CN105085667A - 邻苯二甲酸二乙酯人工包被原及其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种邻苯二甲酸二乙酯人工包被原制备及其用途；所述人工包被原结构式如下：制备时，将4-硝基邻苯二甲酸与乙醇在强酸的催化作用下酯化反应得邻苯二甲酸二乙酯半抗原中间体4-硝基邻苯二甲酸二乙酯；4-硝基邻苯二甲酸二乙酯和锌粉在强酸的作用下发生还原反应得邻苯二甲酸二乙酯半抗原；再采用戊二醛法，将所述半抗原与卵清白蛋白偶联反应，即得包被原DEP-OVA。本发明的包被原的制备方法简单，稳定性好，成本低，易于工业化生产。制备的包被原可以与被分析物邻苯二甲酸二乙酯形成直接竞争关系，特异性识别抗邻苯二甲酸二乙酯的多克隆抗体，为建立免疫检测方法奠定基础。

Description

邻苯二甲酸二乙酯人工包被原及其制备和用途
技术领域
本发明涉及小分子有机污染物的免疫化学及生物分析技术领域，具体涉及一种邻苯二甲酸二乙酯人工包被原及其制备方法和用途。
背景技术
邻苯二甲酸酯类塑化剂(缩写为PAEs)，又称酞酸酯类，是一类由邻苯二甲酸与含有4-15个碳的醇发生费歇尔(Fischer)酯化反应所形成的酯的重要衍生物的统称。这类物质有特殊性气味，毒性较大，一般情况下状态为粘稠液体；液态条件下温度范围宽，流动性大，挥发性低，不溶于水，易溶于大多数有机溶剂。这类物质用途广泛，它不仅可作为食品包装材料、玩具、农药载体、驱虫剂、润滑剂、乙烯地板和壁纸、去泡剂、清洁剂、医用材料(如人工心脏瓣膜等人工器官、血袋、注射器和胶管)和个人护理用品(主要有化妆品、香味品、指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液)等近千种产品的生产原材料，还常作为塑料增塑剂被用于改造塑料制品性能。
其中，邻苯二甲酸二乙酯(英文名称：Diethylphthalate，简称DEP)，又名酞酸二乙酯，CAS号为84-66-2，分子式为C12H14O4，分子量为222.24，无色至微黄色澄清油状液体，极易溶解于乙醇，几乎不溶于水；遇明火、高热可燃烧，具有刺激性。该物质低毒，对皮肤、眼睛、上呼吸道有刺激作用；经皮肤吸收或摄入后可引起头痛、头晕和呕吐；具潜在的光毒性、轻度致敏；对女性子宫有影响，可能导致胎儿畸形或死亡]。由于它能与大多数树脂的相容性比较好，因此，它主要作为树脂的增塑剂而广泛应用；此外，还可作为润滑剂、起泡剂、香水及药用包衣材料的辅料。近些年来，有研究学者发现该物质在食品(如：酒、饮料等)中的含量过高从而危及食品安全，因此便备受人们关注。
目前，关于DEP的研究主要集中在水体、沉积物、大气等环境领域和生物体的毒性方面，但样品的检测方法方面研究较少。目前对邻苯二甲酸二乙酯的检测手段主要为气相色谱和高效液相色谱等仪器检测方法，这些方法虽然准确可靠，但对样品的预处理方法和操作人员的专业性有很高的要求。正因为这些方法的处理复杂、耗时、仪器价格昂贵而不适合推广使用，也不利于在环境污染事故现场快速检测。为克服这些缺点，寻求一种快速、简便、灵敏且经济实用的分析方法就成为环境监测领域的主要研究方向。因此，开展研究并建立有效、可靠的塑化剂的检测方法及标准，并通过相关的法规予以保障，成为一项极为重要和迫切的工作。
20世纪60年代发展起来的免疫分析(Immunoassay,IA)是基于抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和高灵敏性，非常适合复杂介质中痕量组分的分析。因此免疫分析具有的特异性强、灵敏度高、方法快捷简单、分析通量大、检测成本低等优点，使得该类方法可以满足简单、快速、灵敏地检测持久性有机污染物的要求。1971年Engvail,VanWeerman等报道了检测体液中微量物质的固相免疫分析技术，即酶联免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。目前，ELISA方法已经成为免疫分析方法中重要的组成部分。ELISA方法是将抗原-抗体之间的免疫反应与酶的高效催化特性有机结合而发展起来的一种免疫分析方法。其中，以亲和素-生物素信号放大系统为基础的亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法，以生物素标记抗体(抗原)，并以酶标亲和素代替ELISA方法中酶标抗体。亲和素是卵白蛋白中的一种碱性糖蛋白，分子量约为68kDa。一个亲和素分子由4个亚单位组成，每个亚单位都可以与一个生物素分子(分子量为244)特异性结合。生物素与亲和素结合特异性强，其亲和力比抗原抗体反应大得多，亲和常数高达1015M-1。由于一个亲和素能与4个生物素分子结合，因此在检测中可提高被固相结合酶的数量，进而提高检测方法的灵敏度。
现有技术中，一篇名为“环境激素邻苯二甲酸二甲酯(二乙酯)的荧光免疫分析新方法研究”的硕士论文中公开了一种邻苯二甲酸二乙酯的荧光免疫分析方法，但该方法中包被原和免疫原采用相同的制备方法，这样易引起假阳性反应，从而限制了该免疫分析方法的灵敏度的进一步提高。
目前尚没有亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法检测邻苯二甲酸二乙酯的相关报道。而制备合格的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原是建立邻苯二甲酸二乙酯生物免疫分析检测方法的关键，更是建立DEP免疫检测分析方法的关键，这将具有重要的应用价值和理论研究意义。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种步骤简单，速度快，产率高的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原(DEP-OVA)的制备和用途；本发明制备的塑化剂邻苯二甲酸二乙酯人工包被原(DEP-OVA)为利用包被原、高特异性的多克隆抗体建立亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法奠定基础。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种邻苯二甲酸二乙酯人工包被原，其结构式如式(I)所示：
本发明还提供了一种邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备方法，所述方法包括：
采用戊二醛法，将邻苯二甲酸二乙酯半抗原与卵清白蛋白OVA偶联反应，即得邻苯二甲酸二乙酯人工包被原。
优选地，所述采用戊二醛法将邻苯二甲酸二乙酯半抗原与卵清白蛋白OVA偶联反应具体包括以下步骤：
将邻苯二甲酸二乙酯半抗原溶解于非质子性有机溶剂a形成的邻苯二甲酸二乙酯半抗原溶液加入到卵清白蛋白溶液中形成反应液；
向所述反应液中加入戊二醛，搅拌反应。
优选地，所述非质子性有机溶剂a为N,N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；所述卵清白蛋白溶液是将卵清白蛋白溶解于磷酸缓冲液中制备得到；所述搅拌反应是在0～4℃冰浴遮光条件下进行的，反应时间为20～28h。所有需要保持蛋白活性的长时间反应都需要在低温情况下进行，经验表明0～4℃最合适。
优选地，所述邻苯二甲酸二乙酯半抗原、戊二醛和卵清白蛋白的摩尔比为1:4～6:0.005～0.02。
为充分反应，根据经验，当半抗原与戊二醛、OVA反应的摩尔比是1:6:0.005时搅拌反应20小时就可以，当半抗原与戊二醛、OVA反应的摩尔比是1:4:0.02时反应就需要28小时。
优选地，所述采用戊二醛法将邻苯二甲酸二乙酯半抗原与卵清白蛋白OVA偶联反应具体还包括反应结束后，将反应液进行离心分离得上清液，将上清液装入透析袋中透析，离心分离沉淀后，得纯化后的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原DEP-OVA。
优选地，所述邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备包括如下步骤：
S1、在强酸性介质a存在的条件下，4-硝基邻苯二甲酸与乙醇发生酯化反应，生成4-硝基邻苯二甲酸二乙酯；
S2、在非质子性有机溶剂存在的条件下，所述4-硝基邻苯二甲酸二乙酯和锌粉、强酸b发生还原反应，生成邻苯二甲酸二乙酯半抗原，即DEP半抗原，化学名称为4-氨基邻苯二甲酸二乙酯，分子式：C12H15NO4，分子量：237.25。
优选地，步骤S1中，4-硝基邻苯二甲酸、乙醇、强酸性介质a的摩尔比为1:5～7:0.6～0.8；酯化反应温度为86～90℃，时间为8～10小时；所述强酸性介质a选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸。
优选地，步骤S2中，所述4-硝基邻苯二甲酸二乙酯与强酸b、非质子性有机溶剂和锌粉的摩尔比为1:(550～580):(20～22):(18～20)(其中苯作为基质溶液并不参与反应)，所述强酸b选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸；还原反应的温度为25～35℃，时间为10～12小时。
优选地，所述非质子有机溶剂为苯或甲苯。
优选地，所述锌粉为纯锌粉，即化学级别分析纯，国药试剂公司生产。
优选的，步骤S1还包括酯化反应结束后蒸馏除去未反应的乙醇和生成的水，再趁热将液体倒入冰水中，下层的黄色油状粗品用10％Na2CO3溶液洗涤至水层呈无色，重结晶，得到纯化后的4-硝基邻苯二甲酸二乙酯的步骤。
优选的，步骤S2还包括回流反应结束后用冰水和强碱以终止反应，苯萃取反应液，分离、干燥并减压蒸馏去除有机相，得到的粗品再用硅胶柱层析(洗脱剂为体积比为1:8的乙酸和正己烷的混合液)纯化，得到纯化后的邻苯二甲酸二乙酯半抗原的步骤。
本发明采用戊二醛法合成邻苯二甲酸二乙酯人工包被原，其反应方程式如下：
制备时，4-硝基邻苯二甲酸与乙醇在强酸的催化作用下酯化反应得邻苯二甲酸二乙酯半抗原中间体4-硝基邻苯二甲酸二乙酯；4-硝基邻苯二甲酸二乙酯和锌粉在强酸的作用下发生还原反应得邻苯二甲酸二乙酯半抗原；采用戊二醛法，将所述半抗原与卵清白蛋白偶联反应，即得包被原DEP-OVA。上述反应方程式中，戊二醛一端的醛基与邻苯二甲酸二乙酯半抗原4-氨基邻苯二甲酸二乙酯的氨基结合，戊二醛另一端的醛基与卵清白蛋白OVA一端的氨基结合，偶联脱水，生成了DEP人工包被原。
本发明还提供了一种邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的用途，用于邻苯二甲酸二乙酯的检测。
优选的，所述检测采用亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法，检测时所述邻苯二甲酸二乙酯人工包被原与被分析物邻苯二甲酸二乙酯直接竞争具特异性免疫反应的抗邻苯二甲酸二乙酯特异性抗体。
由于邻苯二甲酸二乙酯人工包被原(DEP-OVA)可以与被分析物邻苯二甲酸二乙酯形成直接竞争关系，它们都能特异性识别抗邻苯二甲酸二乙酯的多克隆抗体，进而建立专一、高效的生物免疫方法用于水体、土壤、大气等环境样品和各类食品中痕量塑化剂邻苯二甲酸二乙酯的检测。
本发明的机理在于：由于邻苯二甲酸二乙酯是小分子物质，只具有反应原性而没有包被原性，而且该分子上没有能与蛋白质分子直接结合的氨基、羧基等官能团，故本发明选择4-硝基邻苯二甲酸为原料，通过两步反应(包括酯化反应和还原反应)制备带有氨基活性基团的邻苯二甲酸二乙酯半抗原，然后用戊二醛法将这个含氨基的半抗原与卵清白蛋白偶联制备人工包被原，将其用于建立针对邻苯二甲酸二乙酯的荧光免疫PCR分析检测方法。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1)包被原实用性强：邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备具有重要的实用价值和现实意义。本发明首次采用戊二醛法成功制备了邻苯二甲酸二乙酯人工包被原(DEP-OVA)。该人工包被原保留了邻苯二甲酸二乙酯的结构，具有针对邻苯二甲酸二乙酯的抗原决定簇，为建立亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法提供了保障。
2)包被原稳定性好：此法合成的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原具有较好的稳定性，在0～4℃环境下可保存12个月不变性，-20℃环境下可保存3～5年。
3)包被原制备技术简便可行：抗原的整个制备过程无需特别的仪器设备，成本低廉，容易工业化规模生产。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为邻苯二甲酸二乙酯半抗原红外光谱；
图2为邻苯二甲酸二乙酯半抗原核磁共振光谱；
图3为邻苯二甲酸二乙酯半抗原、蛋白质OVA和人工包被原DEP-OVA的紫外吸收光谱图；
图4为间接竞争BA-ELISA免疫分析方法检测邻苯二甲酸二乙酯的标准工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备，通过4-硝基邻苯二甲酸与乙醇在强酸的催化作用下发生酯化反应得4-硝基邻苯二甲酸二乙酯；4-硝基邻苯二甲酸二乙酯和锌粉、强酸发生还原反应得邻苯二甲酸二乙酯半抗原；采用戊二醛法，将所述半抗原与卵清白蛋白偶联，即得DEP人工包被原DEP-OVA。戊二醛法反应中，邻苯二甲酸二乙酯半抗原4-氨基邻苯二甲酸二乙酯的氨基与戊二醛一端的醛基结合，戊二醛另一端的醛基与卵清白蛋白OVA一端的氨基结合，偶联脱水，生成了DEP人工包被原DEP-OVA。具体制备及应用见以下各实施例：
实施例1、邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备与鉴定
(1)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备
取洁净的容积为100mL三口圆底烧瓶，向瓶底装入10g(0.0474mol)4-硝基邻苯二甲酸，随后缓慢加入16.6mL(0.2850mol)无水乙醇，边搅拌边加入1.65mL浓H2SO4(0.0304mol)催化，86℃搅拌回流，直至薄板层析法(TLC)检测原料点消失为止(显色剂：丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾；展开剂，正己烷：乙酸乙酯＝5:1)；搅拌回流9h后反应完成；蒸馏除去未反应的乙醇和生成的水；此时将液体趁热倒入冰水中，析出固体；过滤后得到的固体粗品用10％Na2CO3溶液洗涤至水层无色(pH7.0-8.0)；最后，油状粗品用无水乙醇重结晶纯化，-20℃冻干后得浅黄色针状晶体4-硝基邻苯二甲酸二乙酯即DEP半抗原中间体。
将1.5g(0.0056mol)DEP半抗原中间体(4-硝基邻苯二甲酸二乙酯)装入容积为500mL三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入280mL(3.1495mol)苯，待半抗原被苯溶解后再加入3.4g纯锌粉(0.0520mol)，搅拌均匀后分次加入10mL浓HCl(0.1200mol)，室温搅拌15min后再次加入3.4g纯锌粉(0.0520mol)，35℃搅拌反应10h；反应结束后，将340mL冷水加入反应体系，并用1M氢氧化钠溶液中和至弱碱性(pH7.0-8.5)；静置1h后分离出苯层，再用苯萃取水层，合并萃取液，水洗后用无水Na2SO4脱水干燥，萃取液减压蒸馏以除去苯，得到的浅黄色固体再用无水乙醇重结晶，硅胶柱层析(洗脱剂为，乙酸和正己烷的混合液(V/V＝8:1))后减压蒸馏，得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二乙酯，即DEP半抗原。邻苯二甲酸二乙酯半抗原分子式：C12H15NO4；分子量237.25；产率86.2％；熔点：90～92℃，纯度98％。
(2)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的鉴定
将制得的半抗原经红外光谱(图1)、核磁共振光谱(图2)鉴定，红外光谱结果为：IR(KBr)ν/cm-1:3466.06,3369.16(-NH2)，1720.18(C＝O)，1257.81,1068.87(C-O-C)，2980.89,2927.48(-CH3)，1449.97(d-OCH2-)，1630.07,1564.19,1449.97(C＝C)，3227.98,1604.33,833.75(C-H,Ar)。核磁共振光谱结果为：1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ7.73(d,1H,ArH)，6.73(d,1H,ArH)，6.67(d,1H,ArH)，4.36(q，2H，OCH2)，4.30(q，2H，OCH2)，4.26(b,2H,-NH2)，1.39(t,3H,OCH2)，1.33(t,3H,OCH2)ppm。红外、核磁表征结果表明，DEP半抗原具有-NH2、-O-CH2CH3、苯环等基团的特征吸收峰，证明制备的DEP半抗原分子中含有氨基官能团，最终实验中成功制备了DEP半抗原。
从以上分析可知，所合成的产物为目标物。
实施例2、邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备与鉴定
(1)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备
取洁净的容积为100mL三口圆底烧瓶，向瓶底装入10g(0.0474mol)4-硝基邻苯二甲酸，随后缓慢加入13.7mL(0.2370mol)无水乙醇，边搅拌边加入1.55mL浓H2SO4(0.0285mol)催化，90℃搅拌回流，直至薄板层析法(TLC)检测原料点消失为止(显色剂：丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾；展开剂，正己烷：乙酸乙酯＝5:1)；搅拌回流8h后反应完成；蒸馏除去未反应的乙醇和生成的水；此时将液体趁热倒入冰水中，析出固体；过滤后得到的固体粗品用10％Na2CO3溶液洗涤至水层无色(pH7.0-8.0)。最后，油状粗品用无水乙醇重结晶纯化，-20℃冻干后得浅黄色针状晶体4-硝基邻苯二甲酸二乙酯即DEP半抗原中间体。
将1.5g(0.0056mol)DEP半抗原中间体(4-硝基邻苯二甲酸二乙酯)装入容积为500mL三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入288mL(3.2480mol)苯，待半抗原被苯溶解后再加入3.3g纯锌粉(0.0504mol)，搅拌均匀后分次加入10mL浓HCl(0.1232mol)，室温搅拌15min后再次加入3.3g纯锌粉(0.0504mol)，30℃搅拌反应11h；反应结束后，将330mL冷水加入反应体系，并用1M氢氧化钾溶液中和至弱碱性(pH7.0-8.5)；静置1h后分离出苯层，再用苯萃取水层，合并萃取液，水洗后用无水Na2SO4脱水干燥，萃取液减压蒸馏以除去苯，得到的浅黄色固体再用无水乙醇重结晶，硅胶柱层析(洗脱剂为，乙酸和正己烷的混合液(V/V＝8:1))后减压蒸馏，得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二乙酯，即DEP半抗原。邻苯二甲酸二乙酯半抗原分子式：C12H15NO4；分子量237.25；产率87.6％；熔点：90～92℃，纯度98％。
(2)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的鉴定
将制得的半抗原经红外光谱(图1)、核磁共振光谱(图2)鉴定，红外光谱结果为：IR(KBr)ν/cm-1:3466.06,3369.16(-NH2)，1720.18(C＝O)，1257.81,1068.87(C-O-C)，2980.89,2927.48(-CH3)，1449.97(d-OCH2-)，1630.07,1564.19,1449.97(C＝C)，3227.98,1604.33,833.75(C-H,Ar)。核磁共振光谱结果为：1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ7.73(d,1H,ArH)，6.73(d,1H,ArH)，6.67(d,1H,ArH)，4.36(q，2H，OCH2)，4.30(q，2H，OCH2)，4.26(b,2H,-NH2)，1.39(t,3H,OCH2)，1.33(t,3H,OCH2)ppm。红外、核磁表征结果表明，DEP半抗原具有-NH2、-O-CH2CH3、苯环等基团的特征吸收峰，证明制备的DEP半抗原分子中含有氨基官能团，最终实验中成功制备了DEP半抗原。
从以上分析可知，所合成的产物为目标物。
实施例3、邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的合成与鉴定
(1)邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的合成
通过戊二醛法制备DEP包被原DEP-OVA，具体合成步骤：将0.0238g(0.1mmol)DEP半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中，边滴加1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)边搅拌，搅拌均匀后再逐滴加入到0.08mMOVA溶液(0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液溶解)10mL(0.0008mmol)中，随后向该混合体系中缓慢加入0.036mL(0.5mmol)25％戊二醛，4℃低温闭光搅拌反应28h后，将得到的抗原粗品装入透析袋，置于0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液中低温4℃透析3d，每隔8h换水1次，最后将终产物4000r·min-1离心15min，取其上清液即DEP包被原DEP-OVA。包被原经紫外-可见分光光度计鉴定后，冷冻干燥、小量分装，-20℃冷冻保存。
(2)邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的鉴定
可进行包被原鉴定的方法有色谱法、红外光谱法、紫外光谱法、SDS-PAGE凝胶电泳等。其中最常用的方法是紫外可见光谱法。一般来说，只要包被原的紫外-可见光谱与载蛋白和半抗原的紫外光谱不同，即可间接说明半抗原成功与蛋白质偶联，包被原合成成功。因为根据朗伯-比尔定律，当波长一定时，混合物的紫外吸收具有加合性。
包被原的紫外光谱表征具体为：将制备的包被原适当稀释，使其吸光度在0.1～2.0之间，以PBS为空白对照，用紫外分光光度计在200～500nm分别测定邻苯二甲酸二乙酯半抗原和包被原DEP-OVA的吸光值，绘制紫外吸收光谱图，并根据以下公式计算偶联比：
式中：ODconjugate——偶联物吸光度；ODprotein——蛋白质吸光值；ODhapten——半抗原吸光值；Chapten——半抗原浓度；Cprotein——蛋白质浓度；Mhapten——半抗原分子量；Mprotein——蛋白质分子量。
本发明采用全波长紫外分光光度计对半抗原、载体蛋白和包被原进行扫描，根据特征吸收峰的位置确定偶联是否成功。元素分析结果进一步证明了产物的结构和所设计的路线一致。
由紫外光谱(图4)可知，DEP半抗原在295nm处有特征吸收峰；载体蛋白OVA有三个紫外吸收峰，分别位于219nm、224nm、268nm处有特征吸收峰，其中268nm紫外吸收峰处的吸收值较低；DEP人工包被原有两个紫外吸收峰，分别位于在336和360nm处。此外，我们可以清晰发现，半抗原在295nm处的紫外吸收峰发生红移后转移到360nm处，这说明DEP半抗原上的氨基发生重氮化后已经成功偶联OVA；此外，DEP-OVA的半抗原特征吸收峰发生了红移，这可能是受到载体蛋白的吸收峰的影响所致，吸收峰红移现象的出现说明偶联成功。计算DEP-OVA中DEP与OVA的结合比分别为15.8:1。
(3)邻苯二甲酸二乙酯人工包被原蛋白质浓度的测定
根据考马斯亮蓝G250法测定包被原蛋白质浓度。考马斯亮蓝G250在游离时为红色，与蛋白质结合后为青蓝色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm处。以OVA为标准物质配置不同浓度标准溶液，与一定量考马斯亮蓝G250反应后，分别在595nm处测定溶液吸光度值。标准溶液在0-150μg/mL范围内线性关系良好。在稀释一定倍数的包被原溶液中加入考马斯亮蓝染色，在相同波长处测量吸光度值，后与标准曲线比较，得制备的包被原蛋白质浓度为1.04mg/mL。
这些包被原可以作为免疫竞争对象而使用。
实施例4、邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的合成与鉴定
(1)邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的合成
通过戊二醛法制备DEP包被原DEP-OVA，具体合成步骤：将0.0238g(0.1mmol)DEP半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中，边滴加1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)边搅拌，搅拌均匀后再逐滴加入到0.08mMOVA(0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液溶解)25mL(0.002mmol)中，随后向该混合体系中缓慢加入0.029mL(0.4mmol)25％戊二醛，3℃低温闭光搅拌反应26h后，将得到的抗原粗品装入透析袋，置于0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液中低温4℃透析3d，每隔8h换水1次，最后将终产物4000r·min-1离线15min，取其上清液即DEP包被原DEP-OVA。包被原经紫外-可见分光光度计鉴定后，冷冻干燥、小量分装，-20℃冷冻保存。
(2)邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的鉴定
可进行包被原鉴定的方法有色谱法、红外光谱法、紫外光谱法、SDS-PAGE凝胶电泳等。其中最常用的方法是紫外可见光谱法。一般来说，只要包被原的紫外-可见光谱与载蛋白和半抗原的紫外光谱不同，即可间接说明半抗原成功与蛋白质偶联，包被原合成成功。因为根据朗伯-比尔定律，当波长一定时，混合物的紫外吸收具有加合性。
包被原的紫外光谱表征具体为：将制备的包被原适当稀释，使其吸光度在0.1～2.0之间，以PBS为空白对照，用紫外分光光度计在200～500nm分别测定邻苯二甲酸二乙酯半抗原和包被原DEP-OVA的吸光值，绘制紫外吸收光谱图，并根据以下公式计算偶联比：
式中：ODconjugate——偶联物吸光度；ODprotein——蛋白质吸光值；ODhapten——半抗原吸光值；Chapten——半抗原浓度；Cprotein——蛋白质浓度；Mhapten——半抗原分子量；Mprotein——蛋白质分子量。
本发明采用全波长紫外分光光度计对半抗原、载体蛋白和包被原进行扫描，根据特征吸收峰的位置确定偶联是否成功。元素分析结果进一步证明了产物的结构和所设计的路线一致。
由紫外光谱(图4)可知，DEP半抗原在295nm处有特征吸收峰；载体蛋白OVA有三个紫外吸收峰，分别位于219nm、224nm、268nm处有特征吸收峰，其中268nm紫外吸收峰处的吸收值较低；DEP人工包被原有两个紫外吸收峰，分别位于在336和360nm处。此外，我们可以清晰发现，半抗原在295nm处的紫外吸收峰发生红移后转移到360nm处，这说明DEP半抗原上的氨基发生重氮化后已经成功偶联OVA；此外，DEP-OVA的半抗原特征吸收峰发生了红移，这可能是受到载体蛋白的吸收峰的影响所致，吸收峰红移现象的出现说明偶联成功。计算DEP-OVA中DEP与OVA的结合比分别为15.8:1。
(3)邻苯二甲酸二乙酯人工包被原蛋白质浓度的测定
根据考马斯亮蓝G250法测定包被原蛋白质浓度。考马斯亮蓝G250在游离时为红色，与蛋白质结合后为青蓝色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm处。以OVA为标准物质配置不同浓度标准溶液，与一定量考马斯亮蓝G250反应后，分别在595nm处测定溶液吸光度值。标准溶液在0-150μg/mL范围内线性关系良好。在稀释一定倍数的包被原溶液中加入考马斯亮蓝染色，在相同波长处测量吸光度值，后与标准曲线比较，得制备的包被原蛋白质浓度为1.04mg/mL。
这些包被原可以作为免疫竞争对象而使用。
实施例5、邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的合成与鉴定
(1)邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的合成
通过戊二醛法制备DEP包被原DEP-OVA，具体合成步骤：将0.0238g(0.1mmol)DEP半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中，边滴加1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)边搅拌，搅拌均匀后再逐滴加入到0.08mMOVA溶液(0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液溶解)6.25mL(0.0005mmol)中，随后向该混合体系中缓慢加入0.044mL(0.6mmol)25％戊二醛，2℃低温闭光搅拌反应32h后，将得到的抗原粗品装入透析袋，置于0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液中低温4℃透析3d，每隔8h换水1次，最后将终产物4000r·min-1离线15min，取其上清液即DEP包被原DEP-OVA。包被原经紫外-可见分光光度计鉴定后，冷冻干燥、小量分装，-20℃冷冻保存。
(2)邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的鉴定
可进行包被原鉴定的方法有色谱法、红外光谱法、紫外光谱法、SDS-PAGE凝胶电泳等。其中最常用的方法是紫外可见光谱法。一般来说，只要包被原的紫外-可见光谱与载蛋白和半抗原的紫外光谱不同，即可间接说明半抗原成功与蛋白质偶联，包被原合成成功。因为根据朗伯-比尔定律，当波长一定时，混合物的紫外吸收具有加合性。
包被原的紫外光谱表征具体为：将制备的包被原适当稀释，使其吸光度在0.1～2.0之间，以PBS为空白对照，用紫外分光光度计在200～500nm分别测定邻苯二甲酸二乙酯半抗原和包被原DEP-OVA的吸光值，绘制紫外吸收光谱图，并根据以下公式计算偶联比：
式中：ODconjugate——偶联物吸光度；ODprotein——蛋白质吸光值；ODhapten——半抗原吸光值；Chapten——半抗原浓度；Cprotein——蛋白质浓度；Mhapten——半抗原分子量；Mprotein——蛋白质分子量。
本发明采用全波长紫外分光光度计对半抗原、载体蛋白和包被原进行扫描，根据特征吸收峰的位置确定偶联是否成功。元素分析结果进一步证明了产物的结构和所设计的路线一致。
由紫外光谱(图3)可知，DEP半抗原在295nm处有特征吸收峰；载体蛋白OVA有三个紫外吸收峰，分别位于219nm、224nm、268nm处有特征吸收峰，其中268nm紫外吸收峰处的吸收值较低；DEP人工包被原有两个紫外吸收峰，分别位于在336和360nm处。此外，我们可以清晰发现，半抗原在295nm处的紫外吸收峰发生红移后转移到360nm处，这说明DEP半抗原上的氨基发生重氮化后已经成功偶联OVA；此外，DEP-OVA的半抗原特征吸收峰发生了红移，这可能是受到载体蛋白的吸收峰的影响所致，吸收峰红移现象的出现说明偶联成功。计算DEP-OVA中DEP与OVA的结合比分别为15.8:1。
(3)邻苯二甲酸二乙酯人工包被原蛋白质浓度的测定
根据考马斯亮蓝G250法测定包被原蛋白质浓度。考马斯亮蓝G250在游离时为红色，与蛋白质结合后为青蓝色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm处。以OVA为标准物质配置不同浓度标准溶液，与一定量考马斯亮蓝G250反应后，分别在595nm处测定溶液吸光度值。标准溶液在0-150μg/mL范围内线性关系良好。在稀释一定倍数的包被原溶液中加入考马斯亮蓝染色，在相同波长处测量吸光度值，后与标准曲线比较，得制备的包被原蛋白质浓度为1.04mg/mL。
这些包被原可以作为免疫竞争对象而使用。
实施例6、间接竞争BA-ELISA免疫分析方法检测环境样品中邻苯二甲酸二乙酯
为了证明DEP人工包被原DEP-OVA制备成功，通过与DEP标准溶液竞争与抗DEP多克隆抗体之间的特异性识别反应，进而建立间接竞争BA-ELISA免疫分析方法检测环境中的DEP，具体步骤如下：用用包被缓冲液(0.05MpH9.60碳酸盐缓冲液)适当稀释包被原溶液(DEP-OVA)，100μL/孔，加入96孔酶标板中，4℃包被过夜；次日倒掉包被液，每孔加入200μL洗涤液(0.01MpH7.40PBST)，重复洗涤三次，每次3min；用吸水纸拍干酶标板后，每孔加入封闭液200μL，37℃温育1小时；倒掉封闭液，重复上述洗涤过程三次，生物素化抗DEP多克隆抗体(Bio-pAb-DEP)稀释至适当浓度，每孔依次加入50μL生物素化抗体及50μLDEP标准样品(用含5％二甲亚砜(DMSO)的PBS(v/v)梯度稀释)，空白孔每孔加入100μLPBS缓冲液，37℃温育30分钟；倒掉抗原-抗体反应液，重复洗涤三次，用PBST适当稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的链霉亲和素(HRP-SA)，每孔加入100μL，37℃温育1小时；倒掉HRP-SA溶液，重复洗涤五次，每孔加入新鲜配制的显色液(400μL2.5mg/mL3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物溶液与10mL磷酸盐-柠檬酸底物缓冲液、10μL30％的H2O2混合形成显色液)100μL/孔，室温下避光反应15min；每孔加入50μL终止液(2mol/L硫酸溶液)以终止显色，然后用酶标仪测定各孔在450nm和630nm处吸光度值(OD值)，以OD＝OD450-OD630作为最终读数。实验结果用抑制率来表示，并以抑制率为纵坐标，标准样品浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，建立的标准工作曲线如图4所示。其中，抑制率(％)＝(1-A/A0)×100，其中A为有样品存在的孔的OD值，A0为没有样品存在的孔的OD值。
生物素化抗体的制备如下：用0.05MpH9.60碳酸盐缓冲液将纯化后的抗DEP多克隆抗体稀释至1.0mg/mL左右，取2mL加入锥形瓶中；用DMSO配制1.0mg/mL生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(BNHS)溶液，向上述锥形瓶中加入BNHS溶液，使BNHS：抗DEP多克隆抗体的质量比为1：10，室温下搅拌反应4小时；反应结束后将反应液装入透析袋中，用PBS缓冲液透析3d，每天换水3次。离心分离去除少量沉淀后，即得相应的生物素化康多克隆抗体溶液(Bio-pAb-DEP)，抗体溶液小体积分装后，于-20℃冷冻保存。
抗DEP多克隆抗体通过生物体免疫反应制备，所用的人工免疫原为采用重氮化法制备的DEP免疫原DEP-BSA。DEP-BSA的具体合成步骤为：将0.0209g(0.1mmol)DEP半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中，边滴加0.75mLH2O边搅拌，混合后再加入0.029mL浓HCl(0.35mmol)，待混合物加热溶解后置冰浴中冷却；随后，在4℃低温搅拌的情况下，逐滴滴加1M亚硝酸钠溶液(0.9mmol)，用pH试纸控制反应酸度为2.0-3.0，同时用淀粉碘化钾试纸显色，显色时间为滴加后的1-3s，试纸由白色瞬间变成灰蓝色时停止滴加，再继续反应30min，加1.86g(0.031mol)尿素以去除未反应的亚硝酸钠；然后，向上述重氮盐中逐滴加入0.08mMBSA溶液(0.01MpH9.18硼酸钠缓冲液溶解)(0.0001mmol)，直至溶液逐渐呈橙红色，继续反应3h后，将得到的抗原粗品装入透析袋，置于0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液中透析2.5d，每隔8h换水1次，最后将终产物4000r·min-1离线15min，取其上清液即DEP免疫原DEP-BSA。免疫原经紫外-可见分光光度计鉴定后，小量分装，-20℃冷冻干燥、分装并于-20℃保存。
间接竞争BA-ELISA免疫分析方法检测邻苯二甲酸二乙酯的标准曲线方程为Y＝22.53LgCDEP+57.96，相关系数R2＝0.9832，其中IC50表示检测方法的灵敏度，即抑制率为50％时对应的分析物浓度0.443μg/L；IC10表示方法的检测下限，即抑制率为10％时对应的分析物浓度0.0079μg/L；IC20-IC80表示线性范围，即0.021μg/L～9.512μg/L。与传统仪器分析方法相比，灵敏度提高了100～500倍。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种邻苯二甲酸二乙酯人工包被原，其结构如式(I)所示：
2.一种如权利要求1所述的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
采用戊二醛法，将邻苯二甲酸二乙酯半抗原与卵清白蛋白偶联反应，即得邻苯二甲酸二乙酯人工包被原。
3.根据权利要求2所述的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备方法，其特征在于，所述采用戊二醛法将邻苯二甲酸二乙酯半抗原与卵清白蛋白偶联反应具体包括以下步骤：
邻苯二甲酸二乙酯半抗原溶解于非质子性有机溶剂a形成邻苯二甲酸二乙酯半抗原溶液，将邻苯二甲酸二乙酯半抗原溶液加入到卵清白蛋白溶液中形成反应液；
向所述反应液中加入戊二醛，搅拌反应。
4.根据权利要求3所述的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备方法，其特征在于，所述非质子性有机溶剂a为N,N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；卵清白蛋白溶液是将卵清白蛋白溶解于磷酸缓冲液中制备得到；所述搅拌反应是在0～4℃冰浴遮光条件下进行的，搅拌反应时间为20～28h。
5.根据权利要求3所述的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备方法，其特征在于，所述邻苯二甲酸二乙酯半抗原、戊二醛和卵清白蛋白的摩尔比为1:4～6:0.005～0.02。
6.根据权利要求2所述的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备方法，其特征在于，所述邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备包括如下步骤：
S1、在强酸性介质a存在的条件下，4-硝基邻苯二甲酸与乙醇发生酯化反应，生成4-硝基邻苯二甲酸二乙酯；
S2、在非质子性有机溶剂b存在的条件下，所述4-硝基邻苯二甲酸二乙酯和锌粉、强酸b发生还原反应，生成邻苯二甲酸二乙酯半抗原。
7.根据权利要求6所述的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备方法，其特征在于，步骤S1中，4-硝基邻苯二甲酸、乙醇、强酸性介质a的摩尔比为1:5～7:0.6～0.8；酯化反应温度为86～90℃，时间为8～10小时；所述强酸性介质a选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸。
8.根据权利要求6所述的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述4-硝基邻苯二甲酸二乙酯与强酸b、非质子性有机溶剂b和锌粉的摩尔比为1:(20～22):(550～580):(18～20)，所述强酸b选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸；还原反应的温度为25～35℃，时间为10～12小时。
9.一种如权利要求1所述的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的用途，其特征在于，用于痕量塑化剂邻苯二甲酸二乙酯的检测。
10.根据权利要求9所述邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的用途，其特征在于，所述检测采用亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法，检测中邻苯二甲酸二乙酯人工包被原与被分析物邻苯二甲酸二乙酯直接竞争具特异性免疫反应的抗邻苯二甲酸二乙酯特异性抗体。
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