CN102772399A - 藤黄酸作为5`-amp激活的蛋白激酶激动剂的用途 - Google Patents
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Abstract
藤黄酸作为5`-AMP激活的蛋白激酶激动剂的用途，涉及一种蒽酮类化合物藤黄酸。所述5`-AMP激活的蛋白激酶激动剂是一种新型的蒽酮类AMPK激动剂，可用于各种因代谢异常引起的疾病的治疗。藤黄酸为：(z)-甲基-3-戊烯基)-;1,5-二亚甲基-1,3,11-三氢-呋喃并(3,4-g)吡喃并(3,2-b)蒽酮-1-巴豆酸。藤黄酸为金黄色结晶，旋光度-685°(甲醇)，不易溶于水，在甲醇等有机溶剂中有较好的溶解性。藤黄酸与AMPK具有较强的结合作用，二者的解离常数约为10-6M，且对AMPK及其下游蛋白质乙酰辅酶A羧化酶均具有激活作用，因此藤黄酸可作为5`-AMP激活的蛋白激酶激动剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种蒽酮类化合物藤黄酸，尤其是涉及一种藤黄酸作为5`-AMP激活的蛋白激酶激动剂的用途。
背景技术
5`-AMP激活的蛋白激酶（5'AMP-activated protein kinase,AMPK）是一种苏氨酸/丝氨酸激酶，被称为“细胞能量代谢的主要调节器”。细胞能量代谢失衡，会引起代谢综合征等多种疾病，严重影响人类的健康。作为能量代谢过程中重要的调节酶，AMPK可以作为代谢综合征的治疗靶点。AMPK由具有催化作用的α亚基（63KD），调节作用的β亚基（30KD）和γ亚基（37~63KD）形成的异源三聚体。
迄今为止，已经发现了AMPK的一些小分子激动剂，如metformin、AICAR、噻唑等，其中的metformin和噻唑已经广泛应用于Ⅱ型糖尿病的治疗。然而，现有的药物存在着特异性差、用量大等缺点。寻找高效、低毒和特异性强的AMPK小分子激动剂，已成为发现新型代谢综合征治疗药物的重要研发方向。
藤黄酸是20世纪60年代从中药藤黄中分离到的蒽酮类化合物(Ollis,W.D.,M.V.J.Ramsay，et al.(1965)."The constitution of gambogic acid."Tetrahedron 21(6):1453-1470)。
迄今为止尚未见有关于藤黄酸作为AMPK激动剂及其与之相关用途的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种藤黄酸作为5`-AMP激活的蛋白激酶激动剂的用途。
所述5`-AMP激活的蛋白激酶激动剂是一种新型的蒽酮类AMPK激动剂，可用于各种因代谢异常引起的疾病（如代谢综合症等）的治疗。
所述藤黄酸（Gambogic acid，简称GB）为：(z)-甲基-3-戊烯基)-;1,5-二亚甲基-1,3,11-三氢-呋喃并(3,4-g)吡喃并(3,2-b)蒽酮-1-巴豆酸，其分子式为C38H44O8，其结构式为：
藤黄酸（GB）为金黄色结晶，旋光度-685°(甲醇)，不易溶于水，在甲醇等有机溶剂中有较好的溶解性。
实验表明，藤黄酸对AMPK在作用较短的时间内即具有较强的激活作用，是AMPK的激动剂。藤黄酸与AMPK具有较强的结合作用，二者的解离常数约为10-6M，且对AMPK及其下游蛋白质乙酰辅酶A羧化酶（ACC）均具有激活作用，因此藤黄酸可作为5`-AMP激活的蛋白激酶激动剂。
附图说明
图1为藤黄酸与AMPK相互作用的荧光谱图。在图1中，横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度（a.u.）；由图1表明，藤黄酸对AMPK的内源荧光具有较强的猝灭作用，由此曲线计算得出藤黄酸与AMPK的解离常数为6.3μM；藤黄酸从上至下由0μmol/L至20μmol/L变化。
图2为分子相互作用仪（ＦortBio Octet Red）检测藤黄酸与AMPK的结合。在图2中，横坐标为时间（s），纵坐标为光移动距离（nm）；由图2表明，藤黄酸对AMPK具有较强的结合作用，由此曲线计算得出藤黄酸与AMPK的解离常数为6.1μM；显示藤黄酸与AMPK具有较强的结合作用。
图3为藤黄酸对人宫颈癌细胞HeLa中AMPK的激活作用，同时引起其下游底物乙酰辅酶A羧化酶的磷酸化水平升高；图3显示藤黄酸在作用短时间内,引起HeLa细胞AMPK的磷酸化增强,磷酸化的AMPK进一步引起乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的磷酸化增强,从而影响后续的代谢。藤黄酸对HeLa细胞中AMPK的激活作用。
图4为藤黄酸对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中AMPK的激活作用。激活的AMPK进一步活化其下游底物ACC。由图4可见，藤黄酸对AMPK具有较强的激活作用，2μM的作用浓度,引起的AMPK磷酸化水平与1mmol/L的作用浓度相当，由此可以判断藤黄酸是AMPK的激动剂。
图5为藤黄酸对小鼠脂肪细胞3T3L1中AMPK的激活作用,同时引起其下游底物乙酰辅酶A羧化酶的磷酸化水平升高。图5显示藤黄酸在作用短时间内,引起3T3L1细胞AMPK的磷酸化增强,磷酸化的AMPK进一步引起ACC的磷酸化增强,从而影响后续的代谢。藤黄酸对3T3L1细胞中AMPK具有较强的激活作用。
图6为藤黄酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-435中AMPK的激活作用。激活的AMPK进一步活化其下游底物ACC。图6显示藤黄酸在作用短时间内,纳摩尔的浓度即引起MDA-MB-435细胞AMPK的磷酸化增强,磷酸化的AMPK进一步引起ACC的磷酸化增强,从而影响后续的代谢。藤黄酸对MDA-MB-435细胞中AMPK具有较强的激活作用,即藤黄酸是AMPK的激动剂。
图7为藤黄酸对人肝癌细胞HepG2中AMPK的激活作用。激活的AMPK进一步活化其下游底物ACC。图7显示藤黄酸在作用短时间内,引起HepG2细胞AMPK的磷酸化增强,磷酸化的AMPK进一步引起ACC的磷酸化增强,从而影响后续的代谢。藤黄酸对HepG2细胞中AMPK的激活作用。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步阐述本发明，但这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1、荧光光谱法检测藤黄酸与AMPK的结合
在该实施例中，使用荧光光谱法检测藤黄酸与AMPK的结合作用。
试验方法
使用大肠杆菌异源表达AMPK融合蛋白，蛋白溶于PBS(pH 7.4)中。实验前先将AMPK用PBS(pH 7.4)稀释至1μM，取2mL至荧光比色皿并置于荧光分光光度计中，实验在303K温度下进行。藤黄酸溶于DMSO中，浓度为10mM。实验采取滴加的方式增加体系中藤黄酸的含量，每次加入后都要充分混匀，待体系稳定后重复测定3次。藤黄酸的浓度变化分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μM。
仪器参数设置：激发波长为280nm，激发及发射狭缝宽度均为5nm，扫描速度为快速扫描（间隔2nm/次），记录290-500nm的荧光光谱。
试验结果
藤黄酸对AMPK的内源荧光具有较强的猝灭作用（图1），表明AMPK与藤黄酸间形成了静态复合物。经计算得出二者的解离常数为6.3μM。
实施例2、分子相互作用仪（ForteBio Octet Red）实验证明藤黄酸与AMPK的结合
在该实施例中，采用分子相互作用法验证藤黄酸与AMPK的结合。
试验方法
使用大肠杆菌异源表达AMPK融合蛋白，将AMPK蛋白用生物素(biotin，B)进行标记，利用B与(streptavidin，SA)特异性的结合将目的蛋白固定在SA-biosenser上。标记后的蛋白B-AMPK过脱盐柱将未结合的B截留，并收集B-AMPK浓缩至10μM于-80℃贮藏。实验中AMPK蛋白浓度为0.7μM，藤黄酸浓度分别为1、2、4、5μM，结合与解离的时间均为10min，实验温度为303K。
试验结果
在图2中，藤黄酸与AMPK的结合（左侧）及解离曲线（右侧）以及由此计算得出的解离常数(6.1μM),表明Hsp90与藤黄酸有较强的结合。
实施例3、藤黄酸对AMPK的激活作用
在该实施例中，采用蛋白质印迹法（Western Blot）检测藤黄酸对各细胞中AMPK及其磷酸化蛋白质以及ACC等的表达。
试验方法
分别用0.2、0.5、1、3μM的藤黄酸处理HeLa等细胞24h，GA作为阳性对照，等量DMSO作为阴性对照。吸去培养液，用PBS漂洗一次，加入细胞裂解液，4℃裂解5min左右，快速刮取细胞置于1.5mL离心管中。冰浴超声裂解细胞10次，每次1s，得到的细胞裂解液于4℃，13500rpm离心15min。取上清，测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度一致，加入2×sample buffer（样品缓冲液）混匀，100℃水浴10min，进行SDS-PAGE电泳。再100V电泳转膜1h到预先用甲醇浸润过的硝酸纤维素(PVDF)膜上。5%BSA室温封闭1h，一抗(体积比1：1000稀释)室温孵育2h，TBST洗涤3次，每次10min。二抗(体积比1：5000稀释)室温孵育1h，TBST洗涤后的PVDF膜用增强型化学发光剂(ECL)溶液浸润，显影观察。
试验结果如下：
不同浓度的藤黄酸处理HeLa等细胞1h后，Western blot检测AMPK、磷酸化AMPK以及ACC和磷酸化的ACC等相关蛋白的表达水平，结果发现AMPK的表达水平在短时间的GB作用后基本不变，而p-AMPK的水平上调；同时p-ACC的表达量上调（图3～7），比阳性对照AICAR的作用要强，表明藤黄酸在细胞水平上，亦对AMPK具有较强的激活作用。
Claims (4)
1.藤黄酸作为5`-AMP激活的蛋白激酶激动剂的用途，所述藤黄酸为：(z)-甲基-3-戊烯基)-;1,5-二亚甲基-1,3,11-三氢-呋喃并(3,4-g)吡喃并(3,2-b)蒽酮-1-巴豆酸，其分子式为C38H44O8，其结构式为：
2.如权利要求1所述5`-AMP激活的蛋白激酶激动剂为蒽酮类AMPK激动剂。
3.如权利要求1所述5`-AMP激活的蛋白激酶激动剂用于各种因代谢异常引起的疾病。
4.如权利要求3所述因代谢异常引起的疾病为代谢综合症。
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Non-Patent Citations (3)
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