CN102924590B - 一种适用于柠檬黄的人工抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种适用于柠檬黄的人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。本发明以丁二酸单乙酯酰氯和2,2-二甲基-1,2-二噁烷-4,6-二酮为原料，经过4步化学反应，制得柠檬黄的衍生物TAR；并以该没含有磺酸基团的柠檬黄衍生物TAR为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白BSA或OVA偶联，制备柠檬黄的人工抗原，用分光光度法测定偶联物的偶联比，并免疫产生针对柠檬黄的特异性抗体，同时建立酶联免疫检测方法。本发明成功合成了柠檬黄的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的柠檬黄人工抗原，可以满足国内对柠檬黄研究的需要。
Description
技术领域
一种适用于柠檬黄的人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
柠檬黄，英文名： Tartrazine，Acid Yellow 23；化学名也叫酒石黄，肼黄，C.I.酸性黄23；CAS号：1934-21-0；分子式是C16H9N4Na3O9S2。柠檬黄色素(Tar)是目前我国批准使用的六种食用合成色素之一，其分子结构为偶氮化合物，在体内代谢的产物对人体具有潜在危害—芳香类化合物。因此，我国对在食品中添加柠檬黄色素有严格限制。凡是肉类及其加工品，鱼类及其加工品等都不能使用人工合成色素，即使在适用的品种和范围内，使用剂量也有严格规定，决不允许过量使用。但实际上，我国食品中普遍存在柠檬黄色素的超标、超范围使用现象屡禁不止。如果人们长期或一次性大量食用柠檬黄含量超标的食品，可能会引起过敏、腹泻等症状，当摄入量过大，超过肝脏负荷时会在体内蓄积，对肾脏、肝脏产生一定伤害。目前，柠檬黄检测采取的方法是薄层分析及分光光度计法。近年来，我国科研工作者在柠檬黄检测方面做了大量的工作，但都主要集中在理化检测方面，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行。这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。近年来，国内外已经开展了对色素类免疫分析方法的研究，但国内外尚比较少发展出针对柠檬黄的酶联免疫检测方法，为了更好地检测柠檬黄，有必要制备开发出能针对柠檬黄更高灵敏度和更好特异性抗体的柠檬黄人工抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于柠檬黄的人工抗原的制备方法。所制备的产品用于柠檬黄的免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。
本发明的技术方案：一种适用于柠檬黄的人工抗原的制备方法，以丁二酸单乙酯酰氯和2,2-二甲基-1,2-二噁烷-4,6-二酮为原料，经过4步化学反应，制得柠檬黄衍生物TAR，以TAR为半抗原用活性酯法将其与载体蛋白BSA或OVA偶联，制备柠檬黄的人工抗原，从而免疫产生针对柠檬黄的特异性抗体，用于建立酶联免疫检测方法；
（1）柠檬黄衍生物TAR的合成：TAR化学名称为1-苯基-3-丙酸-4-苯偶氮基-5-吡唑啉酮，其化学结构和合成路线如下：
以丁二酸单乙酯酰氯 和2,2-二甲基-1,2-二噁烷-4,6-二酮为原料，经过4步化学反应，制得柠檬黄的衍生物TAR，其化学合成步骤如下：
取丁二酸单乙酯酰氯（11.4g，69.59mmol）溶于二氯甲烷溶液中，然后将其在1h内逐滴加入搅拌中的由液氮控温在0-3℃条件下的2,2-二甲基-1,2-二噁烷-4,6-二酮（8.98g，62.33mmol）即米氏酸（Meldrum酸）溶液中，然后继续搅拌反应1h。反应混合物纯化浓缩即得3-酮己二酸二乙酯（13.4g，88%）。
将3-酮己二酸二乙酯（13.4g，61.98 mmol）溶解于200mL纯乙醇溶液中，然后在室温条件下将（10.755g，74.38 mmol）的盐酸苯肼分批加入至该溶液中。反应物在室温下搅拌反应16 h，并纯化获得1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸乙酯（6g，37%）。
将1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸乙酯溶于50mL甲醇和50mL四氢呋喃THF中，在室温下加入LiOH（1.147g，27.34mmol）的水（10mL）溶液中，搅拌反应过夜，并纯化获得1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸（3g， 56%）。
将苯胺（2g，21.47mmol）的盐酸溶液在冰浴中冷却至5℃，然后加入5mL 的冷冻NaNO2 （1.778 g, 25.77 mmol）冷冻水溶液，并搅拌反应1h，得到重氮盐溶液。将NaHCO3 (387 mg，4.61 mmol) 和 Na2CO3 (4 g，37.73 mmol)加入到搅拌中的1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸（1.5 g，6.45 mmol）的甲醇溶液中，并继续搅拌至1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸完全溶解。将上述预先制备好的重氮盐溶液在0-10℃条件下滴加到1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸溶液中，并继续搅拌反应12h，并纯化得目标物1-苯基-3-丙酸-4-苯偶氮基-5-吡唑啉酮，即柠檬黄类似物TAR（0.7g，32%）。
（2）柠檬黄人工抗原的制备
取0.5mL的含有0.1mmol柠檬黄衍生物TAR的N,N-二甲基甲酰胺DMF水溶液，加入0.15mmol碳化二亚胺EDC和0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温避光反应3h，为A液。将0. 0025mmol 牛血清蛋白BSA或鸡卵清白蛋白OVA溶解到3mL的0.01M、pH7.4的磷酸盐PBS缓冲液中，为B液。然后将A液缓慢滴加到B液中，室温反应6h，离心去掉沉淀，取上清液即得柠檬黄人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将柠檬黄人工抗原混合液移入透析袋中，用2L的0.01M的PBS缓冲液透析2次，再用2L的去离子水透析2次，合计透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到柠檬黄人工抗原。
（3）柠檬黄人工抗原的鉴定
偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度．在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制柠檬黄浓度为0，10，20，30 μg·mL-1的0.01M的PBS溶液，通过紫外扫描可知柠檬黄的最大吸收波长为427nm，在427nm处测吸光值，每个浓度做平行样．摩尔吸光系数计算为：ε=吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，10，20，40，60，80，100 μg·ml-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5min，每个浓度做平行样．在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。
偶联比测定：配制150 μg·ml-1牛血清蛋白的纯水溶液，将偶联产物用纯水稀释到150 μg·mL-1，在427nm处测吸光值，以纯水为空白，偶联产物测出的吸光值为A1，牛血清蛋白测出的吸光值为A2，则偶联比率r为：
r＝[(A1-A2)/ε]/(150×10-3/66200)，其中ε为摩尔吸光系数（L·mol-1），66200为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度（μg·mL-1）。
本发明的有益效果：本发明合成了柠檬黄的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图1 柠檬黄人工抗原的紫外扫描图。
图2利用间接ELISA方法测得的柠檬黄的标准抑制曲线。
具体实施方法
实施例1 适用于柠檬黄的人工抗原的制备方法
（1）柠檬黄衍生物的制备
以丁二酸单乙酯酰氯 和2,2-二甲基-1,2-二噁烷-4,6-二酮为原料，经过4步化学反应，制得柠檬黄的衍生物TAR，其化学合成步骤如下：
取丁二酸单乙酯酰氯（11.4g，69.59mmol）溶于二氯甲烷溶液中，然后将其在1h内逐滴加入搅拌中的由液氮控温在0-3℃条件下的2,2-二甲基-1,2-二噁烷-4,6-二酮（8.98g，62.33mmol）即米氏酸（Meldrum酸）溶液中，然后继续搅拌反应1h。反应混合物纯化浓缩即得3-酮己二酸二乙酯（13.4g，88%）。
将3-酮己二酸二乙酯（13.4g，61.98 mmol）溶解于200ml纯乙醇溶液中，然后在室温条件下将（10.755g，74.38 mmol）的盐酸苯肼分批加入至该溶液中。反应物在室温下搅拌反应16 h，并纯化获得1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸乙酯（6g，37%）。
将1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸乙酯溶于50ml甲醇和50mL四氢呋喃THF中，在室温下加入LiOH（1.147g，27.34mmol）的水（10mL）溶液中，搅拌反应过夜，并纯化获得1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸（3g， 56%）。
将苯胺（2g，21.47mmol）的盐酸溶液在冰浴中冷却至5 oC，然后加入5mL 的冷冻NaNO2 （1.778 g, 25.77 mmol）冷冻水溶液，并搅拌反应1h，得到重氮盐溶液。将NaHCO3 (387 mg, 4.61 mmol) 和 Na2CO3 (4 g, 37.73 mmol)加入到搅拌中的1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸（1.5 g, 6.45 mmol）的甲醇溶液中，并继续搅拌至1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸完全溶解。将上述预先制备好的重氮盐溶液在0-10℃条件下滴加入到1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸溶液中，并继续搅拌反应12h，并纯化得目标物1-苯基-3-丙酸-4-苯偶氮基-5-吡唑啉酮即柠檬黄类似物TAR（0.7g，32%）。
（2）人工抗原的制备
取0.5mL的含有0.1mmol柠檬黄衍生物TAR的N,N-二甲基甲酰胺DMF水溶液，加入0.15mmol碳化二亚胺EDC和0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温避光反应3小时，为A液。将0. 0025mmol 牛血清蛋白BSA（或鸡卵清白蛋白OVA）溶解到3mL的0.01M、pH7.4的磷酸盐PBS缓冲液中，为B液。然后将A液缓慢滴加到B液中，室温反应6h，离心去掉沉淀，取上清液即得柠檬黄人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min， 保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的PBS溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到柠檬黄人工抗原。
（3）柠檬黄人工抗原的鉴定
偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度．在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制柠檬黄浓度为0，10，20，30 μg·mL-1的0.01M的PBS溶液，通过紫外扫描可知柠檬黄的最大吸收波长为427nm，在427nm处测吸光值，每个浓度做平行样．摩尔吸光系数计算为：ε=吸光值/摩尔浓度。本实验计算得ε=25649.76 L·mol-1
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，10，20，40，60，80，100μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5 min，每个浓度做平行样．在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为3.35mg·mL-1。
偶联比测定：配制150 μg·mL-1牛血清蛋白的纯水溶液，将偶联产物用纯水稀释到150 μg·mL-1，在427nm处测吸光值，以纯水为空白，偶联产物测出的吸光值为A1，牛血清蛋白测出的吸光值为A2，则偶联比率r为：
r＝[(A1-A2)/ε]/(150×10-3/66200)，其中ε为摩尔吸光系数（L·mol-1），66200为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度（μg·mL-1）。本实验计算得r≈21。
实施例2 柠檬黄人工抗原的不同兔子抗血清的抗血清效价如表1所示。
表1不同兔子抗血清的抗血清效价
Claims (1)
1.一种适用于柠檬黄的人工抗原的制备方法，其特征在于以丁二酸单乙酯酰氯和2,2-二甲基-1,2-二噁烷-4,6-二酮为原料，经过4步化学反应，制得柠檬黄衍生物TAR，以TAR为半抗原用活性酯法将其与载体蛋白BSA或OVA偶联，制备柠檬黄的人工抗原，从而免疫产生针对柠檬黄的特异性抗体，用于建立酶联免疫检测方法；
（1）柠檬黄衍生物TAR的合成：TAR化学名称为1-苯基-3-丙酸-4-苯偶氮基-5-吡唑啉酮，其化学结构和合成路线如下：
柠檬黄的衍生物TAR，其化学合成步骤如下：
取丁二酸单乙酯酰氯11.4g即69.59mmol溶于二氯甲烷溶液中，然后将其在1h内逐滴加入搅拌中的由液氮控温在0-3℃条件下的2,2-二甲基-1,2-二噁烷-4,6-二酮8.98g即62.33mmol溶液中，然后继续搅拌反应1h，反应混合物纯化浓缩即得3-酮己二酸二乙酯13.4g；
将3-酮己二酸二乙酯13.4g即61.98 mmol溶解于200mL纯乙醇溶液中，然后在室温条件下将10.755g即74.38 mmol的盐酸苯肼分批加入至该溶液中，反应物在室温下搅拌反应16 h，并纯化获得1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸乙酯6g；
1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸的合成：
将1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸乙酯溶于50mL甲醇和50mL四氢呋喃THF中，在室温下加入LiOH1.147g即27.34mmol的10mL水溶液中，搅拌反应过夜，并纯化获得1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸3g；
将苯胺2g即21.47mmol的盐酸溶液在冰浴中冷却至5℃，然后加入5mL 的冷冻NaNO2 1.778 g即25.77 mmol冷冻水溶液，并搅拌反应1h，得到重氮盐溶液，将NaHCO3 387 mg即4.61 mmol 和 Na2CO3 4 g即37.73 mmol加入到搅拌中的1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸1.5 g即6.45 mmol的甲醇溶液中，并继续搅拌至1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸完全溶解；将上述预先制备好的重氮盐溶液在0-10℃条件下滴加到1-苯基-5-吡唑啉酮-3-丙酸溶液中，并继续搅拌反应12h，并纯化得目标物1-苯基-3-丙酸-4-苯偶氮基-5-吡唑啉酮，即柠檬黄类似物TAR 0.7g；
（2）柠檬黄人工抗原的制备
取0.5mL的含有0.1mmol柠檬黄衍生物TAR的N,N-二甲基甲酰胺DMF水溶液，加入0.15mmol碳化二亚胺EDC和0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温避光反应3h，为A液；将0.0025mmol 牛血清白蛋白BSA或鸡卵清白蛋白OVA溶解到3mL的0.01M、pH7.4的磷酸盐PBS缓冲液中，为B液；然后将A液缓慢滴加到B液中，室温反应6h，离心去掉沉淀，取上清液即得柠檬黄人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min， 保存在4℃去离子水中备用；
将柠檬黄人工抗原混合液移入透析袋中，用2L的0.01M的PBS缓冲液透析2次，再用2L的去离子水透析2次，合计透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到柠檬黄人工抗原。
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