0190.515±0.125*0.363±0.133△0.323±0.076△△0.380±0.081△	1.160±0.3411.429±0.1681.490±0.3671.267±0.2371.370±0.168

注：与空白对照组比较：^*P＜0.05；^**：P＜0.01；

与高脂模型组比较：^△P＜0.05；^△△：P＜0.01

由表2可知，与空白对照组比较，高脂模型组HDL-C/TC下降，而AI升高，均有显著性差异(P＜0.05)。与高脂模型组比较，石榴油大、小剂量组能使血清中HDL-C/TC升高(P＜0.01)，而AI下降(P＜0.05)。

         表2  各组大鼠HDL-C/TC、AI的比较

分组	HDL-C/TC	AI
			空白对照组	0.942±0.074	0.067±0.086

高脂模型组大剂量组小剂量组辛伐他汀组

0.797±0.074*0.955±0.117△△0.945±0.058△△0.903±0.089△

0.264±0.122**0.163±0.152△0.139±0.884△0.117±0.114△

注：与空白对照组比较：^*P＜0.05；^**：P＜0.01；

    与高脂模型组比较：^△P＜0.05；^△△：P＜0.01

由表3可知，高脂模型组肝脏TC、TG显著高于空白对照组(P＜0.05)。与高脂模型组比较：小剂量组、辛伐他汀组使TC下降(P＜0.05)；而小剂量组TG无显著差异；大剂量组TC、TG均无显著性差异。

           表3  各组大鼠肝脏TC、TG的比较(mmol/L)

分组	TC	TG
			空白对照组高脂模型组大剂量组小剂量组辛伐他汀组	3.204±0.1513.400±0.190*3.298±0.1183.231±0.084△3.225±0.125△	1.929±0.3172.344±0.278*2.259±0.1152.167±0.0991.931±0.223△△

注：与空白对照组比较：^*P＜0.05；^**：P＜0.01；

    与高脂模型组比较：^△P＜0.05；^△△：P＜0.01

由表4可知，高脂模型组血清与肝脏MDA均高于空白对照组，而SOD活力均降低，有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。与高脂模型组比较，石榴油大剂量组能使血清中SOD活力显著增加(P＜0.05)，其它无显著性差异；石榴油小剂量组与辛伐他汀组均能降低血清与肝脏中MDA的含量(P＜0.05，P＜0.01)，显著升高血清SOD活力(P＜0.01)。石榴油小剂量组与辛伐他汀组比较无显著性差异。

         表4  各组大鼠血清与肝脏MDA、SOD的比较

分组	血清		肝脏
					MDA(nmol/1)	SOD(U/ml)	MDA(nmol/g)	SOD(U/mg)
	空白对照组高脂模型组石榴油大剂量组石榴油小剂量组辛伐他汀组	0.46±0.150.62±0.16*0.59±0.160.51±0.62△0.48±0.11△	17403±19.74105.49±41.31**153.99±48.25△165.48±42.71△△171.81±29.73△△	64.21±4.43116.24±3.19**112.17±3.87104.05±6.17△△105.22±8.02△△					240.66±28.40203.19±39.79*191.10±29.64220.83±24.96210.74±16.18

注：与空白对照组比较：^*P＜0.05；^**：P＜0.01；

    与高脂模型组比较：^△P＜0.05；^△△：P＜0.01

4.预防肿瘤试验：

4.1MTT试验：选用EMT6乳腺癌细胞株，于10％胎牛血清RPMI1640完全培养液中培养至对数生长期，胰酶消化处理后制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个·ml^-1，按每孔100μl接种于96孔培养板，24h后吸弃上清，加入不同浓度药物培养液，作用24h。另配制2.5g·L^-1的噻唑蓝，用完全培养液调整噻唑蓝浓度，按每孔100μl、试药终浓度为0.1、，0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8mg·L^-1，加入上述培养孔中，继续培养4h，吸弃上清，再加入150μl二甲基甲砜，作用3min后，在酶联检测仪上测定490nm时的吸光度值(A)，计算细胞存活率[公式：细胞存活率＝(实验组A值/对照组A值)×100％]。结果表明：石榴籽油对体外培养的EMT6细胞株有一定的杀灭作用。

4.2体内抑瘤试验：分别取传代6～7d的EMT6带瘤小鼠，无菌抽取腹水，0.05％台盼兰染色镜检细胞活力在95％以上。以灭菌生理盐水分别稀释瘤液至6×10⁷个·ml^-1的细胞悬液，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml，随机分组并开始灌胃(ig)给药(5-Fu为腹腔注射ip)，实验分组：阳性对照组(5-Fu)、石榴籽油20、40、80mg·kg^-1剂量治疗组及NS对照组。观察指标：称量给药(12d)前后体重、瘤重。试验结果表明：石榴籽油给药12d，对EMT6瘤株的在小鼠体内的增殖有抑瘤作用，瘤重均低于生理盐水组。

4.3实验结果评价：本发明的石榴籽油，安全无毒副作用，可加工制备作为抗氧化(体内、体外)、防衰老、抗高血脂症、动脉硬化的保健食品和药品。此外，还有防治乳腺癌的作用。

所述石榴籽油还可继续加工成胶囊、片剂、丸剂等药品及保健品，并具有抗体内外氧化，抗高脂血症，抗动脉硬化以及预防肿瘤等方面的保健和医药作用。

具体实施方式

实施例1：

100g石榴籽洗净通风干燥，粉碎，石榴籽粉放入500ml圆底烧瓶中，加入120ml石油醚，将烧瓶放人微波炉中，功率320w，间歇处理210s(辐射3次，每次70s)，取出用抽滤瓶过滤。滤液用真空旋转蒸发仪回收：真空度-0.02Mpa，温度30℃。回收石油醚并得到石榴籽油11g，气相色谱检测：石榴酸66.6％；10.0％的亚油酸，9.5％的硬脂酸，4.7％的棕榈酸，9.2％的油酸。

实施例2：

100g石榴籽洗净通风干燥，粉碎，石榴籽粉放入500ml圆底烧瓶中，加入300ml正己烷，将烧瓶放人微波炉中，调功率160w，间歇辐射250s(辐射5次，每次50s)，取出用抽滤瓶过滤。滤液用真空旋转蒸发仪回收：真空度-0.05Mpa，温度45℃。石油醚回收并得到石榴籽油12.5g。气相色谱检测：石榴酸71％；10％的亚油酸，7.5％的硬脂酸，4.5％的棕榈酸，7.0％的油酸。

实施例3：

100g石榴籽洗净通风干燥，粉碎，石榴籽粉放入500ml圆底烧瓶中，加入420ml乙醚将烧瓶放人微波炉中，调功率600w，间歇辐射90s(辐射8次，每次30s)，取出用抽滤瓶过滤。滤液用真空旋转蒸发仪回收：真空度-0.08Mpa，温度40℃。石油醚回收并得到石榴籽油11.6g。气相色谱检测：石榴酸65.5％；9.7％的亚油酸，10.0％的硬脂酸，5.0％的棕榈酸，9.8％的油酸。

实施例4：

取100克石榴籽粉置于超声瓶中，加入0.6L正己烷浸泡2小时，超声提取的频率为20kHz，超声强度2W/cm²，提取温度40℃，萃取1小时。抽滤，滤液减压浓缩得淡黄色的石榴籽油12.4g。气相色谱检测：石榴酸74.4％；8.3％的亚油酸，7.5％的硬脂酸，3.5％的棕榈酸，6.3％的油酸。

实施例5：

取100克石榴籽粉进行CO₂超临界萃取，萃取温度40℃，萃取压力为28Mpa，萃取时间2h，CO₂流量10L/h，分离釜I压力9Mpa，温度50℃，分离釜II压力6Mpa，温度50℃，得淡黄色的石榴籽油12.6g。气相色谱检测：石榴酸75.8％；9.2％的亚油酸，6.3％的硬脂酸，3.2％的棕榈酸，5.5％的油酸。

实施例6：

取实施例四所得的石榴油10克，加入无水乙醇10ml，充分混匀，-15℃净置8小时，抽滤脱蜡，滤液减压回收乙醇，得石榴籽精油8.5克。气相色谱检测：石榴酸95.0％；1.0％的亚油酸，1.0％的硬脂酸，2.0％的棕榈酸，1.0％的油酸。

Claims (9)

1、一种石榴籽提取物，以石榴籽为原料经提取分离制备所得，含有重量比为65～95％的石榴酸，1～10％的亚油酸，1～10％的硬脂酸，2～5％的棕榈酸，1～10％的油酸。

2、如权利要求1所述的石榴籽提取物，其特征是其含有重量比85～95％的石榴酸，1～5％的亚油酸，1～3％的硬脂酸，2～3％的棕榈酸，1～4％的油酸，成为石榴籽精油。

3、权利要求1所述的石榴籽提取物制备方法，其步骤依次为：石榴籽洗净干燥、破碎、提取分离，得到石榴籽提取物；提取分离采用有机溶剂浸提法、微波有机溶剂提取法、超声有机溶剂提取法或者超临界萃取法中的一种。

4、如权利要求3所述的石榴籽提取物制备方法，其特征是：

(1)采用微波有机溶剂提取法时，将粉碎后的石榴籽粉加入有机溶剂，放入微波炉，微波炉功率160～600w，处理次数3～8次，每次30～80s；过滤，收集提取液，真空蒸发回收有机溶剂，得石榴籽油；；

(2)采用超声有机溶剂提取法时，粉碎后的石榴籽粉用有机溶剂浸泡0～6小时，置于超声萃取瓶中，超声频率20～800kHz，超声强度0.3～15W/cm2，石榴籽粉与溶剂的重量体积比为1∶2～20，提取温度20～80℃，萃取0.5～3小时，超声提取后的提取液经过离心或抽滤后，真空蒸发回收有机溶剂，得石榴籽油；

(3)采用超临界萃取法时，粉碎后的石榴籽粉加入到超临界萃取室，抽提压力为10～30Mpa，萃取温度为32～45℃，萃取时间1～6小时，CO₂流量10～40L/h；所得浅黄色油状液体即为石榴籽油；

(4)采用有机溶剂浸提法时，粉碎后的石榴籽粉用有机溶剂浸泡，加热使溶剂微沸，回流1～3小时，过滤，滤渣再加溶剂重复提取一次，过滤，合并滤液，真空蒸发回收有机溶剂，得石榴籽油。

5、如权利要求4所述的石榴籽提取物制备方法，其特征在于所用有机溶剂为正丁烷、正己烷、环己烷、正庚烷、正戊烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮中的一种或两种的混合溶剂，固液比为1∶2～1∶7；含石榴籽油的提取液采用真空浓缩回收有机溶剂时，其真空度为-0.02～-0.08Mpa，温度为30～85℃。

6、如权利要求5所述的石榴籽提取物制备方法，其特征在于得到石榴籽油提取物后，将其与等量的无水乙醇混合，在-10℃～-80℃的低温下静置5～15小时后，抽滤，滤液真空减压回收乙醇，得石榴籽精油。

7、权利要求1或2所述的石榴籽提取物在制备体内外抗氧化的药品或保健食品中的应用。

8、权利要求1或2所述的石榴籽提取物在制备抗高脂血症的药品或保健食品中的应用。

9、权利要求1或2所述的石榴籽提取物在制备抑制肿瘤的药品或保健食品中的应用。