CN102675454B - 一种4-甲基咪唑完全抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种4-甲基咪唑完全抗原的合成方法。本发明将4-甲基咪唑与有机酸混合后，溶解于溶剂中，有机酸为乙醛酸、丙醛酸、丁醛酸、戊醛酸、己醛酸或对醛基苯甲酸，配成4-甲基咪唑的质量浓度为0.01g/mL~0.5g/mL，且有机酸的质量浓度为0.05g/L~5g/mL的混合溶液，反应得到4-甲基咪唑半抗原；然后在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的活化作用下，使4-甲基咪唑半抗原与蛋白结合，制备4-甲基咪唑完全抗原。本发明成功合成了4-甲基咪唑的人工抗原，合成步骤简洁，有效，可用于食品及药品中4-甲基咪唑的快速检测，并为后续产品的研究、开发及应用提供必需的人工抗原。
Description
技术领域
本发明涉及4-甲基咪唑完全抗原，特别是涉及一种4-甲基咪唑-蛋白（BSA和OVA）的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
4‐甲基咪唑（中文别名为4‐甲基咪唑,4‐甲基甘哑啉,4‐甲基‐1H‐咪唑），英文名4‐Methylimidazole（缩写4‐MeI或4‐MI），是一种含氮杂环化合物，分子式为C4H6N2，是白色至类白色结晶粉末，溶于水和乙醇，有腐蚀性。它是合成多种药物的重要医药中间体，还是生产农用化学品、环氧树脂固化剂染料工业乳化剂金属防腐剂等多种产品的中间体。4‐甲基咪唑是氨（铵）法焦糖色素生产中的副产物，这类色素被广泛应用于酒类、饮料、酱油、醋、酱菜、糕点、咖啡、巧克力、糖果、汤料、糖浆药品等行业。然而，据有关文献报道，4‐甲基咪唑作为一种神经毒素，具有强烈的致惊阙作用，能使动物产生超兴奋状态，对反刍动物有后天性的损害,可以令人发生痉挛；它对雄性小鼠的痉挛致死量为370mg/kg体重；同时，它可以诱发老鼠患肺癌，与雌性小鼠患白血病有一定的关联。鉴于4－甲基咪唑对人体潜在的危害性，世界卫生组织（WHO）对焦糖色素的质量标准做出了规定，焦糖色素中4‐甲基咪唑的含量小于200mg/kg，中国卫生标准GB8817‐88中规定其在焦糖色素内含量不得超过0.02%。因此，通过检测食品药品中的4‐甲基咪唑含量，进而控制其在食品药品中的含量、确保食品药品的安全，具有非常重要的现实意义。
目前，国内外有关4‐甲基咪唑的检测方法主要有：层析法、色谱法、分光光度法。层析法和分光光度法虽然操作简单快捷，但是其不能准确定性定量，准确度较低；色谱法可以非常准确对4‐甲基咪唑进行定性和定量，但是其耗时长，成本高，对被检材料要求较高，并且需要专业技术人员进行操作，费时又费力，已经不能满足现代检测对方便、快速、准确的要求。目前，国内尚无使用免疫快速检测法检测食品药品中4‐甲基咪唑含量的报道，为了弥补这一空 白，为今后人们在免疫检测方面的研究提供材料，设计了4‐甲基咪唑半抗原，在此基础上进一步设计了可用于免疫检测用的4‐甲基咪唑完全抗原。
发明内容
针对现有检测技术的缺点和不足，本发明的目的是提供一种4‐甲基咪唑完全抗原的制备方法，所制备的产品可用于食品药品中4‐甲基咪唑含量的免疫检测，为后续研究、开发及应用提供必需的人工抗原。
本发明是以4‐甲基咪唑为原料，与乙醛酸、丙醛酸、丁醛酸、戊醛酸、己醛酸或对醛基苯甲酸反应得到4‐甲基咪唑半抗原，再以EDC和NHS为活化剂，将4‐甲基咪唑半抗原与蛋白（BSA和OVA）结合在一起，制备4‐甲基咪唑的人工抗原，即4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种4-甲基咪唑完全抗原的合成方法，包括如下步骤：
（1）半抗原的制备：将4‐甲基咪唑与有机酸混合后，溶解于溶剂中，配成4‐甲基咪唑的质量浓度为0.01g/mL～0.5g/mL，且有机酸的质量浓度为0.05g/L～5g/mL的混合溶液，在0℃～70℃条件下反应0.1h～24h，得到4‐甲基咪唑半抗原；所述有机酸为乙醛酸、丙醛酸、丁醛酸、戊醛酸、己醛酸或对醛基苯甲酸；所述溶剂为水、甲醇、乙醇、DMSO或DMF；
（2）半抗原的活化：将4‐甲基咪唑半抗原溶于DMSO或DMF中，得到浓度为0.001～0.5g/mL的4‐甲基咪唑半抗原溶液，在搅拌条件下加入1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺（EDC）和N‐羟基琥珀酰亚胺（NHS），使EDC和NHS在DMSO或DMF溶液中的质量浓度为0.001～0.5g/mL，活化0.1～12h；
（3）偶联蛋白溶液的制备：将牛血清白蛋白（BSA）或卵清白蛋白（OVA）溶解于磷酸盐缓冲液中，配成偶联蛋白浓度为0.001g/mL～0.5g/mL的蛋白溶液；
（4）人工抗原的合成：在搅拌条件下，蛋白溶液加入活化后的半抗原溶液中，在温度为0℃～30℃条件下反应0.5h～12h，得到人工抗原混合液；
（5）透析：将人工抗原混合液转移到能透过分子量为1kDa～100kDa的透析袋中，在搅拌的条件下，使用磷酸盐缓冲液透析1天～8天；透析结束后，干燥，得到固体状的4-甲基咪唑完全抗原。
为进一步实现本发明，步骤（2）所述的EDC与NHS的质量比为5:1～1:5；
步骤（3）和步骤（5）所述的磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01～0.6mol/L， pH为5.0～9.0。
步骤（4）中所述蛋白溶液与半抗原溶液的体积比为1:10～10:1。
步骤（2）、步骤（4）和步骤（5）所述的搅拌为磁力搅拌或电动搅拌。
步骤（5）所述干燥为冷冻干燥或真空干燥。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、产率高：对4‐甲基咪唑进行了分子改造，与乙醛酸、丙醛酸、丁醛酸、戊醛酸、己醛酸或对醛基苯甲酸进行反应得到4‐甲基咪唑半抗原，使4‐甲基咪唑分子增加了一段连接臂，它使4‐甲基咪唑更容易与蛋白结合，从而克服了4‐甲基咪唑与蛋白直接偶联速度慢、效率低的缺点，极大提高了4‐甲基咪唑与蛋白的偶联速度和效率，使4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原的产率提高。
2、稳定性好：对4‐甲基咪唑进行分子改造，增加的一段连接臂末端含有羧酸根（‐COOH），在EDC和NHS的作用下，使得4‐甲基咪唑与蛋白稳定的结合在一起。
3、可用于免疫产生高特异性抗体：对4‐甲基咪唑的进行分子改造，增加了一段连接臂，将4‐甲基咪唑与蛋白（BSA和OVA）结合在一起，能最大程度地将4‐甲基咪唑分子暴露出来，在免疫过程中有利于产生高特异性的抗体，从而开发快速检测4‐甲基咪唑的产品。
附图说明
图1和图2分别为实施例1中4‐甲基咪唑完全抗原制备前、后的紫外扫描图。
图3和图4分别为实施例2中4‐甲基咪唑完全抗原制备前、后的紫外扫描图。
图5和图6分别为实施例3中4‐甲基咪唑完全抗原制备前、后的紫外扫描图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
称取50mg的4‐甲基咪唑溶解于5mL乙醇中，加入250mg对醛基苯甲酸，配制成4‐甲基咪唑质量浓度为0.01g/mL的混合液，在10℃下反应24h，制备4‐甲基咪唑半抗原；
将10mg的4‐甲基咪唑半抗原溶于10mLDMSO，得到浓度为0.001g/mL的4‐ 甲基咪唑半抗原溶液，在搅拌条件加入20mgEDC和4mgNHS，活化0.5h;
将1mg的蛋白（BSA或OVA）溶解于1mL，浓度为0.2mol/L，pH为7.0的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L的磷酸二氢钠与0.2mol/L的磷酸氢二钠水溶液按体积比61:39配置）中，配制成蛋白质量浓度为0.001g/mL的蛋白溶液，置于4℃冰箱中保存；
在磁力搅拌器的搅拌的情况下，将蛋白溶液滴加到活化好的4‐甲基咪唑半抗原溶液中，使两者充分反应，在30℃下反应2h，反应完成后，即得到人工抗原混合液；
将人工抗原混合液装入能透过分子量为90kDa的透析袋中，用浓度为0.01mol/L，pH为7.0的磷酸盐缓冲液（0.01mol/L的磷酸二氢钠与0.01mol/L的磷酸氢二钠水溶液按体积比61:39配置）透析1天，每隔3h更换一次磷酸盐缓冲液；透析结束后，将人工抗原混合液进行冷冻干燥，即得到人工抗原：4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白。
4‐甲基咪唑人工抗原的鉴定：采用紫外分光光度计测定其紫外扫描图谱。本实施例中4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原制备前后的紫外扫描图分别如附图1、附图2所示。从图1中可以看出牛血清白蛋白的最大吸收波长为278nm，4‐甲基咪唑半抗原的最大吸收波长为282nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原的最大吸收波长为284nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原与牛血清白蛋白的最大吸收波长不同，认为这是半抗原偶联到蛋白上的结果，即说明4‐甲基咪唑半抗原已经成功偶联到蛋白上，成功得到4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原；从图2中看出卵清白蛋白的最大吸收波长为279nm，4‐甲基咪唑半抗原的最大吸收波长为282nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原的最大吸收波长为284nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原与卵清白蛋白的最大吸收波长不同，说明4‐甲基咪唑半抗原已经成功偶联到卵清白蛋白上，成功得到4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白抗原。
产率的计算：产率是评价一个反应合成效率的一个重要的指标，产率高说明此化学反应合成效率高，反之则称合成效率低。产率=实际得到的产物的质量（g）×100%/理论上产物的质量（g）。经检测，本实施例计算得4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白产率为81.5%，4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白为80.1%，说明本法合成4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原的效率较高。
稳定性试验：将本法制备的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原溶液置于4℃冰箱中3个月，观察其是否出现沉淀或絮状物。3个月后，观察其溶液状态，依然为澄清的溶液，说明本法合成的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原具有很好的稳定性。
特异性试验：将本法制备的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白完全抗原溶液溶于生理盐水（0.9%的氯化钠溶液），使抗原浓度为1mg/mL。吸取配好的抗原溶液100μL，加入200μL不完全弗氏佐剂，充分乳化10min。将乳化好的混合液注射Balb/c小鼠，皮下多点注射，剂量为200μL。一个星期后，用同样的方法对Balb/c小鼠加强免疫（此次免疫用完全佐剂替换不完全弗氏佐剂），免疫3天后对小鼠进行尾部取血，用酶联免疫（ELISA）的方法测定其交叉率。具体步骤如下：
（1）包被：将4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原溶解于碳酸盐缓冲溶液（PH9.6,0.05M）中,使抗原浓度为1μg/mL，往96孔板各孔加入100μL抗原溶液，于4℃冰箱过夜，然后在自动洗板机上洗涤3次，甩干。
（2）封闭：往100mL PBS溶液（pH7.4，0.015M）中加入0.05mL Tween‐20试剂和3g BSA，搅拌使其充分混匀，配制成封闭液。往96孔板中加入200μL封闭液，于37℃培养箱中封闭2h，自动洗板机上洗涤3次，甩干。
（3）加样：用PBS溶液（pH7.4，0.015M）将小鼠血清稀释1000倍，得到血清稀释液；将咪唑、2‐乙基咪唑、4‐羟甲基咪唑和2‐乙基‐4‐甲基咪唑溶解于PBS溶液（pH7.4，0.015M）中，使咪唑、2‐乙基咪唑、4‐羟甲基咪唑和2‐乙基‐4‐甲基咪唑溶液的浓度为8μg/mL；往96孔板第一列的A加入50μL PBS溶液（pH7.4，0.015M），往第一列B、C、D、E孔分别加入50μL咪唑、2‐乙基咪唑、4‐羟甲基咪唑和2‐乙基‐4‐甲基咪唑溶液。然后再往第一列的A、B、C、D、E孔加入50μL血清稀释液，于37℃培养箱中反应1h。自动洗板机上洗涤3次，甩干。
（4）加酶标二抗：用PBS溶液（pH7.4，0.015M）将羊抗鼠IgG‐HRP进行1/20000稀释，往（3）中的各孔加入100μL，37℃培养箱中反应30min。自动洗板机上洗涤3次，甩干。
（5）显色：往（4）中各孔加入显色液100μL，37℃培养箱中反应10min，然后加入10%的硫酸溶液（2mol/L）50μL，终止反应。
（6）检测：酶联免疫检测仪测定各孔A450nm的吸光值。A、B、C、D、E 各孔测定结果分别为：2.8，2.73，2.78，2.66，2.71。
抗原的特异性一般用抗血清的交叉反应率来表示，抗血清与半抗原结构类似物的交叉反应率越低，则说明此抗原免疫的特异性越高。根据测定结果，0药物浓度孔的吸收值记为CR0，其他各浓度药物孔的吸光值记为CR，交叉反应率=(CR0‐CR)×100%/CR0。经过计算得到，本实例抗血清与各药物的交叉反应率均小于5%，说明了本实例制得的抗原用于免疫时产生的抗体特异性非常高。
本实施例制备的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原不仅产率高，稳定性好，而且用于免疫时可产生高特异性抗体，故可用于食品及药品中4‐甲基咪唑含量的快速免疫检测，具有很好的应用前景。
实施例2
称取400mg的4‐甲基咪唑溶解于5mL甲醇中，加入2g乙醛酸，配制成4‐甲基咪唑质量浓度为0.08g/mL的混合液，在30℃下反应12h，制备4‐甲基咪唑半抗原；
将50mg的4‐甲基咪唑半抗原溶于5mlDMF中，得到浓度为0.01g/mL的4‐甲基咪唑半抗原溶液，在搅拌条件加入50mgEDC和50mgNHS，活化6h;
将30mg的蛋白（BSA或OVA）溶解于3mL，浓度为0.2mol/L，pH为6.0的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L的磷酸二氢钠与0.2mol/L的磷酸氢二钠水溶液按体积比12.3:87.7配置）中，配制成蛋白质量浓度为0.01g/ml的蛋白溶液，放置于4℃冰箱中保存；
在磁力搅拌器的搅拌的情况下，将蛋白溶液滴加到活化好的4‐甲基咪唑半抗原溶液中，使两者充分反应，在0℃下反应6h，反应完成后，即得到人工抗原混合液；
将人工抗原混合液装入能透过分子量为14kDa的透析袋中，用浓度为0.2mol/L，pH为6.0的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L的磷酸二氢钠与0.2mol/L的磷酸氢二钠水溶液按体积比12.3:87.7配置）透析8天，每隔6h更换一次磷酸盐缓冲液；透析结束后，将人工抗原混合液进行冷冻干燥，即得到人工抗原：4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白产品。
4‐甲基咪唑人工抗原的鉴定：采用紫外分光光度计测定其紫外扫描图谱。本实施例中4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原制备前后的紫外扫描图分别如附图3、附图4所示。从图3中可以看出牛血清白蛋白 的最大吸收波长为278nm，4‐甲基咪唑半抗原的最大吸收波长为281nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原的最大吸收波长为283nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原与牛血清白蛋白的最大吸收波长不同，说明4‐甲基咪唑半抗原已经成功偶联到蛋白上，成功得到4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原；从图4中看出卵清白蛋白的最大吸收波长为279nm，4‐甲基咪唑半抗原的最大吸收波长为281nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原的最大吸收波长为280nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原与卵清白蛋白的最大吸收波长不同，说明4‐甲基咪唑半抗原已经成功偶联到卵清白蛋白上，成功得到4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白抗原。
本实施例计算得4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白人工抗原的产率为83.6%，4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白人工抗原的产率为82.5%。采用实施例1中测定抗原稳定性的方法，对本实施例中的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白人工抗原和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白人工抗原进行稳定性检测，结果表明，4摄氏度条件下静置3个月的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白人工抗原和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白人工抗原溶液无浑浊。说明本实施例合成的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原具有很好的稳定性；采用实施例1的方法测定抗原的交叉反应率，结果得到抗血清与各药物的交叉反应率均小于5%，说明了本实例制得的抗原用于免疫时产生的抗体特异性非常高。
实施例3
称取2.0g的4‐甲基咪唑溶解于5mLDMSO中，加入10g对醛基苯甲酸，配制成4‐甲基咪唑质量浓度为0.4g/mL的混合液，在60℃下反应1h，制备4‐甲基咪唑半抗原；
将0.5g的4‐甲基咪唑半抗原溶于1mlDMSO中，得到浓度为0.5g/mL的4‐甲基咪唑半抗原溶液，在搅拌条件加入0.4gEDC和2gNHS，活化12h;
将5g的蛋白（BSA或OVA）溶解于10mL，浓度为0.5mol/L，pH为8.0的磷酸盐缓冲液（0.5mol/L的磷酸二氢钠与0.5mol/L的磷酸氢二钠水溶液按体积比94.7:5.3配置）中，配制成蛋白质量浓度为0.5g/ml的蛋白溶液，放置于4℃冰箱中保存；
在磁力搅拌器的搅拌的情况下，将蛋白溶液滴加到活化好的4‐甲基咪唑半抗原溶液中，使两者充分反应，在10℃下反应12h，反应完成后，即得到人工抗原混合液；
将人工抗原混合液装入能透过分子量为80kDa的透析袋中，用浓度为0.2mol/L，pH为6.0的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L的磷酸二氢钠与0.2mol/L的磷酸氢二钠水溶液按体积比12.3:87.7配置）透析3天，每隔6h更换一次磷酸盐缓冲液；透析结束后，将人工抗原混合液进行冷冻干燥，即得到人工抗原：4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白产品。
4‐甲基咪唑人工抗原的鉴定：采用紫外分光光度计测定其紫外扫描图谱。本实施例中4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原制备前后的紫外扫描图分别如附图1、附图2所示。从图1中可以看出牛血清白蛋白的最大吸收波长为278nm，4‐甲基咪唑半抗原的最大吸收波长为282nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原的最大吸收波长为284nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原与牛血清白蛋白的最大吸收波长不同，说明4‐甲基咪唑半抗原已经成功偶联到蛋白上，成功得到4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原；从图2中看出卵清白蛋白的最大吸收波长为279nm，4‐甲基咪唑半抗原的最大吸收波长为282nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原的最大吸收波长为284nm，4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白抗原与卵清白蛋白的最大吸收波长不同，说明4‐甲基咪唑半抗原已经成功偶联到卵清白蛋白上，成功得到4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白抗原。
本实施例计算得4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白人工抗原的产率为76.3%，4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白人工抗原的产率为75.2%。采用实施例1中测定抗原稳定性的方法，对本实施例中的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白人工抗原和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白人工抗原进行稳定性检测，结果表明，4摄氏度条件下静置3个月的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白人工抗原和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白人工抗原溶液无浑浊。说明实施例合成的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原具有很好的稳定性；采用实施例1的方法测定抗原的交叉反应率，结果得到抗血清与各药物的交叉反应率均小于5%，说明了本实例制得的抗原用于免疫时可产生高特异性抗体。
本发明制备的4‐甲基咪唑‐牛血清白蛋白和4‐甲基咪唑‐卵清白蛋白完全抗原不仅产率高，稳定性好，而且用于免疫时可产生高特异性抗体，说明本发明合成的4‐甲基咪唑完全抗原可用于食品及药品中4‐甲基咪唑的快速免疫检测。
Claims (6)
1.一种4-甲基咪唑完全抗原的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）半抗原的制备：将4‐甲基咪唑与有机酸混合后，溶解于溶剂中，配成4‐甲基咪唑的质量浓度为0.01g/mL～0.5g/mL，且有机酸的质量浓度为0.05g/L～5g/mL的混合溶液，在0℃～70℃条件下反应0.1h～24h，得到4‐甲基咪唑半抗原；所述有机酸为乙醛酸、丙醛酸、丁醛酸、戊醛酸、己醛酸或对醛基苯甲酸；所述溶剂为水、甲醇、乙醇、DMSO或DMF；
（2）半抗原的活化：将4‐甲基咪唑半抗原溶于DMSO或DMF中，得到浓度为0.001～0.5g/mL的4‐甲基咪唑半抗原溶液，在搅拌条件下加入EDC和NHS，使EDC和NHS在DMSO或DMF溶液中的质量浓度为0.001～0.5g/mL，活化0.1～12h；
（3）偶联蛋白溶液的制备：将牛血清白蛋白或卵清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，配成偶联蛋白浓度为0.001g/mL～0.5g/mL的蛋白溶液；
（4）人工抗原的合成：在搅拌条件下，蛋白溶液加入活化后的半抗原溶液中，在温度为0℃～30℃条件下反应0.5h～12h，得到人工抗原混合液；
（5）透析：将人工抗原混合液转移到能透过分子量为1kDa～100kDa的透析袋中，在搅拌的条件下，使用磷酸盐缓冲液透析1天～8天；透析结束后，干燥，得到固体状的4-甲基咪唑完全抗原。
2.根据权利要求1所述的一种4‐甲基咪唑完全抗原的合成方法，其特征在于：步骤（2）所述的EDC与NHS的质量比为5:1～1:5。
3.根据权利要求1所述的一种4‐甲基咪唑完全抗原的合成方法，其特征在于：步骤（3）和步骤（5）所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.6mol/L，pH为5.0～9.0。
4.根据权利要求1所述的一种4‐甲基咪唑完全抗原的合成方法，其特征在于：步骤（4）中蛋白溶液与半抗原溶液的体积比为1:10～10:1。
5.根据权利要求1所述的一种4‐甲基咪唑完全抗原的合成方法，其特征在于：步骤（2）、步骤（4）和步骤（5）所述搅拌为磁力搅拌或电动搅拌。
6.根据权利要求1所述的一种4‐甲基咪唑完全抗原的合成方法，其特征在于：步骤（5）所述干燥为冷冻干燥或真空干燥。
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