CN108623655B - 改善胰岛素抵抗的二肽el及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改善胰岛素抵抗的二肽EL，该二肽EL的氨基酸序列为：Glu‑Leu。本发明还同时公开了上述二肽EL在制备降血糖功能药物中的应用；其能制备具有改善胰岛素抵抗功能的降血糖药物，即，制备可显著促进胰岛素抵抗的HepG2细胞对葡萄糖消耗以及糖原合成、改善胰岛素抵抗、达到降血糖效果的药物。

Description

改善胰岛素抵抗的二肽EL及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及具有降血糖功能的二肽EL及其用途。
背景技术
糖尿病是一种严重危害人类健康的常见病和多发病。根据国际糖尿病联盟(IDF)最新报告显示，2017年全球糖尿病患者达4.25亿，预计到2045年，糖尿病患者将达6.29亿。我国是糖尿病患者人数最多的国家，患者数量达1.343亿，患病率为10.9％。其中，2型糖尿病占糖尿病的90％-95％，目前其治疗仍以药物治疗为主，主要有阿卡波糖、伏格列波糖、瑞格列奈、那格列奈、格列美脲、二甲双胍、噻唑烷二酮类等,这些药物虽能较好地控制血糖，但长期服用易产生耐药性，伴随许多不良反应和副作用，且无法有效改善胰岛素抵抗。因此，探寻一种降血糖活性好，安全性高，并且能有效改善胰岛素抵抗的的天然产物具有重要的意义。
胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要发病机制之一，改善胰岛素抵抗是发展新型药物治疗2型糖尿病的重要战略。目前已有大量研究报道从动植物中发现具有降血糖作用的天然产物，如多糖类物质、酚类化合物等植物提取物、动植物蛋白水解物等。生物活性肽是源于蛋白质的多功能化合物，在生命活动中起着重要的调节作用，它比原料蛋白具有更优异的理化特性、营养特性和生物学活性，食用安全性极高。已有研究报道从天然产物中发现具有降血糖作用的多肽类物质，如从大马哈鱼、苦瓜、灵芝、玉米、癞葡萄及蜂蛹蛋白水解物中均发现具有降血糖活性的多肽。现有报道的降血糖多肽大多为蛋白水解混合物，较少涉及具体单一多肽从改善胰岛素抵抗途径达到降血糖的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种改善胰岛素抵抗的二肽EL及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种改善胰岛素抵抗的二肽EL，该二肽EL的氨基酸序列为：Glu-Leu。
本发明还同时提供了上述二肽EL在制备降血糖药物中的应用。
作为本发明的二肽EL的应用的改进：制备具有改善胰岛素抵抗功能的降血糖药物。即，制备可显著促进胰岛素抵抗的HepG2细胞对葡萄糖消耗以及糖原合成，改善胰岛素抵抗，达到降血糖效果的药物。
本发明的二肽EL可通过委托吉尔生化(上海)有限公司合成获得。
本发明所设计的二肽是针对促进胰岛素抵抗的HepG2细胞对葡萄糖的消耗，以及促进细胞内糖原的合成，从而表现出具有降血糖功能的特性。
本发明中所涉及的各项试验方法具体如下：
1、HepG2细胞的培养
HepG2细胞复苏后用含10％灭活胎牛血清的DMEM高糖(葡萄糖浓度为4500mg/L)培养液转入细胞培养瓶中，37℃、5％CO2条件下培养。当细胞贴壁长满后，弃去培养液，用PBS溶液轻轻洗涤2次，用0.25％胰蛋白酶消化，每3天按1：3比例传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。
2、胰岛素抵抗HepG2细胞模型的建立
将处于对数生长期的HepG2细胞消化后，用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液调整为细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL细胞悬液。待细胞单层贴壁后，更换含有胰岛素浓度为5×10-7mol/L的DMEM高糖培养液，于37℃、5％CO2条件下培养箱中孵育24h，建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型。
3、葡萄糖消耗实验
试验设置空白组(不接种细胞)、对照组(正常HepG2细胞)、胰岛素抵抗模型组、阳性药物对照组(二甲双胍)和肽实验组(EL)。除空白组外，其他组于5×104个/mL的细胞密度接种于96孔板，每组设4个复孔；对照组采用的是正常HepG2细胞；而胰岛素抵抗模型组、阳性药物对照组和肽实验组采用的均是胰岛素抵抗HepG2细胞；空白组、对照组和胰岛素抵抗模型组各加入培养液200μL/孔，阳性药物对照组加入二甲双胍溶液(10mmol/L，由培养液配制)200μL/孔，肽实验组加入EL溶液(1.0mg/mL，由培养液配制)200μL/孔。孵育48h后，用葡萄糖临床检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，F006)测定培养基上清液的葡萄糖含量。先将检测试剂盒中的R1和R2溶液1:1混合，配置成工作液，并配置以下试剂管：
空白管：取5μL超纯水，加入1mL工作液。
校准管：取5μL葡萄糖标准溶液(5.55mmol/L)，加入1mL工作液。
样本管：取5μL的细胞上清液，加入1mL工作液。
空白管，校准管和样本管置于37℃水浴锅中加热15min使其显色。在波长为505nm处，以空白管调零，读取校准管和样本管的吸光度值(A)。样本管的葡萄糖浓度可以通过以下公式得到：C样本＝A样本/A校准×校准管浓度。计算48h葡萄糖消耗量(GC，mmol/L)，葡萄糖消耗量(GC)＝未接种细胞培养液中葡萄糖含量—各组细胞上清液中葡萄糖含量。
4、糖原测定试验
利用糖原检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，A043)测定各组HepG2细胞内糖原含量，反应体系实验步骤如下，反应中各种组分的加入量如表1，混匀后置沸水中煮5min，冷却后于620nm波长，1反cm光径，空白管调零，测定各管OD值。
表1反应体系组成成分
Figure BDA0001660496390000031
备注说明：
糖原检测液为对照组、胰岛素抵抗模型组、阳性药物对照组和肽实验组HepG2细胞(为取完用于葡萄糖检测上清液的剩余部分)，加入碱液0.75mL(0.2mol/L的NaOH溶液)，加入试管中，沸水浴煮20min，流水冷却。
实验结果的计算
糖原含量(mg/g)＝测定OD值/标准OD值×标准管含量(0.01mg)×样本测试前稀释倍数×10×1.11；式中，10为测试过程中的稀释倍数，1.11为葡萄糖含量换算成糖原含量的系数。
本发明的优点和积极效果：
(1)该二肽分子可以促进胰岛素抵抗HepG2细胞对葡萄糖的消耗。
(2)本发明的二肽分子可以促进胰岛素抵抗HepG2细胞内糖原的合成。
依据本发明所述的氨基酸序列，可委托吉尔生化(上海)有限公司合成，从而获得本发明所述的降血糖肽(或简称为二肽EL)。
本发明的降血糖肽(或简称为二肽EL)的用法和用量如下：
本发明的二肽为口服型，用量为口服，每次500mg，每日2～3次。
综上所述，本发明二肽EL(Glu-Leu)能改善胰岛素抵抗，促进胰岛素抵抗的HepG2细胞对葡萄糖的消耗，以及促进细胞内糖原的合成，达到降血糖的效果的生物活性肽。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1)二肽EL在1.0mg/mL的浓度下的降血糖活性：
检测方法：将通过化学合成法获得的二肽EL，配制成1.0mg/mL进行葡萄糖消耗检测(检测方法同上)。
结果：二肽EL在浓度1.0mg/mL时针对胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量为9.186mmol/L，胰岛素抵抗模型组HepG2细胞(未添加二肽EL)的葡萄糖消耗量为6.759mmol/L，与之相比，二肽EL促进葡萄糖消耗量提高35.9％。对照组(正常HepG2细胞)葡萄糖消耗量为8.196mmol/L，阳性药物对照组(二甲双胍)葡萄糖消耗量为9.477mmol/L。
2)二肽EL在1.0mg/mL的浓度下的降血糖活性：
检测方法：将通过化学合成法获得的此二肽EL，配制成1.0mg/mL进行糖原合成含量检测(检测方法同上)。
结果：二肽EL在浓度1.0mg/mL时针对胰岛素抵抗HepG2细胞的糖原合成含量为1.019mg，胰岛素抵抗模型组HepG2细胞(未添加二肽EL)的糖原合成含量为0.619mg，与之相比，二肽EL促进糖原合成量提高47.0％。对照组(正常HepG2细胞)糖原合成量为0.933mg，阳性药物对照组(二甲双胍)糖原合成量为1.127mg。
通过实施例1中的数据，说明此二肽EL可显著促进胰岛素抵抗HepG2细胞对葡萄糖的消耗以及糖原的合成，达到改善胰岛素抵抗和降血糖的效果，关于此二肽结构具有降血糖活性目前尚未见报道，属于新的具有降血糖活性的功能肽。
对比实验、将目前现有的已知也具有降血糖功能的二肽IF、GW、GT、DI、QN进行葡萄糖消耗检测和糖原合成含量检测(检测方法同上)；上述二肽的浓度均设置为1.0mg/mL，结果显示：相对于“二肽EL促进葡萄糖消耗量提高35.9％”，上述二肽不能体现促进葡萄糖消耗量的提高，即，提高量仅为0～5％。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，比如不同蛋白质来源降解分离所得的EL结构及其衍生化结构。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 改善胰岛素抵抗的二肽EL及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Leu
1

Claims (3)

1.二肽EL在制备降血糖功能药物中的应用，其特征是该二肽EL的氨基酸序列为：Glu-Leu。
2.根据权利要求1所述的二肽EL的应用，其特征是：制备具有改善胰岛素抵抗功能的降血糖药物。
3.根据权利要求2所述的二肽EL的应用，其特征是：制备促进胰岛素抵抗的HepG2细胞对葡萄糖消耗以及糖原合成，改善胰岛素抵抗，达到降血糖效果的药物。
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