CN101585877B - 一种罗丹明b完全抗原的合成方法 - Google Patents

Abstract

一种罗丹明B完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以罗丹明B为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了罗丹明B完全抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。

Description

一种罗丹明B完全抗原的合成方法

技术领域

一种罗丹明B完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

罗丹明B，英文名：Rhodamine B；CAS：81-88-9，分子式C₂₈H₃₁ClN₂O₃；罗丹明B是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料，在溶液中有强烈的荧光，用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业。其为三苯甲烷类碱性染料，具有潜在的致癌和致突变性，我国和欧盟等都不允许在食品中使用。罗丹明B具有脂溶性，被用作调味品(主要是辣椒粉和辣椒油)染色剂。使用了被污染的调味品制作的食品时会造成残留。调味品使用罗丹明B染色时含量较高，甚至直接掺入，可进行现场检测。食品中因其含量较低，需送实验室检测。可能添加的食品类别为调味品。现有的仪器检测法很难实现对罗丹明B进行快速、准确、多残留的检测。目前国内外尚未有理想的针对罗丹明B多残留免疫检测方法的报道。为了弥补这一空白，设计了以罗丹明B自身为半抗原的合成罗丹明B免疫检测的完全抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种罗丹明B完全抗原的合成方法。所制备的产品用于罗丹明B的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案：一种罗丹明B完全抗原的合成方法，以罗丹明B为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；步骤为：

(1)罗丹明B完全抗原的合成：

配制A液：20mg罗丹明B溶于1mL DMF中，全溶后冰浴下加10μL三丁氨混匀后再加10μL氯甲酸异丁酯磁力搅拌1h；

配制B液：40mg BSA溶于3mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，4℃保存备用；

冰浴下将A液逐滴加入B液中，然后置4℃下温孵3h，即得罗丹明B完全抗原混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

透析：将罗丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到罗丹明B完全抗原；

(2)罗丹明B完全抗原的鉴定：罗丹明B完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩尔吸光系数ε，再测定罗丹明B完全抗原的偶联比。

偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100μg·mL^-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。

摩尔吸光系数ε：配制罗丹明B浓度为0，10，20，30μg·mL^-1的20％乙醇溶液，通过紫外扫描可知罗丹明B的最大吸收波长为564nm，在564nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。

偶联比测定：配制150μg·mL^-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物完全抗原用20％乙醇稀释到150μg·mL^-1，在312nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为A1，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比率r为：γ＝[(A₁-A₂)/ε]/(150×10^-3/66200)，其中ε为摩尔吸光系数(L·mol^-1)，66200为牛血清蛋白的分子量，150×10^-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL^-1)。

本发明的有益效果：本发明成功合成了罗丹明B的人工抗原，合成步骤简洁，有效，可完全用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。

附图说明

图1罗丹明B人工抗原制备前后的紫外扫描图。

具体实施方式：

实施例1

(1)罗丹明B完全抗原的制备

配制A液：20mg罗丹明B溶于1mL DMF，全溶后冰浴下加10μL三丁氨混匀后再加10μL氯甲酸异丁酯磁力搅拌1h。

配制B液：40mg BSA溶于3mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，4℃保存备用。

冰浴下将A液逐滴加入B液中，然后置4℃下温孵3h。即得罗丹明B完全抗原混合液。

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

透析：将罗丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH7.4的PBS溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冷冻干燥法将透析袋中的液体制成粉末，即得到罗丹明B完全抗原。

2)罗丹明B人工抗原的鉴定

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100μg·mL^-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为3.28mg·mL^-1。

摩尔吸光系数ε：配制罗丹明B浓度为0，10，20，30μg·mL^-1的20％乙醇溶液，通过紫外扫描可知罗丹明B的最大吸收波长为564nm，在564nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。本实验计算得ε＝7737.3L·mol^-1

偶联比测定：配制150μg·mL^-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物用20％乙醇稀释到150μg·mL^-1，在564nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为A1，偶联产物的吸光值为A2，偶联比率r为：γ＝[(A₁-A₂)/ε]/(150×10^-3/66200)，则偶联比率r为：11.67，其中ε为摩尔吸光系数(L·mol^-1)，66200为牛血清蛋白的分子量，150×10^-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL^-1)。

Claims (1)

1.一种罗丹明B完全抗原的合成方法，其特征是以罗丹明B为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；步骤为：

(1)罗丹明B完全抗原的合成：

配制A液：20mg罗丹明B溶于1mL DMF中，全溶后冰浴下加10μL三丁氨混匀后再加10μL氯甲酸异丁酯磁力搅拌1h；

配制B液：40mg BSA溶于3mL pH7.4的磷酸盐缓冲液中，4℃保存备用；

冰浴下将A液逐滴加入B液中，然后置4℃下温孵3h，即得罗丹明B完全抗原混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

透析：将罗丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到罗丹明B完全抗原；

(2)罗丹明B完全抗原的鉴定：罗丹明B完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩尔吸光系数ε，再测定罗丹明B完全抗原的偶联比。