JPS5866851A - 免疫螢光試薬およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

臨床検査において、免疫法によってホルモン。 薬物または代謝物の如き少量化合物を定量することはき
わめて重要である。免疫反応の定量法のうち７つの方法
は、抗原または抗体をフルオレセインマタはローダミン
インチオシアネートの如き螢光発色団でマークするもの
である。この方法の利用に伴う主な問題点は、生化学検
体の固有の螢光である。これについて、フラピン、ピリ
ジン補酵素および血清蛋白質の如き多くの物質は、試料
として通常使用される発色団も放射するスペクトル域で
強い螢光を発する。 赤一近赤外域（６００な，いし９００ｎｍ）、したがっ
て検体の固有螢光（３００ないし’ｉ’　！　Ｏ　ｒ＋
ｎｔ　）からかなり離れた域で螢光を発する試料を使用
することにより、天然物によるバックグラウンドケ排除
することができ、該方法の感度を改善することが可能と
なる。 溶液中で遊離する多くの染料は、螢光の強度がかなり弱
いもめではあっても、これらの特性を４１していること
は知られている。しかしながら、その構造が他の分子と
の共有結合によって何らかの方法で変性される場合にも
、これらの特性が維持されることは自明なことではない
。 本発明者らは、近赤外域で螢光を発する染料を、螢光発
色団の−ＮＨ２基と反応する二官能性物質を使用して、
各種の蛋白質に共有結合させる場合にも、これら染料は
そのスペクトル特性を失なわないとの結果を得て、本発
明に至った。この場合、螢光はコないし９倍に増大する
（第１図および第２図参照）。 第１図は抗γ−免疫グロブリンーナイルプルー複合体（
曲＠２）およびナイルブルー溶液（曲線ｌ）の発光スペ
クトルを示す。発色団の濃度はコＸ１０−Ｍである。励
起波長ｆＪ、６００ｎｍである。 スペクトルは、光電子増倍管１１ΔＭＡＭＡＴＢＵ　Ｒ
４１４を具備する分光螢光光度計Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ＋
ｒ＋ｅｒ　ＭＰｇ　−２Ａにより測定したものである。 図中、横軸に波長（ｎｍ）ｉ示し、縦＠は螢光を示す。 第一図はアルゴンレーザーによりλ＝！；／！；ｎｍで
励起することにより得られ−１１、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ
−ナィルブルー複合体（曲線Ｊ）、ＩｊＣ８−ナイルブ
ルー複合体（曲線２）およびナイルブルー単独（曲線／
）の発光スペクトルを示す。発色団の濃度はＡ×１０　
　Ｍである。横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は螢光を
示す。 一般に、架橋剤により代表される二官能性物置は、蛋白
質および染料の両者と直接反応し、トー記の一般式で表
わされる錯体を形成する 〔染料＋Ｌｍ−蛋白質 二官能性物質がカルボジイミドである場合にに、これら
反応体は作用し、カルボキシル基’ｅ　活１４’、　化
してカルボキシル基と染料のアミノ基との間でカルボア
ミド結合を形成するため、次式で表わされる錯体が生成
される。 これら複合体の蛋白質部分もその生化学特性、たとえば
抗原または抗体である場合には免疫性、を維持している
。 これら免疫螢光試薬を使用する場合にも、装置における
特別な変更はない。すなわち、通常の分光螢光光度計に
赤外線感応光電子増倍管を取付けるだけである。特殊な
感度の測定は、ヘリウム−ネオンレーザ−、ルビーレー
ザー筐たは簡便には色素レーザーの如き赤色光または近
赤外の連続レーザーまたはパルス化レーザーによＩ）螢
光発色団を励起させることにより行なわれる。 これら複合体、特に螢光抗体を検鏡の際使用することは
、何ら問題点を生ずるものでになく、赤外線感光フィル
ムが必要とされるのみである。また、同−検ｉブレバー
ラドにおいて、スペクトルの緑−黄色域で螢光奮発する
従来の螢光牛肴発色団によりマークした抗体で溝色した
区域に対しての識別が可能になる利点がある。 本発明は、下記一般式を有する新規な免疫螢光試薬に係
わる。 式中、 ｎ：／ないしｑの整数 ｍ二ｎに等しい整数（ただし、架橋剤がカルボ１ミドの
場合には、ｍ　＝　Ｑ Ｐ：ｆｉ、白質 Ｌ：架橋剤残基 Ｘ：酸素またはイオウ原子 Ｙ　：　ｌＪＨ，ＮＨ２、）ＪＲ’、　　ＮＲ’ＦＩ”
　　（コＣＴＦ’オヨＵ　ｌ＋’？、１：同一または異
なる置換または未置換のアルキル基、アリール基、アリ
ールアルキル峻寸たはアルキルアリール （ここでＲ１は前記と同意義である）の中力・ら選ばれ
る基 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ，、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ，およびＲ８：同−
または異なる水素原子またにアミノ基、または置換また
に未置換のアルキル基、アリール基、アルキルアリール
基まｆＵアリールアルキル基（Ｒ，および１（２および
／またはＲ７およびＲ８ハ互いに結合して芳香環との縮
合環を形成するコ価の基であってもよい。 これらのうち少なくとも７つ（多くの場合Ｒ，）は架橋
剤との反応の除、−ＮＨ−Ｌまたは−Ｎ＝Ｌ−基を形成
するアミノ基でなければならない。） 上記試薬に、以下の各群の・ら選ばれる各々少なくとも
７種類の化合物を反応させることにより調製される。 （ａ）　　蛋白質 （ｂ＋　　可視域に吸収（λｍａｘ　　はｓｓｏないし
ｇｏ。 τｒｍ）ｆｉｌ″有しかつ少なくとも１つの遊離ＮＨ２
および１００ないし９００　ｎｍ　　での螢光を有する
オキサジンまｆｆ１Ｕチアジンから選ばれ染料（ｃ）架
橋剤（一般に、染料のアミノ基と反応しつる＄分有する
二官能性物質） 各群を構成するいくつかの化合物を参考のために例示す
る。 蛋白質 （＋）　　スタフィロコッカス　アウレウス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｏｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）　　からの
ＰｒｏｔｅｉｎΔ（１１）　　ホルモン蛋白質 （＋ｉｔｌ　　各種のγ−免疫グロブリン（Ｉ＆）（た
とえばＩ％、ＩｆＭ、Ｉハ、１四、ＩｆＩＥ）染　　料 （１）ナイルブルー（Ｃ，Ｔ、！；／　／　ｇ　Ｏ）（
１１）　　タレジルバイオレット（Ｃｒｅｓｙｌ　ｖｊ
ｏｌｅし）（ｉｉｔｌ　　トルイジンブルー（ｃ、ｘ、
５２０ＱＯ）（１ｖ）　　ブリリアントクレジルブルー
　（Ｃ１Ｉ、　５１０１０）架橋剤 （１）　　一般式 ％式％ （ここでＲは置換または未置換のアルキレン基、アリー
レン基、アルキルアリーレン基まりはアリールアルキレ
ン基である）で表わされるジインシアネート （１１）一般式 ％式％： （ここでＲおよびＲ１は同一または異なる置換寸たハ未
置換のアルキル ルアリール基″ｉ！たはアリーＪレアｌレキル吊で．ら
る）で表わされるカルボジイミド （ｉｉｉ）　　一般式 ％式％（０ （ここでＲは置換または未置換のア／Ｌ．キレン基、ア
リーレン基、アルキルアリーレン基１りＱ“１アリール
アルキレン基である）で表わさ扛るジアルデヒド （１ｖ）構造式 で表わされるエチレン−無水マレイン酸共重合体（　Ｅ
ＭＡ　） （Ｖ１式 ヲ有するジニトロベンゼン これら３つの化合物の間の反応は、これら化合物を単独
で使用して行なうことができ、またこ水ら化合物用の溶
媒、たとえば水、少なくとも１種類の塩の水溶液源たは
緩衝剤混合物の存在下でも行なうことができる。酵媒の
ｐｉ（ｎ’１．！ｉないし９．５で、染料の溶解度を高
めるために少酸のＭ機溶媒を添加してもよい。反応温度
はほぼ室温（４（−５°Ｃないし蛋白質変性温度）であ
る。 蛋白質−市白質間の反応を防止するため、蛋白質に対し
て大過剰量（４１ないしＳＯ倍のモル濃度）の染料全使
用して反応を行なう。 また、ボ白質と染料との総：１ｔに対して大過剰量の架
橋剤を使用して反応を行なう。 操作上の詳細については以下の’４４例により明らかに
なるであろう。しかしながら、これらの実施例は本発明
を限定するものではなく、い乃・ｆ

【る種類の物質につ
いても有利に適用できる。 実施例／ 抗ヒト免疫グロブリンＧ家兎血清（抗ヒト＋ｙｔＱの免
疫グロブリンフラクションを、二官能性４勿“改として
グルタルアルデヒドを使用して、ナイノ）゛ルー（Ｃ，
１，！；／／ｇＯ）およびトルイジンブルー（’Ｃ．ｒ
．！５２０１ＩＯ）でマークした。 まず、リン酸カリウム緩衝剤（　０．０　／　Ｍ　、　
ｐｌ＋　’）、／　）／　ｍｌ中に抗ヒトＩｙＧ２９お
よびナイルプルー７、３×ＩＯ−４ミリモルを含有する
＠液に、最終のダルタルアルデヒド濃度が０．０５％と
なる壕でグルタルアルデヒドを添加した。室温において
攪拌しながら反応を３０分間行ない、ついで遊離のア）
レデヒド基ヲ唾硫酸水素ナトリウムにより捕集すること
により反応を停止した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　０　、２
　！ｉ　　のクロマトグラフィーにより未反応の染料を
除去した。 代表的な実験例では、蛋白質：染料のモル比力；ｔ　：
　ｌ，ｇの螢光抗ヒトＩｇＯーナイルブルー複合体、あ
るいＵ／：／．、２の抗ヒトｌｙｏートルイジンブルー
複合体が得られた。 染料の濃度金、ナイルブルーについてはモル吸収係数ｓ
，ｇＸｉｏを使用してλ＝４ｊ５ｎｍにおいて、トルイ
ジンブルーについてはモル吸収係数、３，／×１０を使
用してλ＝Ａ２０ｎｍにおいて測定した。 蛋白質濃度についてに、ε（係）−／＋，　　λ−２ｇ
Ｏｎｍ　　ｆ使用し、紫外域での染料の吸収を補正する
ことにより、あるいはケルグールミクロ法により窒素を
測定することにより算定した。 両複合体とも、結合ヒト免疫グロブリンの抗体特性を明
確に維持していた。 実施例コ 三官能性物質としてグルタルアルデヒドヲ使用し、ヒト
絨毛模性ソマトマモトロピン（ＨＯＳ）とオキサジン系
染料、すなわちブリリアントクレジルブルー（　ｃ．１
．ｓｉｏｉｏ　）　　との間の複合体を調製した。 Ｈ　Ｏ　Ｓ　２．３　ｍ／ｌおよび染料！×１０　　：
リモルｆ含有するリン酸ナトリウム緩衝剤（　０．０　
！；　Ｍ，　ｐＨ７．Ｓ）’　ｍｅ　Ｋ　、最終グルタ
ルア！レデヒド濃度が０．／　％となる１で、グルタル
アルデヒドを添加した。室温で１時間反応を行なったの
ち、実施９１　／　’（７）　’ａ口くｙ丈応溶液を処
理してＨＣＳ：ブリリアントクレジルブルールーのモル
比が／：／の複合体を得た。 染料の割合についてはモル吸収係数／Ａ！；００ｆ使用
してλ＝６３３　において、■−］ＣＳ　　についてｒ
１ε（％）＝ｇ．３’ｆｒ使用してλ＝＝ｊｙ７　ｇに
おいて棋１１定した。 実施例３ 架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用し、実施例１と
同じ条件下で、ナイルプルーとスタフィロコッカス　ア
ウレウスからのＰｒｏｔｅｊｎ　Ａとの間の複合体を調
製した。 この複合体の蛋白質：染料のモル比はｌ：／．Ｓであっ
た。 この場合、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａの測定にあたり、ケｌレ
タールミクロ法を使用しない場合には、ε（％）ニア、
４５。 λ＝２？Ｓ′ｆ：使用する。 実施例ダ 構造式 を有するトルＣ杉−コ、ｌＩ−ジインシアネート（ＴＤ
Ｉりを二官能性物質として１更用し、抗ヒト免疫グロブ
リン（抗ヒトＩ＃Ｇ　）　ｋナイルブル−（Ｃ，Ｉ、　
Ｓ”／　／８０）でマークした。 反応全コ段階で行なった。第１段階では、９位のインシ
アネート基を抗ヒトＩＩＧのＮＨ２と反応させる。第２
段階では、遊離のｌ’　Ｄ　Ｉ　Ｃを含有しない抗ヒト
１４０−　ＴＤＩＣ複合体に３７°Ｃでナイルプルーを
添加し、第一のインシアネート基を染料のアミノ基と反
応させる。 工程／ リン１竣カリウム緩衝剤（ｐＨ７，Ｓ、０．０！；Ｍ）
中にｒ−免疫グロブリンＳツを含む溶液（ｏｏｃに冷却
したもの）にＴＤＩ　Ｃθ、０３＠ｌを添加した。激（
〜く攪拌しなから０　”Ｃで約３ｏ分間反応を行ない、
混合物を遠心分離してＯ″Ｃにおいて水溶液中で沈殿す
る未反応のジイソシア礼−トヲ除去した。溶解し；ｌ’
ｙＴＤＩｏを反応させるため、上清液１ｒ：ｏ　’ｃで
さら［／時間反応させた。 工程コ 工程ｌの溶液に、ナイルブルーｔ　ｏ＝　ミリモルを含
有するリン酸塩緩衝剤０．ｌＨｌを添加した。反応溶液
を３７°Ｃで７時間攪拌し、ついで未反応インシアネー
ト基金分解するために０．／　Ｍ炭酸アンモニウムに対
して透析した。遊離の染料についてに、蒸留水まには中
性の緩衝剤に対する透析および５ｅｐｈａｄｅｘ　０２
５のクロットゲラフィーにより除去した。 得られた購合体における蛋白質：ナイルブルーのモル比
はｌ：コ、ｑであった。なお、こｎらの算定にあたって
は、実施例／で蛋白質および染料について示した方法お
よびモル吸収係数を使用［７た。 この複合体の螢光強度は、同じ濃度で遊離の発色団を励
起する際に帰られるものよりもがなり高いものであった
。 実施例Ｓ 構造式 ％式％） を有する／−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド（ＥＣＤＩ）　　’ｉ使用して、
ナイルプル−（ｃ、Ｉ、ｓ／／ｇＯ）をスタフィロコッ
カス　アウレウスからのＰｒｏｔｅｉｎ　Ａと結合させ
た。 蒸留水／、２＠ｌ中にＰｒｏｔ、ｅ】ｕ　Ａ　５９およ
び大過剰量（約１０倍モル）のナイルブルーを含有する
溶液にＥＣ，ＤＩｊθりを添加した。攪拌しながら室温
で７時間反応を続け、その間、希）Ｉρβを添加するこ
とによりｐＨ全６ないし６．８に維持した。その後、水
をｑ″！！たは５回交換しながら生成物をｌ１ｇ時間透
析した。透析暎円で形成されたコロイド状懸濁液を遠心
分離により除去し、溶液中になお存在するｔｉ離の染料
を５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｏ２５のクロマトグラフ１−に
より除去した。 複合体中におけるナイルブルーの濃度については、水中
におけるモル吸収係数！；０ｇ　Ｘ　／　０　　を使用
し、λ＝６３５　で測定した。蛋白質の濃度については
、ε（％）　：　／、４　Ｓを使用してλ＝　２７５　
ｔｏｎで測定し、紫外部における染料の吸収を補ｉＥす
ることにより算定した。また、より王権には、ケ／Ｌタ
ーールミクロ法により窒素を測定することにより算定す
る。 代表的な反応により、Ｐｒｏｔ、ｅｌｎ八：ナイルブＩ
し−のモル比が／：ｌないし／、５（このモル比Ｑ−１
反応時間および反応温度を変えることにより変えＣ〕レ
ル）であり、λ−ｔｌｉＯｎｍにおける螢光強度が同じ
濃度で遊離の発色団を励起することによって得られるも
のよりも大きい複合体が鍔られた。この方法でマークし
ｆ７　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａは、家兎Ｇ免疫グロブリンで
感作した羊赤血球のＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ−ナイルブルー
による凝集反応でなる受動血球凝集テストにより示され
る如く、結合免疫グロブリンの特性を維持していた。 実施例乙 実施例Ｓの方法に従って、ＥＯＤＩ　　の存在下、ホル
モン蛋白質、すなわちヒト絨毛膜性ンマトマモトロビン
（＋−１０３）’ｉｉナイルブルーでマークした。 各試薬の量についてｆｆ、１（Ｃ８２，３岬、メタノー
ル０．０！；１ｎｌに溶解したナイルプルー１０　　　
Ｓ９モルおよびＩｆｌＯＤＴＩｉＺＳ９であり、反応を
水、２　ｍｅ中で行なった。 蛋白質の濃度はε（％）＝ｇ、３を使用し、２２２７ｇ
で測定した。 得られた螢光複合体はモル比ＨＯＳ　：染料＝ｌ：／を
イイしており、ホルモンは抗ＨＣＳ　　抗血清と反応さ
せる際、その抗原特性を維持していた。 実施例？ ＥＣＤＴ　　の存在下で家兎γ−免疫グロブリンをマー
クするためにトルイジンブルー（ｃ、ｘ、５２ｏｌＩｏ
）を使用した。 反応の詳細は次のとおりである。 水２　ｍｅ中にγ−免疫グロブリン３ツおよびトルイジ
ンブルー２×１０　　：リモルを含有する反応混合物を
、希ＨｒｅでｐＨＳ、Ａに調整した。ＥＣＤＩ２Ｓツを
加え、攪拌しながら室温で反応を行なった。約２時間後
、さらにＥＣＤＩ　　２！ツを加え、さらにコ時間反応
を続けた。最後に、水または１オン強度の低い中性緩衝
剤に対してｐｇないし７２時間透析した。 染料についてはモル吸収係数＝Ｊ、／　Ｘ　／　０’、
λ＝６コＯｎｍ％計白計尺質いてはε（％）　＝　ｔ　
４Ｉ。 λ−２ｇＯｎｍにより測定して、調製された複合体のモ
ル比蛋白質：トルイジンブルーを算定したと／、ｌ ころ、ｌニー−であった。 このようにしてマークしたγ−免疫グロブリンは抗γ−
免疫グロブリンの存在下で、その免疫特性を維持してい
た。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、本発明による調製された各種の
複合体および対照の発光スペクトルを示すグラフである
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ／　一般式 （式中、ｎは／ないしｑの整数であり、ｍは前記ｎに等
   しい整数またば０であり、Ｐは蛋白質であり、Ｌは架橋
   剤の残基であり、ｘに酸素原子またはイオウ原子であり
   、ＹはＮＨ１ＮＦ＋２．　ＮＲ’　　およびＮＲ’Ｒ”
   　（ここでＲ１およびＲ′　は同一または異なる置換ま
   たは未置換のアルキル基、アリール基、アリールアルキ
   ル基まｌｃ　Ｉｒｅアルキルアリール基である）および
   ０００Ｉ（’　（ここでＲ１は前記と同意義を有する）
   の中力）ら選ばれる基であり、Ｒ，、ｉ１２．　Ｉ＋、
   、Ｒ４、Ｒ５，Ｒ，およびＲ８は同一またば異なる水素
   原子、アミノ基または置換または未置換のアルキル基、
   アリール基、アルキルアリール基またはアリールアルキ
   ル基であり、１（。 およびＲ２および／丑たはＲ７および、ｔ１４８Ｃ：Ｊ
   ：互いに結合して芳香環との縮合環を形成するコ価の基
   であってもよく、Ｒ，、Ｒ２、Ｒ３、ｌべ４、Ｒ５、Ｒ
   ，およびＲ８のうち少なくとも１つは架橋剤との反応の
   際−ＮＨ−Ｌまたは−Ｎ−１、−基を形成するアミノ基
   でなければならない）ヲ有する免疫螢光試薬。 コ　一般式 （式中、ｎは／ないしｑの整数であり、ＩＩＩは前記ｎ
   に等しい整数または０であり、Ｐは蛋白質であり、ＬＨ
   架橋剤の残基であり、又は酸素原子またはイオウ原子で
   あり、ＹはＮｌｌ。 ＮＨ２，ＮＲ’およびＮＲＩＲ＃　　（ここでＲ１およ
   びＲ“は同一または異なる置換捷たは未置換のアルキル
   基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルア
   リール基である）および０ＣＯＲ’　（ここでＲ１は前
   記と同意義を有する）の中から選ばれる基であり、Ｒ，
   、Ｒ２ｓ　Ｊ、Ｒ，、Ｒ５，Ｒ，およびＲ８は同−筐た
   は異なる水素原子、アミノ基または置換または未置換の
   アルキル基、了り−ル基、アルキルアリール基またにア
   リールアルキル基であり、Ｒ７およびＲ２および／ま７
   ”ｔｌｄＲ，およびＲ８は互いに結合して芳香環との縮
   合環を形成する２価の基であってもよく、Ｒ，、Ｒ２、
   Ｒ５，Ｒ，、Ｒ５、Ｒ，およびＲ８のうち少なくとも１
   つに架橋剤との反応の際−ＮＨ−Ｌまたは−Ｎ＝Ｌ−基
   を形成するアミノ基でなければならない〕ｋＮする免疫
   螢光試薬の製法において、以下の群（ａ）、（ｂ）およ
   び（ｃ）の・ら選ばれる各々少７：Ｃくとも１種類の化
   合物音４いに反応させることを特徴とする、免疫螢光試
   薬の製法。 ｌａ）　　蛋白質、 （ｂ）　　町睨域に吸収（λｍａｘ　はＳＳＯないしｇ
   ｏｏｎｍにある）をもつオキサンン丑た汀チアジンから
   選ばれる染料、および （ｃ）一般に前記染料（ｂ）のアミン基と反応しつる基
   を有する二官能性物質の形の架橋剤。 ３、　　＠記載つの化合物の間の反応を、これら化合物
   のみを使用してまたはこれら化合物用の溶媒の存在下で
   行なう特許請求の範囲第一項記載の製法。 ダ　好ましくは水、少なくとも７種類の塩の水溶液また
   は緩衝剤混合物、の存在下で反応を行なう特許請求の範
   囲第一項または第３項記載の製法。 ｒ、　　ｐＨダ、Ｓないしｑ、ｓにおいて反応を行なう
   特許請求の範囲第２項ないし第ｑ項のいずれが７項に記
   載の製法。 ム　はぼ室温において反応を行なう特許請求の範囲第コ
   項ないし第５項のいずれが１項に記載の製法。 ７　反応温度が好捷しくにｑ″Ｃないし蛋白質変性温度
   の範囲から選ばれる特許請求の範囲第２頃ないし第６項
   のいずれ力・７項に記載の製法。 ｇ　　ｒｔｉ白質に対して大過剰量の染料を使用して反
   応を行なう特許請求の範囲第２項ないし第９項のいずれ
   か７項に記載の製法。 ｑ　ｆｉ白質に対してダないしＳＯ倍（モル濃度）の大
   過剰量で染料を使用して文応を行なう特許請求の範囲第
   一項ないし第８項のいずれが７項に記載の製法。 ｌａ　蛋白質および染料の総量に対して大過剰の二官能
   性物質を使用して反応を行なう特許請求の範囲第２項な
   いし第９頃のいずれが１項に記載の製法。