KR20150010793A - 열 충격 단백질 (hsp) 90-베타의 조절에 의한 대사 증후군의 치료 방법들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HSP90 저해제들, 특히 Hsp90P 저해제들로 대사 증후군을 치료하는 방법들을 제공한다. 본 발명은 HSP90, 특히 Hsp90p, 발현 및 활성 수준, 을 이용하는 대사 증후군의 진단 및 모니터링 방법들을 제공한다.

Description

열 충격 단백질 (HSP) 90-베타의 조절에 의한 대사 증후군의 치료 방법들{METHODS OF TREATING A METABOLIC SYNDROME BY MODULATING HEAT SHOCK PROTEIN (HSP) 90-BETA}
[우선권 정보]
본 출원은 2012년 5월 25일에 출원된 미국 가출원 제61/652023호의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참조로서 편입된다.
[서열 목록]
본 출원은 EFS-Web을 통하여 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며 그 전부가 참조로서 본 명세서에 편입된다. 2013년 5월 14일에 생성된 상기 ASCII 카피는 SeqLst.txt라는 이름이며 크기는 22,186 바이트이다.
[배경기술]
혈당의 수준은 식후에 상승하므로, 인슐린이 분비되고 에너지 원으로서 혈액으로부터 글루코오스를 활발하게 받아들이도록 말초 조직들 (골격근들 및 지방)의 세포들을 자극한다. 인슐린 분비 또는 작용의 조절 곤란의 결과로서 글루코오스 항상성의 손실은 전형적으로 대사 장애들 이를테면 당뇨병을 일으키는데, 이는 비만이 함께 촉발될 수 있거나 (co-triggered) 또는 비만에 의하여 더욱 악화될 수 있다. 이들 상태들이 종종 치명적이므로, 혈류로부터 적절한 글루코오스 청소율(clearance)을 복구시키는 전략이 요구된다.
비록 당뇨병은 췌장에 심각한 손상 (예컨대, 췌장염, 종양들, 특정 약물들 이를 테면 코르티코스테로이드들 또는 또는 펜타미딘의 투여, 철분 과부하 (즉, 혈 색소 침착증), 후천적 또는 유전자적 내분비병증들, 그리고 외과적 적출)을 일으키는 여하한 상태에 이차적으로 나타날 수 있으나, 당뇨병의 가장 흔한 형태는 전형적으로 인슐린 신호 시스템의 일차 장애들로부터 일어난다. 당뇨병에는 두 가지 주요한 타입들 있는데, 이른바 타입 1 당뇨병 (또한 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM)으로 알려짐) 그리고 타입 2 당뇨병 (또한 인슐린 독립성 또는 비-인슐린 의존성 당뇨병 (NIDDM)으로 알려짐)이며, 이들은 그들의 상이한 발명 메커니즘들에도 불구하고 공통의 장-기간 합병증들을 공유한다.
타입 1 당뇨병, 일차 당뇨병의 모든 케이스의 대략적으로 10%를 차지함, 은 췌장의 인슐린-생성 베타 세포들의 심각한 파괴에 의하여 특징지워지는 기관-특이적 자가면역 질환이다. 인슐린 생산의 결과적인 감소는 필연적으로 글루코오스 대사의 조절완화(deregulation)에 이르게 한다. 인슐린의 투여는 이 상태로 고통받는 환자들에게 현저한 이득을 제공하는 동시에, 인슐린의 짧은 혈청 반감기(half-life)는 정상혈당의 유지에 주요한 장애가 된다. 대안적인 치료는 섬 이식이지만, 이 전략은 낮은 성공률과 관련되어 있다.
타입 2 당뇨병, 이는 인구의 보다 큰 비율에 영향을 줌, 은 인슐린의 분비에서의 조절완화 및/또는 인슐린에 대한 말초 조직들의 감소된 반응, 즉, 인슐린 저항성에 의하여 특징지워 진다. 타입 2 당뇨병의 병원론은 분명하지 않지만, 역학적인 연구들은 당뇨병의 이 형태는, 과도한 체중, 다이어트, 무활동, 약물들, 그리고 과도한 알코올 소비를 포함하는, 각각 그 자신의 예측 위험들에 기여하며 환경적 인자들에 의하여 변경되는 다중의 유전적 결함들 또는 다형성들의 집합으로부터 초래됨을 제안한다. 비록 다양한 치료적 처치들이 타입 2 당뇨병의 관리에 이용 가능하지만, 그들은 다양한 약화시키는 부작용들과 연관되어 있다. 따라서, 타입 2 당뇨병으로 진단되거나 또는 이를 가질 위험이 있는 환자들은 종종 체중 감소, 식이 변화, 운동 및 적당한 알코올의 섭취를 포함하는 보다 건강한 라이프스타일을 채용하도록 권고받는다. 그러한 라이프스타일 변화는, 그러나, 당뇨병에 의한 혈관 및 기관 손상을 역전시키는데 충분하지 않다.
[발명의 요약]
일 측면에서, 본 발명은 대상에서 대사 증후군을 치료하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 대상에 HSP90 조절제를 투여하는 것, 이로써 상기 대상에서 상기 대사 증후군을 치료하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 HSP90 조절제는 HSP90 저해제이다.
일 실시예에서, 상기 HSP90 저해제는 Hsp90β의 저해제이다.
일 실시예에서, 상기 HSP90 저해제는 Hsp90β의 특이적 저해제이다.
일 실시예에서, 상기 HSP90 저해제는 HSP90α의 저해제이다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 타입 2 당뇨병을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 타입 1 당뇨병을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 인슐린 저항성을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 인슐린 부족을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 비만을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 고인슐린혈증을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 손상된 글루코오스 내성 (IGT)을 포함한다.
일 실시예에서, 대사 증후군이 있는 대상은 셋 또는 그 이상의 이하의 징후들을 나타낸다:
a) 130/85mMHg 이상의 혈압;
b) 100mg/dL 이상의 공복 혈당;
c) 큰 허리 둘레, 여기서 큰 허리 둘레는 남성의 경우 40 인치 또는 그 이상이며 여성의 경우 35 인치 또는 그 이상이다;
d) 낮은 HDL 콜레스테롤, 여기서 낮은 LDH 콜레스테롤은 남성의 경우 40mg/dL 보다 작으며50mg/dL 보다 작다; 그리고
e) 150mg/dL 이상의 트리글리세라이드들.
일 실시예에서, 상기 HSP90 저해제는 핵산 저해제를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 핵산 저해제는 안티센스 핵산 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 핵산 저해제는 이중 가닥 핵산 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 핵산 저해제는 siRNA, shRNA, 그리고 다이서 기질(dicer substrate) siRNA (DsiRNA) 로 구성된 그룹으로부터 선택되는 이중 가닥 RNA를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 HSP90 저해제는 항체를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 HSP90 저해제는 소분자를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 소분자는 로니다민 또는 그의 유사체, 세라스트롤 또는 그의 유사체, 게두닌 또는 그의 유사체, 그리고 쿠머마이신 또는 그의 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 대상에서 혈당 수준을 정상화하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 대상에서 Hb1Ac 수준을 정상화하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 불량한 순환과 연관된 당뇨병의 하나 이상의 합병증의 예방을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 타입 2 당뇨병의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 타입 1 당뇨병의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 인슐린 저항성의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 인슐린 부족의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 고인슐린혈증의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 손상된 글루코오스 내성 (IGT)의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 비만의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 하나 이상의 다음의 개선을 포함한다:
a) 130/85mMHg 이상의 혈압;
b) 100mg/dL 이상의 공복 혈당;
c) 큰 허리 둘레, 여기서 큰 허리 둘레는 남성의 경우 40 인치 또는 그 이상이며 여성의 경우 35 인치 또는 그 이상이다;
d) 낮은 HDL 콜레스테롤, 여기서 낮은 LDH 콜레스테롤은 남성의 경우 40mg/dL 보다 작으며 그리고 50mg/dL 보다 작다; 그리고
e) 150mg/dL 이상의 트리글리세라이드들.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 상승된 130/85mMHg 이상의 혈압의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 상승된 100mg/dL 이상의 공복 혈당의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 큰 허리 둘레, 여기서 큰 허리 둘레는 남성의 경우 40 인치 또는 그 이상이며 여성의 경우 35 인치 또는 그 이상임, 의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 HDL 콜레스테롤을 증가시킴으로써 낮은 HDL 콜레스테롤, 여기서 낮은 LDH 콜레스테롤은 남성의 경우 40mg/dL 보다 작은 것이며 그리고 50mg/dL 보다 작은 것임, 의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군을 치료하는 것은 상승된 150mg/dL 이상의 트리글리세라이드들의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 대사 증후군을 치료하는 것은 지방간의 개선을 포함한다.
일 실시예에서, 대사 증후군을 치료하는 것은 지방 침착의 조절을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 이하를 포함하는 대상에서 대사 증후군을 진단하는 방법을 제공한다:
a) 상기 대상으로부터의 샘플에서 Hsp90β 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 그리고
b) 상기 대상으로부터의 샘플 내의 Hsp90β 발현의 수준 또는 활성을 대조군 샘플에 비교하는 단계, 여기서 상기 대상 샘플에서 대조군 샘플에 비하여 Hsp90β의 증가된 발현 또는 활성은 상기 대상에서 대사 장애의 지표이다.
일 실시예에서, Hsp90β 발현의 수준은 Hsp90β 단백질 또는 HSP90AB1 유전자의 발현의 수준을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 방법은 상기 대상에서 대사 장애를 치료하는 것을 더 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 타입 2 당뇨병을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 타입 1 당뇨병을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 타입 인슐린 저항성을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 인슐린 부족을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 비만을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 고인슐린혈증을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 손상된 글루코오스 내성 (IGT)을 포함한다.
일 실시예에서, 대사 증후군이 있는 상기 대상은 하나 또는 그 이상의 이하의 징후들을 더 나타낸다:
a) 130/85mMHg 이상의 혈압;
b) 100mg/dL 이상의 공복 혈당;
c) 큰 허리 둘레, 여기서 큰 허리 둘레는 남성의 경우 40 인치 또는 그 이상이며 여성의 경우 35 인치 또는 그 이상이다;
d) 낮은 HDL 콜레스테롤, 여기서 낮은 LDH 콜레스테롤은 남성의 경우 40mg/dL 보다 작은 것이며 그리고 50mg/dL 보다 작은 것이다; 그리고
e) 150mg/dL 이상의 트리글리세라이드들.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 대상에서 대사 증후군을 모니터링하는 방법을 제공한다:
a) 상기 대상으로부터 제 1 시점에서 그리고 제 2 시점에서 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 제 1 시점에서 그리고 상기 제 2 시점에서 Hsp90β 발현 또는 활성을 수준을 측정하는 단계; 그리고
c) 상기 제 1 시점에서 Hsp90β 발현의 수준 또는 활성을 상기 제 2 시점에서 Hsp90β 발현의 수준 또는 활성에 비교하는 단계, 여기서 제 1 시점에 비하여 상기 제 2 시점에서 Hsp90β 발현의 수준 또는 활성의 변화는 상기 대상에서 대사 증후군의 변화의 지표이다.
일 실시예에서, Hsp90β 발현의 수준은 Hsp90β 단백질 또는 HSP90AB1 유전자의 발현의 수준을 포함한다.
일 실시예에서, Hsp90β 발현 또는 활성의 증가는 대사 증후군 악화의 지표이다. 일 실시예에서, Hsp90β 발현 또는 활성의 감소는 대사 증후군에서 개선의 지표이다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 타입 2 당뇨병을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 타입 1 당뇨병을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 타입 인슐린 저항성을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 인슐린 부족을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 비만을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 고인슐린혈증을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대사 증후군은 손상된 글루코오스 내성 (IGT)을 포함한다.
일 실시예에서, 대사 증후군이 있는 상기 대상은 하나 또는 그 이상의 이하의 징후들을 더 나타낸다:
a) 130/85mMHg 이상의 혈압;
b) 100mg/dL 이상의 공복 혈당;
c) 큰 허리 둘레, 여기서 큰 허리 둘레는 남성의 경우 40 인치 또는 그 이상이며 여성의 경우 35 인치 또는 그 이상이다;
d) 낮은 HDL 콜레스테롤, 여기서 낮은 LDH 콜레스테롤은 남성의 경우 40mg/dL 보다 작으며 그리고 50mg/dL 보다 작다; 그리고
e) 150mg/dL 이상의 트리글리세라이드들.
본 발명에 의해 HSP90 저해제들, 특히 Hsp90P 저해제들로 대사 증후군을 치료하는 방법들을 제공된다. 본 발명에 의해 HSP90, 특히 Hsp90p, 발현 및 활성 수준, 을 이용하는 대사 증후군의 진단 및 모니터링 방법들이 제공된다.
도 1은 당뇨병 모델을 적용하는 질문 플랫폼 방법(interrogatory platform method)에서 사용되는 델타-델타 네트워크들의 도식적 표현이다. HG는 고혈당증; HGT1 코엔자임 Q10 처치된 고혈당증; 그리고 NG는 정상 혈당증이다.
도 2는 본원 명세서에서 논의된 질문 플랫폼 방법에 의하여 생성된 당뇨병 대 정상 세포 모델들에서의 네트워크의 도식적 표현이다. 더 어두운 노드들은 상기 방법을 사용하여 확인된 활성의 5개의 주요 허브들(predominant hubs)을 나타낸다.
도 3은 도 2에서 박스에 의하여 지시된 네트워크의 확대된 버전이며, 본원 명세서에서 논의된 플랫폼 방법 당뇨병 아웃풋으로부터 관심 인과 노드들 (causal nodes of interest) 및 HSP90AB1 (Hsp90β)의 연결 맵(association map)을 보여준다.
도 4는 델타-델타 네트워크들에서 인과 단백질 연결들을 묘사하는데 사용된 심볼들 및 색상 코드들에 대한 색인(key)을 제공한다.
도 5는 대사 인자들 및 염증에 반응한 Hsp90β 발현 mRNA및 단백질의 유도를 도시한다.
도 6은 AKT, ERK, 및 GSK3β의 인슐린 자극 인산화의 현저한 증가에 이르게 하는 근관세포들(myotubes)에서 Hsp90β의 넉다운의 결과들을 도시한다. pERK 상의 넉다운의 효과는 스크램블(scrambled) siRNA에 비하여 현저하였다.
도 7은 스크램블 siRNA (si scrambled)에 비교하는 경우 인슐린 자극 포도당 섭취의 현저한 증가에 이르게 하는 근관세포들에서 Hsp90β의 넉다운의 결과들을 도시한다.
도 8 은, 스크램블 siRNA과 비교하여 CCCP 유도 언커플링(uncoupling)의 현저한 증가에 이르게 하는, 근관세포들에서 Hsp90β의 넉다운의 결과들을 도시한다. Hsp90β가 넉다운된 근관세포들에서의 기초 호흡이 스크램블 siRNA (si scrambled)로 처리된 근관세포들에서보다 약간 높은 것으로 관찰되었다.
도9A 및 9B는 근관세포들을 Hsp90 저해제 (CCT018159)로 처치한 효과들을 입증하는 (A) 웨스턴 블롯 및 (B) 정량 분석 결과들을 도시하는데, 이는 처치되지 않은 배양들과 비교하여 포스포-AKT의 수준들을 증가시키는 것으로 관찰되었다. pERK 또는 pGSK3β에서 현저한 변화들은 관찰되지 않았다.
도 10 은 골격근 근관세포들을 1μM, 3μM, 그리고 10μM의 Hsp90 저해제 (CCT018159)로 처치한 결과들을 도시하는데, 이는 미토콘드리아 대사에 대한 CCCP 유도 언커플링 반응들에 현저한 효과를 갖지 못하였다.
도11A 및 11B는 근관세포들에서 (A) 대사 촉매 유전자 발현 (헥소키나아제 2 (HK2); 락테이트 디하이드로게나아제 (LDH); 글리코겐 신타아제 1 (GYS1); 카르니틴 팔미토일 트랜스퍼라아제 1 (CPT-1); 아세틸 CoA 카르복실라아제 1 및 2 (ACC1 및 ACC2); 호르몬 감수성 리파아제 (HSL); 그리고 미토콘드리아 언커플링 단백질 3 (UCP 3))에 대한; 그리고 (B) 골격근 근관세포들에서 UCP3 발현에 대한 Hsp90β의 넉다운의 효과들을 도시한다.
도 12A-12D는 (A) 글루코오스 유도 ECAR; (B) 올리고마이신 유도 ECAR; (C) 기저 OCR; 그리고 (D) 언커플링된 OCR에서 골격근 근관세포들에서의 포도당화 해당능률(glycolytic flux)에 대한 Hsp90β의 넉다운의 효과를 도시한다.
도 13A 및 13B는 (A) 웨스턴 블롯 및 (B) 정량적으로 도시된 바와 같이 근육 근관세포들에서의 염증성 인슐린 저항성 모델에서 총 Erk 수준들에 대한 인산화된-Erk 수준들의 비율에 대한 Hsp90β의 넉다운의 효과를 도시한다.
도 14는 골격근 근관세포들에서 정상-글루코오스 조건들 하에서 팔미테이트 유도 OCR에서의 상대 OCR/DNA 비율에 대한 Hsp90β 넉다운의 효과를 도시한다.
도 15 는 인간 HSP90AA1 유전자 (서열 번호: 7) 및 HSP90α 단백질 (서열 번호: 8)의 서열을 도시한다.
도 16은 인간 HSP90AB 유전자 (서열 번호: 9) 및 Hsp90β 단백질 (서열 번호: 10)의 서열을 도시한다.
도 17 은 인간 HSP90AB 유전자 (서열 번호: 9)와 HSP90AA1 유전자 (서열 번호: 7); 그리고 인간 Hsp90β 단백질 (서열 번호: 10)와 인간 HSP90α 단백질 (서열 번호: 8)의 서열들의 정렬들을 도시한다.
디스커버리 플랫폼 기술이 당뇨병 및 대사 증후군의 병리 생리학을 구동하는 명백한(distinct) 분자 서명들(molecular signatures)을 묘사하기 위하여 사용되었다. Hsp90β는 이 디스커버리 플랫폼 기술을 통하여 당뇨병의 인간 일차 시험관 내 모델들에서 현저하게 조절되는, 그리고 지질 대사, 프로테아좀 기능, 엔도좀 트레피킹, 그리고 RNA 스플라이싱과 연관된 다중 메커니즘과 관련된 임계 노드(critical node)로서 확인되었다.
열 충격 단백질들 (HSPs)은 클라이언트 단백질들의 많은 세트들을 안정화 하는 분자 샤페론들(chaperones)이다. 척추동물들은 사이토졸 HSP90, HSP90α (유전자 HSP90AA1) 그리고 Hsp90β (유전자 HSP90AB1)의 두 동종형들을 갖는다. 척추동물들에서, 상기 HSP90 동종형들은 일반적으로 아미노산 서열 수준에서 약 85% 동일하다. 인간들에서, 상기HSP90α 아미노산 서열은 Hsp90β 아미노산 서열에 86% 동일하며 93% 유사하다. 양쪽 모두의 단백질들은 ATP 결합 도메인을 포함한다. Hsp90β는 대부분의 세포들에서 높은 수준으로 구성요소로서 발현되며 일반적으로 HSP90α보다 풍부하다. HSP90α 발현은 스트레스-유도성이며 상기 단백질은 많은 암세포들에서 과발현된다. HSP90 동종형들의 클라이언트 단백질들은 대부분 중복되나, HSP90α는 열 충격 후, 많은 신호 단백질들, 예컨대, c-Src, A-raf의 샤프로닝(chaperoning)을 책임진다.
비록 시험관 내 분석이 유사한 그리고 상당히 중복적인(redundant) 기능들을 제안하지만, HSP90 넉아웃 마우스들의 표현형들은 두드러지게 상이하다. Hsp90β 넉아웃 마우스는 초기 배아 치사성(lethality)을 나타낸다. 반대로, HSP90α- 결손 마우스들에서 확인되는 유일한 결함은 성체 수컷에서 나타나는데, 이는 정자형성의 실패를 나타낸다. Hsp90β의 경우, 치사성은 9일의 배아에서 일어나는데, 이는 착상의 실패 및 24시간 안에 사망에 이르게 하는 배아의 태반 발생의 무능력에 기인한다. 이들 돌연변이체들은 HSP90α를 발현하지만, 그럼에도 실패는 발생되는데, 이는 HSP90α가 이 결정적인 발생 단계에서 Hsp90β를 보완하지 못함을 제안한다. Hsp90β와 반대로, 양쪽 모두의 수컷 및 암컷 HSP90α 넉아웃 마우스들은 생존 가능하며 성체까지 표현형적으로 정상인데, 단 수컷 마우스들의 불임성만이 예외이다. 이들 결과들은 두 HSP90 동종형들이 마우스들의 생체 내에서 상이한 역할들을 담당함을 입증한다.
일차 인간 골격근 세포들 (HSMM) 및 간세포암 (HepG2) 세포들로 다양한 기능적 분석들을 이용함으로써, 본원 출원인들은 Hsp90β의 RNAi 매개 넉다운이 기저 OCR/ECAR 비율을 ~50%까지의 감소를 초래하였음을 입증하였다. 상기 감소된 비율은 HSMM 및 HepG2 세포들 양쪽 모두에서 감소된 OCR 및 상승된 ECAR 에 기인하였는데, 이는 Hsp90β가 산화적 호흡 및 해당을 조절함을 지시한다. 더욱이, HSMM 세포들에서 Hsp90β 넉다운은 글루코오스 유도된 ECAR를 증가시켰는데, 이는 감소된 Hsp90β에 의하여 유도된 해당을 증진시켰음을 입증한다.
나아가, 본원 출원인들은 일차 인간 골격근 세포들에서, Hsp90β을 넉다운시키는 것이 인슐린 자극 포도당 섭취의 증가를 유도하였다는 것을 입증하였고, 이는 Hsp90β가 골격근 글루코오스 대사 및 인슐린 작용에 관련된다는 것을 지시한다. 나아가, 근관세포들에서 Hsp90β의 넉다운이 pERK의 현저한 다운스트림 유도 그리고 pAKT 및 pGSK3β에 대한 중간 정도의 영향을 초래한다는 본 출원인들에 의한 관찰은 인슐린 신호의 기능적 분지(functional bifurcation) 및 Hsp90β가 선택적 메커니즘에 관여한다는 것을 제안한다. 추가 실험들에서, 본원 출원인들 HSP90α 및 Hsp90β 양쪽 모두를 저해하는 팬(pan) HSP90 소분자 저해제 (CCT018159)가 단독Hsp90β 넉다운보다 인슐린 신호 및 생물에너지학적으로 덜 심한 효과를 갖는다는 것을 보여주었다. 따라서, 특이적 Hsp90β 저해는 팬 HSP90 저해 접근방식보다 효과적임이 밝혀졌다.
요약하면, 넉다운 Hsp90β는 본원 출원인들에 의하여 생물에너지학 및 미토콘드리아 기질 대사에 현저한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 특히, HSP90β는 본원 명세서에서 설명된 연구들로부터 세포 대사의 중요한 조절제 및 골격근 세포들에서 산화적 호흡 및 해당 사이의 분자 스위치로서 명백해졌다. Hsp90β는 그러므로 당뇨병에서 실행 가능한 치료적 표적이다.
[정의들]
본원 명세서에서 사용되는, "HSP90 저해제" 는 HSP90의 발현 또는 활성을 감소시키는 치료제이다. HSP90 저해제는 HSP90과 직접 작용함에 의하거나 HSP90/CDC37 복합체의 형성을 감소시키거나 또는 방지함에 의하는 어느 하나에 의하여 HSP90 활성을 감소시킬 수 있으며 따라서 HSP90의 하나 이상의 클라이언트 단백질의 적절한 폴딩(folding) 및 발현이 저해된다. 본원 명세서에서 사용되는, "HSP90" 저해제는 여하한 메커니즘에 의하여 작용할 수 있는데, 예컨대, RNA 또는 단백질 수준에서 HSP90의 발현을 저해함에 의하거나; HSP90의 활성을 저해함에 의하거나, 예컨대, ATP 결합 또는 가수분해를 저해함에 의하거나; 또는 HSP90와 하나 또는 그 이상의 그의 상호작용 단백질들의 상호작용을 저해함에 의하거나; 또는 HSP90의 안정성을 감소시킴에 의한다. HSP90 저해제들은 하나 또는 그 이상 HSP90 동종형들(isoforms)의 활성을 저해할 수 있다. 예를 들면, HSP90α의 저해제는 또한 Hsp90β를 저해할 수 있다. 유사하게, Hsp90β의 저해제는 또한 HSP90α를 저해할 수 있다. 일 실시예에서, HSP90 저해제들은 특이적 HSP90 동종형의 저해에 대하여 특이적, 예를 들면, Hsp90β의 저해에 대하여 특이적일 수 있는데, 즉, HSP90α 를 훨씬 덜 저해하는 동안 Hsp90β를 주로 저해할 수 있다.
HSP90 저해제들은 (i) 소분자 저해제들, 이들의 다수는 HSP90의 다중 동종형들의 활성을 저해하는데, 예컨대, 라디시콜 그리고 겔다나마이신 그리고 그의 유도체들임; (ii) 핵산 저해제들, 예컨대, HSP90의 하나 또는 그 이상의 특이적 동종형들을 표적할 수 있는 안티센스, siRNA, shRNA, dsiRNA, 등등 (예컨대, 본원 명세서에서 제공된 실시예들; Kuo et al., 2007, J. Immunol. 178:600; Didelot et al., 2008, Cell. Death Diff., 15:859, 이들 각각의 전체 내용은 본원 명세서에 참조로서 편입됨, 참조); 그리고 (iii) HSP90의 하나 또는 그 이상 특이적 동종형들을 표적할 수 있는 항체들 (Cortes-Gonza'lez et al., 2010, Cell Physiol. Biochem. 26:657, 이들 각각의 전체 내용은 본원 명세서에 참조로서 편입됨)를 포함한다. HSP90 저해제들의 특이적 클래스들 및 예시들이 본원 명세서에서 상세하게 논의된다.
본원 명세서에서 사용되는, 특정의 HSP90 동종형에 대하여 "특이적(specific)"인, 예컨대, Hsp90β에 대하여 특이적인 HSP90 저해제는 다른 HSP 동종형에 대하여 현저하게 보다 낮은 활성을 가질 수 있다. 그러나, 본원 명세서에서 사용되는, 특정의 HSP90 동종형의 "특이적" 저해제는 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 30-배, 적어도 50-배, 적어도 75-배, 또는 적어도 100-배로 특이적 HSP90 동종형의 활성 또는 발현에 더 효과적이다. 예를 들면, 만약 상기 저해제가 특이적 HSP90 동종형을 저해하는데 적어도 10-배 더 효과적인 Hsp90β에 대하여 특이적인 siRNA이라면, 1nm의 siRNA는 10nm의 siRNA가 HSP90α의 발현을 감소시키는 것과 동일한 정도로 Hsp90β의 발현을 감소시킬 것이다. 유사한 분석이 HSP90 동종형들의 활성에 대한 저해제들의 효과, 예컨대, 다운스트림 작동제들(effectors)의 인산화의 저해의 수준, 클라이언트 단백질들의 폴딩의 저해, 무기 포스페이트 생성의 저해, 등등, 를 비교하기 위하여 수행될 수 있다. 일부 실시예들에서, Hsp90β 동종형의 특이적 저해제는 Hsp90β의 발현 또는 활성을 적어도 50%까지 저해하지만, 그러나 동일 농도에서 HSP90α의 발현 또는 활성은 50%, 40%, 30%, 20%, 10%까지 저해하지 않는다. 일부 실시예들에서, Hsp90β 동종형의 특이적 저해제는 Hsp90β의 발현 또는 활성을 적어도 60%까지 저해하지만, 그러나 HSP90α의 발현 또는 활성은 동일한 농도에서 50%, 40%, 30%, 20%, 10%까지 저해하지 않는다. 일부 실시예들에서, Hsp90β 동종형의 특이적 저해제는 Hsp90β의 발현 또는 활성을 적어도 70%까지 저해하지만, 그러나 동일한 농도에서 HSP90α α의 발현 또는 활성은 50%, 40%, 30%, 20%, 10%까지 저해하지 않는다. 일부 실시예들에서, Hsp90β 동종형의 특이적 저해제는 Hsp90β의 발현 또는 활성을 적어도 80%까지 저해하지만, 그러나 동일한 농도에서 HSP90α의 발현 또는 활성은 50%, 40%, 30%, 20%, 10%까지 저해하지 않는다. 일부 실시예들에서, Hsp90β 동종형의 특이적 저해제는 Hsp90β의 발현 또는 활성을 적어도 90%까지 저해하지만, 그러나 동일한 농도에서 HSP90α의 발현 또는 활성은 50%, 40%, 30%, 20%, 10%까지 저해하지 않는다.
HSP90 저해제들의 특이성 및 활성을 측정하기 위한 방법들은 당해 기술분야의 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다. 특이적 분석 방법은 사용되는 저해제, 예컨대 활성의 저해제 또는 발현의 저해제, 에 의존할 수 있다. HSP90α 및 Hsp90β 활성을 분석하기 위한 키트들은 상업적으로 이용 가능하다 (예컨대, BPS Bioscience, 샌디에고, 캘리포니다). HSP90α 및 Hsp90β을 분석하기 위한 방법들은 또한 당해 분야에 공지되어 있다. (예컨대, Kim et al., J. Biomol. Screening 2004; 9: 375-381; 및 Howes et al., Anal. Biochem. 2006; 350:202-213, 이들 양쪽 모두의 전체 내용은 본원 명세서에서 참조로서 편입됨, 참조).
예를 들면, Hsp90 활성의 저해는 ATPase 활성에 대한 분석, 예컨대, Methods Mol Med, 2003, 85:149에 개시된 바와 같은 말라카이트 그린 분석, 에서 측정될 수 있다. 간단히 말하면, 분석 버퍼 (100mM 트리스-HCl, pH7.4, 20mM KCl, 6mM MgCl2) 내의 Hsp90 단백질 (예컨대, HSP90α 그리고 Hsp90β 단백질들)이 96-웰 플레이트에 ATP 단독 (음성 대조군), 겔다나마이신과 ATP (양성 대조군), 다양한 농도들의 테스트 화합물과 ATP, 또는 테스트 화합물 단독 (다른 음성 대조군)과 혼합된다. ATP의 가수분해에 의하여 생성되는 무기 포스페이트를 탐지하기 위하여, 말라카이트 그린 시약이 이후에 반응에 첨가된다. 상기 혼합물들은 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션되고, 인큐베이션의 말에, 소듐 사이트레이트 버퍼 (34% w/v 소듐 사이트레이트)가 상기 반응에 첨가된다. 상기 플레이트는 620nm 에서의 흡광도로 ELISA 판독기에 의하여 판독된다. HSP90α 및 Hsp90β에 대한 활성은, 만약 존재한다면, 저해제의 특이성을 측정하기 위하여 비교될 수 있다. 그러한 분석들은 HSP90 동종형들의 각각에 대한 저해제들의 활성의 직접적인 비교를 허용한다.
대안적으로, Hsp90 활성의 저해는 경쟁적 결합 분석에서 측정될 수 있다. 겔다나마이신은 HSP90α 또는 Hsp90β의 ATP-결합 부위와 상호작용 하는 것으로 알려져 있으며 여타 Hsp90 저해제들에 의하여 쉽게 교체될 수 있다. 상기 교체의 측정은 겔다나마이신을 형광으로 또는 비-형광적으로 표지함으로써 촉진될 수 있다. 형광적으로-표지된 겔다나마이신을 이용하는 예시적인 경쟁적 결합 분석은 Yin, et al., Int J Cancer. 2010 Mar 1;126(5):1216-25 (본원 명세서에서 참조로서 편입됨)에 설명되어 있다. 간단히 말하면, FITC-겔다나마이신 프로브는 먼저 TCEP로 실온에서 3시간 동안 환원되며, 이 후 상기 용액은 분취되어서(aliquoted) -80℃에서 사용될 때까지 저장된다. 재조합 인간 HSP90α 또는 Hsp90β 그리고 환원된 FITC-겔다나마이신이 96-웰 마이크로플레이트 내에서 실온에서 3시간 동안 20mM HEPES (pH 7.4), 50mM KCl, 5mM MgCl2, 20mM Na2MoO4, 2mM DTT, 0.1 mg/mL BGG, 및 0.1% (v/v) CHAPS를 함유하는 분석 버퍼의 존재 하에 인큐베이션 된다. 음성 대조군으로서, Hsp90 단백질은 선(pre)인큐베이션에 포함되지 않는다. 이 선인큐베이션 후, 용제 내의 테스트 화합물 (경쟁자로서)이 이후에 0.2nM 내지 10 μM (최종 부피 100 ㎕)의 최종 농도들로 첨가된다. 양성 대조군으로서, 비-표지된 겔다나마이신이 경쟁자로서 사용된다. 음성 대조군으로서, 테스트 화합물도 비-표지된 겔다나마이신도 첨가되지 않는다. 상기 반응은 16시간 동안 실온에서 인큐베이션 되고 형광성이 이후에 Analyst 플레이트 판독기, 여기(excitation) = 485nm, 방출(emission) = 535nm에서 측정된다. 높은 그리고 낮은 대조군들은 각각 화합물 또는 Hsp90을 함유하지 않았다. 상기 데이타는 GraphPad 프리즘을 이용하는 네-파라미터 곡선에 맞춰지고(fit) IC50 값들이 생성된다. IC50 값들은 예컨대, Machida, et al., Cancer Sci 2005;96:911-17 (31)에 기재된 바와 같이 변형된 Cheng-Prusoff 방정식을 이용하여 저해 상수들(Ki)로 전환된다. HSP90α 및 Hsp90β에 대한 활성은, 만약 있다면, 저해제의 특이성을 측정하기 위하여 비교될 수 있다.
대안적으로, HSP90 활성은 오직 존재하는 단일 HSP90 동종형만을 발현하는 세포들에서 분석될 수 있다. (예컨대, HSP90α 또는 Hsp90β 만을 발현하는 효모, C. elegans, 또는 포유류 세포들). HSP90의 양쪽 모두의 동종형들의 클라이언트 단백질의 안정성 및/또는 폴딩의 저해는 상기 저해제들의 상대 활성들을 측정하기 위하여 분석된다. 본원 명세서에서 사용되는, HSP90의 "핵산" 저해제는 HSP90α 또는 Hsp90β의 발현의 감소를 일으키기 위하여 HSP90AA1 및/또는 HSP90AB1 유전자로부터 RNA 전사체의 적어도 일부와 혼성화(hybridizing)에 의하여 HSP90의 발현에 감소를 일으키는 여하한 핵산 기초 저해제이다. 핵산 저해제들은, 예를 들면, 단일 가닥 핵산 분자들, 예컨대, 안티센스 핵산들 그리고 이중 가닥 핵산들 이를테면 siRNA, shRNA, dsiRNA (예컨대, 미국 특허 출원 제20070104688호 참조)을 포함한다. 본원 명세서에서 사용되는, 이중 가닥 핵산 분자들은 적어도 12이상, 바람직하게는 적어도 15 뉴클레오타이드들의 이중 가닥으로 디자인된다. 이중 가닥 핵산 분자들은 그 자체에 혼성화 되도록 디자인되는 단일 핵산 가닥, 예컨대, shRNA일 수 있다. HSP90의 핵산 저해제가 분리된(isolated) 핵산으로서 투여될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 대안적으로, 상기 핵산 저해제는 세포에서 저해제를 생산하기 위한 발현 구조체로서 투여될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 핵산 저해제는 핵산 저해제의 활성 및/또는 안정성을 향상시키기 위한 하나 또는 그 이상의 화학적 변형들을 포함한다. 그러한 변형들은 당해 분야에 널리 알려져 있다. 사용되는 특이적 변형들(modifications)은 예를 들면, 핵산 저해제의 타입에 의존할 것이다.
본원 명세서에서 사용되는, "항체"는 특이적 표적 항원에 결합하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 단백질이다. 항체는 종종 하나 이상의 면역글로불린 가변 영역, 예컨대, 면역글로불린 가변 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열을 제공하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 항체는 중쇄 (H) 가변 영역 (본원 명세서에서 VH로서 약칭됨), 그리고 경쇄 (L) 가변 영역 (본원 명세서에서VL로서 약칭됨)을 포함할 수 있다. 다른 예시에서, 항체는 두 중쇄 (H) 가변 영역들 및 두 경쇄 (L) 가변 영들을 포함한다. "항체"라는 용어는 완전한 항체들, 예컨대, IgA, IgG, IgE, IgD, IgM 타입들(그의 서브타입들은 물론임)의 온전한 면역글로불린들은 물론 항체들의 항원-결합 단편들(예컨대, 단일 사슬 항체들, Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 그리고 dAb 단편들)을 포괄한다. 면역글로불린의 경쇄들은 카파 또는 람다 타입들일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 항체는 글리코실화된다. 예를 들면, 항체는 적재 화물(payload)에 대한 특이적 결합을 보유하는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 변형된 항체, 키메릭 항체, 리쉐이프(reshaped) 항체, 인간화된 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, dAb 단편, 단일 사슬 Fv, 이합체화된(dimerized) 가변 영역 (V 영역) 단편 (디아바디(dia신체)), 디설파이드-안정화된 V 영역 단편 (dsFv), 어피바디들(affibodies), 항체 모방체들(mimetics), 그리고 하나 또는 그 이상의 분리된 상보성 결정 영역들 (CDR) 일 수 있다. 본원 명세서에서 사용되는, "분리된(isolated)" CDR은 천연 생성 항체의 상태(context)가 아닌 CDR이다. 상기 항체는 여하한 면역글로불린 타입, 예컨대, IgG, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 또는 IgE일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 항체는 인간 항체일 수 있다.
본원 명세서에서 사용되는, "소분자" 저해제는 1000Da 미만, 바람직하게는 750Da 미만, 또는 바람직하게는 500Da 미만의 분자량을 갖는 저해제 분자이다. 일부 실시예들에서, 소분자는 핵산 분자를 포함하지 않는다. 일부 실시예들에서, 소분자는 3 아미노산들 길이를 넘는 펩타이드를 포함하지 않는다.
본원 명세서에서 사용되는, 단순성을 위하여, 발현 또는 활성에서의 변화 또는 조절, 즉, HSP90 예컨대, HSP90α 및/또는 Hsp90β의, 발현 또는 활성의 증가 또는 감소는 유전자 및/또는 단백질의 발현 또는 활성의 변화를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일 실시예에서, 발현 또는 활성은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%까지 감소된다.
본원 명세서에서 사용되는, HSP90 "활성"의 변화는, 특이적 HSP90의 클라이언트 단백질들의 폴딩의 변화를 탐지함으로써, 예를 들면, HSP90, 예컨대, HSP90α 및/또는 Hsp90β의 ATP 가수분해 활성의 변화를 탐지함으로써, 탐지될 수 있다. ATP 가수분해의 탐지 방법들은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 클라이언트 단백질들의 폴딩은, 예를 들면, 샘플 내에 존재하는 클라이언트 단백질의 용량을 측정함으로써 또는 상기 클라이언트 단백질이 효소 활성, 예컨대, 키나아제 활성을 갖는 신호 단백질인 경우 샘플 내의 클라이언트 단백질의 활성을 탐지함으로써 평가될 수 있다. HSP90α 및 Hsp90β 활성을 분석하기 위한 키트들은 또한 상업적으로 이용 가능하다 (예컨대, BPS Bioscience사로부터).
본원 명세서에서 사용되는, "대사 증후군"으로 고통받는 대상은 하나 또는 그 이상의 다음의 상태들: 타입 2 당뇨병, 인슐린 저항성, 인슐린 부족, 비만, 고인슐린혈증, 또는 손상된 글루코오스 내성 (IGT) 을 갖는; 또는 셋 또는 그 이상의 대사 증후군의 이하의 징후들을 갖는 대상을 지시하고자 의도된다.
a) 130/85mMHg 이상의 혈압;
b) 100mg/dL 이상의 공복 혈당;
c) 큰 허리 둘레, 여기서 큰 허리 둘레는 남성의 경우 40 인치 또는 그 이상이며 그리고 여성의 경우 35 인치 또는 그 이상임;
d) 낮은 HDL 콜레스테롤, 여기서 낮은 LDH 콜레스테롤은 남성의 경우 40mg/dL 보다 작으며 그리고 50mg/dL 보다 작음; 그리고
e) 150mg/dL 이상의 트리글리세라이드들.
대사 증후군의 지시된 상태들을 진단하기 위한 그리고 지시된 징후들을 탐지하기 위한 방법들은 당해 기술분야에서 일상적인 것이다. 일부 실시예들에서, 대사 증후군은 타입 1 당뇨병을 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 대사 증후군은 타입 1 당뇨병을 포함하지 않는다. 연관된 질환들 및 징후들은 고 요산 혈증, 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD)으로 진행하는 지방간 (특히 비만을 동반하는), 다난성 난소 증후군 (여성에서), 그리고 흑색가시세포증을 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 이들 관련된 질환들 또는 징후들의 처치를 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 이들 관련된 질환들 또는 징후들의 처치를 포함하지 않는다.
본원 명세서에서 사용되는, "당뇨병"은 타입 1 당뇨병 또는 타입 2 당뇨병 중 어느 하나, 또는 타입 1 그리고 타입 2 당뇨병 양쪽 모두를 지시하는 것으로 의도된다. 일부 실시예들에서, 당뇨병은 예비(pre)-당뇨병을 포함한다. 일부 실시예들에서, 당뇨병은 예비(pre)-당뇨병을 포함하지 않는다.
본원 명세서에서 사용되는, "인슐린 저항성" 및 "인슐린 무감증(insensitivity)"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며 인슐린의 용량이 정상 대상에서보다 혈당을 낮추는데 덜 효과적이어서 인슐린의 결핍에 기인하지 않는 정상 범위를 넘는 혈당의 증가를 초래하는 상태들을 지시한다. 메커니즘에 결부되지 않고, 상기 상태들은 전형적으로 인슐린 수용기(receptor)를 통한 신호전달의 감소와 연관된다. 전형적으로, 근육 및 지방 세포들에서의 인슐린 저항성은 각각 포도당 섭취 그리고 글라이코겐 및 트리글리세라이드들로서의 저장을 감소시킨다. 간 세포들에서의 인슐린 저항성은 감소된 글라이코겐 합성 및 글루코오스 생산의 억제 및 혈액으로의 방출의 실패를 초래한다.
인슐린 저항성은 동일한 대상에서 "인슐린 부족"과 종종 함께 존재하며, 이는 또한 인슐린의 결핍에 기인하지 않는 정상 범위를 넘는 혈당의 증가를 초래한다. 인슐린 부족은 인슐린 작용의 부족에 관련된 상태이며 여기서 인슐린은 체내에서 생성되며 존재한다. 이것은 섬 세포들의 부족에 의하여 인슐린이 생산되지 않는 타입 1 당뇨병과는 구별된다.
만약 대상이 대사 증후군을 갖는지를 측정하기 위한 목적을 위하여, 대상이 인슐린 저항성, 인슐린 부족, 또는 양쪽 모두로 고통받는 지를 구별하는 것은 중요하지 않다.
본원 명세서에서 사용되는, "비만"은 여하한 임상적으로 관련된 정의들을 사용하여 정의될 수 있다. 예를 들면, 성인들에서, 체질량지수 (BMI, kg/m2)가 과체중 및 비만의 척도로서 빈번히 사용되는데, 과체중은 BMI 25-29.9 kg/m2로서, 비만은 BMI 30 kg/m2 이상으로서 정의되며 그리고 병적 비만은 40 kg/m2를 넘는 BMI들로서 정의된다. 비만은 또한 성인들에서 허리 둘레에 의하여 측정되는 내장 지방(central adiposity)에 의하여 정의될 수 있는데, 남성에서 102cm 이상 그리고 여성에서 88cm 이상으로 정의되는 증가된 허리둘레이다. 비만의 처치는 BMI 또는 허리 둘레의 정상 수준들로의 감소를 요구하지 않는다. 대신, 처치는 바람직하게는 상기 대상에 대한 정상 상한을 넘는 초과 BMI 값 또는 초과 허리 둘레의 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 7%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 그 이상의 감소를 포함한다. 예를 들면 허리 둘레 100cm인 여성은 초과 허리 둘레 12cm (100cm - 88cm)를 가질 것이다. 상기 초과의 20% 감소는 2.4cm 감소일 것이다.
"고인슐린혈증"은 단식 또는 식후 혈청 또는 혈장 인슐린 농도가 인슐린 저항성을 갖지 않는 정상의, 여윈(lean) 개체들 보다 높게 상승되는 (즉, 단식 혈장 글루코오스 테스트에서 > 100mg/dL 또는 경구 글루코오스 내성 테스트에서 > 140mg/dL), 또한 허리-대(to)-힙 비율 < 1.0 (남성의 경우) 또는 < 0.8 (여성의 경우)을 갖는, 정상혈당(euglycemia)을 갖거나 갖지 않는, 인슐린 저항성을 갖는 대상에서의 상태로서 정의된다.
"손상된 글루코오스 내성" (IGT) 또는 "예비(pre)-당뇨병"이라는 용어는 글루코오스 내성 테스트가 제공되는 경우, 정상 및 고혈당증 사이에 해당되는 혈당수준을 갖는 사람을 설명하기 위하여 사용된다. 그러한 사람은 비록 그들이 당뇨병을 갖는 것으로 평가되지 않더라도 보다 높은 당뇨병 발병 위험을 갖는다. 예를 들면, 손상된 글루코오스 내성은 환자가 110mg/dL 보다 큰 그리고 126mg/dL (7.00mMol/L) 미만의 공복 혈당 농도 또는 단식 혈청 글루코오스 농도, 또는 140mg/dL (7.78mMol/L)보다 큰 그리고 200mg/dL (11.11mMol/L) 미만의 2시간 식후 혈당 또는 혈청 글루코오스 농도를 갖는 상태를 지시한다. 증가하는 증거는 예비-당뇨병 상태가 심혈관 질환 발병 위험 인자일 수 있음을 제안한다 (Diabetes Care 26:2910-2914, 2003). 예비당뇨병, 또한 손상된 글루코오스 내성 또는 손상된 단식 글루코오스로서 지시됨, 은 타입 2 당뇨병, 심혈관 질환 및 사망의 발생의 주요 위험 인자이다. 예비-당뇨병을 효과적으로 치료함으로써 타입 2 당뇨병의 발명을 방지하는 치료적 개입방법들을 개발하는 것에 많이 집중되어 왔다. (Pharmacotherapy, 24:362-71, 2004).
"고혈당증(hyperglycemia)" (높은 혈액 내의 당(sugar))의 상태는 혈당 수준이 너무 높은 상태이다. 전형적으로, 고혈당증은 혈당 수준이 180mg/dL 위로 올라가는 경우에 일어난다. 고혈당증의 증상들은 빈뇨(frequent urination), 과도한 갈증(excessive thirst) 그리고 장기간에 걸친 체중 감소를 포함한다.
"저혈당증" (낮은 혈액 내의 당)의 상태는 혈당 수준이 너무 낮은 상태이다. 전형적으로, 저혈당증은 혈당 수준이 70mg/dL 아래로 떨어지는 경우 일어난다. 저혈당증의 증상들은 우울(moodiness), 말단부의 무감각(numbness of the extremities) (특히 팔과 손), 당황(confusion), 떨림(shakiness) 또는 현기증(dizziness)을 포함한다. 이 상태들이 이용 가능한 글루코오스의 용량을 넘는 인슐린의 과량이 존재하는 경우에 일어나기 때문에, 이는 때때로 인슐린 반응으로서 지시된다.
본원 명세서에서 사용되는, "HbA1c 수준"은, 앞선 이 및 삼 개월동안의 평균 혈당 수준들을 평가하는, HbA1c 테스트로부터 측정되는 헤모글로빈 Alc (HbAlc) 수준으로서 이해되며, 적용될 수 있다. 당뇨병이 없는 사람은 전형적으로 4% 내지 6%사이의 범위인 HbAlc 값을 갖는다. 예비-당뇨병은 5.7% 내지 6.5%의 HbA1c 수준으로 특징지워지며, 6.5%보다 큰 Hb1Ac 수준은 당뇨병의 지표이다. HbAlc의 1% 증가 마다, 혈당 수준들은 대략적으로 30mg/dL 증가하며 그리고 지속적인 상승된 혈당 증가들에 의하여 합병증의 위험증이 증가한다. 바람직하게는, 본원 발명에 따라 처치되는 환자의 HbAlc 값은 9% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 5% 주변으로 감소된다. 따라서, 처치되는 환자의 초과 HbAlc 수준 (즉, 5.7% 초과의 Hb1Ac 수준)은 바람직하게는 처치 전의 그러한 수준들에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상 낮아진다.
본원 명세서에서 사용되는, "대상(subject)"이라는 용어는, 인간 및 수의학적 대상을 포함하는 비-인간 동물들을 지시한다. "비-인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물들, 예컨대, 포유동물들 및 비-포유동물들, 이를테면 비-인간 영장류, 마우스들, 토끼들, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭들, 양서류들 및 파충류들을 포함한다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 대상은 인간이며 환자로서 지시될 수 있다.
본원 명세서에서 사용되는, "처치", "치료하는 것" 또는 "치료"는 바람직하게는, 이하로 한정되는 것은 아니나, 질환 또는 상태의 하나 또는 그 이상 징후들 또는 증상들의 경감 또는 개선, 질환의 정도의 감축, 질환의 안정성 (즉, 악화되지 않음) 상태, 질환 상태의 개선 또는 일시적 저해(palliation)를 포함하는 유익한 또는 바람직한 임상적 결과를 얻는 작용을 지시한다. 본원 명세서에서 사용되는, 처치는 인슐린 저항성의 감소, 인슐린 감수성의 증가, 인슐린 결핍의 감소, HbAc1 수준들을 개선 또는 정상화 하는 것, 혈당 수준들을 개선 또는 정상화 하는 것, 체중을 감소시키는 것, 허리 칫수를 감소시키는 것, HDL 수준들을 정상화하는 것 또는 감소시키는 것, 트리글리세라이드 수준들을 정상화하는 것 또는 감소시키는 것, 그리고 당뇨병의 하나 이상의 징후 또는 증상을 호전시키는 것 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 처치는 치유일 필요는 없다. 처치 성과들은 정량적으로 측정될 필요는 없다. 그러나, 일부 실시예들에서, 처치 성과들은 범위의 말단에서 정상 값을 향한 퍼센트 개선을 고려하여 정량화될 수 있다. 예를 들면, 대사 증후군은 일부 측정값들의 초과(예컨대, 체중/BMI, 허리 둘레, 트리글리세라이드 수준들) 그리고 다른 측정값들의 부족(예컨대, HDL 콜레스테롤 또는 인슐린 반응의 부족)에 의하여 특징지워질 수 있다. 허리 둘레 100cm인 여성은 초과 허리 둘레 12cm(100cm - 88 cm, 최고 정상 허리 둘레)를 갖는다. 초과 허리 둘레의 20% 감소는 초과 허리 둘레의 2.4cm감소일 것이다. 유사한 계산이 다른 값들에 대하여 이루어질 수 있다. 30mg/dL의 HDL을 갖는 남성은 20mg/dL의 부족을 가질 것이다(남성의 경우 정상값은 적어도 50mg/dL임). 5mg/dL 에서 25mg/dL로의 증가는 HLD의 부족을 25% 감소시킨 것으로 고려될 것이다.
본원 명세서에서 사용되는, "글루코오스 수준들을 감소시키는 것"은 정상화된 글루코오스 수준, 즉 150mg/dL보다 높지 않은 글루코오스 수준을 달성하기 위하여 글루코오스의 상승된 수준을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상으로 감소시키는 것을 의미한다. 유익하게는, 글루코오스 수준들은 정상 혈당 수준들, 즉, 150 내지 60mg/dL, 140 내지 70mg/dL, 130 내지 70mg/dL, 125 내지 80mg/dL, 그리고 바람직하게는 120 내지 80mg/dL으로 감소된다. 그러한 글루코오스 수준들의 감소는 혈액으로부터 글루코오스의 청소와 연관된 생물학적 활성들의 여하한 하나를 증가시킴으로써 얻어질 수 있다. 따라서, 글루코오스 수준들을 감소시키는 능력을 갖는 약제는 인슐린 생성, 분비, 또는 작용을 증가시킬 수 있다. 인슐린 작용은 예를 들면, 말초 조직들에 의하여 포도당 섭취를 증가시킴으로써 및/또는 간 글루코오스 생산을 감소시킴으로써 증가될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약제는 소장으로부터 탄수화물들의 흡수를 감소시키거나, 글루코오스 운반체(transporter) 활성을 변경시키거나 (예컨대, GLUT4 발현, 고유 활성, 또는 전위(translocation)를 증가시킴으로써), 인슐린-감수성 조직의 양을 증가시키거나 (예컨대, 근육 세포 또는 함지방 세포 분화를 증가시킴으로써), 또는 함지방 세포들 또는 근육 세포들에서 유전자 전사를 변경 (예컨대, 대사 경로 유전자들의 함지방 세포들 발현으로부터의 인자들의 변경된 분비)시킬 수 있다. 유익하게는, 본 발명의 약제는 글루코오스의 청소율과 연관된 하나 이상의 활성들을 증가시칸다.
"지질 수준들을 감소시키는 것"에 의하여는 정상 지질 수준, 즉, 150mg/dL이하를 달성하기 위하여 초과 지질들의 수준을 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상 감소시키는 것이 의미된다.
"글루코오스 수준들이 감소되도록 인슐린 신호전달 경로를 변경"에 의하여는 전체적 결과가 혈장으로부터의 글루코오스 청소율 증가이도록 인슐린 신호전달에 관련된 활성들 중 여하한 하나를 (증가시키는 것 또는 감소시키는 것에 의하여) 변경하는 것이 의미된다. 예를 들면, 인슐린 신호전달 경로를 변경하는 것은 이로써 인슐린 생산, 분비, 또는 작용에 증가를 이르키는 것, 말초 조직들에 의한 포도당 섭취를 증가시키는 것, 간 글루코오스 생산을 감소시키는 것, 또는 소장들로부터 탄수화물들의 흡수를 감소시키는 것이다.
"치료적으로 유효한 용량"은 대상에서 질환을 치료하는데 충분한 용량이다. 치료적으로 유효한 용량은 하나 또는 그 이상의 투여들로서 투여될 수 있다.
본원 명세서에서 사용되는, "진단하는 것" 그리고 이와 유사한 것들은 하나 이상의 지표, 이를테면 질환, 장애, 또는 상태의 징후 또는 증상, 의 존재에 기초하여 질환, 장애, 또는 상태를 갖는 대상을 확인하기 위한 관찰, 테스트 또는 환경들에 기초한 대상의 상태의 임상적 또는 여타 평가를 지시한다. 전형적으로, 본 발명의 방법을 이용하는 진단 방법은 본원 명세서에서 제공되는 방법들과 결합된 질환, 장애, 또는 상태의 다중적 지표들에 대한 상기 대상의 관찰을 포함한다. 진단 방법들은 질환이 존재하거나 또는 존재하지 않는 지표를 제공한다. 단일 진단 테스트는 전형적으로 상기 테스트되는 대상의 질환의 상테에 대한 확정적인 결론을 제공하지 않는다.
본원 명세서에서 사용되는, "모니터링"은 질환 대상에서 제 1 시점에서 그리고 후에 제 2 시점에서 하나 이상의 징후 또는 증상을 평가하고, 상태의 징후(들) 또는 증상(들)의 중증도를 비교하고, 그리고 시간에 걸쳐 더욱 또는 덜 심각해 진 상태를 결정하는 것으로서 이해된다.
"투여하다", "투여하는 것" 또는 "투여"이라는 용어들은 약제학적 조성물 또는 약제를을 대상의 시스템 내로 또는 대상 내 또는 위의 특정한 영역에 전달하는 여하한 방법을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 약제는 장내로 또는 비경구적으로 투여된다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 약제는 정맥 내로, 근육 내로, 피하로, 피내로, 비강 내로, 경구로, 경피적으로, 또는 점막으로 투여된다. 일부 바람직한 실시예들에서, 약제는 정맥 내로 투여된다. 일부 실시예들에서, 상기 약제는 국소적으로 또는 전신적으로 투여된다. 약제를 투여하는 것은 협력하여 작업하는 다수의 사람들에 의하여 수행될 수 있다. 약제를 투여하는 것은 예를 들면, 특이적 약제를 섭취하기 위하여, 자가-전달에 의하여, 예컨대, 경구적 전달, 피하 전달, 중앙 라인(central line)을 통한 정맥 내 전달, 기타 등등에 의하여; 또는 숙련된 전문가에 의한, 예컨대, 정맥 내 전달, 근육 내 전달, 등등에 의한 전달을 위하여, 직접 또는 다른 통로로, 약제를 대상에 투여되도록 처방하는 것 및/또는 지시사항을 제공하는 것, 을 포함한다.
본원 명세서에서 사용되는 "샘플"이라는 용어는 대상으로부터 분리된 유사한 유동체들, 세포들, 또는 조직들의 수집물을 지시한다. "샘플"이라는 용어는 여하한 신체의 유동체 (예컨대, 소변, 혈청, 혈액 유동체들, 림프, 부인과적 유동체들, 담낭 유동체, 복수(ascetic) 유동체, 안구 유동체들, 그리고 기관지 세척 및/또는 복막 헹굼에 의하여 수집된 유동체들), 복수들(ascites), 조직 샘플들 (예컨대, 종양 샘플들) 또는 대상으로부터의 세포를 포함한다. 여타 대상 샘플들은 눈물 방울들, 혈청, 뇌척수 유동체, 분변들, 객담, 그리고 세포 추출물들을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 샘플은 소변 또는 혈청이다. 다른 실시예에서, 상기 샘플은 복수들(ascites)을 포함하지 않거나 복수들 샘플이 아니다. 일 실시예에서, 상기 샘플은 세포들을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 샘플은 세포들을 포함하지 않는다.
본원 명세서에서 사용되는 "대조군 샘플"이라는 용어는 대사 증후군으로 고통받지 않는 건강한 대상으로부터의 샘플 또는 더 앞선 시점 예컨대, 처치 전, 처치의 초기 단계로부터 대상으로부터의 샘플을 포함하는 여하한 임상적으로 관련된 비교 샘플을 지시한다. 대조군 샘플은 키트로 제공되는 정제된 샘플, 단백질, 및/또는 핵산일 수 있다. 그러한 대조군 샘플들은 예를 들면, 테스트 샘플들에서 분석체들의 정량적 측정을 허용하는 희석 시리즈들로 희석될 수 있다. 대조군 샘플은 하나 또는 그 이상의 대상으로부터 유도되는 샘플을 포함할 수 있다. 대조군 샘플은 또한 평가되는 상기 대상으로부터의 보다 앞선 시점에서 만들어진 샘플일 수 있다. 예를 들면, 상기 대조군 샘플은 대사 증후군의 개시(onset) 전에, 또는 처치 또는 처치의 일부의 투여 전에 평가되는 대상으로부터 취해진 샘플일 수 있다. 대조군 샘플은 또한 동물 모델로부터의, 또는 대사 증후군의 동물 모델로부터 유도된 조직 또는 세포 라인으로부터의 샘플일 수 있다. 측정들의 그룹을 구성하는 대조군 샘플에서의 HSP90, 예컨대, HSP90α 및/또는 Hsp90β, 활성 또는 발현의 수준은 예컨대, 여하한 적합한 통계학적 측량, 이를테면, 예를 들면, 평균, 중앙값(median), 또는 양상(modal) 값들을 포함하는 집중 경향치(central tendency)의 측정들에 기초하여, 측정될 수 있다.
"대조 수준"이라는 용어는 대상에서 또는 대상 샘플에서 대사 장애의 징후의 수용된 또는 예정된(pre-determined) 수준을 지시한다. 이하의 수준들은 정상 수준들로 간주된다:
-- 120/80mMHG 이하의 혈압
-- 100mg/dL이하의 공복 혈당.
-- 허리 둘레, 남성의 경우 40 인치 (102cm) 미만 그리고 여성의 경우 35 인치 (88 cm) 미만.
-- 여성의 경우 적어도 50mg/dL, 남성의 경우 적어도 40mg/dL의 HDL
-- 150mg/dL이하의 트리글리세라이드들
-- 5.7% 이하의 HbA1c
-- 140mg/dL 이하의 경구 글루코오스 내성 테스트.
본원 명세서에서 사용되는, "얻는(obtaining)"이라는 용어는 제조, 구입, 또는 다른 방법으로 소유하게 되는 것을 지시하는 것으로 이해되어야 한다.
본원 명세서에서 사용되는, "탐지하는 것(detecting)", "탐지" 그리고 이와 유사한 것들은 샘플에서의 특이적 분석체, 예컨대, 샘플에서 HSP90, 예컨대, HSP90α 및/또는 Hsp90β, 발현 또는 활성 수준, 의 동정(identification)을 위하여 수행되는 분석을 지시하는 것으로 이해된다. 샘플에서 탐지되는 분석체 또는 활성의 용량은 분석 또는 방법의 탐지의 수준 이하이거나 또는 없을 수 있다.
"조절하다(modulate)" 또는 "조절"이라는 용어들은 수준의 상향조절 (즉, 활성화 또는 자극), 하향조절 (즉, 저해 또는 억제), 또는 둘을 조합하거나 별개로 지시한다. "조절제"는 예컨대, 작용제, 길항체, 활성화제, 자극제, 억제제(suppressor), 또는 저해제(inhibitor)를 조절하는, 그리고 할 수 있는 화합물 또는 분자이다.
"발현"이라는 용어는 본원 명세서에서 DNA로부터 폴리펩타이드가 생성되는 공정을 의미하는 것으로 사용된다. 상기 공정은 유전자의 mRNA로의 전사 및 이 mRNA의 폴리펩타이드로의 번역과 관련된다. 사용되는 문맥에 따라, "발현"은 RNA, 또는 단백질, 또는 양쪽 모두의 생산을 지시할 수 있다.
"유전자의 발현 수준" 또는 "유전자 발현 수준"이라는 용어들은 pre-mRNA 신생(nascent) 전사체(들), 전사체 가공 중간체들, 성숙한 mRNA(들) 및 분해 산물들, 또는 세포에서 유전자에 의하여 인코딩되는(encoded), 단백질의 수준은 물론 mRNA의 수준을 지시한다.
본원 명세서에서 사용되는, "활성의 수준"은 정량적, 세미-정량적, 또는 정성적 분석에 의하여 측정된 단백질 활성, 전형적으로 효소 활성의 용량으로서, 이해된다. 활성은 전형적으로 쉽게 탐지할 수 있는 생성물, 예컨대, 착색된 생성물, 형광 생성물, 또는 방사성 생성물을 생산하는 기질을 이용하여 분석에서 생성된 생성물의 용량의 모니터링에 의하여 측정된다. 수행되는 특이적 분석은 예를 들면, 측정되는 활성에 의존한다.
"단수형(a)", "단수형(an)" 그리고 "상기(the)"의 관사들은 본원 명세서에서 반대로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상 (즉 하나 이상)을 지시하는 것으로 사용된다. 예시로서, "한 성분"은 하나의 성분 또는 하나 이상의 성분을 의미한다.
"포함하는(including)"이라는 용어는 본원 명세서에서 "포함하나 이에 한정되지 않는"을 의미하는 것으로 그리고 이와 상호교환적으로 사용된다.
"또는"이라는 용어는 본원 명세서에서 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는 한 "및/또는"이라는 용어를 의미하는 것으로, 그리고 이와 상호교환적으로 사용된다.
"이를테면"이라는 용어는 본원 명세서에서 "이를테면 그러나 이에 제한되지 않는"라는 구를 의미하는 것으로, 그리고 이와 상호교환적으로 사용된다.
특이적으로 서술되거나 문맥으로부터 명백하지 않은 한, 본원 명세서에서 사용되는, "약"이라는 용어는 당해 기술 분야에서 정상 용인(normal tolerance)의, 예를 들면 평균의 2 표준 편차들 내의, 범위 내로서 이해된다. 약은 서술된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1 %, 0.05%, 또는 0.01% 내로 이해될 수 있다. 문백으로부터 명백히 다르지 않는 한, 본원 명세서에서 제공되는 모든 수치 값들은 약이라는 용어에 의하여 변경될 수 있다.
다양한 본원 명세서의 여하한 정의에서 화학적 그룹(들)의 열거의 인용은 열거된 그룹들의 여하한 단일 그룹 또는 조합으로서 변이될 수 있는 정의들을 포함한다. 본원 명세서에서 변수 또는 측면에 대한 실시예의 인용은 여하한 단일 실시예로서 또는 여하한 여타 실시예들 또는 그의 일부들과의 조합으로서의 실시예를 포함한다.
본원 명세서에서 제공된 여하한 조성물들 또는 방법들은 본원 명세서에서 제공된 여타 조성물들 그리고 방법들의 여하한 하나 또는 그 이상과 조합될 수 있다.
본원 명세서에서 제공되는 범위들은 상기 범위 내의 값들 모두에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들면, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50로 구성되는 그룹으로부터의 여하한 숫자, 숫자들의 조합, 또는 서브-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
이제 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세히 참조할 것이다. 본 발명은 바람직한 실시예들과 결부하여 설명될 것이나, 그들 바람직한 실시예들로 본 발명을 제한하고자 의도되는 것이 아님을 이해할 것이다. 오히려, 첨부된 청구항들에 의하여 정의되는 바와같은 본 발명의 기술적 사상 및 보호범위 내에 포함될 수 있는 대안들, 변형들, 및 등가물들을 커버하고자 의도된다.
I. 대사 증후군
대사 증후군 (Syndrome X)은 함께 발생하며 관상 동맥 질환, 뇌졸중(stroke), 그리고 타입 2 당뇨병에 대한 위험을 증가시키는 위험 인자들의 그룹에 대한 명칭이다. (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0004546/). 대사 증후군은 미국에서 점점 더 흔해지고 있다. 연구자들은 상기 증후군이 단일 원인에 기인하는지 여부에 대하여 확신하지 못하나, 상기 증후군에 대한 모든 위험은 비만에 관련되어 있다. 본원 명세서에서 사용되는, 대사 증후군은 인슐린 저항성, 인슐린 부족, 예비-당뇨병, 타입 2 당뇨병, 그리고 비만을 포함하는 것으로 이해된다. 아래의 진단 기준들을 만족하는 대상 또한 대사 증후군을 갖는 것으로서 이해된다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 대사 증후군은 또한 타입 1 당뇨병을 포함할 수 있다. 다른 실시예들에서, 대사 증후군은 타입 1 당뇨병을 포함하지 않는다.
대사 증후군에 대한 두개의 가장 중요한 위험 인자들은 신체의 중간 및 상부 주위의 과 체중 (복부(central) 비만) 그리고 신체가 인슐린을 효과적으로 사용할 수 없는 인슐린 저항성이다. 인슐린은 신체에서 당(sugar)의 용량을 제어한다. 신체가 충분한 인슐린을 생산하지 않는 및/또는 신체가 생산되는 인슐린이 수준에 반응하지 않는 대상들에서, 혈당 및 지방 수준들은 상승한다. 대사 증후군에 대한 여타 위험 인자들은 노화, 유전 인자들, 호르몬 변화들, 그리고 늘 앉아 있는 라이프스타일을 포함한다. 대사 증후군을 갖는 사람들은 빈번히 과도한 혈액 응고 및 전신 염증의 낮은 수준들 중 하나 또는 양쪽 모두로 고통받으며, 이들 양쪽 모두는 상태를 악화시킬 수 있다.
미국 심장 협회 및 국립 심장, 폐, 그리고 혈액 협회는 셋 또는 그 이상의 이하의 징후들을 갖는 대상들에서 대사 증후군이 존재하는 것으로 간주한다:
* 130/85mMHg 이상의 혈압
* 100mg/dL 이상의 공복 혈당 (글루코오스)
* 큰 허리 둘레(허리 주위의 길이):
- 남성 - 40 인치 또는 그 이상
- 여성 - 35 인치 또는 그 이상
* 낮은 HDL 콜레스테롤:
- 남성 - 40mg/dL 보다 작은
- 여성 - 50mg/dL 보다 작은
* 150mg/dL 이상의 트리글리세라이드들
처치는 권장되는 라이프스타일 변화들 또는 혈압, LDL 콜레스테롤, 그리고 혈당의 감소, 예컨대, 체중 손실, 운동 증가를 돕는 의약들을 포함한다. 혈압 및 콜레스테롤 또한 적절한 약물들을 사용하여 조절될 수 있다.
심혈관 질환 및 타입 2 당뇨병의 진행에 대한 증가된 장기적 위험을 갖는 것뿐만 아니라, 대사 증후군 합병증들은 전형적으로 당뇨병과 연관된 합병증들은 물론 아테로마성 동맥경화증(atherosclerosis), 심장 발작(heart attack), 신장 질환, 비-알코올성 지방간 질환, 말초 동맥 질환, 및 뇌졸중(stroke)을 포함한다.
A. 당뇨병, 인슐린 저항성, 그리고 인슐린 부족
당뇨병 (DM), 종종 단순하게 당뇨병(Diabetes)로 지시됨,은 신체가 충분한 인슐린을 생성하지 않기 때문에, 또는 세포들이 생성된 인슐린에 반응하지 않기 때문에, 중 어느 하나로 인하여 사람이 높은 혈당을 갖는 대사성 질환들의 그룹이다. 이 높은 혈당은 다뇨증 (빈뇨), 번갈다음 (증가된 갈증) 그리고 다식증 (증가된 허기)의 고전적인 증상들은 발생시킨다.
타입 2 당뇨병은 때때로, 절대적인 인슐린 고갈과 조합되는, 세포들이 인슐린을 적절히 사용하는데 실패한 상태인 인슐린 저항성으로부터 초래된다. 인슐린에 대한 신체 조직들의 불량한 반응성은, 적어도 부분적으로는 인슐린 수용기와 관련된다고 생각된다. 그러나, 특이적 결함들은 알려져있지 않다.
타입 2 당뇨병의 초기 단계에서, 주요한 비정상성은 감소된 인슐린 감수성이다. 이 단계에서, 고혈당증은 인슐린 감수성을 개선시키는 또는 간에 의한 글루코오스 생산을 감소시키는 약물들 및 대책들에 의하여 역전될 수 있다. 예비당뇨병은 사람의 혈당 수준들이 정상보다 높으나 타입　2 당뇨병으로 진단하기에 충분히 높지 않은 경우의 상태를 지시한다.
타입 2 당뇨병은 인슐린 저항성의 세팅에서 베타 세포들로부터의 불충분한 인슐린 생산에 기인한다. 세포들의 인슐린의 정상 수준들에 적절히 반응하는데에 있어서의 무능력인, 인슐린 저항성은 처음에는 근육들, 간 및 지방 조직 내에서 일어난다. 간에서, 인슐린은 정상적으로 글루코오스의 방출을 억제한다. 그러나 인슐린 저항성의 세팅(setting)에서, 간은 부적절하게 글루코오스를 혈액 내로 방출한다. 인슐린 저항성 대(verses) 베타 세포 기능장애의 비는 개체마다 상이한데, 일부는 주로 인슐린 저항성을 가지며 인슐린 분지에 단지 소수의 결점을 가지며 다른 사람들은 약한 인슐린 저항성을 가지며 주로 인슐린 분비의 부족을 갖는다.
타입 2 당뇨병 및 인슐린 저항성과 연관된 여타의 가능한 중요한 메커니즘들은 다음을 포함한다: 지방 세포들 내의 지질들의 증가된 붕괴, 인크레틴(incretin)에 대한 저항성 및 이의 부족, 혈액 내 높은 글루카곤 수준들, 증가된 신장들에 의한 물 및 염의 보유, 그리고 중앙 신경 시스템에 의한 대사의 부적절한 조절. 그러나 인슐린 저항성을 갖는 모든 사람들에서 당뇨병이 발생하는 것은 아닌데, 이는 췌장 베타 세포들에 의한 인슐린 분비의 손상 또한 요구되기 때문이다.
타입 1 당뇨병은 신체의 인슐린 생산의 실패로부터 초래되며, 즉시 주사 가능한 인슐린으로의 처치가 요구된다. 타입 1 당뇨병은 인슐린 결핍에 이르게 하는, 췌장에서의 랑게르한스의 섬들의 인슐린-생산 베타 세포들의 손실에 의하여 특정지워 진다. 가장 영향을 받은 사람들은 개시가 일어나는 경우 다른 점에서는 건강하며 건강한 체중의 사람들이다. 인슐린에 대한 감수성 및 반응성은, 특히 초기 단계들에서는, 대개 정상이다. 그러나, 특히 후기 단계들에서, 인슐린 저항성이 일어날 수 있다.
B. 당뇨병, 인슐린 저항성, 그리고 인슐린 부족의 이차 병리들
당뇨병, 타입 1 및 타입 2 양쪽 모두, 인슐린 저항성, 그리고 인슐린 부족으로부터 초래되는 비정상 글루코오스 조절은 이차 병리들과 연관되며, 이의 다수는 불량한 순환으로부터 초래된다. 그러한 이차 병리들은 시력 감퇴(macular degeneration), 말초 신경장애들, 궤양들 그리고 감소된 치유, 그리고 감소된 신장 기능을 포함한다. 글루코오스 수준들 및/ 또는 HbAc1 수준들을 정상 범위들 내로 유지하는 것은 이들 이차 병리들의 출현을 감소시키는 것으로 제안되어왔다. 혈당, 인슐린, 그리고 Hb1Ac 수준들의 정상화는 일차 병리, 예컨대, 대사 증후군을 제한함으로써 이차 병리들의 발생을 감소시킬 것이라는 것이 이해되어야 한다. 일부 실시예들에서, HSP90 저해제들, 특히 Hsp90β 저해제들 및 Hsp90β 특이적 저해제들,은 대사 증후군들 및 당뇨병 연관 이차 병리들의 처치에 사용되지 않는다. 일부 실시예들에서, HSP90 저해제들, 특히 Hsp90β 저해제들 및 Hsp90β 특이적 저해제들,은 대사 증후군들 및 당뇨병과 연관된 이차 병리들의 처치에 사용된다.
II. 투여의 투약량들 및 방식들
투여를 위한 기술들 및 투약량들은 화합물의 타입 (예컨대, 화학적 화합물, 항체, 또는 핵산)에 따라 다양하며 당해 기술 분야의 통상의 기술자들에게 잘 알려져 있거나 또는 쉽게 측정된다.
본원 발명의 치료적 화합물들은 단위 투약 형태로 약제학적으로 수용 가능한 희석된, 담체, 또는 부형제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 비경구, 정맥 내, 피하, 경구, 국부, 또는 국소적일 수 있다. 약제를 투여하는 것은 협력하여 작업하는 다수의 사람들에 의하여 수행될 수 있다. 약제를 투여하는 것은 자가-전달에 의하여, 예컨대, 경구 전달, 피하 전달, 중앙 라인, 기타등등을 통한 정맥 내 전달에 의하여; 또는 숙련된 전문가에 의한 전달, 예컨대, 정맥 내 전달, 근육 내 전달, 종양내투여(intratumoral) 전달, 기타 등등 중 하나에 의하여, 직접 또는 다른 방식을 통하여, 특이적 약제를 섭취하기 위하여, 예를 들면, 대상에게 투여될 약제를 처방하는 것 및/또는 설명들을 제공하는 것을 포함한다.
상기 조성물은 경구 투여를 위한 환제, 정제, 캡슐, 액제, 또는 지속 방출 정제; 또는 정맥 내, 피하, 또는 비경구 투여를 위한 액제; 또는 국소 투여를 위한 폴리머 또는 여타 지속 방출 운반체의 형태일 수 있다.
당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 제제들을 제조하는 방법들은, 예를 들면, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams "Wilkins, Philadelphia, Pa.)에 있다. 비경구 투여를 위한 제제들은 예를 들면, 부형제들, 멸균수, 식염수, 폴리알킬렌 글리콜들 이를테면 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원 오일들, 또는 수소화된 나프탈렌들을 함유할 수 있다. 생물 적합성의, 생분해 가능한 락타이드 폴리머, 락타이드/글라이콜라이드 코폴리머, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머들이 화합물들의 방출을 제어하는데 사용될 수 있다. 나노미립자 제제들 (예컨대, 생물 분해성 나노입자들, 고체 지질 나노입자들, 리포좀들)이 화합물들의 생분포(biodistribution)의 제어에 사용될 수 있다. 여타의 가능한 유용한 비경구 전달 시스템들은 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머 입자들, 삼투성 펌프들, 이식형 주입 시스템들, 그리고 리포좀들을 포함한다. 제제 내의 화합물의 농도는 투여되는 약물의 투여량, 그리고 투여의 경로를 포함하는, 인자들의 수에 따라 달라진다.
화합물은 약제학적으로 수용 가능한 염, 이를테면 약제학적 산업에서 보통 사용되는 비-독성 애시드 부가 염들 또는 금속 복합체들로서 임의선택적으로 투여될 수 있다. 애시드 부가 염들의 예시는 유기 산들 이를테면 아세틱, 락틱, 파모익, 말레익, 사이트릭, 말릭, 아스코르빅, 숙시닉, 벤조익, 팔미틱, 수버릭, 살리실릭, 타르타릭, 메탄술포닉, 톨루엔술포닉, 또는 트리플루오로아세틱 애시드들 그리고 이와 유사한 것들; 폴리머릭 애시드들 이를테면 탄닉 애시드, 카르복시메틸 셀룰로오스, 그리고 이와 유사한 것들; 그리고 무기 애시드 이를테면 하이드로클로릭 애시드, 하이드로브로믹 애시드, 설퓨릭 애시드 포스포릭 애시드, 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 금속 복합체들은 아연, 철, 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다.
경구 용도를 위한 제제들은 비-독성의 약제학적으로 수용 가능한 부형제들과의 혼합물 내에 활성 성분(들)을 함유하는 정제들을 포함한다. 이들 부형제들은 예를 들면, 불활성의 희석제들 또는 충전재들 (예컨대, 수크로오스 및 솔비톨), 윤활제들, 활윤제들, 그리고 항-접착제들 (예컨대, 마그네슘, 징크 스테아레이트, 스테아릭 애시드, 실리카들, 수소화된 식물 오일들, 또는 탈크)일 수 있다. 경구 용도를 위한 제제들은 또한 씹을 수 있는 정제들로서, 또는 경질 젤라틴 캡슐들, 여기서 활성 성분이 불활성의 고체 희석제와 혼합됨, 또는 연질 젤라틴 캡슐들, 여기서 활성 성분이 물 또는 오일 매질과 혼합됨, 로서 제공될 수 있다.
상기 화합물을 투여하는 투약량 및 타이밍은 상기 대상의 전체적 건강 및 질환, 예컨대, 당뇨병, 대사 증후군의 증상들의 중증도를 포함하는 임상적 인자들에 따라 달라진다.
III. 핵산 치료제들
핵산 치료제들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 핵산 치료제들은 세포 내의 표적 서열에 상보적인 단일 가닥 및 이중 가닥 (즉, 적어도 15 뉴클레오타이드들 길이의 상보적 영역을 가지는 핵산 치료제들) 핵산들 양쪽 모두를 포함한다. 핵산 치료제들은, 예컨대, 핵산을 단독으로 또는 세포 내로 핵산의 섭취를 촉진시키는 약제와 함께 배양 배치에 첨가함으로써, 배양내의 세포로 전달될 수 있다. 핵산 치료제들은 대상에서 세포 즉, 생체 내로, 여하한 투여 경로에 의하여 전달될 수 있다. 특이적 제제는 투여의 경로에 의존할 것이다.
본원 명세서에서 사용되는, 그리고 달리 지시되지 않는 한, 제 1 뉴클레오타이드 서열을 제 2 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 설명하는데 사용되는 경우 "상보적인,"이라는 용어는, 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 제 1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 제 2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 혼성화 하여 이중 구조(duplex structure)를 형성하는 능력을 지시한다. 그러한 조건들은 예를 들면, 엄격한(stringent) 조건들 일 수 있으며, 여기서 엄격한 조건들은 이하를 포함할 수 있다: 400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA, 50℃ 또는 70℃에서 12-16 시간동안, 세척이 수반됨. 여타 조건들, 이를테면 유기체 내에서 직면할 수 있는 생리학적 관련 조건들, 이 적용될 수 있다. 통상의 기술자는 혼성화된 뉴클레오타이드들의 궁극적 적용에 따른 두 서열들의 상보성 테스트에 가장 적합한 조건들의 세트를 결정할 수 있을 것이다.
서열들은 제 1 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드들의 제 2 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드들과의 염기-쌍 형성이 제 1 및 제 2 뉴클레오타이드 서열들의 전체 길이에 걸쳐서 있는 경우 각각에 대하여 "완전히 상보적"일 수 있다. 그러나, 본원 명세서에서 제 1 서열이 제 2 서열에 대하여 "실질적으로 상보적인" 것으로 지시되는 경우, 상기 두 서열들은 완전히 상보적일 수 있으며, 또는 그들은 그들의 궁극적 적용과 가장 관련된 조건들 하에서 혼성화 능력을 보유하면서 하나 또는 그 이상의, 그러나 일반적으로 혼성화에 따른 염기쌍들의 4, 3 또는 2 미만의 미스매치를 형성할 수 있다. 그러나, 이중 가닥 핵산 치료제들에서 흔한 것처럼 두 올리고뉴클레오타이드들이 혼성화에 의하여 하나 또는 그 이상 단일 가닥 돌출부들(overhangs)를 형성하도록 디자인되는 경우, 그러한 돌출부들은 상보성의 결정과 관련하여 미스매치들로 간주되지 않을 것이다. 예를 들면, 21　뉴클레오타이드들 길이의 하나의 올리고뉴클레오타이드 및 23 뉴클레오타이드들 길이의 또 하나의 올리고뉴클레오타이드을 포함하는 dsRNA, 여기서 상기 보다 긴 올리고뉴클레오타이드는 보다 짧은 올리고뉴클레오타이드에 완전히 상보적인 21 뉴클레오타이드들의 서열을 포함함, 은 본원 명세서에서 설명된 목적을 위하여 여전히 "완전히 상보적인" 것으로서 지시될 수 있다.
본원 명세서에서 사용되는, "상보적인" 서열들은 또한 위의 그들의 혼성화 능력에 관련된 요구사항들이 충족되는한, 비-왓슨-크릭 염기 쌍들 및/또는 비-천연의 그리고 변형된 뉴클레오타이드들로부터 형성된 염기 쌍들을 포함하거나, 또는 그로부터 완전히 형성될 수 있다. 그러한 비-왓슨-크릭 염기 쌍들은, 이하로 한정되는 것은 아니나 G:U 동요(Wobble) 또는 후그스틴(Hoogstein) 염기 쌍 형성를 포함한다.
본원 명세서에서 "상보적인", "완전히 상보적인" 그리고 "실질적으로 상보적인"이라는 용어들은 그들이 사용되는 문맥으로부터 이해되는 바와 같이, 센스 가닥과 dsRNA의 안티센스 가닥 사이의, 또는 안티센스 핵산 또는 dsRNA의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의 염기 매칭과 관련하여 사용될 수 있다.
본원 명세서에서 사용되는, 메신저 RNA (mRNA) "의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인" 폴리뉴클레오타이드는, 5' UTR, ORF (open reading frame), 또는 3' UTR를 포함하는 관심 대상의 mRNA(예컨대, HSP90, 특히 Hsp90β를 인코딩하는 mRNA) 의 인접 부위(contiguous portion)에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 지시한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드는, 만약 상기 서열이 HSP90, 특히 Hsp90β을 인코딩하는 mRNA의 비-단속 영역 (non-interrupted portion)에 실질적으로 상보적이라면, HSP90, 특히 Hsp90β mRNA의 적어도 일부에 상보적이다.
안티센스 핵산들, 화학적 변형들, 그리고 치료적 용도들에 대한 특허들은, 예를 들면, 화학적으로 변형된 RNA-함유 치료 화합물들에 관련된 미국 특허 제5,898,031호, 그리고 치료제로서 이들 화합물을 이용하는 방법들에 관련된 미국 특허 제6,107,094호, 단일-가닥의 화학적으로 변형된 RNA-유사 화합물들을 투여함으로써 환자들을 치료하는 방법들에 관한 미국 특허 제7,432,250호; 그리고 단일-가닥의 화학적적으로 변형된 RNA-유사 화합물들을 함유하는 약제학적 조성물들에 관한 미국 특허 제7,432,249호에 제공되어 있다. 미국 특허 제7,629,321호는 복수의 RNA 뉴클레오사이드들 및 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 이용한 표적 mRNA의 절단(cleaving) 방법들에 관한 것이다. 상기 단락에 열거된 각각의 특허들은 본원 명세서에서 참조로서 편입된다.
치료 핵산은 천연 (즉 A, G, U, C, 또는 T) 또는 변형된 (7-데아자구아노신, 이노신, 기타 등등) 염기들을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 뉴클레오타이드 내의 염기들은, 그것이 혼성화를 간섭하지 않는 한, 포스포디에스테르 결합이외의 결합에 의하여 연결될 수 있다. 따라서, 저해 핵산들은 구성 성분의 염기들이 포스포디에스테르 결합들이 아니라 펩타이드 결합들에 의하여 연결되는 펩타이드 핵산들일 수 있다. 저해 핵산들은 RNA를 cDNA로 공지된 방법들을 이용하여 전환시킴으로써 제조될 수 있다. (예컨대, Ausubel et. al., Current Protocols in Molecular Biology Wiley 1999 참조). 저해 핵산들은 또한 cRNA일 수 있다 (예컨대, Park et. al., (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325(4): 1346-52 참조).
치료 핵산들은 합성 방법들 이를테면 포스포라미디트(phosphoramidite) 방법들, H-포스포네이트 방법론, 그리고 포스파이트-삼에스터법들(phosphite trimestr methods), 로부터 생성될 수 있다. 저해 핵산들은 또한 PCR 방법들로 제조될 수 있다. 그러한 방법들은 mRNA에 상보적인 cRNA 및 cDNA 서열들을 생성한다. 치료 핵산의 합성 방법은 본 발명의 제한이 아니다.
핵산 치료제들은 전형적으로 그들의 안정성을 향상시키고 그들의 약물동태학적 및 약역학적 성질들을 조절하기 위한 하나 또는 그 이상 화학적 변형들을 포함한다. 예를 들면, 뉴클레오타이드들에 대한 변형은 이하로 한정되는 것은 아니나, LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C- 알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 2'-하이드록실, 그리고 이의 조합들을 포함할 수 있다.
핵산 치료제들은 하나 이상의 포스포로치오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합(internucleotide linkage)을 더 포함할 수 있다. 포스포로치오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 양쪽 모두의 여하한 뉴클레오타이드 상에서 (센스 가닥을 포함하는 핵산 치료제들에서) 상기 가닥의 여하한 위치에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 뉴클레오타이드마다 일어날 수 있으며; 각각의 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상에서 교대 패턴으로 일어날 수 있으며; 또는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 양쪽 모두의 뉴클레오타이드간 결합 변형을 교대 패턴으로 함유할 수 있다. 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 그리고 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥 상의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴에 비하여 쉬프트(shift)를 가질 수 있다.
여타의 변형들은 표준 염기들, 당들(sugars) 및/또는 리보뉴클레익 (즉, A, C, G 및 U) 그리고 데옥시리보뉴클레익 (즉, A, C, G 및 T) 애시드들에서 나타나는 포스페이트 백본 화학적 구조들의 변형체들인 변형된 염기들 (또는 변형된 뉴클레오사이드 또는 변형된 뉴클레오타이드들)의 편입을 포함한다. 본 발명의 보호범위에 포함되는 것은, 예를 들면: Gm (2'-메톡시구아닐릭 애시드), Am (2'-메톡시아데닐릭 애시드), Cf (2'-플루오로사이티딜릭 애시드), Uf (2'-플루오로유리딜릭 애시드), Ar (리보아데닐릭 애시드)이다. 압타머들(aptamers)은 또한 5-메틸사이토신, 4-아세틸사이토신, 3-메틸사이토신, 5-하이드록시메틸 사이토신, 2-치오사이토신, 5-할로사이토신 (예컨대, 5-플루오로사이토신, 5-브로모사이토신, 5-클로로사이토신, 그리고 5-아이오도사이토신), 5-프로피닐 사이토신, 6-아조사이토신, 5-트리플루오로메틸사이토신, N4, N4-에타노사이토신, 페녹사진 사이티딘, 페노사이아진 사이티딘, 카바졸 사이티딘 또는 피리도인돌 사이티딘을 포함하는 사이토신 또는 여하한 사이토신-관련 염기를 포함할 수 있다. 압타머는 6-메틸구아닌, 1-메틸구아닌, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2-프로필구아닌, 6-프로필구아닌, 8-할로구아닌 (예컨대, 8-플루오로구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 그리고 8-아이오도구아닌), 8-아미노구아닌, 8-설프하이드릴구아닌, 8-치오알킬구아닌, 8-하이드록실구아닌, 7-메틸구아닌, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌 또는 3-데아자구아닌을 포함하는 구아닌 또는 여하한 구아닌-관련 염기를 더욱 포함할 수 있다. 압타머는, 6-메틸아데닌, N6-이소펜테닐아데닌, N6-메틸아데닌, 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸치오-N6-이소펜테닐아데닌, 8-할로아데닌 (예컨대, 8-플루오로아데닌, 8-브로모아데닌, 8-클로로아데닌, 그리고 8-아이오도아데닌), 8-아미노아데닌, 8-설프하이드릴아데닌, 8-치오알킬아데닌, 8-하이드록실아데닌, 7-메틸아데닌, 2-할로아데닌 (예컨대, 2-플루오로아데닌, 2-브로모아데닌, 2-클로로아데닌, 그리고 2-아이오도아데닌), 2-아미노아데닌, 8-아자아데닌, 7-데아자아데닌 또는 3-데아자아데닌를 포함하는, 아데닌 또는 여하한 아데닌-관련 염기를 더욱 더 포함할 수 있다. 또한 포함되는 것은, 5-할로유라실 (예컨대, 5-플루오로유라실, 5-브로모유라실, 5-클로로유라실, 5-아이오도유라실), 5-(카르복시하이드록실메틸)유라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-치오유라실, 5-카르복시메틸아미노메틸유라실, 디하이드로유라실, 1-메틸수도유라실, 5-메톡시아미노메틸-2-치오유라실, 5'-메톡시카르보닐메틸유라실, 5-메톡시유라실, 5-메틸-2-치오유라실, 2-치오유라실, 4-치오유라실, 5-메틸유라실, 유라실-5-옥시아세틱 애시드 메틸에스테르, 유라실-5-옥시아세틱 애시드, 수도유라실, 5-메틸-2-치오유라실, 2-치오유라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)유라실, 5-메틸아미노메틸유라실, 5-프로피닐 유라실, 6-아조유라실, 또는 4-치오유라실을 포함하는, 유라실 또는 여하한 유라실-관련 염기이다.
당해 기술 분야에 알려져 있는 여타 변형되 염기 변형체들의 예시는, 제한 없이, 예컨대, 4-아세틸사이티딘, 5-(카르복시하이드록실메틸) 유리딘, 2'-메톡시사이티딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-치오리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸유리딘, 디하이드로유리딘, 2'-O-메틸수도유리딘, b-D-갈락토실큐에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸수도유리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸사이티딘, 5-메틸사이티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸유리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-치오유리딘, b-D-만노실큐에오신, 5-메톡시카르보닐메틸유리딘, 5-메톡시유리딘, 2-메틸치오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-b-D-리보퓨라노실-2-메틸치오퓨린-6-일)카르바모일)트레오닌, N-((9-b-D-리보퓨라노실퓨린-6-일)N-메틸-카르바모일)트레오닌, 유르딘(urdine)-5-옥시아세틱 애시드 메틸에스테르, 유리딘-5-옥시아세틱 애시드 (v), 와이부톡소신, 수도유리딘, 큐에오신, 2-치오사이티딘, 5-메틸-2-치오유리딘, 2-치오유리딘, 4-치오유리딘, 5-메틸유리딘, N-((9-b-D-리보퓨라노실퓨린-6-일)카르바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸유리딘, 2'-O-메틸유리딘, 그리고 와이부토신, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)유리딘을 포함한다.
또한 포함되는 것은 미국 특허 제 3,687,808 호, 제 3,687,808 호, 제 4,845,205 호, 제 5,130,302 호, 제 5,134,066 호, 제 5,175,273 호, 제 5,367,066 호, 제 5,432,272 호, 제 5,457,187 호, 제 5,459,255 호, 제 5,484,908 호, 제 5,502,177 호, 제 5,525,711 호, 제 5,552,540 호, 제 5,587,469 호, 제 5,594,121 호, 제 5,596,091 호, 제 5,614,617 호, 제 5,645,985 호, 제 5,830,653 호, 제 5,763,588 호, 제 6,005,096 호, 그리고 제 5,681,941호에 개시된 변형된 뉴클레오염들이며, 이들 각각은 그것의 전체가 본원 명세서에서 참조로서 편입된다. 당해 기술 분야에 알려진 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 당 백본 변형체들의 예시들은, 제한 없이, 예컨대, 2' 라이보실 치환체들, 이를테면 F, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2, CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2ON(CH3)2, OCH2OCH2N(CH3)2, O(C1-10 알킬), O(C2-10 알케닐), O(C2-10 알키닐), S(C1-10 알킬), S(C2-10 알케닐), S(C2-10 알키닐), NH(C1-10 알킬), NH(C2-10 알케닐), NH(C2-10 알키닐), 그리고 O-알킬-O-알킬을 갖는 것들을 포함한다. 유익한 2' 라이보실 치환체들은 2'-메톡시 (2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시 (2' OCH2CH2CH2NH2), 2'-O-알릴 (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴 (2'-O--CH2-CH=CH2), 2'-아미노 (2'-NH2), 그리고 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 2'-치환체는 아라비노 (위(up)) 위치 또는 리보 (아래(down)) 위치에 있을 수 있다.
A. 단일 가닥 핵산 치료제들
안티센스 핵산 치료제들은, 전형적으로 약 16 내지30 뉴클레오타이드들 길이의, 단일 가닥 핵산 치료제들이며, 그리고 배양 또는 유기체 중 하나에서, 표적 세포 내 표적 핵산 서열에 상보적이다.
다른 측면에서, 상기 약제는 단일-가닥 안티센스 RNA 분자이다. 안티센스 RNA 분자는 표적 mRNA 내의 서열에 상보적이다. 안티센스 RNA는 mRNA에 염기쌍을 형성함으로써 그리고 번역 기구를 물리적으로 방해함으로써 화학양론적 방식으로 번역을 저해할 수 있으며, Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355를 참조하라. 안티센스 RNA 분자는 표적 mRNA에 상보적인 약 15-30 뉴클레오타이드들을 가질 수 있다. 예를 들면, 안티센스 RNA 분자는 표적 mRNA에 상보적인 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 인접(contiguous) 뉴클레오타이드들의 서열을 가질 수 있다.
안티센스 핵산들, 화학적 변형들, 그리고 치료적 용도들에 대한 특허들이 예를 들면, 화학적으로 변형된 RNA-함유 치료 화합물들을에 대한 미국 특허 제5,898,031호, 그리고 치료제로서 이들 화합물들을 사용하는 방법들에 대한 미국 특허 제6,107,094 호. 단일-가닥 화학적으로 변형된 RNA-유사 화합물들을 투여함으로써 환자들을 치료하는 방법들에 대한 미국 특허 제7,432,250 호; 그리고 단일-가닥의 화학적으로 변형된 RNA-유사 화합물들을 함유하는 약제학적 조성물들에 대한 미국 특허 제7,432,249 호에서 제공된다. 미국 특허 제7,629,321 호는 복수의 RNA 뉴클레오사이드들 및 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 표적 mRNA를 절단하는 방법들에 관한 것이다. 이 단락에서 열거된 특허들의 각각의 전체 내용은 본원 명세서에 참조로서 편입된다.
B. 이중 가닥 핵산 치료제들
본 발명의 핵산 치료제들은 또한 이중 가닥 핵산 치료제들을 포함한다. "RNAi 약제", "이중 가닥 RNAi 약제", "이중-가닥 RNA (dsRNA) 분자", 또한 본원 명세서에서 상호 교환가능하게 사용되며, "dsRNA 약제," "dsRNA", "siRNA", "iRNA 약제,"로서 지시됨, 는 두개의 역-평행의(anti-parallel) 그리고 실질적으로 상보적인, 아래에서 정의되는 바와 같은, 핵산 가닥들을 포함하는 이중 구조를 갖는, 리보핵산 분자들의 복합체를 지시한다. 본원 명세서에서 사용되는, RNAi 약제는 또한 dsiRNA를 포함할 수 있다. (예컨대, 미국 특허 공개 제 20070104688 호 참조, 본원 명세서에 참조로서 편입됨). 일반적으로, 각각의 가닥의 뉴클레오타이드들의 대다수는 리보뉴클레오타이드들이나, 본원 명세서에서 개시된 바와 같이, 각각의 또는 양쪽 모두 가닥들은 또한 하나 또는 그 이상 비-리보뉴클레오타이드들, 예컨대, 데옥시리보뉴클레오타이드 및/또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 상세한 설명에서 사용된 바와 같이, "RNAi 약제"는 화학적 변형들을 갖는 리보뉴클레오타이드들을 포함할 수 있으며; RNAi 약제는 다중 뉴클레오타이드들에서 실질적 변형들을 포함할 수 있다. 그러한 변형들은 본원 명세서에 개시된 또는 당해 기술 분야에 알려진 모든 타입의 변형들을 포함할 수 있다. siRNA 타입 분자에서 사용된 바와 같은, 여하한 그러한 변형들은 본원 상세한 설명 및 청구항들의 목적을 위한 "RNAi 약제"에 의하여 포괄된다.
이중 구조를 형성하는 두 가닥들은 하나의 보다 큰 RNA 분자의 상이한 두 영역일 수 있거나, 또는 그들은 별개의 RNA 분자들일 수 있다. 상기 두 가닥들이 하나의 보다 큰 분자의 부분이며, 그리고 그러므로 이중 구조를 형성하는 각각의 한 가닥의 3'-말단과 다른 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오타이드들의 단속되지 않은(uninterrupted) 사슬에 의하여 연결되는 경우, 상기 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프"로서 지시된다. 두 가닥들이 이중 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 다른 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오타이드들의 단속되지 않은 사슬이 아닌 수단들에 의하여 공유적으로 연결된 경우, 상기 연결 구조는 "링커(linker)"로서 지시된다. RNA 가닥들은 동일한 또는 상이한 갯수의 뉴클레오타이드들을 가질 수 있다. 염기 쌍들의 최대 개수는 dsRNA의 가장 짧은 가닥의 뉴클레오타이드들의 개수 빼기 이중(듀플렉스)에 존재하는 여하한 돌출부들(overhangs)이다. 이중 구조뿐만 아니라, RNAi 약제는 하나 또는 그 이상 뉴클레오타이드 돌출부들을 포함할 수 있다. "siRNA"이라는 용어는 또한 본원 명세서에서 전술한 바와 같이 RNAi 약제를 지시하는 것으로 사용된다.
많은 실시예들에서, 듀플렉스 영역은 15-30 뉴클레오타이드 쌍들의 길이이다. 일부 실시예들에서, 듀플렉스 영역은 17-23 뉴클레오타이드 쌍들의 길이, 17-25 뉴클레오타이드 쌍들의 길이, 23-27 뉴클레오타이드 쌍들의 길이, 19-21 뉴클레오타이드 쌍들의 길이, 또는 21-23 뉴클레오타이드 쌍들의 길이이다.
일부 실시예들에서, 각각의 가닥은 15-30 뉴클레오타이드들을 갖는다.
본 발명의 방법들에서 사용되는 RNAi 약제들은 예를 들면, 2011년 11월 18일에 출원된 미국 가출원 제 61/561,710호, 2010년 9월 15일에 출원된 국제 출원 제 PCT/US2011/051597호, 그리고 PCT 공개 제 WO 2009/073809에 개시된 바와 같은 화학적 변형들을 갖는 약제들을 포함하며, 이들 각각의 전체의 내용들은 본원 명세서에 참조로서 편입된다. "안티센스 가닥"이라는 용어는 표적 서열 (예컨대, 인간 TTR mRNA)에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 이중 가닥 RNAi 약제의 가닥을 지시한다. 본원 명세서에서 사용되는, "mRNA 인코딩 트랜스티레틴(transthyretin)의 일부에 상보적인 영역"이라는 용어는 TTR mRNA 서열의 일부에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지시한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않는 경우, 미스매치들은 말단의 영역들에서 가장 관용되며(tolerated) 그리고, 만약 존재한다면, 일반적으로 말단의 영역 또는 영역들, 예컨대, 5' 및/또는 3' 말단들의 6, 5, 4, 3, 또는 2 뉴클레오타이드들 내에 있다.
본원 명세서에서 사용되는, "센스 가닥"이라는 용어는 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 지시한다.
IV. 진단 및 치료 항체들
본 발명의 진단 및 치료 방법들 양쪽 모두는 폴리클로날 및 모노클로날 항체들을 포함하는 항체들의 용도를 포함할 수 있다. 본원 명세서에서 사용되는, "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이라는 용어는 특정의 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위의 오직 한 종들을 함유하는 항체 분자들의 집단을 지시한다. 본 발명에서 사용하기 위한 항체들은 HSP90에 결합하는 항체들, 바람직하게는 Hsp90β-특이적인 항체들을 포함한다. 항체들은 상업적인 공급원들로부터 입수되거나 또는 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
폴리클로날 항체들은 적절한 대상을 면역원으로서 본 발명의 단백질로 면역시킴으로써 제조될 수 있다. 면역화된 대상에서 항체 적정은 표준 기술들, 이를테면 고정된 폴리펩타이드를 이용하는 효소 링크된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의하여 시간에 걸처 모니터될 수 있다. 면역화 후 적정 시간에, 예컨대, 특이적 항체 역가들(titers)이 가장 높은 경우, 항체-생산 세포들이 상기 대상으로부터 얻어질 수 있으며 그리고 표준 기술들, 이를테면 원래 Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256:495-497에 기재되어 있는 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72 참조), EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985 참조) 또는 트리오마(trioma) 기술들에 의하여 모노클로날 항체들 (mAb)을 제조하는데 사용될 수 있다. 하이브리도마들을 생산하는 기술은 잘 알려져 있다(일반적으로 Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994 참조). 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포들은, 하이브리도마 배양 상청액들을 관심 대상의 폴리펩타이드에 결합하는 항체들에 대하여 예컨대, 표준 ELISA 분석을 이용하여 스크리닝함으로써 탐지된다.
모노클로날 항체-분비 하이브리도마들의 제조에 대한 대안으로서, 본 발명의 단백질에 대하여 지정된(directed) 모노클로날 항체는 관심 대상의 폴리펩타이드로 재조합 조합(combinatorial) 면역글로불린 라이브러리 (예컨대, 항체 파아지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝함으로써 동정되고 분리될 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리들의 생성 및 스크리닝을 위한 키트들이 상업적으로 이용 가능하다. (예컨대, Pharmacia Recombinant Phage Antibody system, Catalog No. 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 추가로, 특히 항체 디스플레이 라이브러리의 생산 및 스크리닝의 용도에 순응하는 방법들 및 시약들의 예시들은 예를 들면, 미국 특허 제5,223,409 호; PCT 공개 제 WO 92/18619호; PCT 공개 제 WO 91/17271 호; PCT 공개 제 WO 92/20791 호; PCT 공개 제 WO 92/15679 호; PCT 공개 제 WO 93/01288 호; PCT 공개 제 WO 92/01047 호; PCT 공개 제 WO 92/09690 호; PCT 공개 제 WO 90/02809 호; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734에서 찾을 수 있다.
관심 대상 단백질에 특이적으로 결합하는 재조합 항체들 또한 본 발명의 방법들에 사용될 수 있다. 바람직한 실시예들에서, 재조합 항체들은 관심 대상 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합한다. 재조합 항체들은, 이하로 한정되는 것은 아니나, 인간 및 비-인간 양쪽 모두의 영역들, 단일-사슬 항체들 그리고 다중-특이적 항체들을 포함하는, 키메릭 그리고 인간화된 모노클로날 항체들, 을 포함한다. 키메릭 항체는 상이한 영역들이 상이한 동물 종들로부터 유래되는 분자이며, 이를테면 쥐과동물 mAb으로부터 유래된 가변영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것들이다. (예컨대, Cabilly et al., 미국 특허 제4,816,567호; 그리고Boss et al., 미국 특허 제4,816,397호를 참조하라, 이들은 그 전체로서 본원 명세서에서 참조로서 편입된다) 단일-사슬 항체들은 항원 결합 부위를 가지며 그리고 단일 폴리펩타이드로 구성된다. 그들은 당해 기술 분야에 공지된 기술들에 의하여, 예를 들면 Ladner et. al 미국 특허 제 4,946,778호 (이는 그 전체가 본원 명세서에서 참조로서 편입됨); Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:1-9; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:97-105; 및 Huston et al., (1991) Methods in Enzymology Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications 203:46-88에 기재된 방법들을 이용하여 생산될 수 있다. 다중-특이적 항체들은 상이한 항원들에 특이적으로 결합하는 적어도 두 항원-결합 부위들을 갖는 항체 분자들이다. 그러한 분자들은 당해 기술 분야에 알려진 기술들에 의하여, 예를 들면 Segal, 미국 특허 제4,676,980호 (이의 개시는 그의 전체가 본원 명세서에서 참조로서 편입된다); Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Whitlow et al., (1994) Protein Eng. 7:1017-1026 그리고 미국 특허 제 6,121,424호에 설명된 방법들을 이용하여 생산될 수 있다.
인간화된 항체들은 비-인간 종들로부터의 하나 또는 그 이상 상보성 결정 영역들 (CDRs) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 비-인간 종들로부터의 항체 분자들이다. (예컨대, Queen, 미국 특허 제5,585,089호 참조, 이는 그 전체가 본원 명세서에서 참조로서 편입된다.) 인간화된 모노클로날 항체들은 당해 기술 분야에 알려진 재조합 DNA 기술들에 의하여, 예를 들면 PCT 공개 제 WO 87/02671호; 유럽 특허 출원 제 184,187 호; 유럽 특허 출원 제 171,496 호; 유럽 특허 출원 제 173,494 호; PCT 공개 제 WO 86/01533호; 미국 특허 제4,816,567호; 유럽 특허 출원 제 125,023 호; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; 그리고 Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; 미국 특허 제 5,225,539호; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 그리고 Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060에 기재된 방법들을 이용하여 생산될 수 있다.
보다 구체적으로, 인간화된 항체들은, 예를 들면, 내생적(endogenous) 면역글로불린 중쇄 및 경쇄들의 유전자들을 발현할 수 없으나, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자들을 발현할 수 있는 유전자도입(transgenic) 마우스들을 이용하여 생산될 수 있다. 상기 유전자도입 마우스들은 선택된 항원, 예컨대, 본 발명의 마커에 대응되는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부 영역, 으로 보통의 방식으로 면역화된다. 항원에 대하여 지정된(directed) 모노클로날 항체들은 전통적인 하이브리도마 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자도입 마우스들에 의하여 정박된(harbored) 인간 면역글로불린 이식유전자들(transgenes)은 B 세포 분화 동안에 전위(rearrange)되며, 그리고 이후에 클래스 전환(class switching) 및 체세포 변이(somatic mutation)를 겪는다. 따라서, 그러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA 및 IgE 항체들을 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체들 제조에 대한 이 기술의 개관을 위하여, Lonberg 및 Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93를 참조하라). 인간 항체들 및 인간 모노클로날 항체들을 생산하는 이 기술 및 그러한 항체들을 생산하는 프로토콜들에 대한 상세한 설명은, 예컨대, 미국 특허 제 5,625,126호; 미국 특허 제 5,633,425 호; 미국 특허 제 5,569,825 호; 미국 특허 제 5,661,016 호; 그리고 미국 특허 제 5,545,806 호를 참조하라. 뿐만 아니라, 전술한 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대하여 지정된 인간 항체들을 제공하기 위하여 회사들이 고용될 수 있다.
선택된 에피토프를 인식할 수 있는 완전하게 인간 항체들은 "안내된 선택(guided selection)"으로서 지시되는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 접근 방법에서, 선택된 비-인간 모노클로날 항체, 예컨대, 쥐과동물 항체, 가 동일한 에피토프를 인식하는 완전하게 인간 항체의 선택을 안내하는데 사용된다. (Jespers et al., 1994, Bio/technology 12:899-903).
본 발명의 항체들은 생산 또는 합성 후 (예컨대, 상기 대상의 혈액 또는 혈청으로부터)분리될 수 있으며 잘-알려진 기술들로 더욱 정제될 수 있다. 예를 들면, IgG 항체들은 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 본 발명의 단백질에 특이적인 항체들은 선택되거나 또는 (예컨대, 부분적으로 정제됨) 또는 예컨대, 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있다. 예를 들면, 재조합적으로 발현되고 정제된 (또는 부분적으로 정제된) 본 발명의 단백질은 본원 명세서에서 설명된 바와 같이 생산되며, 그리고 공유적으로 또는 비-공유적으로 고체 지지체 이를테면, 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼에 커플링된다(coupled). 상기 칼럼은 이후, 다수의 상이한 에피토프들에 대하여 지정된(directed) 항체들 함유 샘플로부터 본 발명의 단백질들에 특이적인 항체들의 친화성 정제에 사용될 수 있으며, 이로써 실질적으로 정제된 항체 조성물, 즉, 실질적으로 오염 항체들이 없는 것을 생성할 수 있다. 실질적으로 정제된 항체 조성물에 의하여 의미되는 것은, 본원의 문맥에서, 상기 항체 샘플이 많아야 단지 30% (건조 중량으로)의 본 발명의 바람직한 단백질의 것들 이외의 에피토프르에 대하여 지정된 오염 항체들을 함유하는 것이며, 그리고 바람직하게는 많아야 20%, 더욱 더 바람직하게는 많아야 10%, 그리고 가장 바람직하게는 많아야 5% (건조 중량으로)의 샘플이 오염 항체들이다. 정제된 항체 조성물은, 조성물 내의 항체들의 적어도 99%가 본 발명의 바람직한 단백질에 대하여 지정된 것을 의미한다.
단백질에 대하여 지정된 항체는 표준 기술들, 이를테면 친화성 크로마토그래피 또는 면역 침강(immunoprecipitation)에 의하여 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 그러한 항체는 마커의 발현의 패턴 및 수준을 평가하기 위하여 마커 단백질, 예컨대, Hsp90β, 또는 그의 단편 (예컨대, 세포 용해물 또는 세포 상청액에서)을 탐지하는데 사용될 수 있다. 상기 항체들은 또한 임상 테스트 절차의 일부로서, 예컨대, 예를 들면, 주어진 처치 요법(regimen)의 유효성을 측정하기 위하여 조직들 또는 신체 유동체들 (예컨대 질환 상태 또는 독성 상태 연관 신체 유동체에서) 단백질 수준들을 모니터 하는데 진단적으로 사용될 수 있다. 탐지는 탐지 가능한 성분에 커플링된 본 발명의 항체를 포함하는 항체 유도체의 사용에 의하여 촉진될 수 있다. 탐지 가능한 성분들의 예시들은, 다양한 효소들, 보결원자단들 (prosthetic groups), 형광성 물질들, 발광성 물질들, 생물발광성 물질들, 그리고 방사성 물질들을 포함한다. 적절한 효소들의 예시들은 호울스라디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하며; 적절한 보결원자단 복합체들의 예시들은 스트렙타비딘/바이오틴 그리고 아비딘/바이오틴을 포함하며; 적절한 형광성 물질들의 예시들은 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소치오시아네이트, 로다민, 디클로로 트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하며; 발광성 물질의 예시는 루미놀을 포함하며; 생물발광성 물질의 예시들은 루시페라아제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하며, 그리고 적절한 방사성 물질의 예시들은 125I, 131I, 35S 또는 3H 를 포함한다.
항체들은 또한 대사 증후군 및/또는 당뇨병 치료에 치료제들로서 사용될 수 있다.
V. HSP90의 소분자 저해제들
HSP90의 소분자 저해제들은, 이하로 한정되는 것은 아니나, 겔다나마이신
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
그들의 작용 메커니즘에 따라, 일부 소분자 저해제들은 바람직하게는 N-말단의 ATP-결합 도메인에서 ATP의 결합 및/또는 가수분해를 간섭함으로써 HSP90를 저해하며, 예컨대, 겔다나마이신이다. (Sausville, et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003; 43: 199-231 참조, 본원 명세서에서 참조로서 편입됨). 여타 HSP90 저해제들은 C-말단의 ATP-결합 도메인에서 ATP의 결합 및/또는 가수분해에 간섭함으로써 HSP90를 저해하며, 예컨대, 노보바이오신이다. (Marcu, et al., J Biol Chem 2000; 275: 37181-37186 참조, 본원 명세서에서 참조로서 편입됨). 모든 HSP90 저해제들이 Hsp90 단백질의 어느 한 말단에서 ATP-결합 부위와 상호 작용함으로써 HSP90에 작용하는 것은 아니다. 그러한 HSP90 저해제들의 예시들은 KU174, 쿠머마이신 A1, 세라스트롤, 게두닌, H2-개멘다졸(gamendazole), 그리고 개멘다졸을 포함한다. (Matts, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 19 (2011) 684-692 및 Tash, et al., Biology of Reproduction 2008; 78, 1139-1152 참조, 본원 명세서에서 참조로서 편입됨). 이들 제해제들 중에서, 예를 들면, 세라스트롤은 Hsp90를 효과적으로 무력화하기 위하여 Hsp90과 키나아제 co-샤페론 Cdc37 사이의 상호작용을 붕괴시킨다. (Matts, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 19 (2011) 684-692 참조, 본원 명세서에서 참조로서 편입됨).
많은 공지된 HSP90 저해제들이 HSP90α 및 Hsp90β 동종형들 양쪽 모두를 저해하는데, 예컨대, 겔다나마이신 및 NVP-HS990이다. 여타 저해제들은 두 아이소타입들 중 하나에 대하여 선호도를 나타내는데, 이를테면 Hsp90β에 특이적인 개멘다졸 및 H2-개멘다졸 이다.(Tash, et al., Biology of Reproduction 2008; 78, 1139-1152 참조). 뿐만 아니라, Hsp90β는 HSP90α보다 라디시콜에 더 민감하다. (Millson et al., FEBS J 2007; 274, 4453-4463 참조, 본원 명세서에서 참조로서 편입됨). 추가로, Hsp90β에 특이적인 신규한 저해제들은 공지된 Hsp90β 저해제들로부터 선택될 수 있거나 또는 공지된 특이적 저해제들, 이를테면 개멘다졸, 을 변형함으로써 또는 Hsp90β 및 Hsp90β-특이적 저해제, 예컨대, 개멘다졸의 공-결정학(co-crystalography)에 의하여 측정된 결합 도메인에 기초하여 저해제들을 디자인함으로써 통상의 기술자에 의하여 개발될 수 있다.
전술한 개멘다졸, Hsp90β-특이적 저해제, 은 로니다민의 유사체이다. 로니다민 유사체들은 당해 기술 분야에 알려져 있다. 로니다민 유사체들의 일부-비 제한적 예시들은 WO2006/023704 및 WO2011/005759에 설명되어 있으며 (양쪽 모두의 전체 내용은 본원 명세서에서 참조로서 편입됨) 이하의 화학식; 그리고 그의 약제학적으로 수용 가능한 염들 및 에스테르들에 의하여 대표된다:
Figure pct00011
여기서 R1은 카르복실,
Figure pct00012
, 또는 카르복실릭 애시드 하이드라자이드이며;
여기서 R2는 수소, 할로겐, 알코올, 알킬, 알콕시, 아랄킬, 사이클로알킬, 할로알킬, 할로알콕시, 아미노, 또는 카르복실이며;
여기서 X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하며 할로겐 또는 저급 알킬이며;
여기서 Z1, Z2, Z3, 그리고 Z4는 독립적으로 질소 또는 탄소임; 및 약제학적으로 수용가능한 이들의 염 또는 에스테르.
그러한 로니다민 유사체들의 예시들은 다음을 포함한다.
6-클로로-l-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카르복실릭 애시드 하이드라자이드;
1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오로-lH-인다졸-3-카르복실릭 애시드 메틸 에스테르;
6-플루오로-l-(2, 4-디클로로벤질)-1H -인다졸-3 -카르복실릭 애시드 하이드라자이드;
3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오로-lH- 인다졸-3-일]-아클릴릭 애시드;
3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-lH- 인다졸-3-일]-아클릴릭 애시드;
3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오로메톡시-lH-인다졸-3-일] 아클릴릭 애시드;
3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-lH- 인다졸-3-일]-프로피오닉 애시드;
3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-lH-인다졸-3-일] 아클릴릭 애시드 (TH 2-192);
1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-lH-인다졸-3-카르복실릭 애시드 (TH 2-178);
1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-lH-인다졸-3-카르복실릭 애시드 하이드라자이드 (TH 2-179);
3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-lH- 인다졸-3-일]-아클릴릭 애시드 (JWS 1-190);
1-(2-클로로-4-플루오로벤질)-6-클로로-lH-인다졸-3-카르복실릭 애시드 하이드라자이드 (JWS 2-22); 그리고
1-(2,4-디플루오로벤질)-6-클로로-lH-인다졸-3-카르복실릭 애시드 하이드라자이드 (JWS 1-282).
추가적인 로니다민 유사체들은 WO2006/015263 및 WO2006/015191에 그리고 또한 Mok et al., Reproduction, 2011, 141, 571-580에 더 설명되어 있다 (이의 각각은 본원 명세서에서 참조로서 편입된다). 그러한 로니다민 유사체들의 예시들은 로니다민(lonidamin), 아쥬딘(Adjudin) (AF-2364), AF2785, 그리고 CDB-4022를 포함한다.
쿠머마이신(coumermycin) 및 쿠머마이신 A1의 일부 유사체들이 WO2001/87309 및 WO2012/162054에 개시되어 있으며 (양쪽 모두는 본원 명세서에서 참조로서 편입된다), 여기서 쿠머마이신(cumermycin)유사체는 이하의 식에 의하여 대표된다:
Figure pct00013
여기서:
R1, R2, X1, X2, Y1, 및 Y2는 독립적으로 수소, 할로겐들, 하이드록실들, 알콕시들, 직쇄 지방족들, 분지된 지방족들, 사이클릭 지방족들, 헤테로사이클릭 지방족들, 치환된 지방족들, 비치환된 지방족들, 포화된 지방족들, 불포화된 지방족들, 방향족들, 폴리방향족들, 치환된 방향족들, 헤테로-방향족들, 아민들, 일차 아민들, 이차 아민들, 삼차 아민들, 지방족 아민들, 카르보닐들, 카르복실들, 아마이드들, 에스테르들, 아미노산들, 펩타이드들, 폴리펩타이드들, 당(sugar)들, 당 모방체들(mimics), 이의 유도체들, 또는 이의 조합들로부터 선택된 모이어티를 포함하며, 상기 지방족 그룹들은 약 0-20 탄소들의 탄소 사슬들 또는 헤테로 원자들 또는 O, N, S, 또는 P을 가짐; 그리고
링커(linker)는 직쇄 지방족, 분지된 지방족, 사이클릭 지방족, 헤테로사이클릭 지방족, 치환된 지방족, 비치환된 지방족, 포화된 지방족, 불포화된 지방족, 방향족, 폴리방향족, 치환된 방향족, 헤테로-방향족, 아민, 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민, 지방족 아민, 카르보닐, 카르복실, 아마이드, 에스테르, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 당(sugar)들, 당 모방체들(mimics), 이의 유도체들, 또는 이의 조합들을 포함함.
쿠머마이신 유사체들의 예시들은 이하의 식에 의하여 대표된다:
Figure pct00014
여기서 X는 상기 분자의 두 반쪽체들을 연결하는 약 1 내지 약 54 원자들을 함유하는 링커(linker)이다.
세라스트롤 및 겐듀닌(gendunin)의 일부 유사체들은 WO2007/117466에 개시되어 있다 (이는 본원 명세서에서 참조로서 편입됨). 일부 실시예들에서, HSP90의 소분자 저해제들은 Hsp90β를 저해한다. 일부 실시예들에서, HSP90의 소분자 저해제들은 Hsp90β를 특이적으로 저해한다.
VI. 대사 증후군의 진단 방법들
본 발명은, 대상으로부터의 샘플에서 마커 단백질 및/또는 핵산의 발현 수준을 탐지하는 것을 포함하는, 상기 대상을 대사 증후군 및/또는 당뇨병을 갖거나 또는 그러한 위험을 갖는 것으로 확인하는 방법들을 더 제공한다.
생물학적 샘플에서 마커 단백질 또는 핵산, 예컨대, HSP90, 특히 Hsp90β, 의 존재 또는 부재를 탐지하는 예시적 방법은 테스트 대상으로부터 생물학적 샘플 (예컨대 조직 샘플)을 얻는 단계 그리고 상기 생물학적 샘플을 폴리펩타이드 또는 핵산 (예컨대, mRNA, 게놈의 DNA, 또는 cDNA)을 탐지할 수 있는 화합물 또는 약제와 접촉시키는 단계와 관계된다. 본 발명의 탐지 방법들은 따라서 예를 들면, 대사 증후군의 진단을 위하여 생체 내는 물론 시험관 내의 생물학적 샘플에서 mRNA, 단백질, cDNA, 또는 게놈의 DNA를 탐지하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, mRNA의 시험관 내에서의 탐지 기술은 노던(northern) 혼성화들 및 현장(in situ) 혼성화들을 포함한다. 마커 단백질의 탐지를 위한 시험관 내 기술들은 효소 링크된 면역흡착 분석들 (ELISAs), 웨스턴 블롯들, 면역 침강들 및 면역형광(immunofluorescence)을 포함한다. 게놈 DNA의 탐지를 위한 시험관 내 기술들은 서던(Southern) 혼성화들을 포함한다. mRNA의 탐지를 위한 생체 내 기술들은 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR), 노던 혼성화들 및 현장 혼성화들을 포함한다. 더욱이, 마커 단백질의 탐지를 위한 생체 내 기술들은 대상 내로 단백질 또는 그의 단편에 대하여 지정된 표지된 항체를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체는 방사성 마커로 표지될 수 있는데, 이의 대상에서의 존재 및 위치가 표준 영상화 기술들에 의하여 탐지될 수 있다.
그러한 진단 및 예후 분석들의 일반적 원칙은 마커와 프로브가 상호작용하고 결합하는 것을 허용하는 충분한 시간 및 적합한 조건들 하에서 마커, 그리고 프로브를 함유할 수 있는 샘플 또는 반응 혼합물을 제조하는 것, 따라서 상기 반응 혼합물 내에서 제거 및/또는 탐지될 수 있는 복합체를 형성하는 것에 관련된다. 이들 분석들은 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
예를 들면, 그러한 분석을 수행하기 위한 하나의 방법은 고체 상 지지체, 또한 기질로서 지시됨, 상에 마커 또는 프로브를 고정시키는 단계(anchoring) 그리고 반응의 말기에 상기 고체 상 위에 고정된 표적 마커/프로브 복합체들을 탐지하는 단계에 관련될 것이다. 그러한 방법의 일 실시예에서, 마커의 존재 및/또는 농도에 대하여 분석될 대상으로부터의 샘플은 담체 또는 고체 상 지지체 위에 고정될 수 있다. 다른 실시예에서, 프로브가 고체 상에 고정될 수 있으며 대상으로부터의 샘플이 상기 분석의 고정되지 않은 성분으로서 반응하도록 허용되는, 반대의 상황이 가능하다.
분석 성분들을 고체 상에 고정하는 많은 방법들이 수립되어 있다. 이들은, 제한 없이, 바이오틴 및 스트렙타비딘의 컨쥬게이션(conjugation)을 통하여 고정되는 마커 또는 프로브 분자들을 포함한다. 그러한 바이오틴화(biotinylated) 분석 성분들은 바이오틴-NHS (N-하이드록시-숙신이미드)로부터 당해 기술 분야에 알려진 기술들을 이용하여 (예컨대, 바이오틴화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, IL) 제조될 수 있으며, 그리고 스트렙타비딘-코팅된 96 웰 플레이트들(Pierce Chemical)의 웰들에 고정될 수 있다. 일부 실시예들에서, 고정된 분석 성분들을 갖는 표면들이 먼저 제조되고 저장될 수 있다.
그러한 분석들을 위한 여타의 적절한 담체들 또는 고체 상 지지체들은 마커 또는 프로브가 속하는 분자의 종류들과 결합할 수 있는 여하한 물질을 포함한다. 잘-알려진 지지체들 또는 담체들은, 이하로 한정되는 것은 아니나, 유리, 폴리스티렌, 나일론, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에틸렌, 텍스트란, 아밀라아제들, 천연의 그리고 변형된 셀룰로오스들, 폴리아크릴아마이드들, 반려암들(gabbros), 그리고 마그네타이트(magnetite)를 포함한다.
전술한 접근 방식들로 분석들을 수행하기 위해서, 비-고정된 성분이 고체 상에 추가되고 그 위에 제 2 성분이 고정된다. 반응이 완결된 후, 복합체화되지 않은 성분들은 형성된 여하한 복합체들이 고체 상 위에 고정되어 남아있는 조건 하에서 제거될 수 있다. (예컨대, 세척에 의하여) 고체 상에 고정된 마커/프로브 복합체들의 탐지는 본원 명세서에서 약술한 다수의 방법들에서 수행될 수 있다.
바람직한 일 실시예에서, 프로브는, 그것이 고정되지 않은 분석 성분인 경우에, 직접 또는 간접적으로, 본원 명세서에서 논의된 그리고 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 탐지 가능한 표지들로 탐지 및 분석의 해독의 목적을 위하여 표지될 수 있다.
또한, 예를 들면 형광 에너지 전달의 기술을 이용함으로써, 어느 하나의 성분(마커 또는 프로브)을 더 조작 또는 표지하지 않고, 마커/프로브 복합체 형성을 직접 탐지하는 것이 가능하다. (예를 들면, Lakowicz et al., 미국 특허 제5,631,169호; Stavrianopoulos, et al., 미국 특허 제4,868,103호 참조). 제 1, '공여체' 분자 상의 형광발색단(fluorophore) 표지는 적합한 파장의 빛의 입사에 의한 여기(excitation)에 따라, 그의 방출되는 형광성 에너지가 제 2 '수용체' 분자 상의 형광성 표지에 의하여 흡수되고, 이것은 차례로 상기 흡수된 에너지에 의하여 형광을 나타낼수 있도록 선택된다. 대안적으로, '공여체(acceptor)' 단백질 분자는 단순히 트립토판 잔기들의 천연 형광성 에너지를 이용할 수 있다. 표지들은 상이한 빛의 파장들을 방출하도록 선택되어, '수용체' 분자 표지는 '공여체'의 그것으로부터 구별될 수 있다. 표지들 사이의 에너지 전달의 효율은 분자들을 이격하는 거리에 연관되므로, 분자들 사이의 공간적 상호관계들이 평가될 수 있다. 결합이 분자들 사이에서 일어나는 상황에서, 분석에서의 '수용체' 분자 표지의 형광 방출은 최대여야 한다. FRET 결합 이벤트는 당해 기술 분야에 잘 알려진 표준 형광분석 탐지 수단을 통하여 (예컨대, 형광분광광도계를 이용하여) 편리하게 측정될 수 있다.
다른 실시예에서, 프로브의 마커를 인식하는 능력을 측정은 어느 하나의 분석 성분 (프로브 또는 마커)를 표지화하지 않고 이를테면 실-시간 생물분자 상호작용 분석 (BIA) 기술을 이용하여 수행될 수 있다. (예컨대, Sjolander, S. 및 Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 그리고 Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 참조). 본원 명세서에서 사용되는, "BIA" 또는 "표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)"은 반응물들의 여하한 표지화 없이, 실시간 생물특이적 상호작용들을 연구하기 위한 기술이다. (예컨대, BIAcore) 결합 표면에서 질량의 변화 (결합 이벤트의 표지)는 표면 근처의 빛의 굴절률 변경들을 초래하여 (표면 플라즈몬 공명(SPR)의 광학적 현상), 생물학적 분자들 사이의 실-시간 반응들의 지표로서 사용될 수 있는 탐지 가능한 신호를 도출한다.
대안적으로, 다른 실시예에서, 유사한 진단 및 예후 분석들이 액체 상에서 용질들로서 마커 및 프로브로 수행될 수 있다. 그러한 분석에서, 복합체 형성된 마커 및 프로브는 다음으로 한정되는 것은 아니나: 분별 원심분리, 크로마토그래피, 전기영동 및 면역 침강를 포함하는 여하한 갯수의 표준 기술들에 의하여, 복합체 형성되지 않은 성분들로부터 분리된다. 분별 원심분리에서, 마커/프로브 복합체들은 복합체 형성되지 않은 분석 성분들로부터 그들의 상이한 크기들 및 밀도들에 기초한 복합체들의 상이한 침강 평형에 의하여, 일련의 원심분리 단계들을 통하여 분리될 수 있다. (예를 들면, Rivas, G., 및 Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7 참조) 표준 크로마토그래피 기술들 또한 복합체 형성된 분자들을 복합체 형성되지 않은 것들로부터 분리하기 위하여 이용될 수 있다. 예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피는 크기에 기초하여 분자들을 분리하며, 그리고 칼럼 포맷 내의 적절한 겔 여과 레진의 이용을 통하여, 예를 들면, 상대적으로 더 큰 복합체가 상대적으로 더 작은 복합체 형성되지 않은 성분들로부터 분리될 수 있다. 유사하게, 복합체 형성되지 않은 성분들에 비하여 마커/프로브 복합체의 상대적으로 상이한 하전 성질들은, 예를 들면 이온-교환 크로마토그래피 레진들의 이용을 통하여, 복합체를 복합체 형성되지 않은 성분들로부터 구별하는데 활용될 수 있다. 그러한 레진들 및 크로마토그래피 기술들은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. (예컨대, Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D.S., 그리고 Tweed, S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 oct 10;699(1-2):499-525 참조). 겔 전기영동 또한 복합체 형성된 분석 성분들을 결합되지 않은 성분들로부터 분리하는데 적용될 수 있다. (예컨대, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999 참조). 이 기술에서, 단백질 또는 핵산 복합체들은 예를 들면 크기 및 전하에 기초하여 분리된다. 전기 영동 과정 동안에 결합 상호작용을 유지하기 위하여, 비-변성 겔 매트릭스 물질들 및 환원제가 없는 조건들이 전형적으로 바람직하다. 특정의 분석 및 그의 성분들에 적합한 조건들은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있을 것이다.
특정 실시예에서, 마커 mRNA의 수준이 당해 기술 분야에 알려진 방법들을 이용하여 생물학적 샘플 내에서 현장(in situ) 및 시험관 내 포맷들 양쪽 모두에 의하여 측정될 수 있다. "생물학적 샘플"이라는 용어는 대상 내의 조직들, 세포들 및 유동체들은 물론 대상으로부터 분리된 조직들, 세포들, 생물학적 유동체들 및 그의 분리체들을 포함하는 것으로 의도된다. 많은 발현 탐지 방법들은 분리된 RNA를 사용한다. 시험관 내 방법들을 위하여, mRNA의 분리에 대하여 선택하지 않는 여하한 RNA 분리 기술 기술이 세포들로부터의 RNA의 정제를 위하여 이용될 수 있다. (예컨대, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999 참조). 추가적으로, 다수의 조직 샘플들이 당해 기술 분야의 통상의 기술자들에게 잘 알려진 기술들, 이를테면, 예를 들면, Chomczynski의 단일-단계 RNA 분리 공정 (1989, 미국 특허 제4,843,155호)을 이용하여 쉽게 가공될 수 있다.
분리된 mRNA는 이하로 한정되는 것은 아니나, 서던 또는 노던 분석들, 폴리머라아제 사슬 반응 분석들 및 프로브 어레이들, 을 포함하는 혼성화 또는 증폭 분석들에 사용될 수 있다. mRNA 수준들의 탐지를 위한 하나의 바람직한 진단 방법은 분리된 mRNA를 탐지되는 유전자에 의하여 인코딩되는 mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것과 관련된다. 핵산 프로브는, 예를 들면, 전체-길이 cDNA, 또는 그의 일 영역, 이를테면 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500 뉴클레오타이드들 길이이며 그리고 본원 발명의 마커를 인코딩하는 mRNA 또는 게놈의 DNA에 엄격한 조건들 하에서 특이적으로 혼성화 하는데 충분한 올리고뉴클레오타이드 일 수 있다. 본 발명의 진단 분석들에서 사용하기 위한 여타의 적절한 프로브들이 본원 명세서에 설명되어 있다. mRNA의 프로브와의 혼성화는 문제의 마커가 발현되고 있음을 지시한다.
한 포맷에서, mRNA는 고체 표면 상에 고정되며, 예를 들면 분리된 mRNA를 아가로스 겔 상에 주행시키고 mRNA를 겔로부터 멤브레인, 이를테면 니트로셀룰루오스, 로 전달함으로써 프로브와 접촉된다. 대안적인 포맷에서, 프로브(들)은 고체 표면에 고정되며 mRNA는 예를 들면, Affymetrix 유전자 칩 어레이에서, 프로브(들)과 접촉된다. 통상의 기술자는 본원 발명의 마커들에 의하여 인코딩되는 mRNA의 수준 탐지에 이용하기 위하여 공지된 mRNA 탐지 방법들을 쉽게 적용할 수 있다.
샘플에서 mRNA 마커의 수준을 측정하기 위한 대안적인 방법은, 예컨대, RT-PCR(Mullis, 1987, 미국 특허 제4,683,202호에 설명된 실험적 실시예), 리가아제 연쇄 반응 (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), 자기 부양(self sustained) 서열 복제 (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템 (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 레플리카아제 (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), 구름 원형(rolling circle) 복제 (Lizardi et al., 미국 특허 제5,854,033호) 또는 여하한 여타 핵산 증폭 방법, 당해 기술 분야의 통상의 기술자들에게 잘 알려진 기술들을 이용하는 증폭된 분자들의 탐지가 수반됨, 에 의한 핵산 증폭 공정에 관련된다. 이들 탐지 계획들은 핵산 분자들의 탐지에, 만약 그러한 분자들이 매우 낮은 개수로 존재하는 경우, 특히 유용하다. 본원 명세서에서 사용되는, 증폭 프라이머들은, 유전자의 5' 또는 3' 영역들(플러스 및 마이너스 가닥들, 각각, 또는 반대의 경우)에 어닐링 할 수 있으며 사이에 짧은 영역을 함유하는 핵산 분자들의 쌍으로서 정의된다. 일반적으로, 증폭 프라이머들은 약 10 내지 30 뉴클레오타이드들 길이이며 그리고 약 50 내지 200 뉴클레오타이드들 길이의 영역을 플링킹(flank)한다. 적절한 조건 하에서 그리고 적절한 시약들로, 그러한 프라이머들은 프라이머들에 의하여 플랭킹되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자의 증폭을 허용한다.
현장(in situ) 방법들을 위하여, mRNA는 탐지 전에 분리될 필요가 없다. 그러한 방법들에서, 세포 또는 조직 샘플은 공지된 조직학적 방법들을 이용하여 제조/가공된다. 샘플은 이후 지지체, 전형적으로 유리 슬라이드, 에 고정되고 이후 마커를 인코딩하는 mRNA에 혼성화될 수 있는 프로프와 접촉된다.
마커의 절대적 발현 수준에 기초한 측정들을 만들기 위한 대안으로서, 측정들은 마커의 정상화된(normalized) 발현 수준에 기초할 수 있다. 발현 수준들은 마커의 발현 수준을, 마커가 아닌 유전자, 예컨대, 구성요소로서 발현되는 하우스키핑(housekeeping), 의 발현에 그것의 발현을 비교함으로써, 보정함으로써 정상화된다. 정상화에 적절한 유전자들은 하우스키핑 유전자들 이를테면 액틴 유전자, 또는 상피 세포-특이적 유전자들을 포함한다. 이 정상화는 하나의 샘플, 예컨대, 환자 샘플, 내의 발현 수준의 다른 샘플, 예컨대, 상이한 공급원들로부터의 비-질환 샘플들과의 비교를 허용한다.
대안적으로, 발현 수준은 상대 발현 수준으로서 제공될 수 있다. 마커의 상대 발현 수준을 측정하기 위하여, 마커의 발현 수준은, 문제가 되는 샘플들에 대한 발현 수준의 측정 전에, 정상 대(versus) 질환 세포 분리물들의 10 또는 그 이상 샘플들, 바람직하게는 50 또는 그 이상 샘플들, 에 대하여 측정된다. 다수의 샘플들에서 분석된 유전자들의 각각의 평균 발현 수준이 측정되며 그리고 이것은 마커에 대한 기저(baseline) 발현 수준으로서 사용된다. 테스트 샘플에 대하여 측정된 마커의 발현 수준 (절대 발현 수준)은 이후 그 마커에 대하여 얻어진 평균 발현 값으로 나누어 진다. 이것은 상대 발현 수준을 제공한다.
바람직하게는, 기저 측정에 사용된 샘플들은 비-질환 세포들로부터일 것이다. 세포 공급원의 선택은 상대 발현 수준의 용도에 따른다. 정상 조직들에서 발견되는 발현을 평균 발현 스코어로서 사용하는 것은 분석된 마커가 질환 특이적 (정상 세포들에 대하여)인지 아닌지를 인증하는 것을 돕는다. 뿐만 아니라, 보다 많은 데이터가 축적될수록, 평균 발현 값은 수정될 수 있으며, 축적된 데이터에 기초한 개선된 상대 발현 값들을 제공한다. 질환 세포들로부터의 발현 데이터는 질환 상태의 중증도를 등급화 하기 위한 수단을 제공한다.
본원 발명의 다른 실시예에서, 마커 단백질, HSP90, 바람직하게는 Hsp90β, 가 탐지된다. 본 발명의 마커 단백질의 탐지에 바람직한 약제는 그러한 단백질 또는 그의 단편에 결합 능력이 있는 항체, 바람직하게는 탐지 가능한 표지를 갖는 항체이다. 항체들은 폴리클로날, 또는 그 이상 바람직하게는, 모노클로날일 수 있다. 손상되지 않은 온전한(intact) 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체 (예컨대, Fab 또는 F(ab')2)가 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련하여 "표지된"이라는 용어는, 직접 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적 표지화는 물론 탐지 가능한 성분을 프로브 또는 항체에 커플링시킴(즉, 물리적으로 링킹(linking))에 의한 프로브 또는 항체의 직접적 표지화를 포괄하는 것으로 의도된다. 간접적 표지화의 예시들은 형광적으로 표지된 이차 항체를 이용한 일차 항체의 탐지 그리고 DNA 프로브를 그것이 형광적으로 표지된 스트렙타비딘과 탐지될 수 있도록 바이오틴으로 말단-표지화하는 것을 포함한다.
세포들로부터 단백질들은 당해 기술 분야에서 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술들을 이용하여 분리될 수 있다. 적용되는 단백질 분리 방법들은, 예를 들면, 이를테면 Harlow 및 Lane에 기재된 것 (Harlow 및 Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)일 수 있다.
다양한 포맷들이 샘플이 주어진 항체에 결합하는 단백질을 함유하는지 아닌지를 측정하는데 적용될 수 있다. 그러한 포맷들의 예시들은, 이하로 한정되는 것은 아니나, 효소 면역 분석 (EIA), 방사능면역분석 (RIA), 웨스턴 블롯 분석 및 효소 링크된 면역흡착 분석 (ELISA)을 포함한다. 통상의 기술자는 쉽게 알려진 단백질/항체 탐지 방법들을 세포들이 본원 발명의 마커를 발현하는지 아닌지를 측정하는데 사용하기 위하여 적용할 수 있다.
하나의 포맷에서, 항체들, 또는 항체 단편들 또는 유도체들, 은 발현된 단백질들을 탐지하기 위하여, 이를테면 웨스턴 블롯들 또는 면역형광 기술들과 같은 방법들에 사용될 수 있다. 그러한 용도들에서, 일반적으로 항체 또는 단백질들 중 하나를 고체 지지체 상에 고정하는 것이 바람직하다. 적절한 고체 상 지지체들 또는 담체들은 항원 또는 항체와 결합 능력이 있는 여하한 지지체를 포함한다. 잘-알려진 지지체들 또는 담체들은 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 텍스트란, 나일론, 아밀라아제들, 천연의 그리고 변형된 셀룰로오스들, 폴리아크릴아마이드들, 반려암들, 그리고 마그네타이트를 포함한다.
당해 기술 분야에서 통상의 기술자는 항체 또는 항원의 결합에 적절한 많은 여타의 담체들을 알 것이며 그러한 지지체를 본원 발명의 용도에 적용할 수 있을 것이다. 예를 들면, 질환 세포들로부터 분리된 단백질은 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 주행될 수 있으며 고체 상 지지체 이를테면 니트로셀룰루오스 상에 고정될 수 있다. 상기 지지체는 이후 적절한 버퍼들로 세척되고 탐지 가능하게 표지된 항체로의 처치가 수반될 수 있다. 상기 고체 상 지지체는 이후 버퍼로 2회 결합되지 않은 탐지 가능하게 표지된 항체를 제거하기 위하여 세척될 수 있다. 고체 지지체 상에 결합된 표지된 항체의 용량은 이후 전통적인 수단에 의하여 탐지될 수 있다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플에서 마커 단백질 또는 핵산의 존재를 탐지하기 위한 키트들을 포괄한다. 그러한 키트들은 만약 대상이 특정 질환들, 예컨대, 당뇨병 및/또는 대사 증후군으로 고통받는지 또는 이의 증가된 발생 위험이 있는지를 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 마커 단백질 또는 핵산을 탐지하는 능력을 갖는 표지된 화합물 또는 약제 그리고 샘플에서 단백질 또는 mRNA의 용량을 측정하기 위한 수단 (예컨대, 단백질 또는 그의 단편에 결합하는 항체, 또는 상기 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 mRNA에 결합하는 올리고뉴클레오타이드 프로브)을 포함할 수 있다. 키트들은 또한 상기 기트를 사용하여 얻어지는 결과들을 설명하는 설명서들을 포함한다.
항체-기초 키트들에 있어서, 상기 키트는, 예를 들면: (1) 마커 단백질에 결합하는 제 1 항체 (예컨대, 고체 지지체에 부착된); 그리고, 임의선택적으로, (2) 단백질 또는 제 1 항체 중 어느 하나에 결합하며 그리고 탐지 가능한 표지에 컨쥬게이션된 제 2, 상이한 항체를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드-기초 키트들에 있어서, 상기 키트는, 예를 들면: (1) 마커 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 혼성화하는, 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, 탐지 가능하게 표지된 올리고뉴클레오타이드 또는 (2) 마커 핵산 분자를 증폭하는데 유용한 프라이머들의 한 쌍을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한, 예컨대, 완충제, 방부제, 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 상기 키트는 탐지 가능한 표지를 탐지하는데 필요산 성분들을 (예컨대, 효소 또는 기질) 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 분석될 수 있으며 테스트 샘플에 비교될 수 있는 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플들을 함유할 수 있다. 상기 키트의 각각의 성분이 개별 용기에 동봉될 수 있으며 다양한 용기들 모두가 상기 키트를 이용하여 수행되는 분석들의 결과를 설명하기 위한 설명서와 함께 단일 포장 내에 있을 수 있다.
본원 명세서에서 제공된 방법들에서, HSP90, 특히 Hsp90β의 조절된 수준이 이를테면 본원 명세서에서 제공된 것들과 같은 대사 증후군의 하나 또는 그 이상 지표들과 결합하여 진단 지표로서 사용될 수 있다.
반복된 진단 분석들이 상기 대상의 질환 상태를 모니터하는데 사용될 수 있다.
VII. 대사 증후군의 처치
본원 명세서에서 입증된 바와 같이, HSP90 발현 또는 활성, 특히 Hsp90β 발현 또는 활성, 의 저해는 포도당 섭취, 인슐린 신호, 그리고 지질 대사를 개선한다. 본 발명은 HSP90의 저해제, 바람직하게는 Hsp90β 저해제, 보다 바람직하게는 Hsp90β 저해제, 이를테면 본원 명세서에서 제공된 것들, 을 대사 증후군의 하나 이상의 징후 또는 증상을 호전시키기 위하여 투여하는 것을 포함하는 대사 증후군으로 고통받는 대상들의 처치 방법들을 제공한다. 일부 실시예들에서, HSP90의 저해제, 바람직하게는 Hsp90β-특이적 저해제, 가 대상에 투여될 수 있는데, 여기서 대사 증후군의 처치를 위한 하나 이상의 추가적 약제가 상기 대상에 투여된다. 본원 명세서에서 사용되는 바와 같이, 상기 약제들은 순차적으로, 어느 한 순서로, 또는 동시에 투여될 수 있다. 다중 약제의 대상에의 투여는 약제들의 공동-제제화 또는 동일한 투여 요법을 요구하지 않는다.
Hsp90β 저해제들을 사용하는 대사 증후군의 처치 방법은 대사 증후군의 처치를 위한 공지된 방법들 및 약제들과 조합될 수 있다. 많은 약제들 및 요법들이 현재 대사 증후군 및 당뇨병에 이용 가능하다. 처치를 위하여 선택되는 특정 약제는 상기 대상, 특이적 증상들 및 질환 상태의 증등도에 의존한다. 예를 들면, 일부 실시예들에서, Hsp90β 저해제들은 식이 및/또는 행동 변형, 예컨대, 칼로리 제한과 결합하여, 단독으로 또는 비만치료 수술과 조합하여, 및/또는 증가된 신체 활동과 함께 투여될 수 있다. 일부 실시예들에서, Hsp90β 저해제들은 타입 2 당뇨병의 치료를 위한 약제들, 예컨대, 메트포민 (글루코파지, 글루메차, 여타의 것들), 글리타존들, 예컨대, 피오글리타존 (액토스), 글리피자이드 (글루코트롤), 글리부라이드 (디아베타, 글리나제), 글리메피리드 (아마릴), 아카르보스 (프리코스), 메트포민 (글루코파지), 시타글립틴 (자누비아), 삭사글립틴 (온글리자), 레파클리니드 (프란딘), 나테글리니드 (스타릭스), 엑세나티드 (바이에타), 리라글루타이드 (빅토자), 또는 인슐린과 함께 투여될 수 있다.
VIII. 대사 증후군의 동물 모델들
대사 증후군들 이를테면 타입 1 및 타입 2 당뇨병, 인슐린 저항성, 고지질혈증의 수많은 유전적 그리고 유도된 동물 모델들은 당해 기술 분야에서 잘 특징지워져 있다. 그러한 동물들은 HSP90 저해제들, 예컨대, Hsp90β 저해제들의 당뇨병의 치료에서의 효과를 입증하는데 사용될 수 있다. 타입 1 당뇨병의 모델들은, 이하로 한정되는 것은 아니나, NOD 마우스들 그리고 스트렙토조토신-유도된 당뇨병 랫트들 및 마우스들 (타입 1 당뇨병 모델들)을 포함한다. 타입 2 당뇨병의 유전적 그리고 유도된 모델들은, 이하로 한정되는 것은 아니나, 렙틴 결함 ob/ob 마우스, 렙틴 수용기 결함 db/db 마우스, 그리고 고 지방 사료 마우스 또는 랫트 모델들을 포함한다. 각각의 모델들에서, 특이적 질환 특성들의 발생의 타임라인은 잘 알려져 있다. HSP90 저해제들은 이들 동물 모델들에서 당뇨병의 예방 또는 처치에, HSP90 저해제들, 특히 Hsp90β 저해제들의 효능을 입증하기 위하여 당뇨병의 증상들의 출현 전 또는 후에 투여될 수 있다.
선택된 특이적 동물 모델 및 개입 시간, 예컨대, 대사 증후군의 출현 전 또는 후, 에 따라, 동물 모델들이 대사 증후군의 예방, 처치, 진단, 그리고 모니터링을 위하여 본원 명세서에서 제공된 방법들의 효능을 입증하기 위하여 사용될 수 있다.
IX. 키트들
본 발명은 또한 질환 상태, 예컨대 대사 증후군의 진단을 위한 조성물들 그리고 키트들을 제공한다. 이들 키트들은 다음의 하나 또는 그 이상을 포함한다: Hsp90β에 특이적으로 결합하는 탐지 가능한 항체 및 Hsp90β 항체에 특이적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 항체, 염색을 위한 대상 조직 샘플들을 얻기 위한 및/또는 제조하기 위한 시약들, 그리고 사용을 위한 설명서.
본 발명의 키트들은 임의 선택적으로 본 발명의 방법들을 수행하는데 유용한 추가적 성분들을 포함할 수 있다. 예시의 방법으로서, 상기 키트들은 상보적인 핵산들의 어닐링을 위하여 또는 항체와 그것과 특이적으로 결합하는 단백질과의 결합을 위하여 적절한 유동체들 (예컨대, SSC 버퍼, TBST), 하나 또는 그 이상 샘플 구획들, 본 발명의 방법의 수행을 설명하는 교육 자료 그리고 조직 특이적 대조군들/표준들을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 대사 장애의 처치를 위한 키트들을 제공한다. 상기 키트들은 하나 이상의 HPS90 저해제, 바람직하게는 Hsp90β-특이적 저해제, 그리고 하나 또는 그 이상의 사용을 위한 설명서들 그리고 적절한 투여를 위한 장치를 포함한다.
실시예들
실시예 1 - 당뇨병의 병인학에 있어서 활성의 중요한 노드로서 HSPAB1 (Hsp90β)를 확인하기 위한 플랫폼 기술의 적용
이 실시예에서는, 국제 특허 출원 제PCT/US2012/027615호에 상세히 설명된 플랫폼 기술이 주문 제작된 당뇨병 모델로부터 얻은 데이터를 통합하고, 당뇨병의 발병학을 구동하는 신규한 단백질들/경로들을 확인하기 위하여 적용되었다. 이 분석 방법으로부터 얻은 관계도들이 HSPAB1 (Hsp90β)을 당뇨병 병인학에 있어서 활성의 중요한 노드로서 확인하였다. 그러므로, HSPAB1 (Hsp90β)은 당뇨병과 연관된 진단/예후 마커임은 물론 중요한 당뇨병 처치 표적이다.
다섯 가지의 일차 인간 세포 라인들, 즉 함지방 세포들, 근관세포들, 간 세포들, 대동맥 민무늬 근육 세포들 (HASMC), 그리고 근위 세뇨관 세포들 (HK2)이 생체 내에서 이들 질환-관련 세포들에 의하여 경험되는 환경을 시뮬레이션하는 다섯 조건들 중 하나의 대상이었다. 특히, 각각의 다섯 세포 라인들은 개별적으로 각각의 다음의 조건들에 노출되었다: 고혈당 조건들, 고지질혈증 조건들, 고인슐린혈증 조건들, 저산소증 조건들 및 락틱 애시드에의 노출. 고혈당 조건은 세포들을 22mM 글루코오스 함유 배지들에서 배양함으로써 유도되었다. 고지질혈증 조건은 세포들을 0.15mM 소듐 팔미테이트 함유 배지들에서 배양함으로써 유도되었다. 고인슐린혈증 조건은 세포들을 1000nM 인슐린 함유 배지들에서 배양함으로써 유도되었다. 저산소증 조건은 세포들을, 5% CO2, 2% O2 그리고 93% 질소를 함유하는 산업 가스 믹스로 잠긴 모듈식의 인큐베이션 또는 챔버 (MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)에 배치함으로써 유도되었다. 각각의 세포 라인은 또한 0 또는 12.5mM 락틱 애시드로 처리되었다.
뿐만 아니라, 두 상이한 쌍들의 세포들, 인간 대동맥 민무늬 근육 세포들 (HASMC) (세포 시스템 1) 및 인간 신장 2 (HK2) 세포들 (세포 시스템 2); 또는 간 세포들 (세포 시스템 1) 및 함지방 세포들 (세포 시스템 2), 사이의 연결망(cross talk) 실험들이 수행되었으며 여기서 쌍을 이룬 세포들이 공동-배양되었다. 이 공동-배양 접근 방법은 세포외 세크레톰 (extracellular secretome: ECS) 실험으로서 지시된다. 제 1 세포 시스템 (예컨대, HASMC)이 트랜스웰 타입 성장 챔버의 웰들의 인서트들에 먼저 씨딩되었다(seeded). 여섯 웰 플레이트들이 더 나은 통계적 분석을 가능하게 하기 위하여 사용되었다. 인서트들에 제 1 세포 시스템으로 씨딩하는 시점에, 상기 인서트들은 개별적 6-웰 플레이트에 배치되었다. 제 2 세포 시스템 (예컨대, HK2)은 일차 트레이 상에 씨딩되었다. 제 1 세포 시스템을 함유하는 인서트 트레이 및 제 2 세포 시스템을 함유하는 일차 트레이가 37℃에서 하룻밤동안 인큐베이션 되었다. 각각의 세포 시스템들은 특이적 세포 특이적 배지들에서 성장되었다 (여기서 대안적으로, 각각의 세포 시스템들은 양쪽 모두의 세포 타입들의 성장을 지지하기 위하여 적응된 배지 내에서 성장될 수 있다.) 제 2일에, 예정된 처치가 배지들 교환에 의하여 제공되었다. 특히, 제 1 세포 시스템을 함유하는 인서트들이 제 2 세포 시스템을 함유하는 일차 트레이 내에 배치되었다. 상기 트레이는 이후 예정된 시간, 예컨대, 24시간 또는 48 시간 동안 인큐베이션 되었다. 중복(Duplicate) 웰들이 동일한 조건들로 설정되었으며, 그리고 세포들이 2D 분석을 위하여 충분한 물질을 산출하기 위하여 모아졌다. 배지들 (1 ml 분액), 인서트들로부터의 세포들 그리고 일차 트레이의 웰들로부터의 세포들이 개별적 샘플들로서 수확되었다. 실험은 더 나은 통계적 분석 능력을 제공하기 위하여 삼중으로 수행되었다.
연결망 실험들 (Cross-talk experiments) 또한 "배지들 스왑(swap)" 실험들에 의하여 수행되었다. 특히, 제 1 세포 시스템으로부터의 배양된 배지들 또는 "세크레톰", HASMC가 동요(perturbation) 또는 컨디셔닝(conditioning) 24시간 또는 48시간 후 수집되었으며 그리고 이후 제 2 세포 시스템, 지방세포들, 에 24-48시간동안 첨가되었다. 제 2 세포 시스템으로부터의 최종 배양된 배지들 또는 "세크레톰"이 이후 수집되었다. 모든 최종 세크레톰들이 프로테옴 분석에 도입되었다.
전술한 세포들을 포함하는 세포 모델, 여기서 상기 세포들은 전술한 각각의 조건에 노출됨, 이 코엔자임 Q10으로 처치함으로써 추가적으로 세포들을 "환경적 동요(environmental perturbation)"에 노출시킴으로써 "심문(interrogated)" 되었다. 특히, 상기 세포들은 코엔자임 Q10의 0, 50μM, 또는 100μM로 처리되었다.
각각의 세포 라인, 조건 및 코엔자임 Q10 처치에 대한 세포 샘플들이, 처치의 24 시간 및 48 시간 후를 포함하는 다양한 시점들에 수집되었다. 특정 세포들 및 특정 조건들에 하에 대한, 배지들 샘플들이 또한 수집되고 분석되었다.
정량적 단백체학(proteomics)에 의한 총 세포 단백질 발현의 변화의 아이프로파일링(iProfiling)이 전술한 상세한 설명에서 설명된 기술들을 이용하여 각각의 "환경적 동요", 즉 코엔자임 Q10 처치, 와 각각의 조건에서 각각의 세포 라인에 대하여 수집된 세포 및 배지들 샘플들에 대하여 수행되었다
각각의 조건에서 그리고 각각의 동요가 있는 열거된 각각의 세포 라인에 대하여 수집된 단백체학 데이터, 그리고 각각의 조건에서 그리고 각각의 동요가 있는 각각의 세포 라인에 대하여 수집된 생물에너지학 프로파일링(bioenergetics profiling) 데이터가 이후 REFSTM 시스템에 의하여 가공되었다. 복합 동요 네트워크(composite perturbed network)가 동요 (CoQ10)에 노출된 하나의 특이적 조건 (예컨대, 고혈당증)에 대한 모든 세포 라인들로부터 얻은 조합된 데이타로부터 생성되었다. 복합 비동요 네트워크(composite unperturbed network)가 동요 없는(CoQ10 없는), 동일한 하나의 특이적 조건 (예컨대, 고혈당증)에 대한 모든 세포 라인들로부터 얻은 조합된 데이터로부터 생성되었다. 유사하게, 복합 동요 네트워크가 동요 (CoQ10)에 노출된 제 2, 대조 조건 (예컨대, 정상 혈당증)에 대한 모든 세포 라인들로부터 얻은 조합된 데이터로부터 생성되었다. 복합 비동요 네트워크가 동요 없는 (CoQ10 없는) 동일한 제 2, 대조 조건 (예컨대, 정상 혈당증)에 대한 모든 세포 라인들로부터 얻은 조합된 데이터로부터 생성되었다.
전술한 합의(consensus) 복합 네트워크들에서 각각의 노드가 전술한 발명의 상세한 설명에 상세히 기재된 바와 같이, REFSTM를 이용하여 시뮬레이션 네트워크들을 생성하기 위하여 시뮬레이션 되었다. (10-배 증가시킴으로써 또는 감소시킴으로써)
시뮬레이션 네트워크들에서 부모 노드(parent node)를 자식 노드(child node)에 연결하는 각각의 에지(edge)에 대한 곡선하 면적 및 배수 변화들(fold changes)이 R 프로그래밍 언어를 사용하는 맞춤(custom-built) 프로그램에 의하여 추출되었으며, 여기서 상기 R 프로그래밍 언어는 통계적 컴퓨팅 및 그래픽들을 위한 오픈 소스 소프트웨어 환경이다.
델타 네트워크들이 시뮬레이션 된 복합 네트워크들로부터 생성되었다. 코엔자임 Q10에 대한 반응에서 당뇨병 질환 상태 대(vs.) 정상 상태 미분(differential) 네트워크를 생성하기 위하여 (델타-델타 네트워크), 비교의 단계들이 도 1에 도시된 바와 같이, PERL 프로그래밍 언어를 사용하는 맞춤 프로그램에 의하여 수행되었다.
특히, 도 1에 나타난 바와 같이, 처치 T1은 코엔자임 Q10 처치를 지시하며 그리고 NG 및 HG는 정상 및 고혈당증을 조건들로서 지시한다. NG∩HG 델타 네트워크에서 NG로부터의 고유한 에지들이 HG∩HGT1 델타 네트워크에서 HGT1의 고유한 에지들과 비교되었다. NG와 HGT1의 교차점에서의 에지들은 T1으로 NG으로 복구된 HG 에지들이다. T1으로 NG로 복구된 HG 에지들은 NG∩HG 델타 네트워크 상에 포개어(superimposed)졌다. (도 2에서 진한 색으로 표시된 원으로 나타남).
특히, 정상 혈당증 (NG) 조건의 시뮬레이션 된 복합 맵 그리고 고혈당증 (HG) 조건의 시뮬레이션 된 복합 맵이 정상 혈당증 조건의 고유한 에지들을 생성하기 위하여 맞춤(custom-made) PERL 프로그램을 사용하여 비교되었다. 코엔자임 Q10 처치가 없는 고혈당증 조건의 시뮬레이션 된 복합 맵(HG) 그리고 코엔자임 Q10 처치를 갖는 고혈당증 조건의 시뮬레이션 된 맵 (HGT1)이 코엔자임 Q10 처치를 갖는 고혈당증 조건(HGT1)의 고유한 에지들을 생성하기 위하여 맞춤 PERL 프로그램을 사용하여 비교되었다. 정상 혈당증 조건 (NG)으로부터의 고유한 에지들과 코엔자임 Q10 처치를 갖는 고혈당증 조건 (HGT1)으로부터의 고유한 에지들의 교차점에 있는 에지들이 PERL 프로그램을 이용하여 확인되었다. 이들 에지들은 코엔자임 Q10의 처치에 의하여 고혈당증 조건으로부터 정상 혈당증 조건으로 복구된 인자들(factors)/네트워크들을 나타낸다. 코엔자임 Q10 처치로 정상으로 복구된 고혈당증 에지들의 델타-델타 네트워크가 정상 혈당증 ∩ 고혈당증 델타 네트워크 상에 포개어 졌다.
PERL 및 R 프로그램들의 출력물이 코엔자임 Q10 처치 델타-델타 네트워크로 정상 조건으로 복구된 고혈당증 에지들과 정상 혈당증 대(vs.) 고혈당증 델타 네트워크들 사이의 겹쳐진(superimposed) 네트워크의 가시적 표시를 생성하기 위하여 Cytoscape, 오픈 소스 프로그램, 에 입력되었다. 겹쳐진 네트워크를 나타내는 Cytpscape 프로그램의 출력물이 도 2에 도시된다. 도 2에서 진한 색의 원들이 확인된 코엔자임 Q10의 처치에 의하여 고혈당증 조건으로부터 정상 혈당증 조건으로 복구된 에지들이다. 도 2에서 밝은 색의 원들이 확인된 고유한 정상 혈당(hypercemia) 에지들이다. 도 2에 나타난 박스 내의 서브-네트워크가 확대되어 도 3에 도시되어 있다. HSP90AB1 (Hsp90β)는 코엔자임 Q10의 처치에 의하여 고혈당증 조건으로부터 정상 혈당증 조건으로 복구된 에지들인 확인된 마커들의 하나이다. (도 3 참조).
도 3은 HSP90AB1 (Hsp90β)의 연관 맵 및 Interrogative Biology® 당뇨병 출력물들로부터의 관심 대상의 인과(causa) 노드들을 나타낸다. 도 4는 질환 및 정상 세포 모델들에서 단백질들의 인관 연관들을 묘사하기 위하여 미분 네트워크 맵들에서 사용되는 심볼들 및 색상 코드들의 목록을 나타낸다. HSP90AB1 (Hsp90β)가 이 포개어진 델타-델타 네트워크에서 당뇨병에 대한 잠재적 치료 인자, 약물 표적 그리고 생물마커로서 확인되었다.
실시예 2 - 세포 기질 대사 및 인슐린 신호의 Hsp90β 조절
A. 물질들 및 방법들:
1. 인간 근원세포들(myoblasts)의 근관세포들(myotubes)로의 분화:
인간 골격근 근원세포들 (HSMM)이 Promocell사(社)로부터 얻어졌으며 판매자가 추천한 성장 배지들에서 배양되었다. 합류(Confluent) 배양들이 분화 배지들 (DMEM, 2% 말 혈청, 파이루베이트 및 HEPES)로 교체되었으며 세포들은 7 내지 10일 동안 분화되도록 두었다.
2. Hsp90β의 siRNA /HSP90의 저해:
IDT®로부터의 상업적으로 이용 가능한 trifecta siRNA가 Hsp90β의 특이적 넉다운에 사용되었다. 대조군으로서 스크램블 siRNA가 모든 실험들에 포함되었다. IDT®에 의하여 공급되는 모든 세 siRNA가 Mirus® TKO® 유전자 도입시약을 사용하여 개별적으로 유전자 도입(transfected) 되었다. Hsp90 β 넉다운은 인간 Hsp90β 단백질 및 mRNA에 특이적인 프라이머 프로브들 및 상업적으로 이용 가능한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅 및 qPCR에 의하여 확인되었다. HSP90 저해제 CCT018159가 Tocris Bioscience로부터 입수되었다.
3. siHsp90β 서열 정보:
H1:
듀플렉스 서열들
5'-rArGrG rCrCrG rArCrA rArGrA rArUrG rArUrA rArGrG rCrAG T-3' (서열 번호: 1)
5'-rArCrU rGrCrC rUrUrA rUrCrA rUrUrC rUrUrG rUrCrG rGrCrC rUrCrA-3' (서열 번호: 2)
H2:
듀플렉스 서열들
5'-rCrArA rCrGrA rUrGrA rUrGrA rArCrA rGrUrA rUrGrC rUrUG G-3' (서열 번호: 3)
5'-rCrCrA rArGrC rArUrA rCrUrG rUrUrC rArUrC rArUrC rGrUrU rGrUrG-3' (서열 번호: 4)
H3:
듀플렉스 서열들
5'-rCrGrU rUrGrC rUrCrA rCrUrA rUrUrA rCrGrU rArUrA rArUC C-3' (서열 번호: 5)
5'-rGrGrA rUrUrA rUrArC rGrUrA rArUrA rGrUrG rArGrC rArArC rGrUrA-3' (서열 번호: 6)
4. 인슐린 신호전달 실험들:
전 주에 12 웰 플레이트들에 플리이팅된 인간 HSMM 근관세포들 세포들이 사용되었다. 배지들은 아스피레이션으로 빨아내졌으며 Hsp90 넉다운을 위한 NC 및 H3 siRNA의 적합한 희석을 갖는 신선한 배지들이 첨가되어 플레이트의 웰들 내의 최종 농도는 100nM으로 하였다. Mirus TKO 유전자 도입 시약이 세포들에 유전자 도입을 위하여 사용되었다. 상기 플레이트는 이후 37℃에서 하룻밤. 인큐베이션 되었다.
배지들은 아스피레이션으로 빨아내졌으며 세포들은 2번 - 제 1회는 따듯한 PBS로 그리고 제 2회는 0.1% BSA 함유 성장 배지들로- 세척되었다. 상기 세포들은 이후 37℃에서 적합한 저해제들을 함유하는 0.1% 분화 배지들에서 2-3 시간 동안 혈청에 굶주리도록(starved) 되었으며 5분 동안의 인슐린 자극이 수반되었다. (0, 10, 및 100nM 인슐린).
상기 웰들은 이후 PBS로 한번 세척되었으며 100 μl의 프로테아제 및 포스파타아제 저해제들을 함유하는 RIPA 버퍼 내로 수확되었다. 상기 플레이트는 얼음 상에 배치되었으며 그리고, 세포 스크레퍼(scraper)를 사용하여, 상기 세포들은 플레이트로부터 긁어내었다. 용해물들이 1.5 ml 에펜도르프 튜브들에 수집되었으며 주사기와 바늘을 사용함으로써 균질화(homogenized) 되었다. 상기 용해물들은 이후 4℃에서 10분 동안 14,000 RPM에서 원심분리되었다. 상기 용해물들은 나중에 사용하기 위하여 -20℃에 저장될 수 있다.
단백질 함량이 BCA 분석으로 측정되었으며 샘플들은 상세한 설명의 다음 부분에서 설명되는 바와 같이 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅을 위하여 준비되었다. 10μg의 총 단백질을 로딩하기 위하여 요구되는 총 부피가 계산되었다.
상기 샘플들은 비스-트리스 또는 트리스-글라이신-SDS 겔 상에 로딩되었다. 단백질들은 PVDF 또는 니트로셀룰루오스 멤브레인으로 일상적인 ?(wet) 또는 드라이(dry) 이동 방법들을 이용하여 이동되었다. 상기 멤브레인들은 이후 적어도 한 시간 동안 차단(blocking) 버퍼를 이용하여 차단되었다. 상기 멤브레인들은 이후 인큐베이션을 위하여 차단 버퍼 내에 희석된 적합한 일차 항체들에 노출시키기 전에 절단되었다. pAKT (p-Akt, S473), pERK(p-Erk, 포스포-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204), 그리고 pGSK3β (포스포-GSK-3β (Ser9)에 대한 일차 항체들이 Cell Signaling Inc.®으로부터 입수되었다. 여타 항체들 또한 상업적 공급원들로부터 입수되었다. 상기 멤브레인은 교반기 내에 배치되었으며 냉장고에서 (4℃) 하룻밤 인큐베이션 되었다.
단백질들의 가시화 및 웨스턴 블롯들의 정량화가 다음과 같이 수행되었다. 상기 멤브레인들은 1X PBS-T (각각 10분)을 사용하여 세번 세척되었다. 적합한 HRP 컨쥬게이션된 이차 항체들이 차단 버퍼 내에 희석되었으며(1:10,000) 그리고 각각의 멤브레인들에 첨가되었다. 멤브레인들은 적어도 한 시간동안 교반기에서 실온에서 인큐베이션되었다. 상기 멤브레인들은 세번 (각각 10분) PBS-T로 세척되었다. 최종 세척 후 상기 멤브레인들은 단백질들을 탐지할 때까지 PBS-T 내에 유지되었다.
멤브레인의 각 조각을 취하여 깨끗한 평평한 표면 위에 배열하였다. 화학발광성 기질 (Pierce® PICO 또는 DURA)이 각각의 멤브레인들에 첨가되었으며 5분 동안 인큐베이션되었다. 상기 멤브레인들은 이후 BIORAD® 화학 발광 영상화기를 사용하는 가시화를 위하여 플라스틱의 깨끗한 시트에 배치되었다. 밴드들이 BIORAD® 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다.
5. 인슐린 자극된 포도당 섭취:
HSMM 근원세포들 (20,000 세포들/웰)이 실험 전에 7일 동안96 웰 플레이트들에서 2% 말(horse) 혈청으로 분화되었다. 세포들은 200 μl의 0.1% BSA를 함유하는 MBSS 버퍼로 2회 세척되었으며, 이후100 μl의 MBSS 0.1% BSA로 4 시간 동안 혈청 굶주림(starved) 되었다. 일부 웰들은 또한 25μM LY 화합물로 20분 동안 선처리 되었다. 인슐린 자극의 개시에 따라, 100 μl의 MBSS 0.1%BSA 버퍼 내의 2x 시약들이 실험을 위하여 1x 농도로 만들기 위하여 100 μl 굶주림(starvation) 배지들에 첨가되었다. 2x 시약들은: 인슐린 (0, 20nm, 및 200nm); 2NBDG (500 μM)이다. 세포들은 인슐린 및 2NBDG로 30동안 처치되었으며, 이후 MBSS 버퍼로 2회 세척되었으며, 이후 50 μl의 MBSS 버퍼가 웰들에 첨가되었다. 포도당 섭취가 안에 세포들이 없는 웰들로의 배경 탐지와 함께 형광분광광도계로 탐지 되었다. 형광분광광도계 판독 후, 고정제 (포르말린, 50 μl)가 웰들 내의 50 μl MBSS에 첨가되었으며, 이후 100 μl 1μM DAPI가 100 μl 포르말린 및 MBSS 혼합물에 첨가되었다.
6. 근관세포들의 생물에너지 프로파일링:
Seahorse® 분석 카트리지 내의 웰들에서 배양된 HSMM 근관세포들이 2% 말 혈청 근육세포(myocyte) 분화 배지들로 7일 동안 분화되었다. 세포들은 음성 대조군 스크램블 siRNA 또는 siHsp siRNA 중 하나로 TKO 유전자 도입 시약들로 50nM의 농도에서 판매자의 설명서에 따라 전술한 바와 같이 유전자 도입 되었다. (Mirus Bio®). 유전자 도입 48 시간 후, 세포들은 세포 에너지학을 조절하기 위한 약물들, 즉, 올리고마이신, 카르보닐 사이아나이드-M-클로로페닐 하이드라진 (CCCP), 및 로테논, 을 사용하여 Seahorse® 생물에너지학 분석에 도입되었다. 올리고마이신은 미토콘드리아 ATP 합성효소 (ET 사슬의 복합체 V)를 저해하며 해당 능력의 분석을 허용한다. CCCP는 미토콘드리아 멤브레인 밖으로 양성자를 펌프해내며, 이로써 최대 보상 산소 소모(maximum compensatory oxygen consumption)를 유도하는 언커플링제(uncoupler)이며, 그리고 언커플링된 OCR의 분석을 허용한다. 로테논은 NADH 디하이드로게나아제 (ET 사슬의 복합체 I)를 저해하며 비-미토콘드리아 OCR의 분석을 허용한다.
분석을 수행하기 위하여, Seahorse® 분석 카트리지의 각각의 웰은 1 ml 주행(running) 배지들로 세척되었다. 500 μl의 주행 배지들이 각각의 웰에 첨가되었으며 그리고 상기 플레이트은 37℃ (CO2 없는) 인큐베이터에 배치되었다. 미토콘드리아 활성을 조절하기 위한 약물들이, 카트리지에 첨가 후, 최종 농도가 1X (1 ㎛)가 되도록, 10X (10 μM) 농도로 제조되었다. 올리고마이신 (50 μl), CCCP (55 μl) 및 로테논 (55 μl)이 카트리지의 입구들(ports) A, B, 및 C에 첨가되었으며 상기 카트리지는 인큐베이터 내로 다시 배치되었다. Seahorse® 분석 마법사가 열렸으며 사이클 파라미터들 및 시간들이 설정되었다. Seahorse® 분석이 이후 상기 장치를 사용하여 수행되었다. Seahorse® 분석 후, 세포들이 50 μl 450mM NaOH로 용해되었으며 이후 5 μl 트리스 6.8로 중화되었다. DNA 용해물들이 OD260 에서 BioTek® Take3 DNA 플레이트 판독기를 사용하여 분광광도 분석에 도입되었다. 데이터는 세포들의 DNA 함량들로 정상화 (normalized) 되었다.
B. 결과들
1. 대사 및 스트레스 인자들이 Hsp90β의 발현을 유도한다:
근관세포들을 대사 및 스트레스 인자들로의 급성 처치하는 것은 Hsp90β의 발현을 조절하는 것으로 나타났다. HSMM 근원세포들은 2% 말 혈청을 함유하는 배지들에서 7일 동안 분화되었고, 이후 다음을 포함하는 상이한 영양 조건들에 24 시간 동안 도입되었다: 정상 글루코오스 (NG 5mM 글루코오스), 고 글루코오스 (HG 25mM), NG + 만니톨 (만니톨은 삼투압을 평형이 되도록 하는데 사용된다.), 올레익 애시드 및 리놀레익 애시드의 혼합물 (150 μM), 팔미테이트 (150 μM), 그리고 이들 상이한 조건들의 조합. 결과들은 24 시간 후, 고 글루코오스는, 삼투 스트레스에 의하여 유도된 효과에도 불구하고, Hsp90β mRNA 발현에 현저한 효과를 갖지 않았다는 것을 나타내었다. 정상 글루코오스 조건들과, 지질 혼합물은, 그것이 Hsp90β mRNA 발현을 고 글루코오스 조건에서 상승시켰지만, Hsp90β mRNA 발현을 억제하였다. NG와 팔미테이트는 BSA 대조군에 비하여 Hsp90β mRNA 발현을 억제하였다. 이들 데이터는 Hsp90β 발현이 상이한 대사 인자들 이를테면 고지질혈증(lipidemia)에 의하여 조절됨을 지시하여, 산화성 대사와 스트레스 반응들과의 상호관계를 입증한다. Hsp90β 발현은 근관세포들을 TNFα로 처치함에 따라 유도되었다 (도 5).
2. 근관세포들에서 Hsp90β의 넉다운은 증가된 인슐린 신호룰 초래하였다:
HSMM 근관세포들이 순차적으로 (1) HSP90AB1를 표적화하는 3개의 상이한 siRNA들로 48 시간 동안 유전자 도입되고, (2) 3 시간 동안 혈청 굶주림되고, 그리고 (3) 상이한 농도들의 인슐린 (0, 10, 100nM)의 자극에 도입되었다. 인슐린 자극의 신호전달 이벤트들 다운스트림이 총 그리고 인산화된 Akt, Erk, 및 GSK3β의 수준들에 대한 웨스턴 블롯팅에 의하여 평가되었다. 웨스턴 블롯들의 정량화는 HSP90AB1 넉다운이 Akt, ERK, 및 GSK3β의 현저하게 상승된 인슐린 자극된 인산화를 유도하였다는 것을 나타내었다. Akt는 Thr308에서 PDK1에 의한 활성화 루프 인산화 및 포스포지질 결합에 의하여 그리고 Ser473에서 카르복시 말단 내의 인산화에 의하여 활성화된다. MEK1 및 MEK2는 p44 및 p42를 각각 활성화 루프 잔기들 Thr202/Tyr204 및 Thr185/Tyr187의 인산화를 통하여 활성화한다. GSK-3는, 그의 활성이 GSK-3α의 Ser21에서 그리고 GSK-3β의 Ser9에서 Akt-매개 인산화에 의하여 저해될 수 있는, PI3K/Akt 세포 생존 경로의 중요한 다운스트림 요소이다. (도 6).
3. 근관세포들에서 Hsp90β의 넉다운은 증가된 인슐린 자극된 포도당 섭취를 초래하였다:
Hsp90β 넉다운에 의하여 유도된 상승된 신호전달 이벤트들과 일치하는, 글루코오스 유도된 포도당 섭취가 HSMM 근관세포들에서 형광성 글루코오스 유사체 2-NBDG를 사용하여 측정되었다. 위에서 제공된 방법들을 사용하여, 세포들이 순차적으로 대조군 또는 Hsp90β siRNA 중 하나로 48 시간 동안 유전자 도입 되었고, 4 시간 동안 혈청 굶주림 되었으며, 그리고 상이한 농도들의 인슐린으로 250 μM 2-NBDG의 존재 하에 30분 동안 자극되었다. 상기 세포들은 이후 PBS로 세척되었으며 형광 발광이 플레이트 판독기를 사용하여 탐지되었다. 세포의 형광 발광은 세포들에 의하여 섭취된 글루코오스의 용량을 반영한다. 결과들은 감소된 Hsp90β 발현을 갖는, siHsp90β 처치된 세포들은, 동일한 조건들 하에서 비-특이적 si-스크램블된 것으로 처치된 세포들에 비교하여, 현저하게 증진된 인슐린 자극된 포도당 섭취를 나타냄을 입증한다. 이들 데이터는 근관세포들에서 Hsp90β의 저해 또는 넉다운이 인슐린 자극된 포도당 섭취를 증진시킴을 입증한다. (도 7).
4. 근관세포들에서 Hsp90β의 넉다운은 증가된 미토콘드리아 효율을 초래한다:
HSMM 근관세포들이 대조군 또는 siHsp90β 중 하나의 siRNA로 48 시간 동안 전술한 바와 같이 유전자 도입되었고, 이후 Seahorse® 생물에너지 프로파일링 (XF24 Analyzer)에 올리고마이신, CCCP, 및 로테논을 포함하는 상이한 미토콘드리아 약물들을 사용하여 도입되었으며; 그리고 기저 또는 최대 미토콘드리아 산화 능력을 반영하는 산소 소모율 (OCR) 상의 변화에 대하여 모니터되었다. 결과들은 DNA 함량에 의하여 정상화되었다.
결과들은 기저 및 언커플링된 조건들 양쪽 모두에서, Hsp90β 넉다운 근관세포들이 증진된 산화적 호흡을 증진시켰음을 입증하였다. 이것은 Hsp90β 넉다운이, 근관세포들에서 미토콘드리아 상의 상당한 대사 변화들을 유도함을 입증하는데, 가능하게는 상이한 미토콘드리아 단백질들의 편입을 표적화함으로써, 그것의 샤페론 활성을 통하여 미토콘드리아 기능들의 조절에서 Hsp90β의 역할을 지시한다. 생물에너지학 프로파일링 연구로부터의 대조군 또는 siHSP90AB1 siRNA들 중 하나와, 근관세포들에서 기저 및 언커플링된 OCR 양쪽 모두에 대한 곡선하 면적 (AUC)의 정량화는 Hsp90β 넉다운 세포들에서 현저하게 증가된 기저 및 언커플링된 OCR을 보여주며, 이로써 Hsp90β 발현의 넉다운에 따른 개선된 미토콘드리아 효율을 입증한다 (도 8)
5. 소분자 저해제 (CCT018159)에 의한 HSP90 저해는 AKT의 인산화는 증가시키지만, ERK 및 GSK3β는 아니다:
근관세포들은 HSP90의 소분자 저해제 (CCT018159)로 처치되고 이후 인슐린 자극에 도입되었다. HSP90의 소분자 저해제 (CCT018159)는 HSP90α 및 Hsp90β 양쪽 모두를 저해한다. 소분자 저해제의 인슐린 신호전달에 대한 효과가 웨스턴 블롯에 의하여 다운스트림 표적들(targekts) Akt, ERK, 및 GSK3β의 인슐린 자극된 인산화를 측정함으로써 평가되었다. 상기 결과들은 보다 높은 농도의 CCT018159, 특히 10μM, 가 현저하게 Akt의 인슐린 자극된 인산화를 증진시킨다는 것을 입증하였으며, HSP90 저해가 근관세포들에서 인슐린 감수성을 증진시킴을 지시한다. 그러나, pERK 또는 pGSK3β의 수준에 변화는 관찰되지 않았다 (도 9).
Hsp90 소분자 저해제들의 세포 생물에너지학에 대한 상이한 효과가 Hsp90β-특이적 넉다운과 비교하여 관찰되었다. CCT018159로 상이한 농도들에서 처치에 따른 근관세포들의 생물에너지 프로파일은 Hsp90β 넉다운 세포들로 관찰된 것과는 상이한 프로파일을 나타내었다. 기저(basal) OCR에 대하여 관찰된 변화는 없었으나, 언커플링된 OCR은 농도 의존적 방식으로 실질적으로 감소되었으며, 여기서 10 μM CCT018159는 CCCP 유도된 OCR의 보다 큰 억제를 유도하였다. 이 상이한 프로파일은 기저 및 언커플링된 상태들 양쪽 모두에서 증가된OCR은 Hsp90β 특이적임을 지시하는 반면, CCT018159는 HSP90α 및 Hsp90β 양쪽 모두를 그들의 ATP 결합 포켓들을 차단함으로써 저해한다. 보다 낮은 농도의 CCT018159 (1㎛)에서, 증가된 언커플링된 OCR가 처치된 근관세포들에서 관찰되었다 (도 10).
C. 결론들:
요약하면, Hsp90β는 골격근 근관세포들에서 인슐린 신호, 포도당 섭취, 및 기질 대사를 조절한다. 고지질혈증, 고혈당증 및 친(pro)-염증성 단서들(cues)에 반응한 Hsp90β mRNA 및 단백질의 유도는 당뇨병의 병리 생리학에서 단백질의 역할을 입증한다. 근관세포들에서 Hsp90β의 넉다운은 그것의 글루코오스 조절에 대한 역할을 입증하는 포도당 섭취의 현저한 증가를 초래하였다. 근관세포들에서 Hsp90β의 넉다운은 또한 AKT 및 GSK3β의 인산화의 증가는 물론 ERK의 인산화의 커다란 증가를 초래하여, 인슐린 신호의 기능적 분지(bifurcation)를 입증하며 그리고 Hsp90β가 선택적 메커니즘에 관련되어 있음을 지시한다. Hsp90β 넉다운은 생물에너지학 및 미토콘드리아 기질 대사에 현저한 효과를 갖는다. HSP90α 및 Hsp90β 양쪽 모두를 저해하는, HSP90 저해제 CCT018159는 인슐린 신호 및 생물에너지학에 대하여 덜 깊은 효과를 가졌으며, Hsp90β-특이적 저해가 범(pan) Hsp90 저해 접근 방식에 비하여 보다 효과적임을 지시한다.
실시예 3 - 골격근 근관세포들에서 대사 효소 발현의 Hsp90β 조절
본질적으로 전술한 바와 같이 근원세포들이 배양되었으며 근관세포들로 분화되었고 siRNA들로 처치되었다. 여러 가지의 대사 경로들에 개입된 일련의 대사 효소들의 mRNA 발현이 rtPCR에 의하여 통상적인 방법들을 사용하여 분석되었다. 상기 효소들은 해당 (HK2, LDH, GYS1), 지질 산화 (CPT1, UCP3), 지방산 수송 (CD36), 및 지방산 합성 (ACC1및 ACC2), 지방분해 (HSL)에 개입되는 것들을 포함한다. Hsp90β siRNA로 처치된 세포들에서 mRNA 발현은 스크램블 siRNA로 처치된 세포들에서 유전자의 발현으로 정상화되었다. 상기 결과들은 도 11A에 도시되어 있다. HK2, LDH, GYS1, CPT1 및 UCP3의 mRNA 발현 수준들은 Hsp90β 발현의 넉다운에 따라 증가되는 것으로 밝혀진데 비하여, CD36 및 HSL의 발현 수준들은 Hsp90β 발현의 넉다운에 따라 감소되는 것으로 밝혀졌다. 지방산 합성에 개입된, ACC2의 발현의 감소 경항 또한 관찰되었다. UCP3 단백질 수준들은 HSP90의 넉다운에 따라 실질적으로 증가되는 것으로 밝혀졌다 (도 11B). 골격근에서 UPC3 단백질 발현 수준은 당뇨병 환자에서 전형적으로 낮으나, 그것의 발현은 운동에 의하여 유도된다. 메커니즘에 얽매이지 않고, Hsp90β발현의 넉다운이 단백질들, 이를테면 UCP3의 조절에 의한 대사 증후군의 처치에서 유익한 효과를 발휘할 수 있는 것으로 제안된다.
실시예 4 - 골격근 근관세포들에서 포도당화 해당능률의 Hsp90β 조절
근원세포들이 배양되었고 본질적으로 전술한 바와 같이 근관세포들로 분화되었고, 정상 혈당 및 고혈당증 조건들 하에서 성장에 도입된다. 고혈당증 조건들에 도입된 세포들은 5mM 글루코오스에서 성장되고 분화되었으며, 그리고 siRNA로 유전자 도입 전에 11mM 글루코오스에서 배양되었다. 정상 혈당 및 고혈당증 조건들 양쪽 모두 하에서 성장된 세포들은 Hsp90β siRNA 또는 스크램블 대조군 siRNA로 유전자 도입되었다. 상기 세포들은 이후 해당 유동(glycolytic flux)을 분석하기 위하여 전술한 바와 같이 Searhorse® 분석에 도입되었으며, 고혈당증 세포들은 11mM 글루코오스에서 분석되었다.
도 12A 및 12B에 도시된 바와 같이, Hsp90β의 넉다운은 정상 혈당 및 고혈당증 조건들 양쪽 모두 하에서 글루코오스 유도된 ECAR 및 올리고마이신 유도된 ECAR를 증가시켰다. 그러나, 비록 Hsp90β의 넉다운이 정상 혈당 조건들 하에서 기저 OCR 및 언커플링된 OCR을 증가시켰지만, 기저 OCR 또는 언커플링된 OCR에는 고혈당증 조건들 하에서 변화가 관찰되지 않았다 (도 12C 및 12D). 이들 결과들은 Hsp90AB1가 상이한 조건들 하에서 미토콘드리아 호흡 및 해당 양쪽 모두를 조절함을 입증한다. 메커니즘에 얽매이지 않고, 이들 결과들은 감소된 Hsp90AB1 단백질 수준들이 전반적 기질 대사를 상승시킬 수 있으며, 이로써 생체 내에서 전신적 대사를 개선시킬 수 있음을 제안한다.
실시예 5 -- 골격근 근관세포들에서 염증성 인슐린 저항성 모델에서 pERK 수준들의 Hsp90β 조절
근원세포들이 배양되고 본질적으로 전술한 바와 같이 근관세포들로 분화되었고, 정상 혈당 및 고혈당증 조건들 하에서 성장에 도입된다. 고혈당증 조건들에 도입된 상기 세포들이 5mM 글루코오스에서 성장되고 분화되었으며, 그리고 siRNA로 유전자 도입 및/또는 TNF-α로 처치 전에 11mM 글루코오스에서 24 시간 동안 배양되었다. 정상 혈당 조건들, 고혈당증 조건들, 또는 TNF-α의 존재 하에 고혈당증 조건들 하에서 성장된 세포들이 Hsp90β siRNA 또는 스크램블 대조군 siRNA로 유전자 도입되었다. 고혈당증 조건들 하에서 성장된 세포들은 이후 따라서 11mM 글루코오스 및/또는 TNF-α의 존재 하에서 배양되었다. 세포들은 수확 및 웨스턴 블롯에 의한 분석 전에 5분 동안 증가하는 농도들의 인슐린 (0, 10, 100nM)에 노출되었다. 간단히 말하면, 세포들은 프로테아제 및 포스파타아제 저해제들을 함유하는 RIPA 버퍼 내로 수확되었다. 세포들은 주사기와 바늘을 사용하여 용해되었다. 총 단백질 농도들이 샘플들 각각에 대하여 측정되었다. 단백질들의 등가 용량들이 SDS-PAGE로 해상되었다(resolved). 단백질들은 니트로셀룰루오스로 이동되었으며 총 그리고 인산화된 ERK 양쪽 모두의 탐지를 위하여 상업적으로 이용 가능한 항체들로 탐사되었다 (도 13A). 총 ERK 그리고 인산화된 ERK의 용량은 phosphorimager를 사용하여 정량적으로 측정되었고 인산화된 ERK의 총 ERK에 대한 비율들이 계산되었다 (도 13B).
도 13A 및13B에 도시된 바와 같이, 정상 혈당 조건들 하에서, ERK 인산화의 기저 수준들 및 인슐린 신호전달 양쪽 모두는, ERK 인산화에 의하여 측정된 바와 같이, Hsp90β 발현의 넉다운에 의하여 증가된다. NG 골격근 근관세포들에서 증가된 인슐린 자극된 ERK 인산화가 Hsp90AB1 넉다운으로 관찰되었다. 비록 HG만이 인슐린 신호전달 및 ERK 인산화를 억제하지 않았으나, TNFα 존재 하에서 HG 조건들은 Hsp90β의 존재 하에서 인슐린 자극된 ERK 인산화를 강력하게 억제한다. 그러나, 동일한 HG 및 TNFα 조건 하에서, Hsp90AB1 넉다운은 TNFα에 의하여 억제된 ERK 인산화를 구조(rescued)하여, HG 조건에서 TNFα 유도된 인슐린 저항성을 구조하였음을 지시한다.
실시예 6 -- 골격근 근관세포들에서 지질 대사의 Hsp90β 조절
골격근에서 인슐린 신호에 대하여 TNF-α의 존재 및 부재 하에 Hsp90β 넉다운의 양쪽 모두에서의 효과를 입증하도록, 지질 대사에 대한 Hsp90β 및 TNF-α의 효과가 분석되었다. 간단히 말하면, 근육세포들이 배양되었고 본질적으로 전술한 바와 같이 정상 및 혈당증(glycemic) 조건들 하에서 분화되었고 Hsp90β 또는 스크램블 siRNA로 처치되었다. 지질 대사가 OCR Seahorse® 분석을 이용하여 본질적으로 전술한 바와 같이 분석되었다. 도 14에 도시된 바와 같이, Hsp90β 의 존재 하에서, TNF-α는 지질 대사를 감소시킨다. 그러나, Hsp90β의 넉다운은 TNF-α의 부재 및 존재 양쪽 모두에서 근육 근관세포들에서 정상 혈당 조건들 하에서 OCR을 증가시킨다. 이들 결과들은 Hsp90β가, Seahorse® 분석에 의하여 측정되는 바와 같이, 지질 대사를 조절함을 입증한다. 비록 TNF-α가 Hsp90β 의 존재 하에서 지질 대사를 감소시키지만, Hsp90β의 넉다운은 지질 대사에서 TNF-α 유도된 감소의 존재 하에서 지질 대사를 재-수립(re-estabilshes)한다.
실시예 7 - HSP90 저해제를 사용하는 대사 증후군의 치료
대사 증후군들 이를테면 타입 1 및 타입 2 당뇨병, 인슐린 저항성, 그리고 고지질혈증의 다수의 유전적 그리고 유도된 동물 모델들은 당해 기술 분야에서 잘 특성화 되어있다. 그러한 동물들이 당뇨병을 포함하는 대사 증후군의 치료에서 HSP90 저해제들, 예컨대, Hsp90β 저해제들의 효과를 입증하는데 사용된다. 타입 1 당뇨병의 모델들은, 이하로 한정되는 것은 아니나, NOD 마우스들 및 스트렙토조토신-유도된 당뇨병 랫트들 그리고 마우스들 (타입 1 당뇨병의 모델들)을 포함한다. 타입 2 당뇨병의 유전적 그리고 유도된 모델들은, 이하로 한정되는 것은 아니나, 렙틴 결함 ob/ob 마우스, 렙틴 수용기 결함 db/db 마우스, 그리고 고 지방 사료 마우스 또는 랫트 모델들을 포함한다. 모델들 각각에서, 특이적 질환 특성들의 발생에 대한 타임라인은 잘 알려져 있다. HSP90 저해제들은 당뇨병, 대사 장애, 및/또는 대사 장애의 하나 또는 그 이상 징후들의 치료에 있어서 HSP90 저해제들, 특히 Hsp90β 저해제들의 효능을 입증하기 위하여 당뇨병의 증상들의 출현 전 또는 후에 투여될 수 있다.
대사 증후군에 대한 유전적 소인이 있거나 또는 없는 동물들이 희망하는 질환 상태를 유도하기 위하여 적합한 조건들 하에서 길러진다. 상기 동물들은 적어도 두 그룹들, 처치된 그리고 대조군, 으로 나누어진다. 처치된 동물들은 하나 또는 그 이상의 복용량들의 HSP90 저해제들, 예컨대, HSP90에 표적된 siRNA들, HSP90에 표적된 항체들, 또는 HSP90의 소분자 저해제들로 처치된다. 바람직하게는, 상기 소분자들, siRNA들, 그리고 항체들은 특히 HSP90α 또는 Hsp90β에 표적된다. 상기 동물들은 여하한 개수의 알려진 방법들에 의하여 대사 증후군의 발생에 대하여 모니터된다. 예를 들면, 기저 인슐린 분비, 글루코오스 수준들, Hb1Ac 수준들, 염증성 마커 수준들, 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수준들, 중량, 간에서의 지방 침착을 포함하는 지방 침착, 혈압, 소변 산출량 및 소변 글루코오스 수준들, 그리고 여타 관련 마커들이 모니터되거나 측정될 수 있다. 마커들은 단식 기간, 예컨대, 하룻밤 단식 후, 또는 글루코오스 도전(challenge) 또는 여타 대사 도전에 대한 반응이 분석된다. 예정된 간격들에, 또는 실험의 최후에, 동물들이 지방 침착, 신장 상태, 그리고 대사 증후군의 여타 적합한 지표들을 평가하기 위하여 안락사된다.
처치 그룹(들)의 결과가 대조군 (비처치된 또는 운반체 처치된) 그룹의 결과에 비교된다. Hsp90β의 저해제들은 여러가지의 평가 방법들에서 대사 증후군을 호전시키는 것으로 입증되었다.
실시예 8 - 대사 증후군의 처치를 위한 간 표적으로서 Hsp90β의 확인
간은 혈당의 조절에 중요한 역할을 한다. 건강한 대상에서, 인슐린은 간에 의하여 글리코겐으로의 전환을 위하여 포도당 섭취를 증진시키며, 혈당 수준들을 감소시킨다. 대사 증후군에서, 간은 인슐린에 대한 무감증 또는 불충분한 인슐린 생산 중 어느 하나, 또는 양쪽 모두에 의하여 인슐린에 반응하지 않으며, 혈액에서 글루코오스의 상승된 수준들을 초래하는데, 이것은 독성이다.
간 세포들 (예컨대, THLE-2 세포들)이 인슐린 신호 및 포도당 섭취의 분석에 대하여 위에서 설명된 것과 유사한 방법들을 사용하여 분석된다. 간단히 말하면, 세포들은 HSP90 저해제들, 바람직하게는 Hsp90β 저해제들로 처치되며, 그리고 인슐린 신호에 대하여, 예컨대, 예컨대, qPCR에 의한, AKT, ERK, 및 GSK3β의 인산화; 포도당 섭취, 글리코겐 합성; 생물에너지학; 당신생(gluconeogenesis) 또는 지질/ 콜레스테롤 대사에 개입된 유전자들의 유전자 발현의 분석에 의하여 분석된다. 염증 및 소포체 (ER) 스트레스의 마커들 또한 평가될 수 있다.
HSP90 저해제들, 특히 Hsp90β 저해제들로 처치된 간 세포들은 상기 저해제들로 처치되지 않은 세포들에 비하여 더 우수한 인슐린 신호전달, 포도당 섭취, 및/또는 지질 대사를 갖는 것으로 밝혀졌다. 저해제들로 처치된 간 세포들은 또한 더 적은 ER 스트레스 및/또는 염증성 마커들의 더 낮은 발현을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 9 - 대사 증후군의 처치를 위한 지방 표적으로서 Hsp90β의 확인
간 세포들과 유사하게, 지방 조직은 인슐린에 반응하여 혈액으로부터 글루코오스를 섭취하여, 당을 지방으로 전환시킨다. 지방 세포들은 근육 세포들 및 간 세포들의 분석을 위하여 전술한 방법들을 사용하여 인슐린 반응성 및 포도당 섭취에 대하여 평가된다. 유사하게, 염증 및 ER 스트레스가 또한 세포들에서 평가될 수 있다.
HSP90 저해제들, 특히 Hsp90β 저해제들로 처치된 지방 세포들은 저해제들로 처치되지 않는 세포들에 비하여 더 우수한 인슐린 신호, 포도당 섭취, 및/또는 지질 대사를 갖는 것으로 밝혀졌다. 저해제들로 처치된 지방 세포들은 또한 더 적은 ER 스트레스 및/또는 더 낮은 염증성 마커들의 발현을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 10 - HSP90 저해제의 특이성의 분류
이를테면 본원 명세서에서 제공된 것들과 같은 다수의 HSP90 저해제들이 이용 가능하며, 이들의 다수는 여러가지의 질환들 또는 조건들, 가장 흔하게는 암, 의 치료에의 사용을 위한 임상 실험들을 거친 것이거나 또는 거칠 것이다. HSP90 전사체, 단백질, 또는 HSP90 결합 단백질, 에 대한 저해제의 작용 또는 결합 부위의 특이적 메커니즘에 따라, 상기 저해제는 하나 또는 그 이상의 HSP90 동종형들, 예컨대, HSP90α 또는 Hsp90β의 활성을 저해할 수 있다. 예를 들면, HSP90의 ATP 결합 부위에 작용하는 저해제들은 HSP90α 및 Hsp90β 양쪽 모두에 대한 저해제 활성을 가질 듯 하다. 더욱이, HSP90의 특이적 결합 파트너와의 상호작용을 저해하는 약제들이 선택될 수 있다. (예컨대, Tsaytler et al., 2009, Cell 스트레스 Chap. 14:629 참조). 유사하게, HSP90의 특이적 핵산 또는 아미노산 서열에 기초하여, 핵산 기초 또는 항체 기초 저해제들이 HSP90α 또는 Hsp90β의 발현 또는 활성을 특이적으로 저해 하도록 디자인될 수 있다. 대안적으로, 핵산 기초 또는 항체 기초 저해제들은 HSP90α 또는 Hsp90β 양쪽 모두의 발현 또는 활성에 특이적으로 디자인 될 수 있다. HSP90α 및 Hsp90β 핵산의 정렬들 그리고 아미노산 서열들이 도 17 에 제공된다. 당해 기술 분야의 통상의 기술자는 HSP90의 단일 동종형에 교차-반응성(cross-reactive) 또는 특이적 일 수 있는 HSP90α 및 Hsp90β 상의 에피토프들을 확인하거나 또는 핵산 저해제들을 디자인하기 위하여 상기 정렬들을 쉽게 검토할 수 있다.
만약 한 약제가 HSP90α, Hsp90β, 또는 양쪽 모두의 활성 또는 발현의 저해재인지를 확인할 수 있는 방법들은 당해 기술 분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다. 예를 들면, 하나 이상의 HSP90의 발현을 저해하는 핵산 및 항체 저해제들은 세포 배양 시스템에서 특이성에 대하여 테스트될 수 있다. 예를 들면, HSP90α 및 Hsp90β 양쪽 모두를 발현하는 세포들이 일련의 농도들의 핵산 또는 항체, 그리고 적합한 대조군들 (예컨대, 스크램블 핵산, 비-면역 IgG)과 적합한 총 시간 동안 접촉된다. 세포들 및/또는 배지들이 적절히 수확된다. 통상적인 핵산 (예컨대, RT-PCR, 노던 블롯) 및 단백질 (예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯) 탐지 방법들이 적합한 대조준과 비교하여 HSP90α 및 Hsp90β의 발현 수준을 측정하기 위하여 사용된다. HSP90 저해제의 특이성은 쉽게 측정될 수 있다.
ATP 결합 및 가수분해 분석들을 수행하기 위한 경쟁 분석들 및 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며 만약 하나의 약제가 HSP90α, Hsp90β, 또는 양쪽 모두의 저해제인지, 즉, 만약 한 약제가 하나의 또는 양쪽 모두 동종형들에서 ATP 결합 또는 가수분해를 저해할 수 있는지를 측정하기 위하여 사용될 수 있다.
효모는 HSP90의 오직 단일 카피만을 함유한다. HSP90를 발현하지 않는 효모 균주들은 HSP90α 또는 Hsp90β 중 하나로 형질전환될 수 있으며 클라이언트 단백질들을 폴딩(fold)하는 능력이 모니터 될 수 있다. 유사하게, 예컨대, HSP90α 넉아웃 마우스들로부터 유도된, 단일 HSP90 동종형만을 발현하는 포유류 세포 라인들, 또는 하나의 HSP90 동종형의 발현을 저해하기 위하여 siRNA로 처치된 세포들이, 하나의 또는 양쪽 모두의 HSP90 동종형들에 대한 약제의 활성을 구분하기 위하여 사용될 수 있다.
상업적으로 이용 가능한 키트들 또한 HSP90α 및 Hsp90β의 저해제들에 대하여 저해제들을 구분하기 위하여 사용될 수 있다. (BPS Bioscience).
실시예 11 -- 인슐린 저항성의 식이 유도된 비만 모델에서 Hsp90β의 컨셉 넉다운의 증거를 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드들 (ASO)의 평가
대사 증후군, 비만, 인슐린 저항성, 및/또는 타입 2 당뇨병의 예방 및/또는 처치에서 Hsp90β을 치료적 표적으로서 더 확인하기 위하여 예시적인 동물 연구 모델이 이하에서 제공된다.
1. 목적 및 논리적 근거
연구의 목적들은,
1. 적합한 생체 내 모델들에서 Hsp90β의 발현의 효율적인 넉다운을 위하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드들 (ASO)을 확인하고 특성화 하기 위하여
2. 생체 내 Hsp90β의 넉다운이 치료적 이득을 갖는 기능적 생리학적 반응을 야기하는 것을 입증하기 위하여 이다.
바람직한 성과는 Hsp90β의 넉다운으로 비만 표현형 및 당뇨병 표현형을 예방하는 것이다.
POC (Proof of Concept) 연구들이 식이 유도된 비만 (DIO) 및 인슐린 저항성 (IR) 마우스 모델들에서 수행된다.
상기 연구는 다음의 두 부분으로 수행된다:
1. 여러 가지의 조직들에서 Hsp90β의 발현의 분석에 의하여 생체 내 모델 내에서 Hsp90β 발현을 현저하게 넉다운 시키는 하나 또는 그 이상 ASO들의 확인.
2. Hsp90β 발현의 저해가 체중 증가 및 대사 증후군의 발생의 개시를 예방, 경감 또는 지연시킴을 입증하기 위하여 식이 유도된 비만 및 인슐린 저항성에 대한 마우스 대상들에 ASO(들)을 투여.
아래에서 제공되는 실험적 방법들이 여타 핵산 치료제들 (siRNA, dsiRNA, shRNA), 항체 기초 치료제들, 그리고 소분자 기초 치료제들을 분석하기 위하여 쉽게 변형될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 더욱이, 상기 연구는 당뇨병 및 대사 장애들(이를테면 전술한 바와 같은 것들)의 여타 모델들의 사용을 포함하기 위하여 변형될 수 있다. 이하에서 논의되는 바와 같이, 얻어지는 특정 결과들에 따라, 시간 및 투약량 범위들은 효능 및 독성의 예비적 분석들에 기초하여 변형될 수 있다. 그러한 변형들은 당해 기술 분야의 통상의 기술자들의 능력 범위 내이다.
2. 의의
Hsp90β의 발현의 넉다운은 고 지방 식이 그리고 식이 유도된 인슐린 저항성의 결과로서의 체중 증가를 지연시키거나, 경감시키거나 또는 예방하며, 하나 또는 그 이상의 비만, 인슐린 저항성, 타입 2 당뇨병, 그리고 상승된 혈압, 상승된 지질 수준들, 중부 지방과다(central adiposity), 낮은 HDL, 그리고 단식 시 및/또는 글루코오스 내성 테스트 동안에 상승된 글루코오스 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 대사 증후군, 의 처치 또는 관리를 위한 표적으로서 Hsp90β의 실용성을 입증한다.
3. 실험적 접근
파트 I: Hsp90β의 ASO 매개 넉다운 그리고 생체 내 (복용량 점증 연구)
올리고뉴클레오타이드 선택. 안티센스 올리고뉴클레오타이드들이 제조되며 Hsp90β의 발현의 특이적 저해에서 효과적인 ASO들을 확인하기 위하여 시험관 내 테스트 된다. 시험관 내 분석들에서 예비적으로 확인된 하나 또는 그 이상의 ASO들이 수반되는 생체 내 연구들에 사용된다.
효능 및 독성의 분석. 그룹 당 5마리의 마우스들을 함유하는, 총 6 그룹들의 마우스들이 표준 음식 식이로 유지된다. 각각 5마리의 마우스들으 두 그룹들을 포함하는, 코호트 1 내의 마우스들은 2 주 동안 주당 2회의 정상 복용량 ASO (30-40 mg/kg) 또는 ASO (100-150mg/kg)의 높은 복용량의 복막 내 주사를 수여받는다. 코호트 2 및 코호트 3의 처치는 선행하는 코호트 (코호트 2에 대하여는 코호트 1 그리고 코호트 3에 대해서는 코호트 2)의 효능 및 독성의 평가 후에 개시된다. 각각의 코호트에 순차적으로, 처치 시간은 2주 마다 증가한다(코호트 1, 2 주; 코호트 2, 4 주; 코호트 3, 6 주). 이하의 판단들은 이전의 코호트에서 얻어진 결과들에 기초하여 이루어진다:
- 효능 없음 - 독성 없음: 코호트 파트 1을 위한 처치 방법들은 10-배 증가된 처치 투약량으로 반복된다. 뿐만 아니라 처치 시간은 2 주 연장된다.
- 효능 - 독성 없음: 이하에 설명되는 바와 같은 파트 2에서의 처치는 이 ASO에 대하여 즉시 개시된다. 뿐만 아니라, 파트 1의 처치 방법들이 독성 역치의 측정을 위하여 50-배 증가된 처치 투약량으로, 코호트 1에서와 같은 2주 복용 스케줄이 아닌 4주 복용 스케줄로, 반복된다.
- 효능 - 독성: 10배 감소된 처치 투약량으로 파트 1의 처치가 반복되며 동일한 처치 시간이 사용된다.
- 효능 없음 - 독성: 이 ASO는 추가의 연구에 고려되지 않는다.
각각의 코호트에 대하여 그리고 모든 그룹들에서, 체중, 글루코오스 수준 그리고 혈장 인슐린 수준이 각 주사 전에 그리고 희생 전에 측정된다. 뿐만 아니라, ASO의 혈장 수준이 상업적으로 이용 가능한 키트, 예컨대, OliGreen® ssDNA 정량 분석 그리고 Invitrogen®로부터의 키트, 를 사용하여 측정된다. 2 주 후, 마우스들이 희생되며 혈액의 회수를 위하여 바늘 (0.5-1 mL)로 심장 채혈이 즉시 수행된다. 부검들이 이후 수행된다. 선택된 조직들이 사용할 때까지 -80℃에서 저장하기 전에 수집되고, 칭량되며, 그리고 급속 냉동된다. (지방 조직들 및 간은 예외임).
다음의 샘플들 및 조직들이 순차적 방식으로 수집된다:
- 혈장 준비를 위한 혈액
- 간 (파라핀 엠베딩(embedding)을 위한 급송 냉동, 고정제)
- 개별적 바이알들에 저장되는 뒷다리 및 등 근육들을 포함하는 골격근들 (급송 냉동).
- 개별적 바이알들에 저장되는, 백색 지방 조직들 (성선주변(perigonadal), 그리고 서혜부) 그리고 갈색 지방 조직을 포함하는, 지방 조직들 (급송 냉동 및 파라핀 엠베딩을 위하여 고정됨)
- 췌장 (급송 냉동)
- 신장 (급송 냉동)
Hsp90β의 넉다운 효율이 qPCR, 웨스턴 블롯팅, 및/또는 면역조직화학을 사용하여 표적의 발현 수준 측정에 의하여 측정된다. 뿐만 아니라, 혈장 인슐린, 렙틴의 혈장 수준, 아디포넥틴(adiponectin), TNFα, PAI-1, 혈청 아밀로이드 A, 및 IL6가 ELISA 를 사용하여 측정된다. 가장 효율적인 넉다운의 ASO가 선택되며 아래의 파트 II에서 제공되는 뒤 이은 실험들에 사용된다.
동물들로부터 수집된 혈장 및 간이 독성의 예비적 평가에 사용된다. 염증성 마커들에 대한 ELISA와 함께 LDH 방출 분석들이 수행된다. 뿐만 아니라 알라닌 아미노 트랜스퍼라아제 (ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AST), 글루타메이트 디하이드로게나아제 (GLDH) 활성 분석들이 혈장 및 간 균질 현탁액들에 대하여 수행된다. 간 내의 GSH 수준들이 간 기능의 부가적 판독으로서 확인된다.
파트 II - 고 지방 식이 유도된 비만 및 인슐린 저항성 모델에 대한 Hsp90β 넉다운의 대사 효과들에 대한 컨셉 연구의 증거
대사 효과들에 대한 컨셉 연구의 증거는 다음의 파라미터들의 분석을 포함한다: 체중, 먹이공급 및 공복 혈당 수준들, 음식 섭취, 물 섭취, 체질량 조성, O2 소모, CO2 생산, 글루코오스 내성 테스트 (GTT), 인슐린 내성 테스트 (ITT), 파이루베이트 내성 테스트 (PTT), 및 자발적(voluntary) 활성.
60% kcal % 지방 고 지방 식이 (HFD)에 도입된 8주령 수컷 여윈(lean) C57BL/6 마우스들이 복막 내 주사들 (IP)을 통하여 주당 2회 Hsp90β ASO, 대조군 ASO, 또는 식염수의 실증적으로 예정된 투약량들로 처치된다. 개별적 여윈(lean) 대조군 그룹들은 식염수 또는 대조군 ASO 중 하나를 수여받으며, 그리고 표준 저 지방 먹이 규정식(저 지방 표준 규정식 (LFD) 10% kcal% 지방)으로 유지된다. 처치 그룹들은 다음에 나타난다:
- LFD 식염수 처치 (21 마우스들)
- LFD 대조군 ASO 처치 (21 마우스들)
- HFD 식염수 처치 (21 마우스들)
- HFD 대조군 ASO 처치 (21 마우스들)
- HFD Hsp90β ASO 처치 (21 마우스들)
각각의 21 마우스들의 그룹들이 각각 7 마우스들로 된 동물들의 3 코호트들로 나뉜다. 상기 마우스들은 4주, 6주, 그리고 8주의 지속 기간으로 처치되고 평가된다. 후자의 코호트들에 대하여는 2주의 지연이 있는데, 즉 코호트 2는 코호트 1의 처치의 개시 2주 후에 ASO 및 HFD 처치들을 시작한다. 이러한 방식으로, 코호트 2 처치는 코호트 1에서의 고무적인 결과들의 관찰에 따라 6주 처치 대신 4주 처치로 변형될 수 있다. 만약 코호트 1이 예측된 결과들을 나타내지 않으면, 코호트 2는 6주 처치들을 거친다. 뿐만 아니라, 각각의 코호트 (4주, 6주 그리고 8주)에 대하여, GTT 및 ITT 연구들에서의 효능의 입증에 따라, 처치들은 PTT를 수용하기 위하여 1주 연장된다. (4주가 5주가 되고, 6주가 7주가 되며, 8주가 9주가 됨)
체중 및 먹이 공급된 혈당은 처치 시작으로부터 매주 IP 주사들 전에 주당 2회 모니터된다.
코호트 1 (4주 ASO 처치)에 대하여, GTT 및 ITT가 ASO 처치의 시작 후 17일 및 24일에 수행된다. 만약 GTT 및 ITT로부터의 양성의 결과들이 관찰된다면, 그리고 PTT가 31일에 수행된다. ASO 및 대조군 처치의 4주 (또는 5주) 후, 코호트 1로부터의 마우스들은 안락사되고, 조직 및 혈액 샘플들이 추가의 분석을 위하여 수집된다.
코호트 2 (6 주 ASO 처치)에 대하여, GTT 및 ITT가 ASO 처치의 시작 후에 31일 및 38일에 수행된다. 만약 GTT 및 ITT로부터 양성 결과들이 관찰된다면, 그리고 PTT가 45일에 수행된다. 코호트 2의 마우스들이 안락사되며, 그리고 조직 및 혈액 샘플들이 처치의 6째주 또는 7째주 후 추가의 분석을 위하여 수집된다.
코호트 3 (8 주 ASO 처치)에 대하여, GTT 및 ITT가 ASO 처치의 시작 후 45일 및 52일에 수행된다. 만약 GTT 및 ITT로부터 양성 결과들이 관찰된다면, PTT가 59일에 수행된다. 코호트 3의 마우스들이 안락사되며, 그리고 조직 및 혈액 샘플들이 처치의 8째주 또는 9째주 후 추가 분석을 위하여 수집된다.
수집된 조직들은 유전자 발현 및 표적 침묵화(silencing)에 대하여 qPCR, 웨스턴 블롯팅, 및/또는 IHC로 분석된다. 인슐린 신호 경로들에서 여타 유전자들 및 단백질들의 발현 또한 분석될 수 있다. 각각의 시점에서 수집된 혈액은 혈장으로 가공되며 다음을 포함하는 상이한 생물화학적 분석에 도입된다: TG, FFA, 총 콜레스테롤, 인슐린, 혈청 아밀로이드 A (SAA), 아디포넥틴, TNFα, 그리고 PAI-1
10 동물들의 추가적 코호트가 다음의 요법들로 처치된다:
- HFD 대조군 ASO 처치 (5 마우스들)
- HFD Hsp90β ASO 처치 (5 마우스들)
마우스들은 54일 내지 57일에 VO2, VCO2, RQ (respiratory quotient) 및 열 생산을 측정함으로써, 음식 섭취, 물 섭취, 자발적 활성 그리고 호흡을 평가하기 위하여 종합 실험실 동물 모니터링 시스템 (CLAMS)을 사용하여 대사 케이지들에서 모니터링에 도입된다. 체 조성이 동일한 주에 51일에 이중-에너지 x-선 흡수법 (DEXA)에 의하여 측정된다. 이 코호트는 8 주동안 상이한 ASO들로 주당 2회 주사된다.
물질들 및 방법들.
동물들
동일한 성별 (수컷), 연령 및 유전적 배경의 마우스들이 모든 비교들에 사용된다.
수컷 C57BL/6J 마우스들 (7 주령)이 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)로부터 입수되며 초기에 12:12시간 낮-밤 사이클로 22℃에 케이지 당 4-5마리씩 수용된다. 마우스들은 화합물로 처치 전에 일 주일 동안 지역 동물 시설에 순응시킨다.
8주령 시작에, 마우스들은 연구 단계 (파트 I 또는 파트 II)에 따라 고 지방 식이 (Research Diets Cat #: D12492; 60 kcal% 지방, 20 kcal% 단백질, 그리고 20 kcal% 탄수화물) 또는 표준, 저 지방 식이 (10% kcal% 지방)로 급식된다. 마우스들은 주당 2회 ASO 또는 식염수로 주사된다. 체중, 글루코오스 수준 및 혈장 인슐린 수준이 매 주사 전에 측정된다.
복막 내 글루코오스 내성 테스트 (IPGTT)
글루코오스 내성 테스트들 (GTT)이 단식 6시간 후에 수행된다. 초기 공복 혈당 수준들이 측정되고, 2.0 g/kg 체중 (2 g/kg 체중)의 복용량으로 20% 덱스트로오스 용액의 복막 내 (ip) 주사가 수반된다. 혈당 수준들이 상업적으로 이용 가능한 글루코오스 모니터, 예컨대, Accu-chek® Advantage glucometer (Roche Diagnostics®, Indianapolis, IN)를 사용하여 글루코오스 주사 후 15, 30, 60, 90,120, 150, 및 180분에 꼬리 정맥으로부터 측정된다. GTT 동안의 곡선하 면적 (AUC)이 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 프로그램, 예컨대, GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산된다. 상이한 그룹들에 대한 GTT 실험들이 병렬로 주행된다. 꼬리 정맥 글루코오스 측정들의 각각의 시점에, ~40 ㎕의 꼬리 정맥 혈액이 수집되고 혈장이 수반되는 글루코오스 주사들 후 0, 15, 및 30분에 ELISA/RIA를 사용하는 인슐린 수준 분석들을 위하여 준비된다.
복막 내 인슐린 내성 테스트 (IPITT)
인슐린 내성 테스트 (ITT)가 1시간 단식 후 수행된다. 초기 혈당 수준들이 측정되며, 인간 인슐린 (1-2 U/kg; Humulin R; Eli Lilly, Indianapolis, IN)의 주사 (ip)가 수반된다. 혈당 수준들이 인슐린 주사 후 15, 30, 60, 90, 및 120분에 전술한 바와 같이 꼬리 정맥으로부터 측정된다. 인슐린 주사 용량이 고 지방 식이에 도입된 마우스들에서 간 인슐린 저항성의 개시로 인한 인슐린 반응에 의하여 실증적으로(empirically) 측정된다
복막 내 파이루베이트 내성 테스트 (IPPTT)
파이루베이트 도전(challenge) 테스트가 단식 6시간 후 투여된다. 초기 혈당 수준들이 측정되고, 식염수에 용해된 파이루베이트 (2 g/kg; Sigma, St. Louis, MO)의 주사 (ip)가 수반된다. 혈당 수준들이 파이루베이트 주사 후 15, 30, 60, 90, 및 120분에 전술한 바와 같이 꼬리 정맥으로부터 측정된다. 테스트 동안의 곡선하 면적 (AUC)이 계산된다.
이중-에너지 X-선 흡수법 (DEXA)
상이한 처치 그룹들의 체 질량 조성이 LUNAR PIXImus® 마우스 농도계(densitometer)를 사용하는 이중-에너지 x-선 흡수법 (DEXA) 스캐닝에 의하여 제조자에 의하여 권장되는 절차에 따라 측정된다. 여윈(Lean) 체 질량, 뚱뚱한(fat) 체 질량, 총 신체 조직 중량, 골 밀도 그리고 골 미네랄 함량이 기록되고 분석된다.
종합 실험질 동물 모니터링 시스템 (CLAMS)
CLAMS (Columbus Instruments, Columbus, OH, USA) 대사 모니터링 케이지들이 수평적(horizontal) 및 수직적(vertical) 활성, 급식 및 급수, 산소 소모, 그리고 CO2 생산을 동시에 모니터링하기 위하여 사용된다. ASO 주사된 그리고 대조군 마우스들이 CLAMS 케이지들 내에 개별적으로 배치되고 1-2일 동안 케이지들에 순응된 후 4-일의 기간에 걸쳐서 모니터된다. 여러가지의 파라미터들이 단식됨 및 급식된 조건들 양쪽 모두에서 기록된다. 먹이 및 물의 소모가 축적되는 데이터로서 직접 측정된다. 시간당 파일들은 각각의 파라미터들에 대한 모든 측정들을 표시한다: 소모된 산소의 부피, ml/kg 시간당 (VO2), 생성된 이산화탄소의 부피, ml/kg 시간당 (VCO2), 호흡 교환 비율(respiratory exchange ratio), 열 (kcal/h), 축적된 사료 (g), 축적된 음료 (g), XY 총 활성 (산출된 모든 수형 빔 침입들), XY 보행(ambulatory) 활성 (산출된 최소 3번의 상이한, 연속적 수평 빔 침입들), 그리고 Z 활성 (산출된 모든 수직 빔 침입들). 이 데이터는 30-초 샘플링 기간 동안 기록된다. CLAMS 데이터는 여윈(lean) 체질량으로 정상화함으로써 분석된다.
조직 수집
각각의 프로토콜 끝에, 마우스들이 다음의 주일에 안락사되고, 조직들이 수집되고 표준 방법들을 사용하는 파라핀 엠베딩을 위한 포르말린 고정 또는 -80℃ 에서의 저장 전에 급속 냉동(snap freezing)에 의한 보존 전에 칭량된다. 혈액은 심장 채혈(cardiac puncture)에 의하여 수집되고 혈장이 준비된다.
다음의 샘플들 및 조직들이 수집된다:
- 간 (급송 냉동, 파라핀 엠베딩을 위한 고정제)
- 개별적 바이알들에 저장되는 뒷다리 및 등 근육들을 포함하는, 골격근들 (급송 냉동).
- 개별적 바이알들에 저장되는, 백색 지방 조직들 (성선주변(perigonadal), 그리고 서혜부) 그리고 갈색 지방 조직을 포함하는, 지방 조직들 (급송 냉동 및 파라핀 엠베딩을 위하여 고정됨).
- 췌장 (급송 냉동)
- 신장 (급송 냉동)
균등물들
당해 기술 분야에서 통상의 기술자들은 본원 명세서에서 설명된 특이적 실시예들 및 방법들에 대한 많은 균등물들을 통상적인 것을 넘지 않는 실험을 이용하여 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등물들은 다음의 청구항들의 범위에 의하여 포괄되는 것으로 의도된다.
참조로서 편입
본 출원에서 인용된 각각의 참조문헌, 특허, 특허출원 및 GenBank 번호는, 마치 각각의 참조가 개별적으로 편입되는 것으로 언급되는 것처럼, 여기에 참조로서 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> BERG PHARMA LLC <120> METHODS OF TREATING A METABOLIC SYNDROME BY MODULATING HEAT SHOCK PROTEIN (HSP) 90-BETA <130> 119992-06420 <140> New Application <141> Concurrently Herewith <150> 61/652,023 <151> 2012-05-25 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1 aggccgacaa gaaugauaag gcagt 25 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 acugccuuau cauucuuguc ggccuca 27 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 caacgaugau gaacaguaug cuugg 25 <210> 4 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 ccaagcauac 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Lys Asp 100 105 110 Leu Gln Pro Phe Ile Leu Leu Arg Leu Leu Met Pro Glu Glu Thr Gln 115 120 125 Thr Gln Asp Gln Pro Met Glu Glu Glu Glu Val Glu Thr Phe Ala Phe 130 135 140 Gln Ala Glu Ile Ala Gln Leu Met Ser Leu Ile Ile Asn Thr Phe Tyr 145 150 155 160 Ser Asn Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ser Ser Asp 165 170 175 Ala Leu Asp Lys Ile Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Asp Pro Ser Lys Leu 180 185 190 Asp Ser Gly Lys Glu Leu His Ile Asn Leu Ile Pro Asn Lys Gln Asp 195 200 205 Arg Thr Leu Thr Ile Val Asp Thr Gly Ile Gly Met Thr Lys Ala Asp 210 215 220 Leu Ile Asn Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Lys Ala Phe 225 230 235 240 Met Glu Ala Leu Gln Ala Gly Ala Asp Ile Ser Met Ile Gly Gln Phe 245 250 255 Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Tyr Leu Val Ala Glu Lys Val Thr Val 260 265 270 Ile Thr Lys His Asn Asp Asp Glu Gln Tyr Ala Trp Glu Ser Ser Ala 275 280 285 Gly Gly Ser Phe Thr Val Arg Thr Asp Thr Gly Glu Pro Met Gly Arg 290 295 300 Gly Thr Lys Val Ile Leu His Leu Lys Glu Asp Gln Thr Glu Tyr Leu 305 310 315 320 Glu Glu Arg Arg Ile Lys Glu Ile Val Lys Lys His Ser Gln Phe Ile 325 330 335 Gly Tyr Pro Ile Thr Leu Phe Val Glu Lys Glu Arg Asp Lys Glu Val 340 345 350 Ser Asp Asp Glu Ala Glu Glu Lys Glu Asp Lys Glu Glu Glu Lys Glu 355 360 365 Lys Glu Glu Lys Glu Ser Glu Asp Lys Pro Glu Ile Glu Asp Val Gly 370 375 380 Ser Asp Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Gly Asp Lys Lys Lys Lys Lys 385 390 395 400 Lys Ile Lys Glu Lys Tyr Ile Asp Gln Glu Glu Leu Asn Lys Thr Lys 405 410 415 Pro Ile Trp Thr Arg Asn Pro Asp Asp Ile Thr Asn Glu Glu Tyr Gly 420 425 430 Glu Phe Tyr Lys Ser Leu Thr Asn Asp Trp Glu Asp His Leu Ala Val 435 440 445 Lys His Phe Ser Val Glu Gly Gln Leu Glu Phe Arg Ala Leu Leu Phe 450 455 460 Val Pro Arg Arg Ala Pro Phe Asp Leu Phe Glu Asn Arg Lys Lys Lys 465 470 475 480 Asn Asn Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Met Asp Asn Cys 485 490 495 Glu Glu Leu Ile Pro Glu Tyr Leu Asn Phe Ile Arg Gly Val Val Asp 500 505 510 Ser Glu Asp Leu Pro Leu Asn Ile Ser Arg Glu Met Leu Gln Gln Ser 515 520 525 Lys Ile Leu Lys Val Ile Arg Lys Asn Leu Val Lys Lys Cys Leu Glu 530 535 540 Leu Phe Thr Glu Leu Ala Glu Asp Lys Glu Asn Tyr Lys Lys Phe Tyr 545 550 555 560 Glu Gln Phe Ser Lys Asn Ile Lys Leu Gly Ile His Glu Asp Ser Gln 565 570 575 Asn Arg Lys Lys Leu Ser Glu Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Ser Ala Ser 580 585 590 Gly Asp Glu Met Val Ser Leu Lys Asp Tyr Cys Thr Arg Met Lys Glu 595 600 605 Asn Gln Lys His Ile Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Lys Asp Gln Val 610 615 620 Ala Asn Ser Ala Phe Val Glu Arg Leu Arg Lys His Gly Leu Glu Val 625 630 635 640 Ile Tyr Met Ile Glu Pro Ile Asp Glu Tyr Cys Val Gln Gln Leu Lys 645 650 655 Glu Phe Glu Gly Lys Thr Leu Val Ser Val Thr Lys Glu Gly Leu Glu 660 665 670 Leu Pro Glu Asp Glu Glu Glu Lys Lys Lys Gln Glu Glu Lys Lys Thr 675 680 685 Lys Phe Glu Asn Leu Cys Lys Ile Met Lys Asp Ile Leu Glu Lys Lys 690 695 700 Val Glu Lys Val Val Val Ser Asn Arg Leu Val Thr Ser Pro Cys Cys 705 710 715 720 Ile Val Thr Ser Thr Tyr Gly Trp Thr Ala Asn Met Glu Arg Ile Met 725 730 735 Lys Ala Gln Ala Leu Arg Asp Asn Ser Thr Met Gly Tyr Met Ala Ala 740 745 750 Lys Lys His Leu Glu Ile Asn Pro Asp His Ser Ile Ile Glu Thr Leu 755 760 765 Arg Gln Lys Ala Glu Ala Asp Lys Asn Asp Lys Ser Val Lys Asp Leu 770 775 780 Val Ile Leu Leu Tyr Glu Thr Ala Leu Leu Ser Ser Gly Phe Ser Leu 785 790 795 800 Glu Asp Pro Gln Thr His Ala Asn Arg Ile Tyr Arg Met Ile Lys Leu 805 810 815 Gly Leu Gly Ile Asp Glu Asp Asp Pro Thr Ala Asp Asp Thr Ser Ala 820 825 830 Ala Val Thr Glu Glu Met Pro Pro Leu Glu Gly Asp Asp Asp Thr Ser 835 840 845 Arg Met Glu Glu Val Asp 850 <210> 9 <211> 2567 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ctccggcgca gtgttgggac tgtctgggta tcggaaagca agcctacgtt gctcactatt 60 acgtataatc cttttctttt caagatgcct gaggaagtgc accatggaga ggaggaggtg 120 gagacttttg cctttcaggc agaaattgcc caactcatgt ccctcatcat caataccttc 180 tattccaaca aggagatttt ccttcgggag ttgatctcta atgcttctga tgccttggac 240 aagattcgct atgagagcct gacagaccct tcgaagttgg acagtggtaa agagctgaaa 300 attgacatca tccccaaccc tcaggaacgt accctgactt tggtagacac aggcattggc 360 atgaccaaag ctgatctcat aaataatttg ggaaccattg ccaagtctgg tactaaagca 420 ttcatggagg ctcttcaggc tggtgcagac atctccatga ttgggcagtt tggtgttggc 480 ttttattctg cctacttggt ggcagagaaa gtggttgtga tcacaaagca caacgatgat 540 gaacagtatg cttgggagtc ttctgctgga ggttccttca ctgtgcgtgc tgaccatggt 600 gagcccattg gcaggggtac caaagtgatc ctccatctta aagaagatca gacagagtac 660 ctagaagaga ggcgggtcaa agaagtagtg aagaagcatt ctcagttcat aggctatccc 720 atcacccttt atttggagaa ggaacgagag aaggaaatta gtgatgatga ggcagaggaa 780 gagaaaggtg agaaagaaga ggaagataaa gatgatgaag aaaaacccaa gatcgaagat 840 gtgggttcag atgaggagga tgacagcggt aaggataaga agaagaaaac taagaagatc 900 aaagagaaat acattgatca ggaagaacta aacaagacca agcctatttg gaccagaaac 960 cctgatgaca tcacccaaga ggagtatgga gaattctaca agagcctcac taatgactgg 1020 gaagaccact tggcagtcaa gcacttttct gtagaaggtc agttggaatt cagggcattg 1080 ctatttattc ctcgtcgggc tccctttgac ctttttgaga acaagaagaa aaagaacaac 1140 atcaaactct atgtccgccg tgtgttcatc atggacagct gtgatgagtt gataccagag 1200 tatctcaatt ttatccgtgg tgtggttgac tctgaggatc tgcccctgaa catctcccga 1260 gaaatgctcc agcagagcaa aatcttgaaa gtcattcgca aaaacattgt taagaagtgc 1320 cttgagctct tctctgagct ggcagaagac aaggagaatt acaagaaatt ctatgaggca 1380 ttctctaaaa atctcaagct tggaatccac gaagactcca ctaaccgccg ccgcctgtct 1440 gagctgctgc gctatcatac ctcccagtct ggagatgaga tgacatctct gtcagagtat 1500 gtttctcgca tgaaggagac acagaagtcc atctattaca tcactggtga gagcaaagag 1560 caggtggcca actcagcttt tgtggagcga gtgcggaaac ggggcttcga ggtggtatat 1620 atgaccgagc ccattgacga gtactgtgtg cagcagctca aggaatttga tgggaagagc 1680 ctggtctcag ttaccaagga gggtctggag ctgcctgagg atgaggagga gaagaagaag 1740 atggaagaga gcaaggcaaa gtttgagaac ctctgcaagc tcatgaaaga aatcttagat 1800 aagaaggttg agaaggtgac aatctccaat agacttgtgt cttcaccttg ctgcattgtg 1860 accagcacct acggctggac agccaatatg gagcggatca tgaaagccca ggcacttcgg 1920 gacaactcca ccatgggcta tatgatggcc aaaaagcacc tggagatcaa ccctgaccac 1980 cccattgtgg agacgctgcg gcagaaggct gaggccgaca agaatgataa ggcagttaag 2040 gacctggtgg tgctgctgtt tgaaaccgcc ctgctatctt ctggcttttc ccttgaggat 2100 ccccagaccc actccaaccg catctatcgc atgatcaagc taggtctagg tattgatgaa 2160 gatgaagtgg cagcagagga acccaatgct gcagttcctg atgagatccc ccctctcgag 2220 ggcgatgagg atgcgtctcg catggaagaa gtcgattagg ttaggagttc atagttggaa 2280 aacttgtgcc cttgtatagt gtccccatgg gctcccactg cagcctcgag tgcccctgtc 2340 ccacctggct ccccctgctg gtgtctagtg tttttttccc tctcctgtcc ttgtgttgaa 2400 ggcagtaaac taagggtgtc aagccccatt ccctctctac tcttgacagc aggattggat 2460 gttgtgtatt gtggtttatt ttattttctt cattttgttc tgaaattaaa gtatgcaaaa 2520 taaagaatat gccgttttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2567 <210> 10 <211> 724 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Pro Glu Glu Val His His Gly Glu Glu Glu Val Glu Thr Phe Ala 1 5 10 15 Phe Gln Ala Glu Ile Ala Gln Leu Met Ser Leu Ile Ile Asn Thr Phe 20 25 30 Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser 35 40 45 Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Asp Pro Ser Lys 50 55 60 Leu Asp Ser Gly Lys Glu Leu Lys Ile Asp Ile Ile Pro Asn Pro Gln 65 70 75 80 Glu Arg Thr Leu Thr Leu Val Asp Thr Gly Ile Gly Met Thr Lys Ala 85 90 95 Asp Leu Ile Asn Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Lys Ala 100 105 110 Phe Met Glu Ala Leu Gln Ala Gly Ala Asp Ile Ser Met Ile Gly Gln 115 120 125 Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Tyr Leu Val Ala Glu Lys Val Val 130 135 140 Val Ile Thr Lys His Asn Asp Asp Glu Gln Tyr Ala Trp Glu Ser Ser 145 150 155 160 Ala Gly Gly Ser Phe Thr Val Arg Ala Asp His Gly Glu Pro Ile Gly 165 170 175 Arg Gly Thr Lys Val Ile Leu His Leu Lys Glu Asp Gln Thr Glu Tyr 180 185 190 Leu Glu Glu Arg Arg Val Lys Glu Val Val Lys Lys His Ser Gln Phe 195 200 205 Ile Gly Tyr Pro Ile Thr Leu Tyr Leu Glu Lys Glu Arg Glu Lys Glu 210 215 220 Ile Ser Asp Asp Glu Ala Glu Glu Glu Lys Gly Glu Lys Glu Glu Glu 225 230 235 240 Asp Lys Asp Asp Glu Glu Lys Pro Lys Ile Glu Asp Val Gly Ser Asp 245 250 255 Glu Glu Asp Asp Ser Gly Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Lys Lys Ile 260 265 270 Lys Glu Lys Tyr Ile Asp Gln Glu Glu Leu Asn Lys Thr Lys Pro Ile 275 280 285 Trp Thr Arg Asn Pro Asp Asp Ile Thr Gln Glu Glu Tyr Gly Glu Phe 290 295 300 Tyr Lys Ser Leu Thr Asn Asp Trp Glu Asp His Leu Ala Val Lys His 305 310 315 320 Phe Ser Val Glu Gly Gln Leu Glu Phe Arg Ala Leu Leu Phe Ile Pro 325 330 335 Arg Arg Ala Pro Phe Asp Leu Phe Glu Asn Lys Lys Lys Lys Asn Asn 340 345 350 Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Met Asp Ser Cys Asp Glu 355 360 365 Leu Ile Pro Glu Tyr Leu Asn Phe Ile Arg Gly Val Val Asp Ser Glu 370 375 380 Asp Leu Pro Leu Asn Ile Ser Arg Glu Met Leu Gln Gln Ser Lys Ile 385 390 395 400 Leu Lys Val Ile Arg Lys Asn Ile Val Lys Lys Cys Leu Glu Leu Phe 405 410 415 Ser Glu Leu Ala Glu Asp Lys Glu Asn Tyr Lys Lys Phe Tyr Glu Ala 420 425 430 Phe Ser Lys Asn Leu Lys Leu Gly Ile His Glu Asp Ser Thr Asn Arg 435 440 445 Arg Arg Leu Ser Glu Leu Leu Arg Tyr His Thr Ser Gln Ser Gly Asp 450 455 460 Glu Met Thr Ser Leu Ser Glu Tyr Val Ser Arg Met Lys Glu Thr Gln 465 470 475 480 Lys Ser Ile Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ser Lys Glu Gln Val Ala Asn 485 490 495 Ser Ala Phe Val Glu Arg Val Arg Lys Arg Gly Phe Glu Val Val Tyr 500 505 510 Met Thr Glu Pro Ile Asp Glu Tyr Cys Val Gln Gln Leu Lys Glu Phe 515 520 525 Asp Gly Lys Ser Leu Val Ser Val Thr Lys Glu Gly Leu Glu Leu Pro 530 535 540 Glu Asp Glu Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Glu Ser Lys Ala Lys Phe 545 550 555 560 Glu Asn Leu Cys Lys Leu Met Lys Glu Ile Leu Asp Lys Lys Val Glu 565 570 575 Lys Val Thr Ile Ser Asn Arg Leu Val Ser Ser Pro Cys Cys Ile Val 580 585 590 Thr Ser Thr Tyr Gly Trp Thr Ala Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala 595 600 605 Gln Ala Leu Arg Asp Asn Ser Thr Met Gly Tyr Met Met Ala Lys Lys 610 615 620 His Leu Glu Ile Asn Pro Asp His Pro Ile Val Glu Thr Leu Arg Gln 625 630 635 640 Lys Ala Glu Ala Asp Lys Asn Asp Lys Ala Val Lys Asp Leu Val Val 645 650 655 Leu Leu Phe Glu Thr Ala Leu Leu Ser Ser Gly Phe Ser Leu Glu Asp 660 665 670 Pro Gln Thr His Ser Asn Arg Ile Tyr Arg Met Ile Lys Leu Gly Leu 675 680 685 Gly Ile Asp Glu Asp Glu Val Ala Ala Glu Glu Pro Asn Ala Ala Val 690 695 700 Pro Asp Glu Ile Pro Pro Leu Glu Gly Asp Glu Asp Ala Ser Arg Met 705 710 715 720 Glu Glu Val Asp

Claims (51)

  1. 대상에서 대사 증후군을 치료하는 방법으로서, 상기 대상에 HSP90 조절제를 투여하는 것과, 이로써 상기 대상에서 상기 대사 증후군을 치료하는 것을 포함하는 대사 증후군 치료 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 HSP90 조절제는 HSP90 저해제인 것을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 HSP90 저해제는 Hsp90β의 저해제임을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 HSP90 저해제는 Hsp90β의 특이적 저해제임을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 HSP90 저해제는 HSP90α의 저해제임을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 타입 2 당뇨병을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  7. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 타입 1 당뇨병을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 인슐린 저항성을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  9. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 인슐린 부족을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 비만을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  11. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 고인슐린혈증 을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  12. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 손상된 글루코오스 내성 (IGT)을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    대사 증후군이 있는 대상이 셋 또는 그 이상의 이하의 징후들을 나타냄을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법:
    a) 130/85mMHg 이상의 혈압;
    b) 100mg/dL 이상의 공복 혈당;
    c) 큰 허리 둘레, 여기서 큰 허리 둘레는 남성의 경우 40 인치 또는 그 이상이며 여성의 경우 35 인치 또는 그 이상임;
    d) 낮은 HDL 콜레스테롤, 여기서 낮은 LDH 콜레스테롤은 남성의 경우 40mg/dL 보다 작으며 그리고 50mg/dL 보다 작음; 그리고
    e) 150mg/dL 이상의 트리글리세라이드들.
  14. 제 2항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HSP90 저해제는 핵산 저해제를 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 핵산 저해제는 안티센스 핵산 분자를 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 핵산 저해제는 이중 가닥 핵산 분자를 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 핵산 저해제는 siRNA, shRNA, 그리고 다이서 기질 siRNA (DsiRNA) 로 구성된 그룹으로부터 선택되는 이중 가닥 RNA를 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  18. 제 2항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HSP90 저해제는 항체를 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  19. 제 2항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HSP90 저해제는 소분자를 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 소분자는 로니다민(lonidamine) 또는 그의 유사체, 세라스트롤(celastrol) 또는 그의 유사체, 게두닌(gedunin) 또는 그의 유사체, 그리고 쿠머마이신(coumermycin) 또는 그의 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 대상에서 혈당 수준을 정상화하는 것을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  22. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 대상에서 Hb1Ac 수준을 정상화하는 것을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  23. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 불량한 순환과 연관된 당뇨병의 하나 이상의 합병증의 예방을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  24. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 타입 2 당뇨병의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  25. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 타입 1 당뇨병의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  26. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 인슐린 저항성의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  27. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 인슐린 부족의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  28. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 고인슐린혈증의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  29. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 손상된 글루코오스 내성 (IGT)의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  30. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 비만의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 이하의 하나 이상의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법:
    a) 130/85mMHg 이상의 혈압;
    b) 100mg/dL 이상의 공복 혈당;
    c) 큰 허리 둘레, 여기서 큰 허리 둘레는 남성의 경우 40 인치 또는 그 이상이며 여성의 경우 35 인치 또는 그 이상임;
    d) 낮은 HDL 콜레스테롤, 여기서 낮은 LDH 콜레스테롤은 남성의 경우 40mg/dL 보다 작으며 그리고 50mg/dL 보다 작음; 그리고
    e) 150mg/dL 이상의 트리글리세라이드들.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 130/85mMHg 이상의 상승된 혈압의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  33. 제 31항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 100mg/dL 이상의 상승된 공복 혈당의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  34. 제 31항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 큰 허리 둘레, 여기서 큰 허리 둘레는 남성의 경우 40 인치 또는 그 이상이며 여성의 경우 35 인치 또는 그 이상임, 의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  35. 제 31항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 HDL 콜레스테롤을 증가시킴으로써 낮은 HDL 콜레스테롤, 여기서 낮은 LDH 콜레스테롤은 남성의 경우 40mg/dL 보다 작으며 그리고 50mg/dL 보다 작음, 의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  36. 제 31항에 있어서,
    상기 대사 증후군을 치료하는 것은 150mg/dL 이상의 상승된 트리글리세라이드들의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서,
    대사 증후군을 치료하는 것은 지방간의 개선을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  38. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서,
    대사 증후군 치료하는 것은 지방 침착의 조절을 포함함을 특징으로 하는 대사 증후군 치료 방법.
  39. 다음을 포함하는, 대상에서 대사 증후군을 진단하는 방법:
    a) 상기 대상으로부터의 샘플에서 Hsp90β 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 그리고
    b) 상기 대상으로부터의 샘플에서 Hsp90β 발현의 수준 또는 활성을 대조군 샘플에 비교하는 단계, 여기서 상기 샘플 대상에서 대조군 샘플에 비하여 Hsp90β의 증가된 발현 또는 활성은 상기 대상에서 대사 장애를 나타냄.
  40. 다음을 포함하는 대상에서 대사 증후군을 모니터링하는 방법:
    a) 상기 대상으로부터 제 1 시점에서 그리고 제 2 시점에서 샘플을 얻는 단계;
    b) 상기 제 1 시점에서 그리고 상기 제 2 시점에서 Hsp90β 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 그리고
    c) 상기 제 1 시점에서의 Hsp90β 발현의 수준 또는 활성을 상기 제 2 시점에서의 Hsp90β 발현의 수준 또는 활성에 비교하는 단계, 여기서 제 1 시점에 비하여 상기 제 2 시점에서의 Hsp90β 발현의 수준 또는 활성의 변화는 상기 대상에서 대사 증후군의 변화를 나타냄.
  41. 제 39항 또는 제 40항에 있어서,
    Hsp90β 발현의 수준은 Hsp90β 단백질 또는 HSP90AB1 유전자의 발현 수준을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40항에 있어서,
    Hsp90β 발현 또는 활성의 증가는 대사 증후군의 악화를 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 40항에 있어서,
    Hsp90β 발현 또는 활성의 감소는 대사 증후군의 개선을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 39항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 타입 2 당뇨병을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 39항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 타입 1 당뇨병을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 39항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 타입 인슐린 저항성을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 39항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 인슐린 부족을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 39항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 비만을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 39항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 고인슐린혈증을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 39항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군은 손상된 글루코오스 내성 (IGT)을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 39항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대사 증후군이 있는 대상은 이하의 징후들의 하나 또는 그 이상을 더 나타냄을 특징으로 하는 방법:
    a) 130/85mMHg 이상의 혈압;
    b) 100mg/dL 이상의 공복 혈당;
    c) 큰 허리 둘레, 여기서 큰 허리 둘레는 남성의 경우 40 인치 또는 그 이상이며 여성의 경우 35 인치 또는 그 이상임;
    d) 낮은 HDL 콜레스테롤, 여기서 낮은 LDH 콜레스테롤은 남성의 경우 40mg/dL 보다 작으며 그리고 50mg/dL 보다 작음; 그리고
    e) 150mg/dL 이상의 트리글리세라이드들.
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