BR112020004136A2 - fator de crescimento de fibroblastos modificado 21 (fgf-21) para uso nos métodos de tratamento de esteato-hepatite não alcoólica (nash) - Google Patents

fator de crescimento de fibroblastos modificado 21 (fgf-21) para uso nos métodos de tratamento de esteato-hepatite não alcoólica (nash) Download PDF

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Bristol-Myers Squibb Company
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Abstract

a presente invenção se refere a métodos para o tratamento de um paciente tendo nash que foi determinado para ter um nível limite particular de pro-c3 no soro (por exemplo, maior do que 10 ng/ml), através da administração ao paciente de um fator de crescimento de fibroblastos modificado 21 (fgf-21) em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a nash. também são for-necidos métodos para o monitoramento da receptividade de um paciente tendo nash ao tratamento com um fgf-21 modificado, o método compreendendo: determinar o nível de pro-c3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tratamento, em que: uma diminuição do nível de pro-c3 no soro na amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tratamento, em comparação com o nível de pro-c3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o fgf-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o fgf-21 modificado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FATOR DE CRESCIMENTO DE FIBROBLASTOS MODIFICADO 21 (FGF-21) PARA USO NOS MÉTODOS DE TRATAMENTO DE ESTEATO- HEPATITE NÃO ALCOÓLICA (NASH)".
PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade dos Pedi- dos Provisórios U.S. Nos. 62/556.179 (depositado em 08 de setembro de 2017), 62/571.960 (depositado em 13 de outubro de 2017) e 62/640.211 (depositado em 08 de março de 2018). Os conteúdos dos pedidos acima mencionados são aqui incorporados por referência na sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentado eletronicamente no formato ASCII e é aqui incor- porada por referência na sua totalidade. Dita cópia ASCII, criada em 21 de agosto de 2018, é denominada MXI-609PC_SL.txt e possui
3.971 bytes de tamanho.
ANTECEDENTES
[0003] A doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) tor- nou-se uma das principais doenças que afligem a nação e o mundo. Nos Estados Unidos, a NAFLD é a causa mais comum de doença he- pática, representando mais de 75% da doença hepática crônica (ver, por exemplo, Younossi ZM, et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2011;9:524–530). Também é uma das indicações mais comuns para transplante de fígado, contribuindo com um grande ônus tanto para a morbidez quanto para a mortalidade da nação.
[0004] O espectro de NAFLD é uma sequência contínua que varia de esteatose simples a esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e, final- mente, cirrose. A característica definidora da doença é a presença de deposição lipídica maior do que o normal dentro do fígado, com a au-
sência de consumo excessivo de álcool definido como > 20 g/d para homens e 10 g/d para mulheres. A esteatose é a presença de lipídio dentro do citoplasma dos hepatócitos, cujo critério é definido na litera- tura como sendo níveis lipídicos hepáticos acima do percentil 95 para indivíduos saudáveis (ao redor de > 55 mg/g de fígado) (ver Cohen JC, et al., Science. 2011;332:1519–1523), maior do que 5% do peso do fígado (ver Kareem Hassan, et al., World J. Gastroenterol. 2014 Sep 14; 20(34): 12082–12101), ou encontrado em mais do que 5% dos he- patócitos histologicamente (ver Neuschwander-Tetri BA, Am. J. Med. Sci. 2005;330:326–335).
[0005] A progressão da esteatose em NASH é um cenário clínico frequentemente encontrado, associado aos piores resultados para os pacientes. Uma característica de definição chave da NASH é a pre- sença de inflamação e subsequente fibrose. Especificamente, a NASH é definida como esteatose na presença de danos nos hepatócitos, in- flamação e/ou subsequente cicatrização e substituição do tecido com colágeno tipo I. Aproximadamente de 10% a 29% dos pacientes com NASH irão desenvolver cirrose dentro de um período de 10 anos (Argo CK, et al., Clin. Liver Dis. 2009;13:511–531). A NASH também pode levar ao câncer de fígado. Atualmente, nenhuma terapia farmacológica é aprovada para o tratamento da NASH (ver Susanne Schuster and Ariel E. Feldstein, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 14, 329–330 (05 April 2017).
[0006] Em conformidade, a seguinte divulgação fornece um novo método de tratamento da NASH utilizando um FGF-21 modificado, cri- térios que levam em conta a otimização do tratamento e métodos para monitorar a progressão e a redução da NASH.
SUMÁRIO
[0007] São fornecidos nesta invenção métodos para o tratamento de um paciente tendo NASH, mediante a administração ao paciente de um fator de crescimento de fibroblastos modificado 21 (FGF-21) se o paciente tiver um nível limiar sérico específico (por exemplo, maior do que 10 ng/ML, 15 ng/ML ou 20 ng/ML) do biomarcador, Pro-C3.
[0008] Em uma modalidade, um método para o tratamento de um paciente tendo NASH é fornecido, o método compreendendo: (a) de- terminar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do pa- ciente e (b) administrar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar NASH, se o nível de Pro-C3 no soro antes da administração ao paciente do FGF- 21 modificado for maior do que cerca de 10 ng/ML.
[0009] Em outra modalidade, um método para o tratamento de um paciente tendo NASH que foi determinado de ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 10 ng/ML é fornecido, o método com- preendendo a administração ao paciente de um FGF-21 modificado em uma quantidade e com frequência suficiente para tratar NASH.
[0010] Em outra modalidade, um método para o tratamento de um paciente com NASH com FGF-21 modificado é fornecido, em que o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro maior do que 10 ng/ML antes do tratamento, em que o método compreende a administração ao paciente de um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH.
[0011] Em outra modalidade, é fornecido um método para tratar um paciente com NASH, em que o método compreende: (1) obter ou ter obtido uma amostra de sangue do paciente, (2) determinar ou ter determinado um nível de Pro-C3 no soro na amostra de sangue que é maior do que 10 ng/ML e (3) administrar ao paciente um FGF-21 modi- ficado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH após um nível de Pro-C3 no soro ter sido a determinado.
[0012] Também são fornecidos métodos para monitorar a recepti- vidade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado, o método compreendendo: determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tratamento, em que: uma diminuição do nível de Pro-C3 no so- ro na amostra de sangue do paciente obtido durante ou após o trata- mento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amos- tra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado.
[0013] Em uma modalidade, o paciente tendo NASH foi determi- nado de ter ou está determinado a ter um nível limite particular de Pro- C3 que justifica o tratamento com um FGF-21 modificado. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 10 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 11 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 12 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 13 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 14 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 15 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 16 ng/ML. Em uma moda- lidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 17 ng/ ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 18 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 19 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 20 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 21 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 22 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 23 ng/ML. Em uma moda- lidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 24 ng/ML. Em uma modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro que é maior do que 25 ng/ML.
[0014] Em outra modalidade, o paciente possui um nível de Pro- C3 no soro entre 10 ng/ML e 25 ng/ML. Em outra modalidade, o paci- ente possui um nível de Pro-C3 no soro entre 10 ng/ML e 20 ng/ML. Em outra modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro entre 10 ng/ML e 15 ng/ML. EM outra modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro entre 12 ng/ML e 20 ng/ML. Em outra mo- dalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro entre 12 ng/ML e 15 ng/ML. Em outra modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro entre 15 ng/ML e 25 ng/ML. Em outra modalidade, o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro entre 15 ng/ML e 20 ng/ML.
[0015] Os níveis de expressão de Pro-C3 podem ser medidos através da quantificação dos níveis de proteína e/ou RNA em uma amostra biológica do paciente (por exemplo, sangue ou uma fração sanguínea) utilizando qualquer técnica adequada. Em uma modalida- de, os níveis de expressão são medidos pela quantificação dos níveis de proteína e/ou RNA, utilizando pelo menos um de um imunoensaio, ensaio de imunoquímica, ensaio de imuno-histoquímica, ensaio de sondas do núcleo, hibridização in situ, sondas de RNA fluorescentes, RT-PCR, ensaio de transcrição de microarranjos e/ou ensaio de trans- crição de RNA. Em outra modalidade, os níveis de expressão são me- didos usando um imunoensaio (por exemplo, um ensaio imunoabsor- vente ligado a enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA)), por exemplo, o ELISA descrito em Nielsen et al., Am J Transl Res 2013;5(3):303-315. O nível ou níveis do Pro-C3 podem ser medidos por um teste aprovado pela FDA.
[0016] Qualquer FGF-21 modificado adequado pode ser utilizado no método aqui descrito. Em uma modalidade, o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que um aminoá- cido no polipeptídeo é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmen- te está em uma posição que corresponde ao resíduo 108 da SEQ ID NO: 1; (b) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina ligada a um polímero que compreende um po- li(etileno glicol). Em outra modalidade, o poli(etileno glicol) possui um peso molecular médio de cerca de 30 kDa. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, ex- ceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito ami- noácido não codificado de maneira natural compreende para-acetil fe- nilalanina e (b) dito aminoácido não codificado naturalmente está liga- do a um polímero que compreende um poli(etileno glicol) tendo um pe- so molecular médio de cerca de 30 kDa. Em outra modalidade, o ami- noácido não codificado naturalmente está ligado ao referido polímero através de uma ligação de oxima. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado compreende a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a para-acetil fenilalanina na SEQ ID NO: 2 está ligada a um polímero que compreende um poli(etileno glicol). Em certa modalidade, o po- li(etileno glicol) possui um peso molecular médio de cerca de 30 kDa.
[0017] Em outra modalidade, um método para o tratamento de um paciente tendo NASH é fornecido, compreendendo: (a) determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente e (b) administrar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, se o nível de Pro- C3 no soro antes da administração ao paciente de um FGF-21 modifi- cado for maior do que cerca de 10 ng/ML (por exemplo, maior do que cerca de 11 ng/ML, cerca de 12 ng/ML, cerca de 13 ng/ML, cerca de 14 ng/ML, cerca de 15 ng/ML, cerca de 16 ng/ML, cerca de 17 ng/ML, cerca de 18 ng/ML, cerca de 18 ng/ML, cerca de 19 ng/ML, cerca de 19 ng/ML, cerca de 20 ng/ML, cerca de 21 ng/ML, cerca de 22 ng/ML, cerca de 23 ng/ML, cerca de 24 ng/ML ou cerca de 25 ng/ML), em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que um o aminoácido no polipeptídeo é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente está em uma posição que corresponde ao resíduo 108 da SEQ ID NO: 1; e (b) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina ligada a um polímero que compreende um poli(etileno glicol).
[0018] Em outra modalidade, é fornecido um método para o trata- mento de um paciente tendo NASH, compreendendo: (a) determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente e (b) administrar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, se o nível de Pro- C3 no soro antes da administração ao paciente de um FGF-21 modifi- cado for maior do que cerca de 10 ng/ML (por exemplo, maior do que cerca de 11 ng/ML, cerca de 12 ng/ML, cerca de 13 ng/ML, cerca de 14 ng/ML, cerca de 15 ng/ML, cerca de 16 ng/ML, cerca de 17 ng/ML, cerca de 18 ng/ML, cerca de 19 ng/ML, cerca de 20 ng/ML, cerca de 21 ng/ML, cerca de 22 ng/ML, cerca de 23 ng/ML, cerca de 24 ng/ML ou cerca de 25 ng/ML), em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmen- te compreende para-acetil fenilalanina e (b) dito aminoácido não codi- ficado naturalmente ácido está ligado a um polímero que compreende um poli(etileno glicol) tendo um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
[0019] Em outra modalidade, um método para tratar um paciente tendo NASH é fornecido, que compreende: (a) determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente e (b) adminis- trar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, se o nível de Pro-C3 no soro antes da administração ao paciente de um FGF-21 modificado for maior do que cerca de 10 ng/ML (por exemplo, maior do que cerca de 11 ng/ML, cerca de 12 ng/ML, cerca de 13 ng/ML, cerca de 14 ng/ML, cerca de 15 ng/ML, cerca de 16 ng/ML, cerca de 17 ng/ML, cerca de 18 ng/ML, cerca de 19 ng/ML, cerca de 20 ng/ML, cerca de 21 ng/ML, cerca de 22 ng/ML, cerca de 23 ng/ML, cerca de 24 ng/ML ou cerca de 25 ng/ML), em que o FGF-21 modificado consiste em ou compreende a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a para-acetil fenilalanina na SEQ ID NO: 2 está ligada a um polímero que compreende um po- li(etileno glicol). Em algumas modalidades, o poli(etileno glicol) possui um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
[0020] Em outra modalidade, um método para o tratamento de um paciente tendo NASH que foi determinado de ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 10 ng/ML é fornecido, o método com- preendendo a administração ao paciente de um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar NASH, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, exceto que um aminoácido no polipeptídeo é substituí- do por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente está em uma posição que corresponde ao resíduo 108 da SEQ ID NO: 1; e (b) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina liga- do a um polímero que compreende um poli(etileno glicol).
[0021] Em outra modalidade, é fornecido um método para o trata-
mento de um paciente tendo NASH que foi determinado de ter um ní- vel de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 10 ng/ML, o método compreendendo a administração ao paciente de um FGF-21 modifica- do em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina e (b) dito aminoácido não codificado natural- mente está ligado a um polímero que compreende um poli(etileno gli- col) tendo um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
[0022] Em outra modalidade, é fornecido um método para o trata- mento de um paciente tendo NASH que foi determinado de ter um ní- vel de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 10 ng/ML, o método compreendendo a administração ao paciente de um FGF-21 modifica- do em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, em que o FGF-21 modificado consiste ou compreende SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a para-acetil fenilalanina na SEQ ID NO: 2 está ligada a um polímero que compreende um polietileno gli- col). Em algumas modalidades, o poli(etileno glicol) possui um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
[0023] Em algumas modalidades aqui descritas, o paciente tendo NASH foi determinado de ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 11 ng/ML, cerca de 12 ng/ML, cerca de 13 ng/ML, cerca de 13 ng/ML, cerca de 14 ng/ML, cerca de 15 ng/ML, cerca de 16 ng/ML, cerca de 17 ng/ML, cerca de 18 ng/ML, cerca de 19 ng/ML, cerca de 20 ng/ML, cerca de 21 ng/ML, cerca de 21 ng/ML, cerca de 22 ng/ML, cerca de 23 ng/ML , cerca de 24 ng/ML ou cerca de 25 ng/ML.
[0024] Em outra modalidade, um método para monitorar a recepti- vidade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado é fornecido, o método compreendendo: determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida du- rante ou após o tratamento, em que: um nível de Pro-C3 no soro redu- zido na amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tra- tamento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que um aminoácido no poli- peptídeo é substituído por um aminoácido não codificado naturalmen- te, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente está em uma posição que corresponde ao resíduo 108 da SEQ ID NO: 1; e (b) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina ligada a um polímero que compreende um poli(etileno gli- col).
[0025] Em outra modalidade, é fornecido um método para monito- rar a receptividade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado, o método compreendendo: determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida duran- te ou após o tratamento, em que: um nível de Pro-C3 no soro reduzido na amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tratamen- to, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modifi- cado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina e (b) dito aminoácido não codificado natural- mente está ligado a um polímero que compreende um poli(etileno gli-
col) tendo um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
[0026] Em outra modalidade, um método para monitorar a recepti- vidade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado é fornecido, o método compreendendo: determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida du- rante ou após o tratamento, em que: um nível de Pro-C3 no soro redu- zido na amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tra- tamento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado, em que o FGF-21 modificado consiste ou compreende a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a para-acetil fenilalanina na SEQ ID NO: 2 está ligada a um polímero que compre- ende um poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, o poli(etileno glicol) possui um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
[0027] Em uma modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose fixa. Em uma modalidade, o FGF-21 modificado é admi- nistrado em uma dose diária ou semanal fixa.
[0028] Em uma modalidade, um método para o tratamento de um paciente tendo NASH é fornecido, o método compreendendo adminis- trar ao paciente um FGF-21 modificado em 10 mg uma vez ao dia para tratar a NASH, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptí- deo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado natu- ralmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina e (b) dito aminoácido não codifi- cado naturalmente está ligado a um polímero que compreende um po- li(etileno glicol) tendo um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
[0029] Em uma modalidade, um método para o tratamento de um paciente tendo NASH é fornecido, o método compreendendo adminis-
trar ao paciente um FGF-21 modificado em 20 mg uma vez por sema- na para tratar a NASH, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmen- te compreende para-acetil fenilalanina e (b) dito aminoácido não codi- ficado naturalmente está ligado a um polímero que compreende um poli(etileno glicol) tendo um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
[0030] Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 10 mg uma vez por semana. Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 11 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 12 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 13 mg uma vez por semana. Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 14 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 15 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 16 mg uma vez por semana. Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 17 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 18 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 19 mg uma vez por semana. Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 20 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 21 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 22 mg uma vez por semana. Em outra mo-
dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 23 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 24 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 25 mg uma vez por semana. Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 26 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 27 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 28 mg uma vez por semana. Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 29 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 30 mg uma vez por semana.
[0031] Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose diária fixa. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 5 mg uma vez ao dia. Em ou- tra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 10 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 mo- dificado é administrado em uma dose de cerca de 11 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 12 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 13 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é admi- nistrado em uma dose de cerca de 14 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 15 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 mo- dificado é administrado em uma dose de cerca de 16 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 17 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o
FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 18 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é admi- nistrado em uma dose de cerca de 19 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 20 mg uma vez ao dia.
[0032] O FGF-21 modificado pode ser administrado de acordo com os métodos aqui descritos isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser selecionados a partir de agentes antifibróticos, antagonista de N-caderina, anticorpo anti-N-caderina, antagonista de N-caderina de pequena molécula, fra- gmento de N-caderina antagonístico, agentes anti-inflamatórios, siste- ma de renina-angiotensina (RAS) supressores de agentes hepatopro- tetores, probióticos e ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs). Em al- gumas modalidades, o agente antifibrótico pode ser selecionado a par- tir de nintedanib, pirfenidona, antagonistas de LPA1, antagonistas de receptores de LPA1, análogo de GLP1, tralokinumab (IL-13, AstraZe- neca), vismodegib (antagonista de ouriço, Roche), PRM-151 (pentraxi- na-2, TGF beta-1, Promedior), SAR-156597 (Mab IL-4&IL-13 biespecí- fico, Sanofi), simtuzumab (anticorpo anti-lisil oxidase-tipo 2 (anti- LOXL2), Gilead), CKD-942, PTL- 202 (liberação oral de controle PDE inh./pentoxifilina/NAC, Pacific Ther.), omipalisib (inibidor oral de PI3K/mTOR, GSK), IW-001 (mod. do colágeno bovino tipo V de sol. oral, ImmuneWorks), STX-100 (integrina alfa V/ beta-6 ant., Strome- dix/Biogen), Actimmune (IFN gama), PC-SOD (midismase; inalado, LTT Bio-Pharma / CKD Pharm), lebrikizumab (mAb humanizado com anti-IL-13 SC, Roche), AQX-1125 (ativador SHIP1, Aquinox), CC-539 (inibidor de JNK, Celgene), FG-3019 (FibroGen) e SAR-100842 (Sa- nofi). Em algumas modalidades, o agente hepatoprotetor pode ser áci- do ursodesoxicólico (UDCA) ou ácido obeticólico (OCA ou INT-747,
Intercept).
[0033] Em uma modalidade, o FGF-21 modificado é administrado no primeiro momento e os um ou mais agentes ativos adicionais são administrados no segundo tempo. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes ativos adicionais são administrados no primeiro momen- to e o FGF-21 modificado é administrado no segundo momento.
[0034] Em uma modalidade, os métodos de tratamento aqui des- critos resultam em uma diminuição nos níveis de Pro-C3 em um paci- ente. Em outra modalidade, os métodos de tratamento aqui descritos produzem uma alteração em direção aos níveis normais de Pro-C3 em um paciente. Em outra modalidade, os métodos de tratamento aqui descritos resultam em uma redução na rigidez do fígado em um paci- ente, conforme avaliado por elastografia de ressonância magnética (MRE). Por exemplo, em uma modalidade, o tratamento com um FGF- 21 modificado resulta em uma redução na rigidez hepática do paciente em comparação com a rigidez hepática do paciente antes do tratamen- to, em que a rigidez hepática é avaliada por MRE. Em outra modalida- de, o tratamento com um FGF-21 modificado resulta em uma redução de 15% ou mais (por exemplo, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mais) na rigidez hepática no paciente em comparação com a rigidez hepática do paciente antes do tratamen- to, em que a rigidez hepática é avaliada pela MRE.
[0035] Em outra modalidade, os métodos de tratamento aqui des- critos resultam em uma redução na fração de gordura hepática em um paciente. Por exemplo, em uma modalidade, o tratamento com um FGF-21 modificado resulta em uma redução na fração de gordura he- pática no paciente em comparação com a fração de gordura hepática do paciente antes do tratamento, em que a fração de gordura hepática é como avaliada pela fração de gordura de densidade de prótons esti- mada pela formação de imagem por ressonância magnética (MRI- PDFF). Em outra modalidade, o tratamento com o FGF-21 modificado resulta em uma redução de 30% ou mais (por exemplo, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mais) na fração de gordura hepática no paciente em comparação com a fração de gordura hepáti- ca do paciente antes do tratamento, em que a fração de gordura hepá- tica é avaliada por MRI-PDFF.
[0036] Em outra modalidade, os métodos de tratamento aqui des- critos resultam em uma redução na rigidez do fígado, uma redução na fração de gordura hepática e/ou uma diminuição nos níveis de Pro-C3 no soro em um paciente. Em outra modalidade, o tratamento com um FGF-21 modificado resulta em uma redução na rigidez do fígado no paciente em comparação com a rigidez do fígado no paciente antes do tratamento, e uma diminuição dos níveis de Pro-C3 no soro no pacien- te em comparação com os níveis de Pro-C3 no soro do paciente antes do tratamento, em que a rigidez do fígado é avaliada por MRE e em que o paciente foi determinado de ter um nível de Pro-C3 no soro mai- or do que 10, 15 ou 20 ng/ML antes do tratamento com o FGF-21 mo- dificado.
[0037] Em outra modalidade, os métodos de tratamento aqui des- critos produzem pelo menos um efeito terapêutico em um paciente se- lecionado do grupo que consiste em uma redução ou cessação de fa- diga, indisposição, perda de peso e/ou desconforto abdominal no qua- drante superior direito no paciente.
[0038] Também é aqui fornecido um FGF-21 modificado para uso nos métodos descritos nesta invenção. Em uma modalidade, é forne- cido um FGF-21 modificado para uso em um método de tratamento de
NASH em um paciente, em que o método compreende administrar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma fre- quência suficiente para tratar a NASH, em que o paciente foi determi- nado de ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que 10, 15 ou 20 ng/ML. Em outra modalidade, é fornecido um FGF-21 modificado para uso em um método de monitoramento da receptividade de um pacien- te tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado, em que um nível de Pro-C3 no soro reduzido em uma amostra de sangue do paci- ente obtida durante ou após o tratamento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida an- tes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado.
[0039] Finalmente, métodos para identificar um paciente tendo NASH que é adequado para o tratamento com um FGF-21 modificado são fornecidos, em que os métodos compreendem a determinação de um nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente utilizando um ensaio in vitro, em que o nível de Pro-C3 soro na amos- tra de sangue é maior do que 10, 15 ou 20 ng/ML. Outras característi- cas e vantagens dos métodos de tratamento serão evidentes a partir da seguinte descrição, dos exemplos e das reivindicações. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências men- cionadas nesta invenção são incorporadas por referência na sua tota- lidade.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0040] A Figura 1 é um esquema que mostra a disposição do paci- ente para a experiência.
[0041] As Figuras 2A a 2C representam a alteração na fração de gordura hepática medida por RMI-PDFF na semana 16. A Figura 2A representa a alteração absoluta na fração hepática em pacientes da linha de base na semana 16. A Figura 2B mostra as medidas de RMI-
PDFF de um paciente que experimentou uma redução na fração de gordura hepática após o tratamento com BMS-986036. A Figura 2C representa a porcentagem de pacientes com reduções relativas ≥ 30%, ≥ 20% ou ≥ 10% na fração de gordura hepática.
[0042] As Figuras 3A a 3B representam a alteração na rigidez do fígado em pacientes na semana 16. A Figura 3A mostra a alteração absoluta na rigidez do fígado (MRE) da linha de base na semana 16 e a Figura 3B mostra a porcentagem de pacientes com redução relativa ≥ 15% na rigidez do fígado (MRE) na semana 16.
[0043] A Figura 4 é uma imagem de MRE de um paciente tratado com 20 mg de QW BMS-986036.
[0044] A Figura 5 mostra a alteração percentual na adiponectina da linha de base na semana 16.
[0045] As Figuras 6A a 6B mostram a distribuição de Pro-C3 na linha de base entre pacientes tratados com BMS-986036. A Figura 6A mostra os níveis de Pro-C3 para indivíduos tratados com BMS-
986036. A Figura 6B mostra a frequência dos níveis de Pro-C3.
[0046] As Figuras 7A a 7B mostram a redução de Pro-C3 no soro na semana 16. A Figura 7A mostra a alteração percentual dos níveis de PRO-C3 na linha de base na semana 16. A Figura 7B mostra a porcentagem de pacientes com redução relativa ≥ 15% no PRO-C3 na semana 16. Análises estatísticas inferenciais foram conduzidas post hoc utilizando uma análise modelo de medidas repetidas longitudinais. a O tamanho de amostra para o Pro-C3 no soro foi menor do que a MRI-PDFF devido a algumas amostras não avaliadas na linha de ba- se.
[0047] As Figuras 8A a 8B mostram as alterações nos marcadores de lesão hepática no final do tratamento. A Figura 8A mostra a altera- ção percentual no ALT da linha de base na semana 16. A Figura 8B mostra a alteração percentual no AST da linha de base na semana 16.
O tratamento com QD e QW BMS-986036 foi associado com melhoras da linha de base nos biomarcadores de lesão hepática (n indica o nú- mero de pacientes com dados de ALT/AST no final do tratamento (EOT)).
[0048] As Figuras 9A a 9C mostram a alteração no colesterol LDL (Figura 9A), colesterol HDL (Figura 9B) e triglicerídeos (Figura 9C) a partir da linha de base na semana 16.
[0049] As Figuras 10A a 10C mostram a densidade mineral óssea medida por DXA nas 16 semanas (D112) e 6 meses após o tratamento (D292) no fêmur (Figura 10A), quadril (Figura 10B) e coluna vertebral (Figura 10C).
[0050] As Figuras 11A a 11B mostram a alteração na MRE (Figura 11A) e Pro-C3 (Figura 11B) na semana 16 em pacientes estratificados pelo Pro-C3 da linha de base (≥ = 20 ng/ML e < 20 ng/ML).
[0051] As Figuras 12A a 12D mostram as alterações no Pro-C3 (Figura 12A), ALT (Figura 12B), AST (Figura 12C) e CK-18 (Figura 12D) na semana 16 em pacientes estratificados pela redução na fra- ção de gordura hepática.
[0052] As Figuras 13A a 13C mostram as alterações no Pro-C3 (Figura 13A), HA (Figura 13B) e HDL (Figura 13C) na semana 16 em pacientes estratificados pela redução da rigidez do fígado.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0053] São aqui fornecidos métodos para o tratamento de um pa- ciente tendo NASH mediante a administração ao paciente de um FGF- 21 modificado se o paciente foi determinado de ter um nível limiar soro particular de Pro-C3 (por exemplo, maior do que cerca de 10 ng/ML, maior do que 15 ng/ML, ou maior do que cerca de 17 ng/ML, ou maior do que cerca de 20 ng/ML) antes da administração ao paciente de um FGF-21 modificado, assim como métodos para o monitoramento da receptividade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um
FGF-21 modificado com base nos níveis de Pro-C3 no soro. I. Definições:
[0054] Para que a presente descrição possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são definidos em primeiro lugar. Defini- ções adicionais são apresentadas em toda a descrição detalhada. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e cientí- ficos utilizados nesta invenção possuem o mesmo significado que é comumente entendido por uma pessoa de habilidade prática na técni- ca, e métodos convencionais de imunologia, química de proteínas, bi- oquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia são utiliza- dos.
[0055] Conforme aqui utilizado, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. O uso de "ou" ou "e" significa "e/ou", a não ser que de outra maneira mencionada. Além disso, o uso do termo "inclu- indo", bem como de outras formas, tais como "incluir", "inclui" e "incluí- do", não é limitativo.
[0056] O termo "cerca de" como aqui utilizado, quando se refere a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração tempo- ral e semelhante, abrange variações de até ± 10% do valor especifica- do. Salvo indicação em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, propriedades tais como peso molecular, condições de reação, etc., aqui utilizados, devem ser entendidos como sendo modificados pelo termo "cerca de".
[0057] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "normal", quan- do usado para modificar o termo "indivíduo" ou "pessoa" se refere a um indivíduo ou grupo de indivíduos que não possui/possuem uma doença ou condição particular (por exemplo, NASH) e também não é suspeito de ter ou estar em risco de desenvolver a doença ou condi- ção. O termo "normal" também é aqui utilizado para qualificar um es-
pécime ou amostra biológica (por exemplo, um sangue ou sua fração) isolada de um indivíduo ou pessoa normal ou saudável (ou grupo de tais pessoas), por exemplo, uma "amostra de controle normal" ou "flui- do biológico de controle normal".
[0058] "Polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são utilizados de modo trocável e significam qualquer cadeia ligada ao peptídeo de ami- noácidos, independentemente do comprimento ou modificação pós- translação. As proteínas aqui descritas podem conter ou ser proteínas do tipo selvagem ou podem ser variantes que não possuem mais do que 50 (por exemplo, não mais do que um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50) substitui- ções de aminoácidos conservadoras. As substituições conservadoras normalmente incluem substituições dentro dos seguintes grupos: glici- na e alanina; valina, isoleucina e leucina; ácido aspártico e ácido glu- tâmico; asparagina, glutamina, serina e treonina; lisina, histidina e ar- ginina; e fenilalanina e tirosina.
[0059] Conforme utilizado nesta invenção, a porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácido é definida como a porcenta- gem de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos aminoácidos em uma sequência de referência, após alinhar as se- quências e introduzir espaços, se necessário, para alcançar a porcen- tagem máxima de identidade de sequência. O alinhamento para pro- pósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência pode ser alcançado de várias maneiras dentro da habilidade na técni- ca, por exemplo, utilizando software de computador disponível ao pú- blico tal como o software BLAST. Os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas, podem ser determinados por métodos conhecidos.
[0060] O termo "formulação farmacêutica" ou "composição farma- cêutica" se refere às preparações que são de forma a permitir que a atividade biológica dos ingredientes ativos seja inequivocamente efi- caz, e que não contenha nenhum componente adicional que seja signi- ficativamente tóxico para os indivíduos aos quais a formulação seria administrada.
[0061] Como aqui utilizado, uma composição farmacêutica "aquo- sa" é uma composição adequada para uso farmacêutico, em que o ve- ículo aquoso é água. Uma composição adequada para uso farmacêu- tico pode ser estéril, homogênea e/ou isotônica. As composições far- macêuticas aquosas podem ser preparadas diretamente em uma for- ma aquosa e/ou podem ser reconstituídas a partir de um liofilizado.
[0062] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos utilizados nesta invenção possuem o mesmo signifi- cado que geralmente é entendido por uma pessoa de habilidade práti- ca na técnica à qual esta invenção se refere. Os métodos e materiais preferidos são descritos abaixo, embora métodos e materiais seme- lhantes ou equivalentes àqueles descritos também possam ser utiliza- dos na prática ou no teste dos métodos e composições atualmente di- vulgados. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e ou- tras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade.
[0063] Outras características e vantagens da presente invenção, por exemplo, métodos para o tratamento de NASH em um indivíduo, serão evidentes a partir da seguinte descrição, dos exemplos e das reivindicações.
1. Pro-C3
[0064] Os níveis de Pro-C3 acima de um nível limiar particular (por exemplo, maior do que cerca de 10 ng/ML, maior do que 15 ng/ML ou maior do que 20 ng/ML) podem ser utilizados como um indicador para avaliar se um paciente tendo NASH será responsivo ao tratamento com um FGF-21 modificado (tal como BMS-986036) e/ou para monito- rar a resposta ao tratamento com um FGF-21 modificado.
[0065] O Pro-C3 (também conhecido como "formação de colágeno tipo III verdadeiro") é um marcador da formação de colágeno tipo III verdadeiro. Juntamente com o colágeno tipo I, o colágeno tipo III cons- titui as principais proteínas estruturais do corpo humano, nas quais o colágeno tipo III é crucial para a fibrilogênese do colágeno tipo I, exce- to nos ossos, que consistem quase exclusivamente em colágeno tipo I (ver Bao X, et al., J Genet Genomics. 2007;34:223–228; Jensen LT, et al., Cardiovasc Res. 1997;33:535–539; e Nielsen et al., Am J Transl Res. 2013; 5(3): 303–315). Durante a montagem fibrilar, o propeptídeo N-terminal do colágeno tipo III é extraído por clivagem por N-proteases específicas antes da incorporação do colágeno maduro na matriz ex- tracelular (ECM), assim liberado na ECM e em circulação. A molécula de propeptídeo consiste em três cadeias α idênticas com um peso mo- lecular total de 42 kDa. Os números de referência do GenBank (Natio- nal Center for Biotechnology Information (NCBI)) para as sequências de proteína e gene do Pro-C3 (cadeia do colágeno α-1 (III)) são NP_000081.1 (UniProt P02461) e NM_000090.3, respectivamente, cu- jas sequências são aqui expressamente incorporadas por referência. Fragmentos da proteína, por exemplo, o propeptídeo N-terminal, tal como a sequência de aminoácido 144 -CPTGPQNYSP-153 (SEQ ID NO: 3), na cadeia α1 Pro-C3, podem ser utilizados para gerar anticor- pos para o imunoensaio (por exemplo, ELISA). Nielsen et al., Am J Transl Res. 2013; 5(3): 303–315.
[0066] A medição ou determinação dos níveis de proteína de um biomarcador, tal como Pro-C3, em uma amostra biológica pode ser executada por qualquer método adequado (ver, por exemplo, Harlow and Lane (1988) “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Har-
bor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY).
[0067] Em geral, os níveis de proteína são determinados mediante o contato de uma amostra biológica obtida de um indivíduo com agen- tes de ligação para uma ou mais das proteínas do biomarcador; detec- ção, na amostra biológica, do nível de expressão (por exemplo, níveis) de uma ou mais das proteínas do biomarcador que se ligam aos agen- tes de ligação; e comparação dos níveis de uma ou mais proteínas do biomarcador na amostra com os níveis dos biomarcadores de proteína correspondentes em uma amostra de controle (por exemplo, uma amostra normal).
[0068] Agentes de ligação adequados também incluem um anti- corpo específico para uma proteína do biomarcador aqui descrita (por exemplo, Pro-C3). Anticorpos adequados para utilização nos métodos da presente invenção incluem anticorpos monoclonais e policlonais e fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos Fab ou scFvs) de anticorpos. Os anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais e policlonais, fragmentos e quimeras, podem ser preparados utilizando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497; Kozbor et al. (1985) J Immunol Methods 81:31-42; Cote et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-203; e Zhang et al. (2002) J Biol Chem 277:39379-39387). Anticorpos exem- plares incluem anticorpos ou seus fragmentos que se ligam ao propep- tídeo N-terminal, tal como a sequência de aminoácidos 144 - CPTGPQNYSP- 153 (SEQ ID NO: 3), na cadeia α1 Pro-C3 (por exem- plo, anticorpo NB61N-62, conforme descrito em Nielsen et al., Am J Transl Res. 2013; 5(3): 303–315). Os anticorpos a serem utilizados nos métodos da invenção podem ser purificados por métodos bem co- nhecidos na técnica. Os anticorpos também podem ser obtidos de fon- tes comerciais.
[0069] Em certas modalidades, o agente de ligação é marcado di-
reta ou indiretamente com um componente detectável. O papel de um agente detectável é facilitar a etapa de detecção do método de diag- nóstico por permitir a visualização do complexo formado pela ligação do agente de ligação ao marcador de proteína (ou seu fragmento). O agente detectável pode ser selecionado de tal modo que gere um sinal que possa ser medido e cuja intensidade esteja relacionada (preferi- velmente proporcional) à quantidade de marcador de proteína presen- te na amostra que está sendo analisada. Os métodos para marcar mo- léculas biológicas tais como polipeptídeos e anticorpos, são bem co- nhecidos na técnica. Qualquer um de uma ampla variedade de agen- tes detectáveis pode ser utilizado na prática da presente invenção. Os agentes detectáveis adequados incluem, mas não são limitados a es- tes: vários ligantes, radionuclídeos, corantes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, micropartículas (tais como, por exemplo, pontos quânticos, nanocristais, fósforos e similares), enzimas (tais como, por exemplo, aquelas utilizadas em um ELISA, isto é, peroxidase de rába- no silvestre, beta-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marca- ções colorimétricas, marcações magnéticas e biotina, digoxigenina ou outros haptenos e proteínas para os quais antissoros ou anticorpos monoclonais estão disponíveis.
[0070] Em certas modalidades, os agentes de ligação (por exem- plo, anticorpos) podem ser imobilizados em um veículo ou suporte (por exemplo, um glóbulo, uma partícula magnética, uma partícula de látex, uma cavidade de placa de microtitulação, uma cubeta ou outro recipi- ente de reação). Exemplos de materiais de veículo ou de suporte ade- quados incluem agarose, celulose, nitrocelulose, dextrano, Sephadex®, Sepharose®, lipossomas, carboximetil celulose, poliacri- lamidas, poliestireno, gabros, papel de filtro, magnetita, resina de troca iônica, película plástica, tubo plástico, vidro, copolímero de poliamina- metil-vinila-éter-ácido maleico, copolímero de aminoácido, copolímero de etileno-ácido maleico, náilon, seda e similares. Os agentes de liga- ção podem ser imobilizados indiretamente utilizando segundos agen- tes de ligação específicos para os primeiros agentes de ligação (por exemplo, anticorpos de camundongo específicos para os marcadores de proteína podem ser imobilizados utilizando anticorpo específico do fragmento de IgG Fc anticamundongo de ovelha revestido no veículo ou suporte).
[0071] Os níveis de expressão de proteína em uma amostra bioló- gica podem ser determinados utilizando imunoensaios. Exemplos de tais ensaios são imunoensaios de fluorescência decididos no tempo (TR-FIA), radioimunoensaios, imunoensaios enzimáticos (por exemplo, ELISA), imunoprecipitação por imunofluorescência, aglutinação de lá- tex, hemaglutinação, Western blot e testes histoquímicos, que são mé- todos convencionais bem conhecidos na técnica. Os métodos de de- tecção e quantificação do sinal gerado pelo complexo formado pela ligação do agente de ligação ao marcador de proteína dependerão da natureza do ensaio e do componente detectável (por exemplo, compo- nente fluorescente). Um exemplar de Pro-C3 ELISA é descrito em Ni- elson et al., Am J Transl Res 2013;5(3):303-315, que é aqui incorpora- do por referência.
[0072] Em um exemplo, a presença ou quantidade de expressão de proteína de um gene (por exemplo, um biomarcador, tal como Pro- C3) pode ser determinada utilizando uma técnica de Western blotting. Por exemplo, um lisado pode ser preparado a partir de uma amostra biológica, ou da própria amostra biológica (por exemplo, sangue ou sua fração), pode ser colocado em contato com o tampão LaemmLi e submetido à eletroforese em dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrila- mida (SDS-PAGE). As proteínas decididas por SDS-PAGE, separadas por tamanho, podem então ser transferidas para uma membrana de filtro (por exemplo, nitrocelulose) e submetidas a técnicas de immuno-
blotting utilizando um anticorpo marcado de forma detectável específi- co para a proteína de interesse. A presença ou quantidade de anticor- po marcado de forma detectável ligado indica a presença ou quantida- de de proteína na amostra biológica.
[0073] Em outro exemplo, um imunoensaio pode ser utilizado para detectar e/ou medir a expressão de proteína de uma proteína de bio- marcador, tal como Pro-C3. Como acima, para os propósitos de detec- ção, um imunoensaio pode ser executado com um anticorpo que car- rega um componente de detecção (por exemplo, um agente fluores- cente ou enzima). As proteínas de uma amostra biológica podem ser conjugadas diretamente a uma matriz de fase sólida (por exemplo, uma placa de ensaio de múltiplas cavidades, nitrocelulose, agarose, Sepharose®, partículas codificadas ou glóbulos magnéticos) ou podem ser conjugadas a um primeiro membro de um par de ligação específico (por exemplo, biotina ou estreptavidina) que se liga a uma matriz de fase sólida após a ligação a um segundo membro do par de ligação específico (por exemplo, estreptavidina ou biotina). Essa ligação a uma matriz de fase sólida permite que as proteínas sejam purificadas para longe de outros componentes interferentes ou irrelevantes da amostra biológica antes do contato com o anticorpo de detecção e também leva em conta a lavagem subsequente do anticorpo não liga- do. Aqui, como acima, a presença ou quantidade de anticorpo ligado marcado de forma detectável indica a presença ou quantidade de pro- teína na amostra biológica.
[0074] Alternativamente, os níveis de expressão de proteínas po- dem ser determinados utilizando métodos baseados na espectrometria de massa ou métodos baseados em imagem conhecidos na técnica para a detecção de proteínas. Outros métodos adequados incluem ele- troforese em gel 2D, métodos baseados em proteômica tais como a identificação de proteínas individuais recuperadas do gel (por exemplo,
por espectrometria de massa ou sequenciamento N-terminal) e/ou bioinformática.
[0075] Os métodos para detectar ou medir a expressão de proteí- nas podem, opcionalmente, ser executados em formatos que levam em conta a rápida preparação, processamento e análise de múltiplas amostras. Isso pode ser, por exemplo, em placas de ensaio de múlti- plas cavidades (por exemplo, 96 cavidades ou 386 cavidades) ou ma- trizes (por exemplo, chips de proteína). As soluções mãe para vários reagentes podem ser fornecidas manual ou roboticamente, e a subse- quente preparação de amostra, pipetagem, diluição, mistura, distribui- ção, lavagem, incubação (por exemplo, hibridização), leitura de amos- tra, coleta de dados (dados ópticos) e/ou análise (análise de imagem auxiliada por computador), pode ser feita de maneira robotizada, utili- zando software de análise comercialmente disponível, robótica e ins- trumentação de detecção capaz de detectar o sinal gerado a partir do ensaio. Exemplos de tais detectores incluem, mas não são limitados a estes, espectrofotômetros, luminômetros, fluorímetros e dispositivos que medem a desintegração de radioisótopos. Ensaios baseados em células de alto rendimento exemplares (por exemplo, detecção da pre- sença ou nível de uma proteína alvo em uma célula) podem utilizar a tecnologia ArrayScan® VTI HCS Reader ou KineticScan® HCS Rea- der (Cellomics Inc., Pittsburg, PA).
[0076] A expressão do biomarcador também pode ser detectada no nível de ácido nucleico (por exemplo, com base nos níveis de RNA). Em uma modalidade, o RNA é detectado utilizando um ensaio de RNA-ISH. Outro método para determinar o nível de RNA em uma amostra envolve o processo de amplificação de ácido nucleico a partir do tecido homogeneizado, por exemplo, através de RT-PCR (transcri- ção reversa do RNA e, em seguida, amplificação do cDNA resultante empregando PCR ou qualquer outro método de amplificação de ácido nucleico, seguido pela detecção das moléculas amplificadas. Em outra modalidade, a expressão de RNA é avaliada por RT-PCR quantitativa fluorogênica (qPCR).
[0077] Em uma modalidade, os métodos aqui descritos envolvem a comparação do nível ou atividade de expressão medida de uma pro- teína de biomarcador, tal como Pro-C3 (como medido em uma amos- tra biológica obtida de um paciente) para uma amostra de controle. Em algumas modalidades, a amostra de controle é obtida do paciente an- tes da administração ao paciente do FGF-21 modificado (por exemplo, BMS-986036). Em algumas modalidades, a amostra de controle pode ser (ou pode ser baseada em), por exemplo, uma coleção de amostras obtidas de uma ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 ou mais) indivíduos sau- dáveis que não foram administrados com FGF-21 modificado. Em al- gumas modalidades, a amostra de controle pode ser (ou pode ser ba- seada em), por exemplo, uma amostra combinada obtida de dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 ou mais) indivíduos. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos nesta invenção, as amostras reunidas podem ser de indivíduos saudáveis, ou pelo menos, indiví- duos que não têm ou não são suspeitos de ter NASH. Em outra moda- lidade, determinar se o nível de expressão ou atividade de um biomar- cador, tal como Pro-C3, ou fração de gordura hepática, diminuiu após o tratamento com um FGF-21 modificado pode envolver a comparação do nível de expressão ou atividade do biomarcador em uma amostra biológica obtida de um paciente antes do tratamento com o nível de expressão do biomarcador em uma amostra do mesmo tipo biológico obtida do paciente após o tratamento com o FGF-21 modificado (por exemplo, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, um mês, 6 semanas, dois meses,
três meses, quatro meses, 5 meses ou 6 meses após o tratamento).
[0078] Em algumas modalidades, determinar se um FGF-21 modi- ficado produziu um efeito desejado (por exemplo, uma redução nos níveis de Pro-C3 no soro (por exemplo, em cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ou 50%) e/ou rigidez do fígado) em um ser humano pode ser executada perguntando se o nível de expressão pós-tratamento do biomarcador (por exemplo, Pro-C3) cai dentro de uma faixa predeter- minada indicativa de receptividade a um FGF-21 modificado por um ser humano. Em algumas modalidades, determinar se um FGF-21 modificado produziu um efeito desejado em um ser humano pode in- cluir a pergunta se o nível de expressão pós-tratamento ou a atividade do biomarcador (por exemplo, Pro-C3) cai acima ou abaixo de um va- lor de ponto de corte predeterminado. Um valor de ponto de corte é tipicamente o nível de expressão ou atividade de um determinado bi- omarcador em uma determinada amostra biológica, acima ou abaixo do qual é considerado indicativo de um certo fenótipo, por exemplo, receptividade à terapia com um FGF-21 modificado.
[0079] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos nesta invenção, o mesmo profissional pode administrar o FGF-21 modificado ao paciente antes de determinar se uma alteração no nível de expressão ou atividade do biomarcador (por exemplo, Pro- C3) ocorreu, enquanto que em algumas modalidades, o profissional que administra o FGF-21 modificado ao paciente é diferente do profis- sional que determina se uma resposta ocorreu no paciente. Em algu- mas modalidades, o profissional pode obter uma amostra biológica do paciente antes da administração do FGF-21 modificado. Em algumas modalidades, o profissional pode obter uma amostra biológica do paci- ente após a administração do FGF-21 modificado ao paciente. Em al- gumas modalidades, a amostra pós-tratamento pode ser obtida do pa- ciente em menos de 48 (por exemplo, menos de 47, 46, 45, 44, 43, 42,
41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, duas ou até menos de uma) horas após a adminis- tração do FGF-21 modificado ao paciente. Em algumas modalidades, a amostra pós-tratamento pode ser obtida do paciente em menos de 20 (por exemplo, menos de 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, dois ou um) dia(s) após a adminis- tração ao paciente do FGF-21 modificado. Em algumas modalidades, a amostra biológica é obtida do paciente em não mais de 20 (por exemplo, não mais de 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, dois ou um) dia(s) após o FGF-21 modi- ficado ser administrado ao paciente.
[0080] Em algumas modalidades, o nível de Pro-C3 no soro é re- duzido em pelo menos 5 (por exemplo, pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 70) % após a administração do FGF-21 modificado. Em algumas modalidades, o nível de Pro-C3 no soro é di- minuído em pelo menos 15% após a administração do FGF-21 modifi- cado. Em algumas modalidades, o nível de Pro-C3 no soro é diminuí- do em pelo menos 20% após a administração do FGF-21 modificado.
[0081] Em algumas modalidades, o nível de Pro-C3 no soro é re- duzido para dentro de 90 (por exemplo, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 ou 30) % do nível de soro normal de Pro-C3 após adminis- tração do FGF-21 modificado.
[0082] Em algumas modalidades, o nível de Pro-C3 no soro é re- duzido para dentro de 90 (por exemplo, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 ou 30) % do nível de soro da linha de base de pré- tratamento (antes do tratamento) de Pro-C3 após a administração do FGF-21 modificado.
2. Polipeptídeos do FGF-21 modificado
[0083] Conforme descrito na Patente US No: 9.434.778 (cujo con-
teúdo é aqui expressamente incorporado por referência na sua totali- dade), os fatores de crescimento de fibroblastos são polipeptídeos amplamente expressos nos tecidos em desenvolvimento e adultos (Baird et al., Cancer Cells, 3:239-243, 1991) que desempenham pa- péis cruciais nas múltiplas funções fisiológicas (McKeehan et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59:135-176, 1998; Burgess, W. H. et al., Annu. Rev. Biochem. 58:575-606 (1989). De acordo com a literatura, a família de FGF consiste em pelo menos vinte e dois membros (Reuss et al., Cell Tissue Res. 313:139-157 (2003)).
[0084] O fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF-21) foi des- crito na literatura (Nishimura et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206 (2000); WO 01/36640; e WO 01/18172, e Publicação de Patente U.S. No. 20040259780, cada um dos quais é aqui expressa- mente incorporado por referência na sua totalidade). Ao contrário de outros FGFs, o FGF-21 foi relatado de não ter efeitos proliferativos e tumorigênicos (Ornitz and Itoh, Genome Biology 2001, 2(3):reviews
3005.1-3005.12).
[0085] Certos polipeptídeos de FGF-21 e seu uso são descritos na Publicação de Patente U.S. No. 20010012628, Patente U.S. No.
6.716.626, Publicação de Patente U.S. No. 2004/0259780, WO 03/011213, Kharitonenkov et al. J Clin Invest. 2005 June; 115(6):1627- 35, WO 03/059270, Publicação de Patente U.S. No. 2005/0176631, WO 2005/091944, WO 2007/0293430, Publicação de Patente U.S. No. 2007/0293430, WO/2008/121563, Patente U.S. No. 4.904.584, WO 99/67291, WO 99/03887, WO 00/26354 e Patente U.S. No. 5.218.092, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalida- de.
[0086] Como utilizado nesta invenção, "polipeptídeo de FGF-21 modificado", "fator de crescimento de fibroblastos modificado 21" ou "FGF-21 modificado" e suas formas não hifenizadas são utilizadas de modo trocável e devem incluir aqueles polipeptídeos e proteínas que diferem do FGF-21 do tipo selvagem (por exemplo, FGF-21 humano do tipo selvagem da SEQ ID NO: 1) e tipicamente possuem pelo me- nos uma atividade biológica de um fator de crescimento de fibroblastos 21, assim como análogos de FGF-21, isoformas de FGF-21, miméticos de FGF-21, fragmentos de FGF-21, proteínas híbridas FGF-21, proteí- nas de fusão, oligômeros e multímeros, homólogos, variantes do pa- drão de glicosilação, variantes, variantes de união e muteínas, inde- pendentemente da sua atividade biológica. O termo "polipeptídeo FGF- 21 modificado" e "FGF-21 modificado" abrange polipeptídeos de FGF- 21 compreendendo uma ou mais substituições, adições ou elimina- ções de aminoácido. Por exemplo, os polipeptídeos de FGF-21 modifi- cado da presente invenção podem compreender uma ou mais modifi- cações de aminoácido não natural, opcionalmente em conjunto com modificações com um ou mais aminoácidos naturais. As substituições, inserções ou eliminações exemplares em uma ampla variedade de po- sições de aminoácido nos polipeptídeos de FGF-21 (incluindo aqueles aqui descritos e outros), incluindo, mas não limitado às substituições que modulam a estabilidade farmacêutica, que modulam uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de FGF-21, tais como, sem limitação, aumentar a atividade agonista, aumentar a solubilidade do polipeptídeo, diminuir a suscetibilidade à protease, diminuir a desami- dação, converter o polipeptídeo em um antagonista, reduzir a imuno- genicidade ou toxicidade ou facilitar a purificação ou viabilizar a fabri- cação, etc., são abrangidos pelo termo "polipeptídeo de FGF-21 modi- ficado".
[0087] Em algumas modalidades, o "FGF-21 modificado" abrange polipeptídeos de FGF-21 compreendendo uma ou mais substituições ou adições de aminoácido não naturalmente codificadas. Em algumas modalidades, o "FGF-21 modificado" abrange polipeptídeos de FGF-
21 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido não na- turalmente codificadas.
[0088] Em alguns casos, as substituições de aminoácido não natu- ralmente codificadas podem ser combinadas com outras adições, substituições ou eliminações dentro do polipeptídeo de FGF-21 modifi- cado para afetar outras características biológicas do polipeptídeo de FGF-21 modificado em relação a outro polipeptídeo de FGF-21.
[0089] Em alguns casos, as outras adições, substituições ou elimi- nações podem aumentar a estabilidade (incluindo, mas não limitado a resistência à degradação proteolítica) do polipeptídeo de FGF-21 mo- dificado ou aumentar a afinidade do polipeptídeo de FGF-21 modifica- do com relação ao seu receptor. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou eliminações podem aumentar a estabilidade farma- cêutica do polipeptídeo de FGF-21 modificado. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou eliminações podem aumentar a solu- bilidade (incluindo, mas não limitando a quando expressa em E. coli ou outras células hospedeiras) do polipeptídeo de FGF-21 modificado. Em algumas modalidades, a outra adição, substituição ou eliminação pode modular a afinidade do polipeptídeo de FGF-21 modificado com relação ao seu receptor, proteínas de ligação ou ligante associado, modular a transdução de sinal após a ligação ao seu receptor, modular a meia-vida circulante, modular a liberação ou biodisponibilidade, facili- tar a purificação ou melhorar ou alterar uma via de administração par- ticular. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de FGF-21 modifi- cados podem compreender sequências de clivagem química ou enzi- mática, sequências de clivagem de protease, grupos reativos, domí- nios de ligação a anticorpos (incluindo, entre outros, FLAG ou poli-His) ou outras sequências baseadas na afinidade (incluindo, mas não limi- tado a FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, en- tre outras, biotina) que melhoram a detecção (incluindo, mas não limi-
tado a GFP), purificação, transporte através de tecidos ou membranas celulares, ou outras características do polipeptídeo.
[0090] Polimorfismos múltiplos de FGF-21 foram identificados. A leucina ou prolina foi descrita na mesma posição na Publicação de Pa- tente U.S. No. 20010012628 e Patente U.S. No. 6.716.626. As se- quências líder ou de sinal N-terminal que diferem em 1 aminoácido (leucina) são mostradas na Patente U.S. No. 6.716.626 e Publicação de Patente U.S. No. 20040259780. As variantes ou mutantes de poli- peptídeo de FGF-21 incluem, mas não são limitados a estes, aqueles divulgados na Patente U.S. No. 6.716.626; Publicações de Patente U.S. Nos. 2005/0176631, 2005/0037457, 2004/0185494, 2004/0259780, 2002/0164713 e 2001/0012628; WO 01/36640; WO 03/011213; WO 03/059270; WO 04/110472; WO 05/061712; WO 05/072769; WO 05/091944; WO 05/113606; WO 06/028595; WO 06/028714; WO 06/050247; WO 06/065582; WO 06/078463; WO01/018172; WO09/149171; WO10/042747; WO12/066075; WO11/154349; WO13/052311; WO13/188181, que são aqui expres- samente incorporadas por referência na sua totalidade.
[0091] O termo "polipeptídeo do FGF-21 modificado" também in- clui fragmentos biologicamente ativos, variantes biologicamente ativas e estereoisômeros do FGF-21 de ocorrência natural, assim como as suas variantes agonistas, miméticas e antagonistas das fusões do FGF-21 e do polipeptídeo de ocorrência natural. As fusões compreen- dendo aminoácidos adicionais no terminal amino, terminal carboxila, ou ambos, são incluídas pelo termo "polipeptídeo do FGF-21 modifica- do". Fusões exemplares incluem, mas não são limitadas a estas, por exemplo, FGF-21 de metionila, em que uma metionina está ligada ao N-terminal do FGF-21 resultante da expressão recombinante da forma madura do FGF-21 sem o peptídeo líder ou de sinal ou uma parte des- ta (uma metionina está ligada ao N-terminal do FGF-21 resultante da expressão recombinante, por exemplo, em E. coli), fusões para os propósitos de purificação (incluindo, mas não limitado a poliistidina ou epítopos de afinidade), fusões com peptídeos de ligação à albumina no soro tais como adectina de extensão de PK (PKE) e fusões com proteínas no soro tais como albumina sérica, e proteínas de fusão compreendendo FGF-21 e uma ou mais outras moléculas ("parceiro de fusão"), incluindo, mas não limitado a estes, albumina sérica, domínio Fc, região constante de imunoglobulina, polipeptídeo não estruturado e adnectina e um fragmento destes. Qualquer um desses fragmentos pode ser preparado a partir das proteínas por métodos bioquímicos padrão ou pela expressão de um polinucleotídeo que codifica o frag- mento.
[0092] O termo "polipeptídeo do FGF-21 modificado" inclui polipep- tídeos conjugados com um polímero tal como PEG e pode opcional- mente compreender uma ou mais derivações adicionais de cisteína, lisina ou outros resíduos. Por exemplo, o polipeptídeo do FGF-21 mo- dificado pode ser conjugado a um conector ou polímero, em que o co- nector ou polímero pode ser conjugado a um aminoácido não natural no polipeptídeo do FGF-21 modificado de acordo com a presente in- venção, ou pode ser conjugado a um aminoácido codificado natural- mente utilizando técnicas conhecidas na especialidade tais como aco- plamento a lisina ou cisteína. Os conectores exemplares incluindo, mas não são limitados a estes, pequenos compostos orgânicos, polí- meros solúveis em água de vários comprimentos, tais como po- li(etileno glicol) ou polidextrano, ou peptídeos ou polipeptídeos de vá- rios comprimentos.
[0093] O termo "polipeptídeo do FGF-21 modificado" também in- clui FGF-21 modificado glicosilado, tal como, mas não limitado a poli- peptídeos glicosilados em qualquer posição de aminoácido, formas glicosiladas ligadas a N ou ligadas a O do polipeptídeo. Variantes con-
tendo alterações de nucleotídeo isoladas também são consideradas variantes biologicamente ativas do polipeptídeo do FGF-21. Além dis- so, variantes de união também estão incluídas. O termo "polipeptídeo do FGF-21 modificado" também inclui heterodímeros, homodímeros, heteromultímeros ou homomultímeros de polipeptídeo do FGF-21 de qualquer um ou mais polipeptídeos do FGF-21 não modificado ou mo- dificado ou qualquer outro polipeptídeo, proteína, carboidrato, políme- ro, molécula pequena, conector, ligante ou outra molécula biologica- mente ativa de qualquer tipo, ligada por meios químicos ou expressa como uma proteína de fusão, assim como análogos de polipeptídeo contendo, por exemplo, eliminações específicas ou outras modifica- ções que ainda mantêm a atividade biológica.
[0094] Um "aminoácido não codificado naturalmente" se refere a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisi- na ou selenocisteína. Outros termos que podem ser utilizados como sinônimo do termo "aminoácido não codificado naturalmente" são "aminoácido não natural", "aminoácido não natural", "aminoácido de ocorrência não natural" e suas versões diferentemente hifenizadas e não hifenizadas. O termo "aminoácido não codificado naturalmente" também inclui, mas não se limita a aminoácidos que ocorrem por mo- dificação (por exemplo, modificações pós-translacionais) de um ami- noácido codificado naturalmente (incluindo, entre outros, os 20 amino- ácidos comuns ou pirrolisina e selenocisteína), mas não são eles mesmos naturalmente incorporados a uma cadeia polipeptídica cres- cente pelo complexo de translação. Exemplos de tais aminoácidos não codificados naturalmente incluem, mas não são limitados a estes, N- acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina e O- fosfotirosina.
[0095] Um "grupo de modificação amino terminal" se refere a qualquer molécula que possa ser ligada ao amino terminal de um poli-
peptídeo. Da mesma forma, um "grupo de modificação do carbóxi ter- minal" se refere a qualquer molécula que possa ser ligada ao carbóxi terminal de um polipeptídeo. Os grupos de modificação terminal inclu- em, mas não são limitados a estes, vários polímeros solúveis em água, metionina, peptídeos ou proteínas, tais como albumina do soro, domínio Fc, região constante de imunoglobulina, polipeptídeo não es- truturado, adnectina ou um fragmento destes ou outros componentes que aumentam a meia-vida no soro (in vivo) de peptídeos.
[0096] Os termos "grupo funcional", "componente ativo", "grupo de ativação", "grupo de saída", "sítio reativo", "grupo quimicamente reati- vo" e "componente quimicamente reativo" são utilizados na técnica e aqui para se referir às distintas partes definíveis ou unidades de uma molécula. Os termos são um tanto sinônimos nas técnicas químicas e são utilizados nesta invenção para indicar as partes das moléculas que desempenham alguma função ou atividade e são reativas com outras moléculas.
[0097] O termo "ligação gênica" é aqui utilizado para se referir a grupos ou ligações que normalmente são formados como resultado de uma reação química e tipicamente são ligações gênicas covalentes. Ligações gênicas hidroliticamente estáveis significa que as ligações gênicas são substancialmente estáveis na água e não reagem com a água em valores úteis de pH, incluindo, mas não limitado às condições fisiológicas por um período prolongado de tempo, talvez até indefini- damente. As ligações gênicas hidroliticamente instáveis ou degradá- veis significam que as ligações são degradáveis em água ou em solu- ções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue. Ligações gênicas en- zimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação gêni- ca pode ser degradada por uma ou mais enzimas. Como compreendi- do na técnica, o PEG e os polímeros relacionados podem incluir liga- ções gênicas degradáveis na cadeia principal do polímero ou no grupo conector entre a cadeia principal do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula de polipetídeo. Por exemplo, ligações gênicas de éster formadas pela reação de ácidos carboxílicos de PEG ou ácidos carboxílicos de PEG ativados com grupos de álcool em um agente biologicamente ativo geralmente hidrolisam sob condições fi- siológicas para liberar o agente. Outras ligações gênicas hidrolitica- mente degradáveis incluem, mas não são limitados a estas, ligações gênicas de carbonato; ligações gênicas de imina resultaram da reação de uma amina e um aldeído; ligações gênicas de éster de fosfato for- madas pela reação de um álcool com um grupo de fosfato; ligações gênicas de hidrazona que são o produto da reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações gênicas de acetais que são o produto da reação de um aldeído e um álcool; ligações gênicas de ortoéster que são o produto da reação de um formato e de um álcool; ligações gênicas de peptídeo formadas por um grupo de amina, incluindo, mas não limita- das a estas, em uma extremidade de um polímero tal como PEG, e um grupo de carboxila de um peptídeo; e ligações gênicas de oligonucleo- tídeo formadas por um grupo de fosforamidita, incluindo, mas não limi- tadas a estas, no final de um polímero, e um grupo de hidroxila 5' de um oligonucleotídeo. Ligações gênicas exemplares também incluem a ligação gênica de oxima resultante da reação de um grupo de carboni- la e um grupo de amino-óxi.
[0098] Os polipeptídeos de FGF-21 modificado adequados para uso na invenção podem ser gerados utilizando métodos bem conheci- dos na técnica. Alternativamente, os polipeptídeos do FGF-21 modifi- cado reconhecidos na técnica podem ser utilizados. Por exemplo, os polipeptídeos do FGF-21 modificado são descritos na Patente US
9.079.971 e Patente US 9.434.778, cujos conteúdos são aqui expres- samente incorporados por referência em suas totalidades.
[0099] Um FGF-21 modificado exemplar pode ser um análogo
PEGuilado do FGF-21 humano. Em uma modalidade, o FGF-21 modi- ficado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que um aminoácido no polipeptídeo é substituído por um aminoácido não codi- ficado naturalmente, em que dito aminoácido não codificado natural- mente está em uma posição que corresponde ao resíduo 108 da SEQ ID NO: 1.
[00100] Em outra modalidade, o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que um aminoácido no polipep- tídeo é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente está em uma posição que corresponde ao resíduo 108 da SEQ ID NO: 1; (b) dito aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero que compreende um poli(etileno glicol).
[00101] Em outra modalidade, o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmen- te compreende para-acetil fenilalanina e (b) dito aminoácido não codi- ficado naturalmente está ligado a um polímero que compreende um poli(etileno glicol). Em uma modalidade, o poli(etileno glicol) pode ter um peso molecular médio de cerca de 30 kDa.
[00102] Em outra modalidade, o aminoácido não codificado natu- ralmente está ligado ao dito polímero através de uma ligação gênica de oxima.
[00103] Em outra modalidade, o FGF-21 modificado compreende a SEQ ID NO: 2.
[00104] Em outra modalidade, o FGF-21 modificado compreende a SEQ ID NO: 2, em que a para-acetil fenilalanina na SEQ ID NO: 2 está ligada a um polímero que compreende um poli(etileno glicol).
[00105] Em outra modalidade, o FGF-21 modificado compreende a
SEQ ID NO: 2, em que a para-acetil fenilalanina na SEQ ID NO: 2 está ligada a um polímero que compreende um poli(etileno glicol) tendo um peso molecular médio de cerca de 30 kDa. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado pode ser BMS-986036.
[00106] Também é fornecido um FGF-21 modificado para uso nos métodos aqui descritos. Em uma modalidade, é fornecido um FGF-21 modificado para uso em um método de tratamento de NASH em um paciente, em que o método compreende administrar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência sufici- ente para tratar a NASH, em que o paciente foi determinado de ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que 10, 15 ou 20 ng/ML. Em outra modalidade, um FGF-21 modificado para uso em um método de moni- toramento da receptividade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado, em que um nível de Pro-C3 no soro redu- zido em uma amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tratamento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado.
3. Amostras e Coleta
[00107] As amostras biológicas adequadas para uso nos métodos aqui descritos incluem sangue total (ou uma fração deste). Uma amos- tra biológica pode ser ainda fracionada, se desejável, em uma fração contendo analitos particulares (por exemplo, proteínas) de interesse. Por exemplo, uma amostra de sangue total pode ser fracionada em soro ou em frações contendo tipos particulares de proteínas.
[00108] As amostras biológicas podem ser obtidas de um indivíduo, por exemplo, um paciente tendo, suspeito de ter ou com risco de de- senvolver a NASH. Quaisquer métodos adequados para obter as amostras biológicas podem ser utilizados.
[00109] Em algumas modalidades, um extrato de proteína pode ser preparado a partir de uma amostra biológica. Em algumas modalida- des, um extrato de proteína contém o teor total de proteína. Os méto- dos de extração de proteína são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Roe (2001) “Protein Purification Techniques: A Practical Ap- proach”, 2nd Edition, Oxford University Press. Vários kits diferentes e versáteis podem ser utilizados para extrair proteínas de fluidos e teci- dos corporais, e estão disponíveis comercialmente, por exemplo, das BioRad Laboratories (Hercules, CA), BD Biosciences Clontech (Moun- tain View, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), Calbio- chem (San Diego, CA), Pierce Biotechnology (Rockford, IL) e Invitro- gen Corp. (Carlsbad, CA).
[00110] Os métodos para obter e/ou armazenar amostras que pre- servam a atividade ou a integridade das células na amostra biológica são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, uma amostra biológica pode ser ainda colocada em contato com um ou mais agentes adicionais tais como tampões e/ou inibidores apropria- dos, incluindo inibidores da protease, agentes destinados a preservar ou minimizar alterações (por exemplo, alterações na osmolaridade ou pH) na estrutura da proteína. Tais inibidores incluem, por exemplo, quelantes tais como ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), ácido etileno glicol tetra-acético (EGTA), inibidores de protease tais como fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), aprotinina e leupeptina. Tam- pões e condições apropriados para armazenar ou de outro modo ma- nipular células inteiras são descritos em, por exemplo, Pollard and Walker (1997), “Basic Cell Culture Protocols,” volume 75 of Methods in molecular biology, Humana Press; Masters (2000) “Animal cell culture: a practical approach,” volume 232 of Practical approach series, Oxford University Press; e Jones (1996) “Human cell culture protocols,” volu- me 2 of Methods in molecular medicine, Humana Press.
[00111] Uma amostra também pode ser processada para eliminar ou minimizar a presença de substâncias interferentes. Por exemplo, uma amostra biológica pode ser fracionada ou purificada para remover um ou mais materiais (por exemplo, células) que não são de interesse. Os métodos de fracionamento ou purificação de uma amostra biológi- ca incluem, entre outros, citometria de fluxo, classificação de células ativadas por fluorescência e sedimentação.
4. Métodos de Tratamento
[00112] Também são aqui fornecidos métodos para o tratamento de um paciente tendo NASH, mediante a administração ao paciente de um fator de crescimento de fibroblastos modificado 21 (FGF-21) se o paciente tiver sido determinado de ter um nível limiar no soro particular de Pro-C3 (por exemplo, maior que cerca de 10 ng/ML, 11 ng/ML, 12 ng/ML, 13 ng/ML, 14 ng/ML, 15 ng/ML, 16 ng/ML, 17 ng/ML, 18 ng/ML, 19 ng/ML, 20 ng/ML, 22 ng/ML, 23 ng/ML).
[00113] Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento", conforme aqui utilizados, referem-se às medidas terapêuticas aqui descritas. Os mé- todos de tratamento empregam a administração a um paciente (tal como um ser humano) da combinação aqui divulgada a fim de curar, atrasar, reduzir a gravidade ou melhorar um ou mais sintomas da do- ença ou distúrbio ou doença ou distúrbio recorrente, ou para prolongar a sobrevida de um paciente além do esperado na ausência de tal tra- tamento.
[00114] Os termos "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeutica- mente eficaz" são utilizados de modo trocável e referem-se a uma quantidade de formulação eficaz para aliviar ou melhorar um ou mais sintomas da doença ou distúrbio (por exemplo, NASH) ou para prolon- gar a sobrevida do paciente que está sendo tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capa- cidade daqueles versados na técnica, especialmente à luz da divulga-
ção detalhada fornecida nesta invenção. As dosagens terapeuticamen- te eficazes podem ser determinadas utilizando métodos in vitro e in vivo.
[00115] Em uma modalidade, um método para o tratamento de um paciente tendo NASH é fornecido compreendendo: (a) determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente e (b) administrar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, se o nível de Pro- C3 no soro for maior do que cerca de 10 ng/ML antes da administra- ção ao paciente do FGF- 21.
[00116] Em outra modalidade, um método para o tratamento de um paciente tendo NASH que foi determinado de ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 10 ng/ML é fornecido, o método com- preendendo a administração ao paciente de um FGF-21 modificado em uma quantidade e com frequência suficiente para tratar a NASH.
[00117] Em outra modalidade, é fornecido um método para o trata- mento de um paciente com NASH com FGF-21 modificado, em que o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro maior do que 10 ng/ML antes do tratamento, em que o método compreende a administração ao paciente de um FGF-21 modificado em quantidade e com uma fre- quência suficiente para tratar a NASH.
[00118] Em outra modalidade, um método para tratar um paciente tendo NASH é fornecido, em que o método compreende: (1) obter ou ter obtido uma amostra de sangue do paciente, (2) determinar ou ter determinado um nível de Pro-C3 no soro na amostra de sangue maior do que 10 ng/ML e (3) administrar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH após um nível de Pro-C3 no soro ter sido determinado.
[00119] Em outra modalidade, é fornecido um método para o trata- mento de um paciente tendo NASH, compreendendo: (a) determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente e (b) administrar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, se o nível de Pro- C3 no soro for maior que cerca de 10 ng/ML, em que o FGF-21 modifi- cado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que um aminoácido no polipeptídeo é substituído por um aminoácido não codi- ficado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado natu- ralmente está em uma posição que corresponde ao resíduo 108 da SEQ ID NO: 1; (b) dito aminoácido não codificado naturalmente com- preende para-acetil fenilalanina ligada a um polímero compreendendo um poli(etileno glicol).
[00120] Em outra modalidade, é fornecido um método para o trata- mento de um paciente tendo NASH, compreendendo: (a) determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente e (b) administrar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, se o nível de Pro- C3 no soro for maior do que cerca de 10 ng/ML, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina e (b) referido aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um po- límero que compreende um poli(etileno glicol) tendo um peso molecu- lar médio de cerca de 30 kDa.
[00121] Em outra modalidade, um método para tratar um paciente tendo NASH é fornecido, compreendendo: (a) determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente e (b) adminis- trar ao paciente um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, se o nível de Pro-C3 no soro for maior do que cerca de 10 ng/ML, em que o FGF-21 modifica-
do consiste ou compreende a SEQ ID NO: 2.
[00122] Em outra modalidade, um método para o tratamento de um paciente com NASH que foi determinado como de ter um nível de Pro- C3 no soro maior do que cerca de 10 ng/ML é fornecido, o método compreendendo a administração ao paciente de um FGF-21 modifica- do em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que um aminoácido no polipeptídeo é substituí- do por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente está em uma posição que corresponde ao resíduo 108 da SEQ ID NO: 1; (b) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina ligada a um polímero que compreende um poli(etileno glicol).
[00123] Em outra modalidade, é fornecido um método para o trata- mento de um paciente tendo NASH que foi determinado de ter um ní- vel de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 10 ng/ML, o método compreendendo a administração ao paciente de um FGF-21 modifica- do em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: ( a) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina; e (b) dito aminoácido não codificado natural- mente está ligado a um polímero que compreende um poli(etileno gli- col) tendo um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
[00124] Em outra modalidade, um método para o tratamento de um paciente tendo NASH que foi determinado de ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 10 ng/ML é fornecido, o método com- preendendo a administração ao paciente de um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a
NASH, em que o FGF-21 modificado consiste ou compreende a SEQ ID NO: 2.
[00125] Em outra modalidade, é fornecido um método para o trata- mento de um paciente com NASH que foi determinado de ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 10 ng/ML, o método com- preendendo a administração ao paciente de um FGF-21 modificado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, em que o FGF-21 modificado consiste ou compreende a SEQ ID NO: 2, em que o aminoácido não codificado naturalmente na SEQ ID NO: 2 está ligado a um polímero que compreende um poli(etileno glicol) tendo um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
[00126] Em outra modalidade, é fornecido um FGF-21 modificado para uso em um método de tratamento de NASH em um paciente, em que o método compreende administrar ao paciente um FGF-21 modifi- cado em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, em que o paciente foi determinado de ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que 10, 15 ou 20 ng/ML.
[00127] O FGF-21 modificado pode ser administrado a um indiví- duo, por exemplo, um paciente humano, utilizando uma variedade de métodos que dependem, em parte, da via de administração. A via po- de ser, por exemplo, injeção ou infusão intravenosa (IV), injeção sub- cutânea (SC), injeção intraperitoneal (IP) ou injeção intramuscular.
[00128] A administração pode ser conseguida, por exemplo, através da infusão, injeção ou por meio de um implante local. O implante pode ser de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo mem- branas, tais como membranas sialásticas ou fibras. O implante pode ser configurado para liberação controlada ou periódica da composição ao paciente. Ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 20080241223; Patentes U.S. Nos. 5.501.856; 4.863.457; e 3.710.795; e Patentes Europeias Nos. EP488401 e EP430539, cujas divulgações de cada uma são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. A composição pode ser liberada ao paciente por meio de um dispositivo implantável baseado em, por exemplo, sistemas difusivos, passíveis de erosão ou convectivos, por exemplo, bombas osmóticas, implantes biodegradáveis, sistemas de eletrodifusão, sistemas de eletro-osmose, bombas de pressão de vapor, bombas eletrolíticas, bombas eferves- centes, bombas piezoelétricas, sistemas baseados em erosão ou sis- temas eletromecânicos.
[00129] Uma dose adequada de um FGF-21 modificado que é ca- paz de tratar a NASH em um paciente, pode depender de uma varie- dade de fatores, incluindo, por exemplo, idade, sexo e peso de um pa- ciente a ser tratado. Outros fatores que afetam a dose administrada ao paciente incluem, por exemplo, a gravidade da doença. Outros fatores podem incluir, por exemplo, outros distúrbios médicos que afetam o paciente de forma simultânea ou anterior, a saúde geral do paciente, a disposição genética do paciente, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de medicamentos e quaisquer outras terapi- as adicionais que são administradas ao paciente. Também deve ficar entendido que uma dosagem e regime de tratamento específicos para qualquer paciente em particular dependerão do julgamento do médico assistente (por exemplo, médico ou enfermeiro).
[00130] Em uma modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose fixa. Como utilizado nesta invenção, os termos "dose fixa", "dose única" e "dose fixa única" são utilizados de modo trocável e referem-se a uma dose que é administrada a um paciente sem levar em consideração o peso ou a área de superfície corporal (ASC) do pa- ciente. A dose fixa ou única, portanto, não é fornecida como uma dose de mg/kg, mas como uma quantidade absoluta do agente.
[00131] Em uma modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose semanal fixa. Em outra modalidade, o FGF-21 modifica-
do é administrado em uma dose de cerca de 10 mg uma vez por se- mana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 11 mg uma vez por semana.
Em outra modali- dade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 12 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modifi- cado é administrado em uma dose de cerca de 13 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 14 mg uma vez por semana.
Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 15 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 16 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 17 mg uma vez por semana.
Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 18 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 19 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 20 mg uma vez por semana.
Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 21 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 22 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 23 mg uma vez por semana.
Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 24 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 25 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 26 mg uma vez por semana.
Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 27 mg uma vez por semana.
Em outra modalidade, o FGF-21 modi-
ficado é administrado em uma dose de cerca de 28 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 29 mg uma vez por semana. Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 30 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modi- ficado é administrado em uma dose de cerca de 35 mg uma vez por semana. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 40 mg uma vez por semana. Em outra mo- dalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose diária fi- xa. Em algumas modalidades, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose ao redor de 5 mg uma vez ao dia, ao redor de 6 mg uma vez ao dia, ao redor de 7 mg uma vez ao dia, ao redor de 8 mg uma vez ao dia, ao redor de 9 mg uma vez ao dia, ao redor de 10 mg uma vez ao dia, ao redor de 11 mg uma vez ao dia, ao redor de 12 mg uma vez ao dia, ao redor de 13 mg uma vez ao dia, ao redor de 14 mg uma vez ao dia, ao redor de 15 mg uma vez ao dia, ao redor de 16 mg uma vez ao dia, ao redor de 16 mg uma vez ao dia, ao redor de 17 mg uma vez ao dia, ao redor de 18 mg uma vez ao dia, ao redor de 19 mg uma vez ao dia, ao redor de 20 mg uma vez ao dia, ao redor de 25 mg uma vez ao dia ou ao redor de 30 mg uma vez ao dia. Em uma modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 10 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é admi- nistrado em uma dose de cerca de 15 mg uma vez ao dia. Em outra modalidade, o FGF-21 modificado é administrado em uma dose de cerca de 20 mg uma vez ao dia.
[00132] Em algumas modalidades, o FGF-21 modificado é adminis- trado em uma dose fixa durante 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses ou 12 meses.
[00133] Uma composição farmacêutica pode incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz de um FGF-21 modificado (por exemplo, con- forme BMS-986036). Essas quantidades eficazes podem ser facilmen- te determinadas por uma pessoa de habilidade prática na técnica com base, em parte, no efeito do FGF-21 modificado ou no efeito combina- tório do FGF-21 modificado e em um ou mais agentes ativos adicio- nais, se mais do que um agente for utilizado. Uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um FGF-21 modificado também pode variar de acordo com fatores tais como estado doentio, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do FGF-21 modificado (e um ou mais agen- tes ativos adicionais) de obter uma resposta desejada no indivíduo, por exemplo, melhora de pelo menos um parâmetro de condição, por exemplo, melhora de pelo menos um sintoma de NASH. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um FGF-21 modificado pode inibir (diminuir a gravidade ou eliminar a ocorrência de) qualquer um dos sintomas de NASH. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da composição são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[00134] A toxicidade e eficácia terapêutica de um FGF-21 modifica- do podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos conhe- cidos em culturas de células ou animais experimentais. Estes proce- dimentos podem ser utilizados, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação de dose entre os efeitos tóxi- cos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a relação de LD50/ED50. As composições que apresentam altos índices terapêuticos são preferíveis. Embora as composições que apresentam efeitos colaterais tóxicos possam ser utilizadas, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de liberação que direcione esses compostos para o local do tecido afetado e para minimizar possíveis danos às cé- lulas normais e, assim, reduzir os efeitos colaterais.
5. Métodos de Monitoramento da Receptividade
[00135] Também são fornecidos métodos para monitorar a recepti- vidade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado, o método compreendendo: determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tratamento, em que: uma diminuição do nível de Pro-C3 no so- ro na amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o trata- mento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amos- tra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado.
[00136] Em outra modalidade, é fornecido um método para monito- rar a receptividade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado, o método compreendendo: determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida duran- te ou após o tratamento, em que: um nível de Pro-C3 no soro reduzido na amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tratamen- to, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modifi- cado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que um aminoácido no polipeptídeo é substi- tuído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente está em uma posição que corresponde ao resíduo 108 da SEQ ID NO: 1; (b) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina ligado a um polímero que compreende um poli(etileno glicol).
[00137] Em outra modalidade, um método para monitorar a recepti- vidade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado é fornecido, o método compreendendo: determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida du- rante ou após o tratamento, em que: um nível de Pro-C3 no soro redu- zido na amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tra- tamento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmen- te compreende para-acetil fenilalanina e (b) dito aminoácido não codi- ficado naturalmente está ligado a um polímero que compreende um poli(etileno glicol) tendo um peso molecular médio de cerca de 30 kDa.
[00138] Em outra modalidade, um método para monitorar a recepti- vidade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado é fornecido, o método compreendendo: determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida du- rante ou após o tratamento, em que: um nível de Pro-C3 no soro redu- zido na amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tra- tamento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado, em que o FGF-21 modificado consiste ou compreende a SEQ ID NO: 2.
[00139] Em outra modalidade, é fornecido um FGF-21 modificado para uso em um método de monitoramento da receptividade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado, em que um nível de Pro-C3 no soro reduzido em uma amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tratamento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente ob-
tida antes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paci- ente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado.
[00140] Em uma modalidade, uma diminuição nos níveis de Pro-C3 no soro em pelo menos 5 (por exemplo, pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 70) % após a administração do FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado.
[00141] Em outra modalidade, uma diminuição nos níveis de Pro-C3 no soro dentro de 90 (por exemplo, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 ou 30) % do nível de Pro-C3 no soro na linha de base após a administração de uma ou mais doses do FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado.
6. Métodos para Identificar os Respondedores
[00142] Também são fornecidos métodos para identificar responde- dores de um paciente tendo NASH para tratamento com um FGF-21 modificado. Em uma modalidade, o método compreende: determinar o paciente com um nível de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 10 ng/ML em uma amostra de sangue obtida antes do tratamento e identi- ficar o paciente como um respondedor do tratamento com o FGF-21 modificado, em que o FGF-21 modificado compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina e (b) dito aminoácido não codificado natural- mente está ligado a um polímero que compreende um poli(etileno gli- col) tendo um peso molecular médio de cerca de 30 kDa. Em outra modalidade, é fornecido um método para identificar um paciente tendo NASH que é adequado para o tratamento com um FGF-21 modificado, em que o método compreende determinar um nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente utilizando um ensaio in vitro,
em que o nível de Pro-C3 no soro na amostra de sangue é maior do que 10, 15 ou 20 ng/ML. Em algumas modalidades, o método compre- ende determinar o paciente com um nível de Pro-C3 no soro maior do que cerca de 11 ng/ML, 12 ng/ML, 13 ng/ML, 14 ng/ML, 15 ng/ML, 16 ng/ML, 17 ng/ML, 18 ng/ML, 19 ng/ML, 20 ng/ML, 21 ng/ML ou 22 ng/ML, em uma amostra de sangue obtida do paciente antes do trata- mento.
7. Agentes/Terapias Adicionais
[00143] Em algumas modalidades, o FGF-21 modificado pode ser administrado a um paciente como uma monoterapia. Alternativamente, como descrito acima, o FGF-21 modificado pode ser administrado a um paciente como uma terapia de combinação com outro tratamento. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir a administração ao paciente (por exemplo, um paciente humano) de um ou mais agentes adicionais que fornecem um benefício terapêutico ao paciente que possui NASH. Em uma modalidade, o FGF-21 modificado é adminis- trado no primeiro momento e o um ou mais agentes ativos adicionais são administrados no segundo momento. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes ativos adicionais são administrados no primeiro momento e o FGF-21 modificado é administrado no segundo momen- to.
[00144] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais podem ser selecionados a partir de agentes antifibróti- cos, antagonista de N-caderina, anticorpo anti-N-caderina, antagonista de N-caderina de molécula pequena, fragmento antagonista de N- caderina, agentes anti-inflamatórios, sistema renina-angiotensina (RAS) supressor de agentes hepatoprotetores, probióticos e ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs). Em algumas modalidades, o agente antifibrótico pode ser selecionado de nintedanib, pirfenidona, antago- nistas de LPA1, antagonistas do receptor de LPA1, análogo de GLP1,
tralokinumab (IL-13, AstraZeneca), vismodegib (antagonista de ouriço, Roche), PRM-151 (pentraxina-2, TGF beta-1, Promedior), SAR- 156597 (Mab IL-4&IL-13 biespecífico, Sanofi), simtuzumab (anticorpo anti-lisil oxidase tipo 2 (anti-LOXL2), Gilead), CKD-942, PTL- 202 (libe- ração oral de controle PDE inh./pentoxifilina/NAC, Pacific Ther.), omi- palisib (inibidor oral de PI3K/mTOR, GSK), IW-001 (mod. do colágeno bovino tipo V de sol. oral, ImmuneWorks), STX-100 (integrina alfa V/ beta-6 ant., Stromedix/Biogen), Actimmune (IFN gama), PC-SOD (mi- dismase; inalado, LTT Bio-Pharma / CKD Pharm), lebrikizumab (mAb humanizado com anti-IL-13 SC, Roche), AQX-1125 (ativador SHIP1, Aquinox), CC-539 (inibidor de JNK, Celgene), FG-3019 (FibroGen) e SAR-100842 (Sanofi). Em algumas modalidades, o agente hepatopro- tetor pode ser ácido ursodesoxicólico (UDCA) ou ácido obeticólico (OCA ou INT-747, Intercept).
8. Resultados
[00145] Os pacientes tratados de acordo com os métodos aqui di- vulgados preferivelmente experimentam melhoras em pelo menos um sinal de NASH.
[00146] Em uma modalidade, os métodos de tratamento aqui des- critos resultam em uma diminuição dos níveis de Pro-C3 (por exemplo, pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 70%) em comparação com os níveis de Pro-C3 pré-tratamento. Em outra moda- lidade, os métodos de tratamento descritos nesta invenção resultam em uma diminuição dos níveis de Pro-C3 (por exemplo, em pelo me- nos 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes ou 3 vezes em comparação com os níveis de Pro-C3 pré-tratamento).
[00147] Em outra modalidade, os métodos de tratamento aqui des- critos produzem uma mudança em direção aos níveis normais de Pro- C3 (por exemplo, dentro de 50 (por exemplo, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25,
24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1) % acima do nível de soro normal do Pro-C3).
[00148] Em outra modalidade, os métodos de tratamento aqui des- critos resultam em uma redução na rigidez do fígado em um paciente, conforme avaliado por elastografia de ressonância magnética (MRE). Por exemplo, em uma modalidade, o tratamento com um FGF-21 mo- dificado resulta em uma redução na rigidez do fígado do paciente em comparação com a rigidez do fígado do paciente antes do tratamento, em que a rigidez do fígado é avaliada por MRE. Em outra modalidade, o tratamento com um FGF-21 modificado resulta em uma redução de 15% ou mais (por exemplo, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mais) na rigidez do fígado no paciente em comparação com a rigidez do fígado do paciente antes do trata- mento, em que a rigidez do fígado é avaliada pelo MRE.
[00149] Em outra modalidade, os métodos de tratamento aqui des- critos resultam em uma redução na fração de gordura hepática em um paciente. Por exemplo, em uma modalidade, o tratamento com um FGF-21 modificado resulta em uma redução na fração de gordura he- pática no paciente em comparação com a fração de gordura hepática do paciente antes do tratamento, em que a fração de gordura hepática é avaliada pela fração de gordura de densidade de prótons estimada pela formação de imagem por ressonância magnética (MRI-PDFF). Em outra modalidade, o tratamento com o FGF-21 modificado resulta em uma redução de 30% ou mais (por exemplo, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mais) na fração de gordura hepática no paciente em comparação com a fração de gordura hepática do pacien-
te antes do tratamento, em que a fração de gordura hepática é avalia- da por MRI-PDFF. Em outra modalidade, a fração de gordura hepática do paciente é reduzida em pelo menos 5 (por exemplo, pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 70) % após a administra- ção do FGF-21 modificado para o paciente, em comparação com a fração de gordura hepática do paciente antes do tratamento, conforme avaliado pela RM-PDFF. Em outra modalidade, a fração de gordura hepática do paciente é reduzida em pelo menos 20% após a adminis- tração do FGF-21 modificado ao paciente, em comparação com a fra- ção de gordura hepática do paciente antes do tratamento, conforme avaliado pela MRI-PDFF. Em outra modalidade, a fração de gordura hepática do paciente é reduzida em pelo menos 30% após a adminis- tração do FGF-21 modificado ao paciente, em comparação com a fra- ção de gordura hepática do paciente antes do tratamento, conforme avaliado por MRI-PDFF. Em outra modalidade, a fração de gordura hepática do paciente é reduzida dentro de 90 (por exemplo, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 ou 30) % do nível de soro da linha de ba- se de pré-tratamento do paciente (antes do tratamento) da fração de gordura hepática após a administração do FGF-21 modificado.
[00150] Em outra modalidade, os métodos de tratamento aqui des- critos resultam em uma redução da rigidez do fígado, uma redução na fração de gordura hepática e/ou uma diminuição dos níveis de Pro-C3 no soro em um paciente. Em outra modalidade, o tratamento com um FGF-21 modificado resulta em uma redução da rigidez do fígado no paciente em comparação com a rigidez do fígado do paciente antes do tratamento, e uma diminuição dos níveis de Pro-C3 no soro no pacien- te em comparação com os níevis de Pro-C3 no soro do paciente antes do tratamento, em que a rigidez do fígado é avaliada por MRE, e em que o paciente foi determinado de ter um nível de Pro-C3 no soro mai- or do que 10, 15 ou 20 ng/ML antes do tratamento com o FGF-21 mo-
dificado. Em outra modalidade, os métodos de tratamento aqui descri- tos produzem pelo menos um efeito terapêutico selecionado do grupo que consiste em uma redução ou cessação de fadiga, indisposição, perda de peso e/ou desconforto abdominal no quadrante superior direi- to no paciente.
9. Kits
[00151] Também são fornecidos kits que compreendem vários rea- gentes e materiais úteis para a realização dos métodos aqui descritos. Os procedimentos para medir, diagnosticar, avaliar e/ou analisar aqui descritos podem ser executados por laboratórios de diagnóstico, labo- ratórios experimentais ou profissionais individuais. A invenção fornece kits que podem ser utilizados em qualquer uma ou todas essas confi- gurações. Em algumas modalidades, os kits aqui descritos compreen- dem materiais e reagentes para, entre outras coisas, caracterizar ou processar amostras biológicas (por exemplo, sangue), medir os níveis de biomarcador Pro-C3 (por exemplo, níveis de proteína ou ácido nu- cleico), monitorar a resposta ao tratamento em um paciente de acordo com os métodos aqui fornecidos. Em certas modalidades, um kit da invenção compreende pelo menos um ou mais reagentes que detec- tam especificamente os níveis de proteína no soro de Pro-C3 e, opcio- nalmente, instruções para o uso do kit.
[00152] Em algumas modalidades, os kits podem incluir amostras de controle adequadas (por exemplo, amostras biológicas de indiví- duos saudáveis normais ou uma solução compreendendo uma quanti- dade de controle conhecida de um analito particular de interesse, tal como Pro-C3). Em algumas modalidades, os kits da invenção podem incluir instruções para o uso do kit de acordo com um ou mais métodos aqui descritos e podem compreender instruções para o processamento da amostra biológica (por exemplo, sangue) obtida do paciente e/ou para a execução do teste ou instruções para a interpretação dos resul-
tados.
[00153] Embora a presente divulgação tenha sido descrita com re- ferência às suas modalidades específicas, deve ficar entendido por aqueles versados na técnica que várias alterações podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem se afastar do verdadeiro es- pírito e escopo da presente invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação, material, composição da matéria, processo, etapa ou etapas do processo particular, com o obje- tivo, espírito e escopo da presente invenção. Todas essas modifica- ções são destinadas a estar dentro do escopo da presente invenção.
[00154] O seguinte exemplo se destina a ilustrar, e não limitar, a invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1: Um Estudo Randomizado, Duplo-Cego, Controlado por Placebo, em Grupo Paralelo, com Múltiplas Doses para Avali- ar os Efeitos de Segurança, Farmacocinética e Farmacodinâmica do BMS-986036 em Adultos com Esteato-hepatite Não Alcoólica (NASH)
[00155] Os objetivos deste estudo foram avaliar o efeito de 16 se- manas de doses diárias ou semanais de BMS-986036 (um FGF21 modificado que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que o pAF está ligado a um PEG de 30kD) sobre a segu- rança, tolerabilidade e alteração na fração de gordura hepática (%) pe- la MR1 em pacientes com NASH e avaliar a farmacocinética e imuno- genicidade do BMS-986036 em pacientes com NASH. Os objetivos também incluíram avaliar o efeito de doses diárias ou semanais de BMS-986036 na rigidez do fígado por MRE em 16 semanas, composi- ção corporal por absorciometria de raios X de dupla energia (DXA), concentração urinária de BMS-986036, peso corporal e circunferência da cintura, níveis de ALT (alanina aminotransferase) e AST (aspartato aminotransferase), homeostase da glicose e sensibilidade à insulina, lipídios em jejum, homeostase óssea, biomarcadores exploratórios as- sociados ao risco da progressão e complicações da doença e índices calculados relacionados ao NASH. A. Métodos
[00156] Os indivíduos foram submetidos a avaliações de varredura para determinar a elegibilidade dentro de 42 dias antes da randomiza- ção. Os indivíduos elegíveis foram escolhidos a esmo para um dos três grupos de tratamento paralelo e tratamento duplo-cego autoadmi- nistrado, uma vez ao dia ou uma vez por semana durante 16 semanas. Foram incluídos no estudo indivíduos do sexo masculino e feminino com idade entre 21 e 75 anos com IMC ≥ 25 kg/m2 com uma biópsia hepática executada dentro de 1 ano após a varredura (ou entre a var- redura e a introdução) com resultados documentados de NASH com fibrose da NASH CRN estágio 1-3 e uma fração de gordura hepática (%) ≥ 10% por fração de gordura de densidade de prótons estimada pela formação de imagem por ressonância magnética (MRI-PDFF). Os pacientes foram excluídos se tivessem evidência de uma condição médica que contribuísse com a doença hepática crônica diferente de NASH, evidência de cirrose, doença hepática descompensada, hemo- globina glicada (HbA1c) ≥ 9,5%, abuso recente de drogas ou álcool ou consumo significativo de álcool, trauma ósseo, fratura ou cirurgia ós- sea dentro de 8 semanas da varredura ou qualquer desvio clinicamen- te significativo do normal no exame físico ou nas determinações labo- ratoriais clínicas além de ser consistente com a população alvo de pa- cientes.
[00157] Os pacientes elegíveis foram escolhidos a esmo (1:1:1) no Dia 1 utilizando o Sistema Resposta Audível Interativo (IVRS) para um dos seguintes grupos: BMS-986036 10 mg QD, BMS-986036 20 mg QW ou placebo QD. Os pacientes foram estratificados pelo diagnóstico do status T2DM com base nos critérios atuais da American Diabetes Association (ver American Diabetes Association, “Classification and diagnosis of diabetes”, Sec. 2. Diabetes Care 2015; 38(Suppl 1): S8). Os tratamentos cegos foram fornecidos em kits numerados para admi- nistração em ambulatório. Em todas as visitas de estudo quando os fármacos de estudo foram dispensados, cada paciente recebeu um número de kit aleatoriamente designado pelo IVRS. Os números de kit correspondiam aos números impressos nas embalagens e kits conten- do o fármaco de estudo. Cada kit continha 8 frascos para sustentar uma semana de dosagem. 2 frascos foram designados para o dia 1 e 1 frasco foi fornecido para cada um dos dias 2 a 7.
[00158] As visitas clínicas foram agendadas aproximadamente a cada 2 semanas inicialmente, e depois mensalmente, para coletar me- didas de segurança PK e PD (Tabela 1). Tabela 1: Plano Esquemático do Estudo Dias de Visita
D D D D D D D D -42 D -7 1 15 29 43 57 86 112 D 142 D 292 Varredura Introdução Em tratamento Acompanhamento 5 semanas 1 semana 4 meses Placebo Tratamento A: 10 mg QD Tratamento B: 20 mg QW Tratamento C: Placebo QD QD = Uma vez ao dia; QW = uma vez por semana; D = dia
[00159] Antes da randomização, os pacientes elegíveis completa- ram um período de introdução de habilidades de estudo de 7 dias, consistindo em injeções diárias de placebo (Dia -7 ao Dia -1). As inje- ções foram autoadministradas por via subcutânea no abdômen e os pacientes foram treinados para alternar os locais de injeção em rela- ção ao umbigo. Após a randomização no Dia 1, os pacientes autoad- ministraram o tratamento duplo-cego por via subcutânea uma vez ao dia durante 16 semanas, conforme apresentado na Tabela 2. Para to- dos os tratamentos, no Dia 1 de cada semana de tratamento, duas in- jeções de 1 mL foram administradas simultaneamente e nos Dias 2 a 7, uma injeção de 1 mL foi administrada. Para o grupo de BMS-986036 10 mg QD, as duas injeções no dia 1 consistiram em uma dose ativa e um placebo para manter a ocultação entre os grupos de tratamento diários e semanais. Para o grupo de BMS-986036 20 mg QW, nos dias 2 a 7, a injeção diária foi placebo para manter a ocultação entre os grupos de tratamento diários e semanais. Tabela 2: Administração do Tratamento Número e volume das injeções Dia 1 de cada Dias 2 a 7 de Intensidade semana de tra- cada semana de Tratamento da solução tamento tratamento Fase de Placebo QD N/A 2 x 1 mL 1 x 1 mL, diário introdução A BMS-986036 10 mg/mL 2 x 1 mL 1 x 1 mL, diário 10 mg QD B BMS-986036 10 mg/mL 2 x 1 mL 1 x 1 mL, diário 20 mg QW C Placebo QW N/A 2 x 1 mL 1 x 1 mL, diário N/A = não aplicável. QD = uma vez ao dia. QW = uma vez por semana.
[00160] As visitas às clínicas em tratamento foram agendadas para os dias 1, 15, 29, 43, 57, 86 e 112. As visitas de acompanhamento pós-estudo foram agendadas para os dias 142 e 292. Exames físicos, medições de sinais vitais e avaliações laboratoriais clínicas foram exe- cutadas na varredura, em cada visita de tratamento e na visita de acompanhamento do dia 142. Eletrocardiogramas de doze derivações (ECGs) foram executados na varredura, dia 1, dia 112 e no acompa- nhamento. Devido à associação do FGF21 e perda óssea observada em modelos de camundongos (ver, por exemplo, Wei W, et al. Proc
Natl Acad Sci U S A 2012; 109(8): 3143-8), absorciometria por raios X de dupla emissão (DXA) foi executada para monitorar a densidade mi- neral óssea (DMO) e a composição corporal na varredura, no final do tratamento, e 6 meses após o término do tratamento. A RM-PDFF foi executada na varredura e no dia 57 e no final do tratamento. Em um subconjunto de instalações com o hardware e software adequados, a elastografia de ressonância magnética (MRE) foi conduzida na varre- dura e no final do tratamento. Os níveis de lipídio (LabCorp, Burlington, NC), adiponectina (Myriad RBM, Austin, TX) e insulina (LabCorp) em jejum foram avaliados nos dias 1, 29, 57, 86, 112 e 142. Os níveis de PRO-C3 foram avaliados nos Dias 1, 57 e 112 (Nordic Bioscience, Herlev, Denmark). Dados de eventos adversos (AE) foram coletados em todos os momentos do estudo e nas visitas de acompanhamento. Os pacientes foram monitorados quanto as reações no local da injeção do dia −7 até o final das visitas de acompanhamento pós-estudo. A escala de Draize para eritema e edema foi utilizada como um guia pa- ra relatar os AEs no local da injeção (ver Haschek W, et al. “Evaluation of Cutaneous Toxicity” In: Fundamentals of Toxicologic Pathology. Second ed. Academic Press; 2009. p.156). A imunogenicidade para estudar o fármaco e o FGF21 endógeno foi avaliada pré-dose e nos dias 15, 29, 57, 86, 112, 142 e 292. Além disso, avaliações de imuno- genicidade também foram realizadas aproximadamente a cada 6 a 8 semanas entre os dias 142 e 292 ou até 12 meses após o dia 142.
[00161] Os parâmetros primários foram segurança, tolerabilidade e alteração absoluta da fração de gordura hepática pela MRI-PDFF em pacientes com NASH tratados com 16 semanas de doses QD ou QW de BMS-986036. Os parâmetros secundários incluíram farmacocinéti- ca e imunogenicidade. Os parâmetros exploratórios incluíram altera- ção na rigidez do fígado conforme medida pela MRE nas 16 semanas, composição corporal por DXA, alanina aminotransferase (ALT) e níveis de aspartato aminotransferase (AST), adiponectina, lipídios em jejum e PRO-C3. Os parâmetros post hoc incluíram melhora relativa na fração de gordura hepática medida por MRI-PDFF, rigidez do fígado medida por MRE e PRO-C3.
[00162] Para o parâmetro primário, com 27 pacientes por grupo de tratamento com medidas pós-linha de base, estimou-se que havia 82% de força para detectar uma diferença de 5% na alteração média da li- nha de base na Semana 16 na fração de gordura hepática entre cada uma das 2 doses de BMS-986036 e placebo em um nível de signifi- cância unilateral de 0,05. Esses cálculos assumiram que a alteração da fração de gordura hepática em relação à linha de base é normal- mente distribuída com um desvio padrão não mais do que 7%, con- forme estimado a partir de dados relatados em uma população seme- lhante (ver Le TA, et al., Hepatology 2012; 56(3): 922-32 e Patel NS, et al., Clin Gastroenterol Hepatol 2015; 13(3): 561-8). Levando-se em conta cerca de 10% dos pacientes abandonaram, foi planejado esco- lher a esmo aproximadamente 30 pacientes por grupo de tratamento.
[00163] Para avaliar o parâmetro primário, uma análise longitudinal de medidas repetidas foi utilizada para analisar a alteração na fração de gordura hepática na Semana 16 a partir da linha de base em paci- entes tratados tanto com uma linha de base quanto com pelo menos uma medição pós-linha de base. O modelo incluiu o grupo de trata- mento, interações semanais e de tratamento por semana como efeitos principais e fração de gordura hepática da linha de base (%) e status diabético da linha de base como covariáveis. Uma matriz de covariân- cia não estruturada foi utilizada para representar a correlação das me- didas repetidas dentro de cada indivíduo. O modelo forneceu estimati- vas pontuais, erros padrão e intervalos de confiança de 90% nos dois lados para alterações médias da linha de base dentro e entre os tra- tamentos. Para parâmetros exploratórios, estatísticas descritivas são fornecidas por dia de tratamento e estudo. As análises post hoc foram conduzidas utilizando o teste exato de Fisher e não foram ajustadas para múltiplas comparações. Todos os eventos adversos registrados foram listados e tabulados por classe de órgãos do sistema, termo pre- ferido e grupo de tratamento. Todas as constatações significativas no exame físico e resultados laboratoriais clínicos foram listados. Uma análise interina pré-especificada foi conduzida após aproximadamente 60 pacientes completarem 8 semanas de tratamento. Se a alteração média da linha de base na fração de gordura hepática em comparação com o placebo for de pelo menos -4,5%, então inscrição é interrompi- da. As análises consistiram de resumos dos dados disponíveis, sem revelar a designação do tratamento de pacientes individuais. Os resul- tados da análise foram revisados por um painel pré-especificado de pessoal e não revelados a outra equipe de estudo. Todos os pacientes que foram escolhidos a esmo e receberam o fármaco de estudo foram incluídos nas análises primárias.
[00164] As concentrações Ctrough de BMS-986036 (Total e C- Terminal intacto) foram derivadas da concentração de soro versus da- dos de tempo. A MRE foi executada em momentos específicos para avaliar possíveis alterações na rigidez do fígado. A DXA foi executada em momentos específicos para avaliar as alterações potenciais na composição corporal. Sangue e urina foram coletados para análise ex- ploratória de biomarcadores, incluindo Pro-C3.
[00165] As avaliações de segurança incluíram eventos adversos (AEs), eventos adversos graves (SAEs) e anormalidades laboratoriais e foram baseadas em análises médicas dos relatórios de AE e nos re- sultados das medições dos sinais vitais, ECG, exames físicos e testes laboratoriais clínicos. B. Resultados
[00166] 184 pacientes com sobrepeso ou obesos com NASH foram incluídos no estudo e 80 pacientes entraram na fase inicial. Dos 80 pacientes que entraram na fase de introdução, setenta e cinco indiví- duos foram escolhidos a esmo e tratados com BMS-986036 10 mg por dia (25 indivíduos), BMS-986036 20 mg semanalmente (24 indivíduos) ou placebo diariamente (26 indivíduos), como mostrado na Figura 1. O tamanho do modelo planejado foi de 30 pacientes por grupo. No en- tanto, a inscrição terminou mais cedo devido a um efeito significativo do BMS-986036 observado para o parâmetro primário durante a análi- se interina pré-planejada no tratamento na Semana 8. Um total de 71 de 75 pacientes (95%) completou o período de tratamento de 16 se- manas.
[00167] A demografia na linha de base e as características da do- ença foram geralmente comparáveis entre os grupos de tratamento, conforme mostrado abaixo na Tabela 3. No geral, 96% (72/75) dos pa- cientes eram brancos, 64% (48/75) eram mulheres, 37% (28/75) apre- sentava T2DM e 20% (15/75) apresentavam fibrose estágio 3, confor- me avaliado pelos critérios da NASH CRN. Nos grupos de pacientes, a fração média de gordura hepática da linha de base medida pela RM- PDFF variou de 18% a 21%, a rigidez média do fígado avaliada pela MRE variou de 3,1 a 3,5 kPa e a NAS média da linha de base variou de 4,0 a 4,4. Tabela 3: Demografia da Linha de Base e Características da Do- ença BMS-986036 Características do Paci- Placebo 10 mg QD 20 mg QW ente (n = 26) (n = 25) (n = 24) Idade, anos, média (SD) 47 (12) 52 (10) 52 (12) Sexo Masculino, n (%) 10 (39) 10 (40) 7 (29) Raça, Branca, n (%) 25 (96) 24 (96) 23 (96) BMI, kg/m2, média (SD) 37 (7) 34 (4) 35 (6) Características da Doença
T2DM, n (%) 11 (42) 9 (36) 8 (33) Pontuação de atividade 4·0 (1) 4,4 (1) 4,4 (1)*
NAFLD Fibrose da NASH CRN, n (%) Estágio 1 17 (65) 10 (40) 13 (54) Estágio 2 8 (31) 6 (24) 6 (25) Estágio 3 1 (4) 9 (36) 5 (21) Fígado, média (SD) Fração de gordura he- 21 (7) 18 (7) 20 (6) pática, % Rigidez do fígado, kPa 3,1 (1,2) 3,5 (1,4) 3,4 (1,0) ALT, U/L 80 (51) 66 (37) 70 (33) AST, U/L 58 (49) 48 (23) 52 (22) PRO-C3, ng/mL 19 (12) 19 (15) 23 (15) Metabólica, média (SD) Triglicerídeos, mg/dL 171 (75)* 208 (110)* 187 (55)† Colesterol LDL, mg/dL 128 (55) 129 (38) 120 (36) Colesterol HDL, mg/dL 50 (11) 47 (10) 45 (12) HbA1c, % 6,0 (0,9) 6,1 (0,9) 6,2 (1,1) ALT = alanina aminotransferase. AST = aspartato aminotransferase. BMI = índice de massa corporal. HbA1c = hemoglobina glicada. HDL = lipoproteína de alta densidade. LDL = lipoproteína de baixa densidade. MRI-PDFF = fração de gordu- ra de densidade de prótons estimada pela formação de imagem por ressonância magnética. NASH CRN = Rede de Pesquisa Clínica da Esteato-hepatite não Al- coólica. NAFLD = doença hepática gordurosa não alcoólica. PRO-C3 = propeptí- deo de colágeno do tipo III N-terminal. T2DM = diabetes melito do tipo 2. QD = uma vez ao dia. QW= uma vez por semana. *n = 23; †n = 20.
[00168] Fração de gordura hepática: Após 16 semanas de trata- mento, a fração média de gordura hepática foi significativamente redu- zida em pacientes que receberam 10 mg de BMS-986036 QD (p = 0,0004) ou 20 mg de BMS-986036 QW (p = 0,008), em comparação com o placebo (ver a Figura 2A). As reduções médias absolutas na fração de gordura hepática na semana 16 foram de -6,8% para o pai- nel de doses de 10 mg QD (P = 0,0004), -5,2% para o painel de doses de 20 mg QW (P = 0,008) e -1,3% para o painel de placebo. As altera- ções absolutas médias na fração de gordura hepática na Semana 8 foram de -8,4%, -6,5% e -1,3% para o regime de 10 mg QD, o regime de 20 mg QW e o regime de placebo, respectivamente. Um total de 68 indivíduos apresentou dados de RMN-PDFF tanto na linha de base quanto na semana 16. A Figura 2B mostra as medidas de RMN-PDFF de um paciente que apresentou uma redução na fração de gordura hepática após o tratamento com BMS-986036. Análises post hoc mos- traram que significativamente mais pacientes tratados com BMS- 986036 10 mg QD (p = 0,03) ou 20 mg QW (p = 0,02) em comparação com pacientes tratados com placebo tiveram uma redução relativa ≥ 30% na fração de gordura hepática (Figura 2C). Uma proporção maior de pacientes tratados com BMS-986036 10 mg QD ou 20 mg QW em comparação ao placebo apresentou reduções relativas de ≥ 20% ou ≥ 10% na fração de gordura hepática. A Tabela 4 apresenta a porcenta- gem de pacientes com redução relativa ≥ 30% da linha de base na semana 16 com relação à fração de gordura hepática (56,5%, 54,5% e 24,0% com relação ao regime de 10 mg QD, ao regime de 20 mg QW e ao regime de placebo, respectivamente). Tabela 4: Alteração da Linha de Base na Semana 16 - Fração de Gor- dura Hepática ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Númbero (%) de indivíduos -------------------------------------------------------------------------------------------------- Alteração Percentual da Linha de Base na Semana 16 BMS 10mg diário BMS 20mg semanal placebo diário N = 25 N = 24 N = 26 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ fração de gordura hepática ≥ 30% de melhora 13/ 23 ( 56.5) 12/ 22 ( 54.5) 6/ 25 ( 24.0) 90% CI (0.395, 0.735) (0.370, 0.720) (0.099, 0.380) relação de probabilidade (90% CI) 4.12(1.46, 11.59) 3.80(1.34, 10.79) Valor P (unilateral) 0.0219 0.0318
1. A linha de base é definida como o último resultado que não falta, com uma data/hora de coleta menor do que a data/hora da primeira dose ativa do medicamento de estudo.
2. O teste exato de Fisher é conduzido para esta análise.
[00169] PK: Para cada grupo de tratamento com BMS-986036 de BMS-986036 10 mg por dia e BMS-986036 20 mg por semana, os da- dos demonstraram que as concentrações em estado estacionário fo- ram alcançadas na primeira semana de tratamento para o BMS- 986036 intacto C-terminal e pela quarta semana para o total de grupos de BMS-986036. A Ctrough permaneceu constante durante o período de tratamento no grupo de dosagem de 10 mg QD e 20 mg QW.
[00170] MRE: Rigidez do Fígado: a MRE foi conduzida para avaliar a rigidez do fígado no subconjunto de instalações de formação de imagem onde o hardware e o software apropriados estavam disponí- veis. Portanto, o tamanho da amostra para a análise de rigidez do fí- gado (MRE) foi menor do que para outros parâmetros. A rigidez do fí- gado média, como medida pela MRE, diminuiu em todos os grupos (ver a Figura 3A). Os grupos de BMS-986036 10 mg QD e 20 mg QW em comparação com o placebo, tiveram uma porcentagem maior de pacientes com uma diminuição de ≥ 15% na rigidez do fígado (ver a Figura 3B). As porcentagens de indivíduos com redução relativa ≥ 15% foram 36%, 33% e 7% para o regime de BMS986036 10 mg QD, para o regime de BMS986036 20 mg QW e para o regime de placebo, res- pectivamente. As imagens de MRE de um paciente que apresentou redução da rigidez do fígado após o tratamento com BMS-986036 são mostradas na Figura 4.
[00171] Adiponectina: Níveis mais elevados de adiponectina estão associados com as melhoras na esteatose, inflamação e fibrose. Au- mentos significativos na adiponectina foram observados após o trata- mento com BMS-986036 10 mg QD (p = 0,003) e 20 mg QW (p = 0,003) em comparação com o placebo (ver a Figura 5), com os níveis médios atingindo o pico no dia 29 e depois tendendo para baixo em direção à linha de base. No dia 112, a alteração percentual média da adiponectina em relação à linha de base foi de 19% e 20% para os grupos de tratamento com BMS-986036 20 mg QW e 10 mg QD, res- pectivamente, em comparação com -1,1% no grupo de placebo, resul- tando em diferenças significativas no tratamento (p = 0,0071 para BMS-986036 10 QD, 0,0072 para BMS-986036 20 QW).
[00172] Pro-C3: Na linha de base, os níveis médios de PRO-C3 no soro foram comparáveis entre os grupos de tratamento, conforme mostrado na Tabela 3. A maioria dos pacientes (67% [28/42]) teve ní- veis de Pro-C3 na linha de base de < 20 ng/mL como mostrado na Fi- guras 6A-6B. Os pacientes tratados com BMS-986036 10 mg QD e 20 mg QW tiveram níveis de PRO-C3 no soro significativamente reduzi- dos em comparação com o placebo (p < 0,0001 e p = 0,0093, respec- tivamente) no dia 112 a partir da linha de base (ver a Figura 7A) .Uma diminuição máxima foi obtida no dia 57 para os grupos de BMS- 986036 10 mg QD e sustentada pelo resto do período de tratamento. Não houve nenhuma diferença significativa na porcentagem de altera- ções entre os grupos de BMS-986036 20 mg QW e BMS-986036 10 mg QD no dia 112. Além disso, os grupos de BMS-986036 10 mg QD e 20 mg QW em comparação com o placebo tiveram uma porcenta- gem significativamente maior de pacientes com uma redução relativa ≥ 15% nos níveis de PRO-C3 no soro (QD: p = 0,0025; QW: p = 0,0063) (ver a Figura 7B). 15% foi selecionado com base na precisão do en- saio. As porcentagens de indivíduos com ≥ 15% em relação a redução foram de 64%, 60% e 18% para o regime de BMS-986036 10 mg QD, para o regime de BMS-986036 20 mg QW e para o regime de placebo, respectivamente (Tabela 5). Nenhuma diferença na resposta de Pro- C3 ao tratamento foi observada pelos estágios da fibrose na linha de base. Tabela 5: Alteração da Linha de Base na Semana 16 - Pro-C3
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Número (%) de Indivíduos --------------------------------------------------------------- Alteração Percentual da BMS 10mg diário BMS 20mg semanal Placebo diário Linha de Base na N = 25 N = 24 N = 26 Semana 16 ------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------- Pro-C3 ≥ 15% de melhora 14/ 22 ( 63.6) 12/ 20 ( 60.0) 4/ 22 ( 18.2) 90% CI (0.467, 0.805) (0.419, 0.780) (0.064, 0.369) relação de probabilidade 7.88(2.46, 25.26) 6.75(2.08, 21.95) (90% CI) Valor P (unilateral). 0.0025 0.0063 * A linha de base é definida como o último resultado não perdido com uma data- tempo de coleta menor do que a data-tempo da primeira dose ativa do medicamen- to de estudo. O teste exato de Fisher é conduzido para esta análise.
[00173] ALT/AST: ALT e AST são biomarcadores da lesão hepática. Os valores médios absolutos de ALT e AST na linha de base e na se- mana 16 são apresentados na Tabela 6. Tabela 6: Valores médios absolutos de ALT e AST na linha de ba- se e na semana 16 BMS-986036 Placebo 10 mg QD 20 mg QW (n = 26) (n = 25) (n = 24) ALT, U/L, média (SD) Linha de Base 80 (51) 66 (37) 70 (33) Semana 16 73 (55)* 39 (18)* 47 (30)† AST, U/L, média (SD) Linha de Base 58 (49) 48 (23) 52 (22) Semana 16 47 (29)* 29 (11)* 35 (12)† ALT = alanina aminotransferase. AST = aspartato aminotransferase. QD = uma vez ao dia. QW = uma vez por semana. SD = desvio padrão. *n = 24. †n = 22.
[00174] Uma diminuição robusta de ALT e AST foi observada para ambos os grupos de dose de BMS-986036 a partir do dia 29 (ver as Figuras 8A-8B). Uma diminuição máxima no dia 43 foi observada para o grupo de 10 mg QD e no dia 57 para o grupo de 20 mg QW. Uma tendência de mais diminuição foi observada no grupo de 10 mg QD em comparação com o grupo de 20 mg QW (ver as Figuras 8A-8B). Em ambos os grupos de tratamento, reduções de aminotransferase foram observadas no dia 15 e um nadir estável foi alcançado no dia 57; esse nadir continuou até o final do tratamento. No grupo de placebo, ALT e AST não mudaram substancialmente da linha de base.
[00175] Lipídios em jejum: a NASH é frequentemente associado com a dislipidemia. O BMS 986036 de 10 mg QD e 20 mg QW resultou em melhoras nos TGs e HDL. Os níveis de HDL aumentaram a partir de linha de base com relação aos grupos tanto de 20 mg QW quanto de 10 mg QD, enquanto não houve alterações no HDL para o placebo (ver a Figura 9B). Em geral, os níveis de triglicerídeo em jejum possu- em alta variabilidade com grandes desvios padrão. No entanto, os ní- veis de triglicerídeo em jejum diminuíram em ambos os grupos de do- ses de BMS-986036 em comparação com a linha de base, com níveis médios diminuídos no dia 29 até o dia 86, e os níveis tenderam para a linha de base no dia 112 (ver a Figura 9C). Além disso, uma diminui- ção no LDL foi observada para o grupo de 10 mg QD, enquanto ne- nhuma redução significativa no LDL foi observada para os grupos de 20 mg QW e placebo (ver a Figura 9A). Índices Calculados Relaciona- dos com a NASH: As pontuações de fibrose Fibrosure foram reduzidas a partir da linha de base nos grupos de BMS-986036, enquanto que nenhuma redução foi observada no grupo de placebo.
[00176] O BMS-986036 foi de uma forma geral bem tolerado. Não houve óbitos ou interrupções devido a eventos adversos, conforme apresentado na Tabela 7. Tabela 7: Resumo de Segurança BMS-986036 Placebo 10 mg QD 20 mg QW Evento, n (%) (n = 26) (n = 25) (n = 24) Óbitos 0 0 0 Interrupção devido aos AEs 0 0 0 AEs graves 1 (4) 1 (4) 0
SAEs relacionados ao tra- 0 0 0 tamento AEs totais 15 (58) 18 (72) 13 (54) AEs mais frequentes Diarreia 2 (8) 3 (12) 5 (21) Náusea 2 (8) 4 (16) 3 (13) Fadiga 5 (19) 1 (4) 0 Dor de Cabeça 3 (12) 1 (4) 2 (8) Infecção do trato urinário 2 (8) 1 (4) 3 (13) Evacuações frequentes 0 5 (20) 0 Tosse 2 (8) 1 (4) 1 (4) Hematomas no local da 0 2 (8) 2 (8) injeção Anormalidades laboratoriais 2 (8) 1 (4) 1 (4) de grau 3 de ALT* aumenta- da AE = evento adverso. ALT = alanina aminotransferase. SAE = evento adverso gra- ve. *Não houve nenhuma anormalidade laboratorial de grau 4 observada.
[00177] Os AEs relatados com mais frequência foram diarreia (13%, [8/49 pacientes tratados com uma dose de BMS-986036 e 2/26 paci- entes que receberam placebo]) e náusea (12%, [7/49 pacientes trata- dos com uma dose de BMS-986036 e 2/26 pacientes que receberam placebo]). Houve dois eventos adversos graves: um paciente no grupo de BMS-986036 10 mg QD experimentou piora da depressão e tentati- va de suicídio, e um paciente que foi escolhido a esmo para o grupo de placebo recebeu o fármaco de estudo errado durante o período de introdução de placebo. Houve 28 eventos adversos entre os seguintes AEs gastrointestinais compósitos: diarréia, náusea, evacuações fre- quentes, dor abdominal superior e vômito. Desses 28 eventos, 11 fo- ram considerados relacionados ao tratamento. A frequência de even- tos adversos gastrointestinais foi maior nos pacientes tratados com BMS-986036 em comparação com os pacientes que receberam place- bo. No entanto, não houve nenhuma associação clara entre a frequên- cia de AE e a dose de BMS-986036. Todos os eventos gastrointesti- nais foram considerados leves ou moderados. Dos AEs gastrointesti-
nais relacionados ao tratamento, apenas 1/11 exigiu tratamento para a resolução (1 paciente que experimentou evacuações frequentes foi tratado com Bifidobacterium infantis). Hematomas, eritema ou reações no local da injeção foram relatados em 5%, 4% e 3% de todos os paci- entes, respectivamente. Esses eventos foram principalmente leves, transitórios e não exigiram tratamento. No total, 5 de 75 pacientes (7%) apresentaram uma anormalidade laboratorial de grau 3 emergen- te do tratamento. Houve 1 evento de glicose alta de grau 3 (aumento do grau 2 na linha de base em um paciente com T2DM tratado com BMS-986036 20 mg QW) e 4 eventos de elevações de ALT de grau 3 (1 aumento do grau 1 na linha de base em um paciente tratado com BMS-986036 20 mg QW, 3 aumentos do grau 2 na linha de base em 2 pacientes que receberam placebo e 1 paciente que recebeu BMS- 986036 10 mg QD), os quais melhoraram apesar da dosagem contí- nua. Não foram observadas anormalidades laboratoriais de grau 4. Nenhuma alteração clinicamente relevante nos intervalos de ECG ou nos sinais vitais após o tratamento com BMS-986036 foi observada. As BMDs médias do fêmur (Figura 10A), quadril (Figura 10B) e coluna vertebral (Figura 10C), conforme medidas pela DXA, não foram signifi- cativamente diferentes no grupo de dose de BMS-986036 em compa- ração com o placebo na semana 16 ou 6 meses após o fim do trata- mento.
[00178] Nos momentos até a alta do estudo no dia 142, anticorpos anti-BMS-986036 e anti-FGF21 foram detectados em 62,5% (15/24) dos pacientes tratados com BMS-986036 20 mg QW e em 92% (23/25) de pacientes tratados com BMS-986036 10 mg QD. Os títulos de anticorpos eram geralmente baixos (a maioria era < 64) e não esta- vam associados a eventos adversos imuno-relacionados, reações no local da injeção ou alterações nos perfis farmacocinéticos ou farmaco- dinâmicos. No momento das visitas de acompanhamento pós-estudo que ocorreram 6 meses após o final do tratamento, < 50% dos pacien- tes apresentaram títulos positivos para anticorpos anti-BMS-986036 e/ou anti-FGF21, e apenas um paciente teve um título de anticorpo >
64. C. Debate
[00179] Em comparação com o placebo, os pacientes com NASH que foram tratados com 10 mg QD ou 20 mg QW de BMS-986036 tive- ram uma fração de gordura hepática absoluta significativamente redu- zida e níveis significativamente aumentados de adiponectina. Os valo- res lipídicos médios e marcadores de lesão hepática (ALT e AST) di- minuíram nos grupos de 10 mg QD e 20 mg QW em comparação com os valores da linha de base. A rigidez média do fígado diminuiu em todos os grupos de tratamento. Nos grupos de 10 mg QD e 20 mg QW, os pacientes tiveram níveis significativamente reduzidos de PRO- C3 (um biomarcador de fibrose) em comparação com o placebo. No geral, os efeitos da dosagem diária e semanal parecem ser semelhan- tes e o tratamento com a dose de BMS-986036 foi geralmente bem tolerado.
[00180] Nos dois grupos de tratamento com BMS-986036, os paci- entes alcançaram uma redução absoluta significativa da fração hepáti- ca de gordura, como medida pela RM-PDFF, e mais da metade dos pacientes alcançou uma redução relativa de ≥ 30%. Em um estudo an- terior, a resposta histológica (redução de ≥ 2 pontos na NAS) foi asso- ciada a uma redução relativa média na fração de gordura hepática de 29% conforme medido por RM-PDFF (ver Patel J, et al. Therap. Adv. Gastroenterol. 2016; 9(5): 692-701). Esses dados, juntamente com fu- turas análises baseadas em histologia, apóiam ainda mais a utilidade clínica da RM-PDFF como um método não invasivo de avaliação da esteatose em pacientes com NASH.
[00181] O tratamento com qualquer dose de BMS-986036 foi asso-
ciado a melhoras significativas na adiponectina, consistente com o que foi relatado anteriormente em ensaios com outros análogos do FGF21 para pacientes com T2DM (ver Gaich G, et al., Cell. Metab. 2013; 18(3): 333-40 e Talukdar S, et al., Cell Metab 2016; 23(3): 427-40). Em pacientes com NASH, os níveis de adiponectina podem ser pelo me- nos 50% menores do que em indivíduos saudáveis (ver Pagano C, et al., Eur. J. Endocrinol. 2005; 152(1): 113-8), o que sugere que a adi- ponectina possui importantes efeitos hepáticos que são protetores contra a NASH. Os camundongos neutralizados com adiponectina co- locados em uma dieta com alto teor de gordura aumentaram os trigli- cerídeos intra-hepáticos, inchaço dos hepatócitos e fibrose e a admi- nistração de adiponectina reduz a esteatose, reduz a inflamação e possui efeitos benéficos no metabolismo lipídico (ver Asano T, et al., J Gastroenterol Hepatol 2009; 24(10): 1669-76 and Xu A, et al., J. Clin. Invest. 2003; 112(1): 91-100). Além disso, a adiponectina antagoniza a ativação das células estreladas hepáticas, um processo crítico para a fibrogênese, e possui efeitos antifibróticos nos fibroblastos estimulados por TGF-beta e em camundongos com fibrose hepática induzida por CCl4 (ver Shafiei MS et al., Am J Pathol 2011; 178(6): 2690-9; Fang F, et al., Arthritis Res Ther 2012; 14(5): R229; e Kumar P, et al., PLoS One 2014; 9(10): e110405).
[00182] Aproximadamente 1/3 dos pacientes nos grupos de 10 mg QD e 20 mg QW alcançaram ≥15% de redução relativa na rigidez do fígado, conforme medido pela MRE, uma técnica de formação de ima- gem não invasiva. Uma redução relativa de 15% na rigidez do fígado medida pela MRE foi associada a uma redução significativa nos mar- cadores de soro de fibrose (ver Loomba R, et al., J Hepatol 2017; 66(Suppl 1): S671). Embora o tamanho pequeno da amostra limite a capacidade de interpretação desses resultados, é encorajador que es- se limite possa ser alcançado com uma duração de tratamento relati-
vamente curta. A MRE é um biomarcador de formação de imagem promissor da fibrose. É reproduzível e possui uma alta taxa de suces- so técnico.
[00183] Na semana 16, os pacientes tratados com BMS-986036 também possuem níveis significativamente reduzidos de PRO-C3, uma medida da formação de colágeno do tipo III, em comparação com o placebo. Em pacientes com NASH, os níveis de PRO-C3 foram as- sociados à atividade da doença de NASH e estágio de fibrose (ver Le- eming DJ, et al., J Hepatol 2017; 66(Suppl 1): S154 and Leeming DJ, et al., Plasma collagen III type III (PRO-C3) levels associate with seve- rity of histological features of non-alcoholic steatohepatitis and fibrosis within the screening population from the CENTAUR study. NASH Bio- markers Workshop 2017 2017; Presented on Saturday, May 5, 2017). Em pacientes com infecção viral crônica de hepatite C, o PRO-C3 de- monstrou correlação com a gravidade da fibrose hepática e altos ní- veis de PRO-C3 da linha de base foram associados com o aumento da progressão da doença fibrótica (ver Nielsen MJ, PLoS One 2015; 10(9): e0137302). O ensaio de PRO-C3 no soro fornece um método preciso e não invasivo para identificar a resposta ao tratamento antifi- brótico (ver Karsdal MA, et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2016; 311(6): G1009-17). Além disso, reduções longitudinais no PRO- C3 foram correlacionadas com melhoras na fibrose hepática, avaliadas por biópsia (ver Luo Y., et al., J Hepatol 2017; 66(Suppl 1): S676). Da- do o exposto, a redução no PRO-C3 observada em pacientes tratados com BMS-986036 parece ser indicativa de um efeito de tratamento an- tifibrótico.
[00184] Neste estudo, nenhuma alteração substancial no peso cor- poral foi observada em pacientes com NASH após 16 semanas de tra- tamento com BMS-986036. Embora a perda de peso induzida por FGF21 tenha sido demonstrada em estudos com animais, a ausência de perda de peso em seres humanos é consistente com as observa- ções de uma experiência anterior do BMS-986036 em pacientes obe- sos com T2DM (ver Kharitonenkov A, et al., Endocrinology 2007; 148(2): 774-81; Coskun T, et al., Endocrinology 2008; 149(12): 6018- 27; Xu J, et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 2009; 297(5): E1105- 14; Charles E, et al., Hepatology 2016; 64(Suppl 1): 17A). A razão para as diferenças na perda de peso em estudos com animais versus en- saios clínicos não é clara. No entanto, pode haver uma diferença dis- tinta na fisiologia do FGF21 de seres humanos versus roedores e pri- matas não humanos.
[00185] No geral, as doses diárias ou semanais de BMS-986036 foram de uma forma geral seguras e bem toleradas, sem mortes, eventos adversos graves relacionados ao tratamento ou descontinua- ções devido a carga de injeção ou AEs. Os eventos adversos relata- dos com mais frequência foram de natureza gastrointestinal (diarreia e náusea), o que é consistente com as observações anteriores em ou- tros estudos de análogos do FGF21 (ver Talukdar S, et al., Cell Metab 2016; 23(3): 427-40 and Fang F, et al., Arthritis Res Ther 2012; 14(5): R229). Esses eventos adversos foram geralmente leves e não exigi- ram tratamento. Da mesma forma, as reações no local da injeção fo- ram principalmente leves, transitórias e não exigiram tratamento. Em contraste com um estudo recente de um análogo FGF21 de ação pro- longada administrado por via intravenosa, não foram observadas alte- rações óbvias na frequência cardíaca ou pressão arterial com o trata- mento com BMS-986036; isso é consistente com os resultados do pri- meiro estudo em ser humano com BMS-986036, no qual esses parâ- metros foram monitorados intensivamente (ver Kim AM, Somayaji VR, Dong JQ, et al., Diabetes Obes Metab 2017; 19(12): 1762-72 e Char- les E, et al., Hepatology 2016; 64(Suppl 1): 546A). Em modelos ani- mais, a administração de FGF21 foi associada a alterações na BMD
(ver Wei W, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109(8): 3143-8). No entanto, neste estudo, a BMD média (determinada por DXA) não alte- rou significativamente com relação ao grupo de tratamento de BMS- 986036, em comparação com o placebo, a partir da linha de base até o final do tratamento ou até 6 meses de acompanhamento.
[00186] Dado que o BMS-986036 é um mimético de FGF21 huma- no PEGuilado, existe o potencial de provocar respostas imunogênicas em alguns pacientes. Os estudos de imunogenicidade mostraram que os anticorpos anti-BMS-986036 e anti-FGF21 foram detectáveis em mais da metade dos pacientes tratados com BMS-986036 20 mg QW e em mais de 90% dos pacientes tratados com BMS-986036 10 mg QD. Esses títulos de anticorpos eram geralmente baixos, não estavam associados a eventos adversos imuno-relacionados ou reações no lo- cal da injeção e estavam diminuindo em muitos pacientes no momento das visitas de acompanhamento. Não houve nenhuma evidência para sugerir quebra na tolerância imunológica para o FGF21 endógeno, uma vez que os títulos dos anticorpos de FGF21 endógenos diminuí- ram após a descontinuação do tratamento. Juntos, esses dados suge- rem que o BMS-986036 não provoca imunogenicidade clinicamente significativa quando administrado QD ou QW durante um período de 16 semanas.
[00187] As principais constatações deste estudo ampliam ainda mais o conhecimento adquirido com uma experiência de fase 2 anteri- or de 12 semanas do BMS-986036 em pacientes obesos com T2DM (MB130-002) (ver Charles E, Neuschwander-Tetri B, et al., Hepatology 2016; 64(Suppl 1): 17A). A obesidade e o T2DM são dois fatores de risco principais para o desenvolvimento da NAFLD, incluindo NASH. No MB130-002, a maioria dos pacientes provavelmente apresentava NAFLD subjacente. 97% dos pacientes tinham um índice de fígado gorduroso (FLI) ≥ 60, um ponto de corte indicativo da presença de fí-
gado gordo (ver Bedogni G, et al., BMC Gastroenterol 2006; 6: 33). Nesses pacientes, o BMS-986036 também melhorou os níveis de lipí- dios, de adiponectina e PRO-C3. Com importância, o perfil de segu- rança do BMS-986036 foi comparável com MB130-002 e no presente estudo, e foi caracterizado por uma frequência aumentada de sintomas gastrointestinais predominantemente leves, sem casos de lesão hepá- tica induzida por fármacos, sem alterações clinicamente significativas no ECG ou sinais vitais e nenhum efeito aparente na densidade óssea (conforme medido pela DXA) durante um período de 16 semanas. Em conjunto, os dados sugerem que o tratamento com BMS-986036 é bem tolerado e possui efeitos positivos nos parâmetros hepáticos e metabólicos em pacientes com NASH, assim como em pacientes com fatores de risco para NASH. Em resumo, o BMS-986036 foi geralmen- te seguro e bem tolerado quando administrado por injeção SC em do- ses de BMS-986036 20 mg QW ou BMS-986036 10 mg QD durante 16 semanas em indivíduos com NASH. Os resultados sugerem que o BMS-986036 possui efeitos benéficos sobre a esteatose, lesão hepáti- ca e fibrose na NASH: Regimes tanto com BMS-986036 10 mg QD quanto com BMS-986036 20 mg QW, em comparação com o placebo, reduziram significativamente a fração de gordura hepática na semana
16. Em relação ao placebo, o BMS-986036 QD e QW foram associa- dos com melhoras nos biomarcadores de fibrose (MRE e Pro-C3), pa- râmetros metabólicos (adiponectina e lipídios) e marcadores de lesão hepática (ALT e AST). Melhoras na RM-PDFF, Pro-C3, LDL, ALT e AST apresentaram dependência da dose. Para cada marcador (exceto para LDL), a maioria da diferença máxima observada no efeito do tra- tamento foi alcançada com BMS-986036 20 mg QW. A Ctrough de BMS-986036 (C-terminal intacto e Total) foi maior para 10 mg QD em relação a 20 mg QW. Os níveis de Ctrough permaneceram estáveis após o estado estacionário ter sido alcançado.
Exemplo 2: Pro-C3 no Soro na Linha de Base Prevê a Resposta ao BMS-986036: Uma Análise Secundária de um Estudo Clínico Mul- ticêntrico na NASH
[00188] O objetivo desta análise post hoc do estudo clínico do Exemplo 1 foi avaliar os indicadores da linha de base da resposta ao tratamento com o BMS-986036.
[00189] As análises post hoc avaliaram a conexão entre as caracte- rísticas da linha de base e as alterações nos marcadores do metabo- lismo, esteatose, lesão hepática e fibrose. As avaliações incluíram sta- tus de diabetes melito tipo 2 (T2DM), grau de biópsia hepática (Pontu- ação da Atividade de NAFLD [NAS]) e estágio de fibrose (critérios de NASH CRN) e níveis de Pro-C3 no soro (≥ 20 vs < 20 ng/mL). Os mar- cadores hepáticos e metabólicos foram avaliados na linha de base e na semana 16 e incluíram gordura hepática (MRI-PDFF), rigidez do fígado (MRE) e biomarcadores no soro: Pro-C3, ALT, AST, adiponecti- na, LDL, HDL, ácido hialurônico (HA), PAI-1 e CK-18 (citoqueratina- 18). Para os propósitos desta análise, os grupos de BMS 986036 (20 mg QW [n = 23] vs 10 mg QD [n = 25]) foram combinados e o grupo de placebo (n = 26) foi analisado separadamente. As comparações esta- tísticas foram feitas utilizando os testes de Kruskal-Wallis.
[00190] Os níveis médios na linha de base de Pro-C3 foram de uma forma geral consistentes nos grupos de tratamento com BMS-986036, nos quais a maioria dos pacientes (67%, [28/42]) apresentou níveis de Pro-C3 na linha de base < 20 ng/mL. Nos pacientes tratados com BMS-986036 (n = 48), o nível de Pro-C3 soro na linha de base ≥ 20 ng/mL, em comparação com < 20 ng/mL, foi associado a uma maior redução na MRE (alteração % média: -16,4% vs 6,0%, P = 0,0198) e maiores reduções nos níveis de Pro-C3 (alteração % média: -34,9% vs 23,1%, P = 0,08) (Figura 11A-11B). Os níveis de Pro-C3 na linha de base não previram a resposta ao tratamento com BMS-986036 avalia-
da por meio de outros biomarcadores hepáticos ou metabólicos. Ou- tras características da linha de base, incluindo o status de T2DM, NAS ou estágio de fibrose, não impactaram claramente as respostas dos marcadores em pacientes tratados com BMS-986036. No grupo de placebo, nenhuma característica da linha de base, incluindo os níveis de Pro-C3, foi claramente associada com as diferenças nas respostas dos biomarcadores avaliados.
[00191] Neste estudo clínico de Fase 2 na NASH, altos níveis na linha de base de Pro-C3 foram associados com as melhoras nos bio- marcadores de fibrose e rigidez do fígado (Pro-C3 e MRE) em pacien- tes tratados com BMS-986036. Por outro lado, outras características da linha de base, incluindo a gravidade da fibrose, não parecem prever a resposta ao tratamento com o BMS-986036. Esses resultados sus- tentam o uso do Pro-C3 no soro como um indicador da resposta ao tratamento com o BMS-986036 e como um marcador substituto poten- cial para identificar os pacientes ideais com NASH para o tratamento.
[00192] Por outro lado, pacientes com redução na fração de gordu- ra hepática ≥ 30% versus pacientes com < 30% apresentaram quedas significativamente maiores no Pro-C3, ALT, AST e CK-18 (Figuras 12A-12D). Além disso, uma redução na rigidez do fígado de ≥ 15% em comparação com a redução < 15% foi associada à diminuição do Pro- C3, HA e aumento do HDL (Figuras 13A-13C).
SUMÁRIO DA SEQUÊNCIA SEQ ID NO: SEQUÊNCIA SEQ ID NO: 1 HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGT (que correspon- VGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGA de à SEQ ID LYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGN NO: 1 da Paten- KSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVG te US 9.079.971) SSDPLSMVGPSQGRSPSYAS SEQ ID NO: 2 MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDG (que correspon- TVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDG de à SEQ ID ALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHL NO: 201 da Pa- PGNKSPHRDPAPRGPARFLPL tente US PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSY
9.434.778) AS

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para o tratamento de um paciente tendo esteato- hepatite não alcoólica (NASH), caracterizado pelo fato de que compre- ende: (a) determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente e (b) administrar ao paciente um fator de crescimento de fi- broblastos modificado 21 (FGF-21) em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, se o nível de Pro-C3 no soro for maior do que 10 ng/mL.
2. Método para o tratamento de um paciente com NASH que foi determinado para ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que 10 ng/mL, caracterizado pelo fato de que o método compreende a ad- ministração ao paciente de um fator de crescimento de fibroblastos modificado 21 (FGF-21) em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH.
3. Método para o tratamento de um paciente com NASH com fator de crescimento de fibroblastos modificado 21 (FGF-21), em que o paciente possui um nível de Pro-C3 no soro maior do que 10 ng/mL antes do tratamento, caracterizado pelo fato de que compreen- de administrar ao paciente o FGF-21 modificado em uma quantidade e com frequência suficiente para tratar a NASH.
4. Método para o tratamento de um paciente tendo NASH, caracterizado pelo fato de que compreende: (1) obter ou ter obtido uma amostra de sangue do paciente, (2) determinar ou ter determinado um nível de Pro-C3 no soro na amostra de sangue que é maior do que 10 ng/ML, e (3) administrar ao paciente um fator de crescimento de fi- broblastos modificado 21 (FGF-21) em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH após um nível de Pro-C3 no soro ter sido determinado.
5. Método para monitorar a receptividade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado, caracterizado pelo fato de que o método compreende: determinar o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tratamento, em que: uma diminuição do nível de Pro-C3 no so- ro na amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o trata- mento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amos- tra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o nível de Pro-C3 no soro antes da administração ao paciente de um fator de crescimento de fibroblas- tos modificado 21 (FGF-21) é maior que cerca do que 11 ng/mL, 12 ng/mL, 13 ng/mL, 14 ng/mL, 15 ng/mL, 16 ng/mL, 17 ng/mL, 18 ng/mL, 19 ng/mL, 20 ng/mL, 21 ng/mL, 22 ng/mL, 23 ng/mL, 24 ng/mL ou 25 ng/mL.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o nível de Pro-C3 no soro é maior do que cerca de 15 ng/mL.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o nível ou níveis de Pro-C3 são medidos por um teste aprovado pela FDA.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o nível ou os níveis de Pro-C3 são medidos mediante o uso de um imunoensaio, ensaio de imuno- química, ensaio de imuno-histoquímica, ensaio de sondas do núcleo, hibridização in situ, sondas de RNA fluorescentes, RT-PCR, ensaio de transcrição de microarranjos e/ou ensaio de transcrição de RNA.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio é um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA).
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o FGF-21 modificado com- preende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que um aminoácido no polipeptídeo é substituído por um aminoácido não codificado natu- ralmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente es- tá em uma posição que corresponde ao resíduo 108 da SEQ ID NO: 1; e (b) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para- acetil fenilalanina ligado a um polímero que compreende um po- li(etileno glicol).
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o FGF-21 modificado com- preende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, exceto que o aminoácido na posição 108 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente, em que: (a) dito aminoácido não codificado naturalmente compreende para-acetil fenilalanina e (b) dito aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero que compreen- de um poli(etileno glicol) tendo um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que dito poli(etileno glicol) possui um peso molecular médio ao redor de 30 kDa.
14. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, carac- terizado pelo fato de que dito aminoácido não codificado naturalmente está ligado ao dito polímero através de uma ligação de oxima.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o FGF-21 modificado com- preende a SEQ ID NO: 2.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que o FGF-21 modificado compreende um poli(etileno glicol) tendo um peso molecular médio de cerca de 30 kDa.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que o poli(etileno glicol) está ligado à para-acetil fenila- lanina.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o FGF-21 modificado é administrado em uma dose semanal de 20 mg ou uma dose diária de 10 mg.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende a administra- ção de um segundo agente terapêutico.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o tratamento resulta em uma diminuição dos níveis de Pro-C3 no soro em um paciente.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o tratamento produz uma mudança em direção aos níveis normais de Pro-C3 no soro em um paciente.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o tratamento com o FGF- 21 modificado resulta em uma redução na rigidez do fígado do pacien- te em comparação com a rigidez do fígado do paciente antes do tra- tamento, em que a rigidez do fígado é avaliada por elastografia de res- sonância magnética (MRE).
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o tratamento com o FGF- 21 modificado resulta em uma redução de 15% ou mais na rigidez do fígado do paciente em comparação com a rigidez do fígado do pacien-
te antes do tratamento, em que a rigidez do fígado é avaliada por MRE.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o tratamento com o FGF- 21 modificado resulta em uma redução na fração de gordura hepática no paciente em comparação com a fração de gordura hepática do pa- ciente antes do tratamento, em que a fração de gordura hepática é avaliada pela fração de gordura de densidade de prótons estimada pe- la formação de imagem por ressonância magnética (MRI-PDFF).
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o tratamento com o FGF- 21 modificado resulta em uma redução de 30% ou mais na fração de gordura hepática no paciente em comparação com a fração de gordura hepática do paciente antes do tratamento, em que a fração de gordura hepática é avaliada por MRI-PDFF.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o tratamento com o FGF- 21 modificado resulta em uma redução da rigidez do fígado no pacien- te em comparação com a rigidez do fígado do paciente antes do tra- tamento, e uma diminuição nos níveis de Pro-C3 no soro em um paci- ente em comparação com os níveis de Pro-C3 no soro do paciente an- tes do tratamento, em que a rigidez do fígado é avaliada por elastogra- fia de ressonância magnética (MRE), em que o paciente foi determina- do para ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que 10, 15 ou 20 ng/mL antes do tratamento com o FGF-21 modificado.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o tratamento produz pelo menos um efeito terapêutico no paciente selecionado do grupo que consiste em uma redução ou cessação da fadiga, indisposição, perda de peso e/ou desconforto abdominal no quadrante superior direito.
28. FGF-21 modificado para uso em um método de trata- mento de NASH em um paciente, caracterizado pelo fato de que com- preende a administração ao paciente de um fator de crescimento de fibroblastos modificado 21 (FGF-21) em uma quantidade e com uma frequência suficiente para tratar a NASH, em que o paciente foi deter- minado de ter um nível de Pro-C3 no soro maior do que 10, 15 ou 20 ng/mL.
29. FGF-21 modificado para uso em um método de monito- ramento da receptividade de um paciente tendo NASH ao tratamento com um FGF-21 modificado, caracterizado pelo fato de que um nível de Pro-C3 no soro reduzido em uma amostra de sangue do paciente obtida durante ou após o tratamento, em comparação com o nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de sangue do paciente obtida antes do tratamento com o FGF-21 modificado, indica que o paciente é res- ponsivo ao tratamento com o FGF-21 modificado.
30. Método para identificar um paciente tendo esteato- hepatite não alcoólica (NASH) que é adequado para o tratamento com um FGF-21 modificado, caracterizado pelo fato de que compreende a determinação de um nível de Pro-C3 no soro em uma amostra de san- gue do paciente utilizando um ensaio in vitro, em que o nível de Pro- C3 no soro na amostra de sangue é maior do que 10, 15 ou 20 ng/mL.
Disposição do paciente
184 pacientes avaliados com relação à elegibilidade e inscritos 95 não atenderam aos critérios do estudo
Petição 870200027621, de 28/02/2020, pág. 115/133 5 retiraram o consentimento 1 insatisfatório/não cooperou 80 entraram no período de 3 outros introdução de placebo 2 deixaram de cumprir os critérios do estudo 3 escolhidos a esmo e tratados em um sub-estudo separado 75 escolhidos a esmo
25 atribuídos com 24 atribuídos com 1/13
26 atribuídos BMS-986036 BMS-986036 com placebo 10 mg QD 20 mg QW
1 interrompeu o tratamento 2 interromperam o tratamento 1 interrompeu o tratamento 1 [pediu para interromper] 2 [perdidos para acompanhamento] 1 [perdido para acompanhamento]
24 completaram o 22 completaram o 25 completaram o período de tratamento período de tratamento período de tratamento
25 foram incluídos na 24 foram incluídos na 26 foram incluídos na análise primária análise primária análise primária
Alteração na fração de gordura hepática medida pela MRI-PDFF na semana 16 Alteração absoluta na fração de gordura Alteração absoluta a partir da linha de base hepática a partir da linha de base para a semana 16 (% de fração de gordura) Média ajustada [90% CI] CI = intervalo de confiança, HFF = fração de gordura hepática, MRI-PDFF = fração de gordura de densidade de prótons estimada pela formação de imagem por ressonância magnética, MMRM = modelo de efeitos misturados para medidas repetidas, QD = uma vez ao dia, QW = uma vez por semana. *As análises estatísticas inferenciais foram conduzidas utilizando MMRM e não ajustadas para múltiplas comparações. †As análises estatísticas inferenciais foram conduzidas post hoc utilizando o teste exato de Fisher e não ajustadas para múltiplas comparações.
Alteração na fração de gordura hepática medida pela MRI-PDFF na semana 16 MRI-PDFF de paciente tratado com BMS-986036 20 mg QW Linha de base Semana 8 Semana 16 Alteração absoluta na HFF Alteração relativa na HFF Alteração na fração de gordura hepática medida pela MRI-PDFF na semana 16 Percentual de pacientes com ≥ 30%, ≥ 20% ou ≥ 10% de reduções relativas na fração de gordura hepática % de pacientes ≥ 30% de ≥ 20% de ≥ 10% de redução relativa redução relativa redução relativa
Alteração na rigidez do fígado na semana 16 Ateração absoluta na rigidez do fígado (MRE) a partir da linha de base para a semana 16 Petição 870200027621, de 28/02/2020, pág. 117/133 CI = intervalo de confiança. kPa, kilopascal Média MRE = elastografia de ressonância magnética QD = uma vez ao dia, QW = uma vez por semana SD = desvio padrão Alteração da linha de base 3/13 Alteração na rigidez do fígado na semana 16 Percentual de pacientes com ≥ 15% de redução relativa na rigidez do fígado (MRE) na semana 16 CI = intervalo de confiança. kPa, kilopascal MRE = elastografia de ressonância magnética QD = uma vez ao dia, QW = uma vez por semana SD = desvio padrão.
% de pacientes com ≥ 15% de redução relativa na rigidez do fígado
Imagem de MRE de pacientes tratados com BMS-986036 20 mg QW
MRE-mapa da rigidez
Petição 870200027621, de 28/02/2020, pág. 118/133 MRI-mapa da rigidez com mapa de confiança
Linha de base 4/13
Semana 16 kPa = kilopascal MRE = elastografia de ressonância magnética Rigidez ao cisalhamento (KPa) QW = uma vez por semana
Alteração percentual na adiponectina a partir da linha de base para a semana 16
Petição 870200027621, de 28/02/2020, pág. 119/133 5/13
Média Alteração % ajustada a partira da linha de base,
Petição 870200027621, de 28/02/2020, pág. 120/133 Distribuição de PRO-C3 da linha de base Distribuição de PRO-C3 da linha de base entre pacientes tratados com BMS-986036 entre pacientes tratados com BMS-986036 6/13
Frequência
Pacientes individualmene tratados com BMS-986036
PRO-C3, propeptídeo de colágeno do tipo III N-terminal PRO-C3, propeptídeo de colágeno do tipo III N-terminal
Redução de PRO-C3 no soro na semana 16 Alteração percentual dos níveis de PRO-C3 da linha de base na semana 16 Petição 870200027621, de 28/02/2020, pág. 121/133 CI = intervalo de confiança. PRO-C3, propeptídeo de colágeno do tipo 3 N-terminal. QD = uma vez ao dia, QW = uma vez por semana. *As análises estatísticas inferenciais foram conduzidas post hoc utilizando uma análise do Média modelo de medidas repetidas longitudinais. †O tamanho da amostra para PRO-C3 no soro foi menor do que a MRI-PDFF devido a algumas amostras não avaliáveis na linha de base.
Percentual ajustado da linha de base, 7/13 Redução de PRO-C3 no soro na semana 16 Percentual de pacientes com ≥ 15% de redução relativa no PRO-C3 na semana 16 CI = intervalo de confiança. MRI-PDFF = fração de gordura de densidade de prótons estimada pela formação de imagem por ressonância magnética. PRO-C3, propeptídeo de colágeno do tipo 3 N-terminal. QD = uma vez ao dia, QW = uma vez por semana. *As análises estatísticas inferenciais foram conduzidas post hoc utilizando uma análise do modelo de medidas de redução relativa no repetidas longitudinais. †O tamanho da amostra para PRO-C3 no soro foi menor do que a MRI-PDFF devido a % de pacientes com ≥ 15% algumas amostras não avaliáveis na linha de base.
Alteração nos marcadores de lesão hepática no final do tratamento
Alteração percentual na ALT a partir da linha de base para a semana 16 % de alteração a partir da linha de base, Média
Alteração nos marcadores de lesão hepática no final do tratamento Alteração percentual na AST a partir da linha de base para a semana 16 % de alteração a partir da linha de base, Média
Alteração nos marcadores metabólicos na semana 16 Alteração no colesterol LDL a partir Alteração a partir da linha de base (mg/dL), da linha de base para a semana 16 CI = intervalo de confiança. HDL = lipoproteína de alta densidade. LDL = lipoproteína de baixa densidade. MMRM = modelo de efeitos misturados média (SD) para medidas repetidas. MRI-PDFF = fração de gordura de densidade de prótons estimada pela formação de imagem por ressonância magnética. QD = uma vez ao dia, QW = uma vez por semana. SD = desvio padrão. *As análises estatísticas inferenciais foram conduzidas post hoc utilizando um MMRM e não ajustadas para múltiplas comparações. †O tamanho da amostra para adiponectina foi menor do que a MRI-PDFF devido a algumas amostras não avaliáveis na linha de base.
Alteração nos marcadores metabólicos na semana 16 Alteração a partir da linha de base (mg/dL), Alteração no colesterol HDL a partir da linha de base para a semana 16 CI = intervalo de confiança. HDL = lipoproteína de alta densidade. LDL = lipoproteína de baixa densidade. MMRM = modelo de efeitos misturados média (SD) para medidas repetidas. MRI-PDFF = fração de gordura de densidade de prótons estimada pela formação de imagem por ressonância magnética. QD = uma vez ao dia, QW = uma vez por semana. SD = desvio padrão. *As análises estatísticas inferenciais foram conduzidas post hoc utilizando um MMRM e não ajustadas para múltiplas comparações. †O tamanho da amostra para adiponectina foi menor do que a MRI-PDFF devido a algumas amostras não avaliáveis na linha de base.
Alteração nos marcadores metabólicos na semana 16 Alteração a partir da linha de base (mg/dL), Alteração nos trigliceriídeos a partir da linha de base para a semana 16 CI = intervalo de confiança. HDL = lipoproteína de alta densidade. LDL = lipoproteína de baixa densidade. MMRM = modelo de efeitos misturados média (SD) para medidas repetidas. MRI-PDFF = fração de gordura de densidade de prótons estimada pela ormação de imagem por ressonância magnética. QD = uma vez ao dia, QW = uma vez por semana. SD = desvio padrão. *As análises estatísticas inferenciais foram conduzidas post hoc utilizando um MMRM e não ajustadas para múltiplas comparações. †O tamanho da amostra para adiponectina foi menor do que a MRI-PDFF devido a algumas amostras não avaliáveis na linha de base.
Densidade mineral do osso medida por DXA nas 16 semanas (D112) e 6 meses após o tratamento (D292) % de alteração a partir da linha de base, Fêmur* D = dia. DXA = absorciometria por raios X de d upla emissão. PBO = placebo. QD = uma vez ao Média dia, QW = uma vez por semana. SD = desvio padrão. *Todos os pacientes tiveram os dados disponíveis no dia 112 e os dados no dia 292 estavam disponíveis para 50% dos pacientes.
Densidade mineral do osso medida por DXA nas 16 semanas (D112) e 6 meses após o tratamento (D292) % de alteração a partir da linha de base, D = dia. DXA = absorciometria por raios X de dupla emissão. PBO = placebo. QD = uma vez ao dia, QW = uma vez por semana. SD = desvio padrão. *Todos os pacientes tiveram os dados disponíveis Média no dia 112 e os dados no dia 292 estavam disponíveis para 50% dos pacientes.
Densidade mineral do osso medida por DXA nas 16 semanas (D112) e 6 meses após o tratamento (D292) % de alteração a partir da linha de base, Espinha dorsal * D = dia. DXA = absorciometria por raios X de dupla emissão. PBO = placebo. QD = uma vez ao dia, QW = uma vez por semana. SD = desvio padrão. Média *Todos os pacientes tiveram os dados disponíveis no dia 112 e os dados no dia 292 estavam disponíveis para 50% dos pacientes.
% de alteração a partir da linha de base
PRO-C3 da linha de base Média
PRO-C3 da linha de base % de alteração a partir da linha de base Média
Petição 870200027621, de 28/02/2020, pág. 126/133 % de alteração a partir da linha de base % de alteração a partir da linha de base Média Média Redução na fração de gordura hepática
Redução na fração de gordura hepática
% de alteração a partir da linha de base % de alteração a partir da linha de base Média Média Redução na fração de gordura hepática
Redução na fração de gordura hepática 12/13
Petição 870200027621, de 28/02/2020, pág. 127/133 % de alteração a partir da linha de base Média % de alteração a partir da linha de base Média Redução na rigidez do fígado
% de alteração a partir da linha de base Média Redução na rigidez do fígado Redução na rigidez do fígado 13/13
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