JPS6038655A - イムノアツセー用粒子試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は比濁イムノアツセーに使用される粒子試薬、そ
してよシ特定的には生物学的に関心ある化合物のラテッ
クス粒子への結合のための親水性重合体結合基を有する
そのような試薬に関する。

〔発明の技術的背景〕

凝集（アグルチネーション）反応は長い間、人混な種々
の細菌、細胞表面抗原、血清蛋白質および臨床的関心の
あるその他のアナライトの視覚的（半定量的）および定
月的アツセーに使用されてきた。二価抗体と関心ある多
価抗原との反応から凝集が生じて凝集塊が生成する。こ
れを種々の方法で検出および／または測定することがで
きる。同様に，同一の反応は相幽する抗原の添加によｐ
生ぜしめられる凝集反応により特異抗体の検出に対して
使用することができる。

一般に大形の交叉結合集塊（アグレゲート）を生成させ
るためには抗原上の反応部位の数は少くとも２でなくて
はならない。−価ハブテンの検出が所望されている場合
には、反応スキームはｖ下のように修正されなくてはな
らない。

すなわち多価形態の抗原例えばハプテン−蛋白Ｊ４コン
ジュゲ゛−１・を生成させそして試料中に存在する遊１
’ｌＩハブテンを抗体の利用可能結合部位に対してこの
多価形態のものと競争させ、それによってん（集忙乞減
少せしめる。この技術は凝集用−１１と呼ばれている。

多価形態のハプテン製造は当技術分野では古いイ）ので
ある。往々にしてハプテンを免疫源の１１　Ｋ、＋Ｔに
おい°ｒ４施されるように担体蛋白質に結合させる。反
応の化学量論性は蛋白質１分子当ｖ３またはそれ以−ヒ
のハプテンを加えるように調整される。正確な数はその
物質の利用される特定のアツセーの璧求によυ決定さり
、る。

凝集またはその阻害の視覚的または機器的測定のための
感朋増大は担体として可溶性蛋白質または蛋白質コンジ
ュゲートではなく粒子試薬を使用することにより達成さ
せることができる。

例えばニワトリ卯アルブミンに対する抗血清はニワトリ
卵アルブミン自体を沈降させる場合よりも、コロイド粒
子上にコーティングさせたニワトリ卵アルブミン沈降の
場合において２０口Ｏ倍感度が高い［Ｈ，Ｎ、　Ｒ１５
ｅｎ氏著「工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｊ第３９４頁（１９
７４年）参照〕。

抗体粒子試薬もまた知られている。そのような試薬の製
造に対する一般的方法は、適当な吸着剤の表面に抗体を
吸着させることである。ポリスチレン重合体のラテック
ス粒子がこの目的に対して広く使用されている。しかし
これら試薬は保存または使用の間に脱着を生じて試薬の
性質の変動を招来しやすい。これは次いでアツセー感度
および再匁、性に悪影響を与えうる。

この脱着の問題を克服するために粒子表面に生物学的関
心のある化合物を共有結合的に結合させることによって
粒子試薬を製造することができる。ポリスチレン重合体
を変性して共有結合蛋白結合を生成させうる官能基を包
含せしめる。米国特許第４，０６４，０　Ｂ　Ｌ１号明
細書は末端アミノフェニル基を肩し且つそれに蛋白質を
結合せしめたスチレン１合体を開示している。米国特許
第４，１８１，６３６号明細書は水浴性活性剤によって
免疫学的に活性な物質にカップリングせしめたカルボキ
シル化ラテックス重合体およびそれらの凝集試験におけ
る診断試薬としての使用をｊｌ示している。米国特許１
４４，２１０，７２５号明細書は粒子表面に遊離エポキ
シ基を有する直径０．１５〜Ｌ５μｍのシェル−コア（
殻−芯）ラテックス重合体粒子およびこれらエポキシ基
を介しての蛋白質のカップリングを記載している。

以後の免疫学的活性物質の結合のためにその他の重合体
系も開発された。米国特許第４，２６４．７６６号明細
書は０．０１〜０．９μｍの粒子サイズを有しそしてカ
ルボキシルおよびアミノ基のような活性基を有しそして
これに水溶性多価ヒドロキシ化合物を共有結合的に結合
させることのできるラテックス重合体を開示している。

活性化剤例えはカルボジイミドの使用によって、免疫学
的活性な物質はラテックス粒子／多価ヒドロキシ化合物
担体に結合されて診断的に有用な試薬を生成する。

米国特許出願第３１５．９２２号明細書は、内部コアが
光散乱測定に対して高い感度を与えるような高い屈折率
を有してお、す、そして外側シェルが生物学的関心ある
化合物を直接か甘たは蛋白性物質を介して結合させうる
官能基を含有しているシェル−コア重合体粒子を開示し
ている。

通常、生物学的関心のある低分子量化合物（アナライト
）はラテックス粒子に直接は結合嘔れない。この即由は
そのような粒子試薬は在住にして適当な抗体と混合した
場合良好には凝集せず、またはそれらは粒子表面への共
有結合に適当な官能基に欠けているからである。これら
の問題を克服するためにアナライトを通常はブリッジま
たはスペーサー成分を介して粒子に結合される。

最も一般的に使用されるスペーサーは蛋白質またに糖蛋
白質例えばアルブミンである。人血ｉＹｔアルブミン（
Ｈ８Ａ）　１１アナライトおよび粒子表面１ｉｌｉｉ者
上のアミン反応性基とのカップリングにおいて使用でき
るアミノ基を多量に有する水溶性蛋白質である。

アナライト−蛋白フンシュゲートから製造される粒子試
薬は一般に大なる有用性な示すけれども、それらの使用
に関してはいくらかの不利点がなお存在している。蛋白
質の溶解性および安定特性はアナライト−蛋白質フンシ
ュゲートの形成およびそれの粒子への結合に対して使用
しうる化学的手段を限定している。蛋白Ｉｊｊは極端な
温度およびｐＨにより変性され、そして往々にしてこれ
は有機溶媒には不溶である。更に親水性蛋白質でさえも
疎水性部分を有しており、この中に疎水性アナライトが
埋没されうる。粒子試薬の長期保存は蛋白質の加水分解
、酸化。

コンホメーション変化、および微生物的分解を生ぜしめ
うる。最後に、蛋白質スペーサーは抗アナライト抗体に
よシ認識される抗原決定基を含有しうるのであり、これ
はアッセーにおりる非％異的凝集の結果となる。

臨床的餘断での使用のための粒子試薬の製造に利用しう
る親水性で化学的に良好に定義された結合基に対する要
求が存在している。

〔発明の概要〕

本発明の粒子試薬は （Ａ）　ナトリウムＤ線の波長で測定して１．５４以上
のＪｉｌｔ折率乞有する重合体である「内側コア」およ
び（１）　エポキシ、カルボキシおよびアルデヒドより
なる群から選ばれた親水性重合体リンカ−と反応しうる
官能基を有するエチレン性不飽和単証体、 （２）場合により重合体粒子を実質的に水不溶性とする
に充分な量のその他のエチレン性不飽和単量体、および （３）外側シェルの１０重量部ン越えない内側コアの単
量体 の重合体であって前記内側コアの存在下の重合によフ形
成された「外側シェル」 を有しそして大約００３〜０．１μｍの直径範囲を有し
ている重合体粒子、および φ）笑験式 ％式％） （式中ＲはＨおよび／またはＣＨｓでおり、Ｘは０〜７
０であシそしてｙは１〜２０である）の親水性重合体リ
ンカ−を介して前記重合体粒子と共有結合的に結合され
ている生物学的関心のある化合物 から本質的に構成されている。

生物学的関心のある化合物を測定するための、本発明の
方法線 （４）下記（１）、（２）および（５）すなわち（１）
　（ａ）　ナトリウムｐ線の波長で測定して１．５４以
上の、屈折率を有する重合体である内側コアおよび （１）　工〆キシ、カルボキシルおよびアルデヒドより
なる群から選ばれた親水性 重合体リンカ−と反応しうる官能基を 有するエチレン性不飽和単量体、 （ＩＩ）　場合によりその粒子を実質的に水不溶性とす
るに充分な量のその他のエチ レン性不飽和単量体、および （ｍ）　外側シェルの１０重量部を越えない内側コアの
単量体 の重合体であって前記内側コーテの存在下の重合によシ
形成された外側シェル を有しそして大約０．０３〜０．１μｍの直径範囲を有
している重合体粒子、そして （ｂ）　実験式 ％式％ （式中ＲはＨおよびまたはＣＨｓであシ。

Ｘは０〜７０でありそしてｙは１〜２ｏである）の前記
親水性重合体リンカ−によって前記重合体粒子と共有結
合的に結合された生物学的に関心ある化合物 から本質的になる高屈折率を有する粒子試薬、 （２）生物学的関心ある化合物を含有すると考えられる
液体、および （３）凝集剤 を培養し、そして （Ｂ）　光学的に凝集から生じた増大された粒子サイズ
を測定する 各段階を包含している。

本発明のポリエーテル−ポリアミン親水性リンカ−は水
および多くの有機溶媒に可溶であり、化学的および熱的
に安定であり、そして微生物分解に対して抵抗性であり
、抗蛋白質または抗（ハプテン−担体コンジュゲート）
抗体と先般学的に交叉反応性でなく、そして疎水性部分
を有していない。結合剤としての蛋白質に対するそｉし
らの置き換えはまた、粒子ペースアツセーの精度の改善
、所望のシグナル水準の達成に要求される抗体量の低減
およびポリエチレンエーテルグリコール（ＰＩｎＧ）の
このアッセーの依存性の減少のような予期せざる利点を
有している。

〔発明の詳細な開示〕

本発明は生物学的関心のある化合物（アナライト）を高
屈折率ラテックス重合体粒子に親水性重合体結合剤を介
して結合せしめた比濁イムノアノセーに使用するための
改善された粒子試薬の製造に関する。

この粒子試薬は、 （１）　高い屈折率のコア物質から形成場せることによ
り、 （２）ポリエーテル・ポリアミン親水性リンカ−に共有
結合的に結合しうるシェル物質を含有させることにより
、そして （３）　イムノアッセーにおける至適感度のだめの小粒
子サイズのものであることによってイムノアッセーの感
度を最大とするようにデザインされてｈる。結合剤は水
性および有機溶媒に可溶性であり、化学的および熱的に
安定であり、化学的に良好に定義されておりすなわち再
現性可能であり、そしてアナライトおよび粒子表面両方
のアミン反応性基に共有結合的に結合しうるようにデザ
インされている。

粒子懸濁液の光散乱性はいくつかの変数に依存するが最
も重要なものは粒子サイズ、コアおよび懸濁媒体の屈折
率、および測定に使用される光の波長である。すなわち
コア材料、粒子サイズおよび凝集反応の検出波長の選択
はすべてアツセー感度の至適化に対して重要なファクタ
ーである。これらのファクターは使用される光散乱検出
手段のタイプにより決定されうる。

ある測定波長における粒子サイズ変化の濁度検出に対し
ては、粒子サイズおよび屈折率を注意して選ぶことが必
要である。その理由は濁度計シグナルは最大値を経てピ
ークにおいてほとんどまたは全く感度のない二重値反応
を示すからである。それに加えて、勾配感度はピークの
小粒子サイス側では大粒子サイズ側よジも犬であり、そ
してそれは粒子の媒体に対する屈折率比の増大と共に上
昇する。

これらの理由の故に、高い屈折率の小形粒子および短い
波長の検出系が最大感度に対しては好ましい。蛋白質お
よびその他の成分による光吸収の故に、血清中の試料の
測定に対しては紫外線領域では実際的制限が存在してい
る。すなわち便利な波長は約５２０　ｎｍ以上のもので
ある。

より長い波長を使用しうるが感度はより低い。

小形粒子すなわち約０．１μｍ以下の直径を有するもの
が増大した勾配感度およびより迅速な反応速度の両方の
故に好ましい。安定性および合成上の便利さの理由から
約０．０３ｐｍＪＪ上の粒子サイズが好ましい。一般に
０．０３〜０１μｍの粒子サイズ範囲を本発明の粒子試
薬中で使用することができる。

いくつかの異つ几光散乱側足法例えば比濁法（ネフロメ
トリー）、粒子計釣、準弾性（ｑｕａｓｉｓｌａｓｔｉ
ｃ）光散乱、自動相関分光分析および粒子の非対称性ま
たは極性の測定を使用しうる。

本発明の粒子試薬を使用した免疫長比、の測定の好まし
い方法は濁度によるものである。その理由は臨床実験室
では一般に使用可能な分光光度計以外の特別の装置を必
要としないからである。

分光光度泪は凝集反応により形成された粒子集塊に由来
するみかけの吸収上昇を記録する。これら集塊は光学ビ
ームの外に光を散乱させ、すなわち検出装置に達する光
の量を減少させる。

￥際にはみかけの吸収はアナライトにより生ぜしめられ
た凝集阻害の逆の尺度である。凝集の間に生ずる開度変
化な至適化させるためには粒子ライスを注意して選ぶこ
とが重要である。

凝集反応の間に有効粒子サイスれ上昇する。

従って高感度測定のためには、ある与えられた粒子ザイ
ス変化に対するシグナル変化が至適となるような波長を
選択することが重要である。

んｌ：集反応の濁度検出に対する屈折率の重要性の故に
、コア物質は所望のアッセー感度に対してＷ１容しうる
シグナル変化を生成するようなも　１のに限定さノＬる
。すなわち高い芳香性および高い原子Ｊ、ＨのＩＮ′Ｌ
ＪＧ！基を有°ノーるコア沌合体が脂肪族重合体よりも
好筐しく、そして一般に昂い屈折率４）　１１＜合体が
低い屈折率の重合体に比べて好ま（、ｔ、ｎ・　。

重合体粒子の内側コアは高い屈折率を有する大なる物質
群から選ぶことができる。好ましいのは最終粒子サイズ
が制御可能でありそして実質的に均一となるように乳化
重合により製造することのできる物質である。重合体粒
子の内側コア中に使用される典汲的重合体は１５４り上
（Ｎａ　Ｄｍ５６９ｎｍにおいて）の屈折率を有してい
る。屈折率は波長の函数なのであるから、散乱性は測定
の波長に依存する。一般に屈折率はよυ短い波長におい
てよυ大である。コアＭ（合本は濁度測定用に選ばれた
波長の光ビ吸収しではならないことが理解されている。

内側コアの製造に対して関心ある単開体は高−屈折性を
付与する置換基例えばハライド、芳貯族基、複素環状基
、不飽和基首には炭素環状的に加えてビニルまたはアリ
ル基を含有するもＤである。

本発明の粒子試薬の製造に有用な重合体粒子Ｑコ、主と
して乳化重台により製造することができる。段ｌＸ１ｓ
的′ｉＬ化ｊｌｉ合はｎＤ＝１．５４以上の所望の屈折
率に近いコア／シェル重合体を導き得る。所望の屈折率
の重合体を得るためには、シェル重合体が重合体粒子の
約１０　ｔｉ（：ｌｉｉ：部を越えないことが好ましい
。

１１１−合体粒子の粒子サイズ制御のための便利な方法
は、最初に使用される表＋１４ｉ活性剤の量によりその
粒子サイズが制御しうるような柚子乳剤を製造すること
である。柚子乳剤の製造後、追加の単お体および表面活
性剤を制御された速度で加えて柚子乳剤中の粒子サイズ
を上昇させることができる。

重合体粒子の外側シェル重合体は結合させるべき親水性
結合基と反応しうる官能基を有する広範囲なエチレン性
不飽オロ単鼠体から製造することができる。場合により
、外側シェルはまた内側コアの製造に使用された単量体
を含むその他のエチレン性不飽和単量体をも含有しうる
。

コアに対するシェル重合体の結合は、コア１合体中の残
存エチレン性不飽和基への官能性単量体のグラフト重合
によって達成できるし、または官能性単量体をコアのま
わりで１合させて隣接シェルを生成させることができる
。好ましい単量体としては、エポキシ基を含有するもの
、例えはグリシジルメタアクリレート、グリシジルアク
リレート、ビニルグリシジルエーテルおよびメタアリル
グリシジルエーテルがあげられる。その他の官能基とし
ではカルボキシルおよびアルデヒドがあけられる。

コア単量体の変換を実質的完了まで笑施して、シェル重
合体が未知の組成の共重合体でなく、ホモ重合体または
既知の組成の共重合体となるようにすることが好ましい
。９８％ｖ上の変換はコア乳剤の温度を重合の終りに釣
９５℃まで上昇させることによって達成できる。その表
面が未知の組成の共重合体である粒子が生成する確率を
更に低下させるために、シェル−＋４１ｎ体をバッチ的
ではなく徐々に加えることができる。

そのような方法においては、残存コア単量体はシェル重
合体形成の初期の間に消費されうる。

使用さり、る単量体がエホ゛キシ基を含有するものであ
る場合には、シェル１合体がホモ重合体であることが好
ましい。しかし実際問題として外側シェルの１０重量部
１での内側コアの単量体をイ↑在させることができる。

シェル単指体がアルデヒドまたはカルボン酸基欠含有す
る場合には、水溶性電合体の形成を避けるように注意が
払われなくてはならない。

１なわち例えばアクロレインまたはメタクリルｆ波ケ単
独で使用し゛Ｃホモ重合体シェル構造な生成させること
はできない。しかしながらそれらを水不溶性重合体粒子
を生成させるようなその他の単量体と共重合させること
はできる。

外側シェルは好ましくはホモ重合体であるがしかしこれ
は外側シェルの１０重量部以下、好１しくけ５重量部以
下、そして更により好ましくは２重量部以下の内側コア
単量体を含有しうる。これら単量体は内側コアの重合か
らの残存単量体であシうるしまたはいずれかのその他の
適当なエチレン性不飽和単量体でありうる。

粒子試薬は数種の異った官能性シェル物質を含有しうる
。好ましいのはエポキシ基を含有するものであり、これ
は親水性重合体結合剤による生物学的関心ある化合物の
共有結合的結合に便利には使用されうる。このようにし
て形成された粒子試薬が本発明の主題である。

親水性重合体リンカ−によって共有結合的に結合された
生物学的に関心ある化合物（アナライト）を含有する粒
子試薬の製造に対しては、２つの方法が存在しうる。リ
ンカ−を最初に重イ）体粒子に結合させ、そして生物学
的に関心ある化合物またはアナライトの適当な誘導体を
次いでリンカ−に結合させることができる。適当なｎｆ
Ｊ　’ｒｆ体は比較的穏和な条件下に水性媒体中でアミ
ンと反応しうる官能基例えばエポキシド、アルデヒドお
よびカルボキシル基を含有するものである。アナライト
銹導体中の官能基はラテックス重合体粒子シェル中に存
在するものと同じかまたけ異ったものでありうる。すな
わち誘導体および粒子シェルが共にカルボキシル基な含
有していることができるし、または誘導体がカルボキシ
ル基を含有しそして粒子シェルがエポキシド基を含有し
ていることもできる。結合剤として屡々使用される蛋白
質に対する本発明の、ポリエーテルポリアミンの置換は
通常の方法からの顕著な逸脱は要しない◇この方法の限
界はすべての段階が必ず災質的に水性の環境中で実施さ
れるということである。

あるいはまた、生物学的関心ある化合物またはその適当
な誘導体を最初に親水性リンカ−に結合させ、次いでこ
の生成物を粒子に結合させる。必要な場合には、アナラ
イト誘導体とボ゛リエーテルポリアミンリンカ一との反
応は厳しい条件下に任意の適当な溶媒中で実施すること
ができる。その理由はポリエーテルアミンは多くの有機
溶媒に可溶性であり、酸化的および熱的に安定であり、
そして酸または塩基触媒によって容易には分解されない
からである。すなわち水性媒体中での使用に不適肖なア
ナライト誘導体をここでは使用しうる。例えば酸ハライ
ド、酸無水物、アリルハライド、α−ハロケトン、スル
ホニルハライドまたはスルホネートエステル基な含廟す
るアナライトｇ導体を使用してアナライト−リンカ−生
成物を生成させることができる。これを次いで水性媒体
中で当技術分野で周知の方法によってアミン反応性基を
有するラテックス恵合体粒子と反応、させることができ
る。

しかしながら時としイコンジュゲートとも呼ばれるこの
アナライト−リンカ−生成物は従来技述工のアナライト
−蛋白性コンジュケ゛−トの場合よりも一層アルカリ性
のｐＨ値で重合体粒子にカップリングさせることができ
る。往々にしてこの自由度は粒子表面とのコンジュケ゛
−トの反応を【友ｉキするＸ−７果となる。

アナライトコンジュゲートによる重合体粒子の表面被覆
すなわち生物学的関心のある化合物にλ・Ｊする重合体
粒子の比は化学ｆＩｔ論により、反応時間によりそして
不活性希釈剤による生物学的に関心ある化合物の希釈に
より変動させることができる。完全な被覆は迅速な凝集
速度を与えうるけれども、アツセー感度上昇においては
表面被覆のよｐ少いことが１袈でありうる。

本発明のポリエーテルよりアミンは次の笑験式 ％式％］ 〔式中ＲはＨ，ＣＨ５および出発グリコールの製造法に
よってＨとＣＨ３との両方（例えば生成物がプロピレン
オキシド末端閉止されたポリエチレングリコールから導
かれた場合）であることができ、そしてＸは０〜７０で
ありそしてｙは１〜２０である〕を有している。好まし
くはＸ＝１〜３０、より好ましくはｘ＝１〜１５であり
そしである場合には最も好ましいものはｘ＝１〜２であ
る。一方好ましいのはｙ＝１〜１０．最も好ましいのは
ｙ＝１〜５である。Ｒ−＝Ｈ（ｒ１４リエチレンエーテ
ルポリアミン）の生成物はＰ１！！ＰＡ　として参照さ
れ、一方Ｒ＝ＣＨ５（ポリプロピレンエーテルポリアミ
ン）の生成物はＰＰＰＡとして参照される。

前記式は便利官のために与えられているということを理
解すべきである。Ｒ＝ＣＨＲの場合には、式中のＲ基の
位置は一定されておらずこれは出発馬１料たるグリコー
ルまたＩ′ｉ酸化物のタイプおよび４リエーテルＳ？リ
アミンの製造に使用される反応条件の性質に応じて、近
隣の炭素原子のどちらかに存イ［させることができる。

本発明に使用されるポリエーテルポリアミン１アンモニ
アを例えばグリフールのヒドロキシル数から１ｉ１ｆｉ
−１，テ１５０〜３０００（Ｒ＝Ｈ）（７）範囲の数平
均分子、１１（ｕｎ）を有する適当なポリアル片１／ン
エーテルクリフールのジ（ｐ−）ルエンスルホネート）
エステル（本明細書では以後［ジトシレートエステル」
と称する）と反応させることにより製造される。化学量
論、溶媒および反応条件は反応の初期段階においてトシ
レート基をアンモニアで置換することによって形成され
る第１級アミンがそれ自体追加のトシレート基の置換に
競争しうるものであって縮合重合を与えて所望の生成物
を与えるように選ばれる。

得られるポリエーテルポリアミンは純粋化合物として使
用することができるしまたは反応中に生成されるオリゴ
マー混合物として使用することができる。更にポリエー
テルポリアミン中のポリエーテル鎖セグメントはＸが単
一の独立した値を有している単分散でありうるしまたは
それらはＸが全体的平均鎖長を意味している多分散でも
ありうる。

アンモニアージトシレートエステル反応に対する好まし
い溶媒は純粋の無水で阻害剤不含のテトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）である。反応は好ましくは１００℃で４時間
、シールしたステンレススチール反応器中で自己発生圧
力下に実施される。副生成物たるアンモニウムトシレー
トは１’ｌｌＦに不溶でめりぞしてこれは冷反応混合物
のθｊ過により除去される。

ｙ値により与えられる、そして表１の式中の（＋’ニー
ＮＨ）の後の下に書いた文字により示されている縮合重
合度は、アンモニア対ジトシレートエステルの比率によ
りそして反応成分の濃度により制御される。オリゴマー
生成物は酸滴定に、Ｊ：！ｌ測定される紛塩基性Ｗ紫含
量により特性づけることができる。表ＩＡはポリエチレ
ンエーテルグリコールのＭｎ（ＰＦｔＧ　＋　ヒドロキ
シル数値しり　Ｉｔ　ｒＦ、）のまたは馬から計算され
るＸの函数としての必要なジトシレートエステルが導か
れる特定のポリエーテルアミンオリゴマーの理論的室紮
含釦、を示す。一方々ＩＢは単分散ＰＦ；Ｇ。

（Ｓは適肖な、Ｉｒリエチレンエーテルセグメントを我
わす）に基いた同様のデータを示す。

表　１ μ丑−習ｎ１６０２００５９０５９５８００１０００１
３００２７００ｘ　１２２．１６．４５１１．１１５．
８２０ｊ　２７１５ａ９５ポリエーテルポリアミン Ｈ２Ｎ−（Ｓ−ＮＨ）Ｈ１２，７１０，１５，１５３，
３７２，５１２，００１，５４０，７４Ｅ２Ｎ−（Ｓ−
ＮＨ）２Ｈ１０，０７，９１３，９５２，５７１，９０
１，５２１，１６０，５６Ｈ２Ｎ−（Ｂ−ＭＨ）５Ｈ９
，０９７，１４５，５４２，２９１，６９１，３５１，
０４０，５０Ｈ２Ｎ−（８−ＮＨ）４Ｈａ６０　６．７
５３．３３２．１５　１．５９　１．２７　０．９７　
０．４７Ｈ２Ｎｔ（Ｓ招）ｔｏＨ７，７１６，０２２，
９５１，９０１，４０１，１２０，８６０，４１Ｈ２Ｎ
−（Ｓ−ＮＨ）　Ｈ７，０？　５．５２２．７０　１．
７４　１．２８　１．０２　０．７８　０３７ｘ　１　
２　３ Ｈ２Ｎ−（８−ＮＨ）２Ｈ１０，７８，１７６，０８Ｈ
２Ｎ−（Ｓ−ＮＨ）５Ｈ９，７４７，３７５，４７Ｈ２
Ｎ−（８−ＮＨ）４Ｈ９，２３６，９７５，１５Ｈ２Ｎ
−（Ｓ−ＮＨ）１．Ｈａ２８　６．２２　４．５８Ｈ２
Ｎ−（Ｓ−ＮＨ）　Ｈ７，６２５，７０４，２０表■は
それぞれ２００および５９５のＭｎを有−するポリエチ
レンエーテルグリコールから導かれたオリゴマー混合物
に対する窒素含量の実際に得られた値を示す（すべての
場合成分を１００℃で自己発生圧力下に４時間−緒に加
熱させた）。

Ｖ＝　Ｒの値はオリゴマーの複雑な混合物の平均窒５（
を含１￥乞・表わしているけれども、アンモニア／シト
／レート比の減少およびジトシレート濃度の止子１は補
合重合過程に対して好ましいことが明白である。生成物
の物理的性質はこれを反映している。例えば生成物の粘
度はＤからＧにいくにつれて″Ａ質的１ζ上昇すること
が見出された。

室恭においてＤは粘稠な液体でありそしてＧはワックス
様固体である。

表　Ｈ ＴＨＦ（ｄ）　５００２５０１２５．５００２５０１２
５６５無水ＮＨ５（モル）１１．７　２．９　１．５　
１１．７　５．９　２．９　１．５前記のポリエチレン
エーテルポリアミンはポリエチレンエーテルグリコ−ル
から合成されるがこれ自体は適当なポリエチレンエーテ
ルグリコールから：ｐ−）ルエンスルホニルクロリド（
トシルクロリド）との酸受容体存在下での反応によって
合成される。好ましい酸受容体は第３級アミンである。

「Ｊ、ｏｈｅｍ、ｓｏｃ、（Ｌｏｎｄｏｎ）Ｊ　ｉｉ　
５２２〜１３２５貞（１９５８年）は「ｏｒｇ、５ｙｎ
ｔｈ、Ｊａ集組編第３巻第３６６〜６６７貞１９５５年
）記載の方法の変形を使用してトリエチレンエーテルジ
トシレートおＡＵテトラエチレンジトシレートを合成し
ている。この方法は酸受容体および溶媒の両方としてピ
リジンを使用しており、そしてこれを非常に、！ｆ；い
濃度で存在させている。前記方法によシ合成をれたジト
シレートエステルから製造されたポリエーテルポリアミ
ンは、本発明の粒子試薬の製造に使用された場合、柚々
の比濁イムノアツセーでは良好に機能しない粒子試薬を
与え／こ。この理由は神々の副反応を招来しそしてシト
うレートエステルＭ′を実質的に減少させてしまうｄあ
碩度のピリジンの存在によると信じられる。

本発明に使用されるポリエチレンエーテルグリコ−ルの
合成のための好ましい方法でＵ溶媒としてメチレンクロ
リドを使用し、そして酸受容体としてトリエチルアミン
を使用する。生成物から過剰のトリエチルアミンを除去
することに対しては特別の注意が払われる。これらジト
シレートから生成されるポリエーテルポリアミンは比濁
イムノアツセーにおいて良好に機Ｆ＋にする粒子試薬を
生成する。

ある種のＰＰＰＡ生放物はテキサコ・ケミカル社からシ
ェフアミン（Ｊθｆｆａｍｉｎｅ）の商品名で市場的に
入手ＢＪ能である。

ポリエーテルポリアミンを使用して、ＪＷ　ｊ）ｆｉさ
れる粒子試桑會更にバッフイー、血清成分および表面活
性剤を含有しうる実質的に水性の媒体中ＫＭ、濁させて
光散乱イムノアツセーにυｙ用するための単分散粒子試
薬を生成させることができる。

本発明は更に生物学的に関Ｊシ・ある成分の８１１１定
のための高感度光散乱イムノアッセーに使用するための
免疫学的に活性な安定な粒子試薬に関する。アツセーの
タイプとしては免疫学的対応反応成分を生成させうる生
物流体、細胞および、ｔｉｌｌ織抽出液抽出人混な種々
の物質があげられる。

生物′テ：的ｊ９ｊ・しのある化合物としては血清、崩
漿、唾液、尿丑たは乳蛋白質、薬物、ビタミン、ホルモ
ン％酵素、抗体、多糖体、細菌、プロトシア％４”Ｃ，
ｆ泊・ビールス、細胞および組織抗原およびその他のＪ
ｆｕ液細脳細胞は血液流体物質があげられる。

イムノアソセーはアナライトのタイプおよび吸求される
７＋ｅ度によってａｔ々の方法でデザイン−ｒることが
できる。

比較的晶娘此のアナライト例えば血清蛋白に対し−（＆
ユ、１〜当なわし体粒す試薬を戚接粒子強化比ｉζｊ免
疫沈降アッセーにｌ１１４用することができる。

本発明の方法は通常の免疫沈降技術に比べて上昇した検
出性を与え、試薬コス）ｋ低下させ、そしてよシ少量の
患者試料容量の使用を可能ならしめる。逆に関心ある循
環抗体の検出のためには、対応反応性抗原′または抗体
粒子試薬を直接アツセーで使用することができる。いず
れの場合にも抗原または抗体はポリエーテルポリアミン
結合剤によって粒子上に共有結合的に結合されている。

本発明の阻害イムノアツセー法は菫だ粒子試薬の他に以
後「＃Ｐ、果剤」と呼ばれる粒子ル（系の凝集音生ぜし
める二官能性または多官能性の薬剤全要求する。生物学
的関心ある化合物によシ阻害されうるのはこの凝集であ
る。この凝呆剤は生物学的に関心ある化合物に対する抗
体であ）うるし、または前述したようにポリエーテルポ
リアミンによって生物学的に関心ある化合物に幻フーる
抗体に４（有結合的に結合された重合体わ′ｌすに茫く
粒子に１（桑であシうる。

９４％削はま／（生物学的に関心ある化合′吻とポリエ
ーテルポリアミンとの多１山コンジュゲートでＩ）シう
る。そのようなコンジュケ゛−トは本発明の方法で使用
される粒子試薬が生物学的関心ある化合物に対する共イ
Ｉ結合的に結合した抗体を含イ→しているス゛う合にて
使用することができる。

＋ｖ　ｖｑ＋の異ったアツセー構造をアナライト３１＋
１にに１ψ用゛Ｊ−ることができる。一つのそのよりな
ｄ♀造にふ・いては、ｂＬ原粒子試桑はアナライトまた
ｒ、ｔ　；＋’４当なアナライトの訪導体、ボ′リエー
テルボリアミンお・よび重合体粒子から製造され、そし
てこれら釈Ｉ子のＲｔｉ１１アナライトにょる抗体との
反応の阻害はり１１Ｊ定される。反応は粒子試薬とアナ
ライトとの間の抗体に対する面接的競争によシ、または
アナライトを最初に過剰の抗体と反応させ次いで抗ＩＪ
Ｘ粒子試薬を加えて過剰の抗体と反応させる一連反応に
よＵＪ施しうる。

その他のアッセー構造においては同一または異ったサイ
ズの抗体と抗原粒子試薬との両名を存在させることがで
き、そしてアナライトによる阻害を競争的まンｔは連続
様式で９５施させることができる。抗体または抗原粒子
試薬のどちらかまたは両方がポリエーテルポリアミン結
合剤全使用しうる。

本発明の粒子強化比濁イムノアッセーは一般には水性の
バッファー化媒体中で９４　、Ｍｉｊされるがこれは更
に表面活性剤、保存剤１．・よびポリエチレングリコー
ルを含有しうる。あるす、Ｖ合にσ、それはまたｌＩ４
１清阻簀を減少させるために１ル元ハリ例えばジチオエ
リスリトール（ＤＴＥｉ）　／、（會有させるのが望ま
しいであろう。このアッセーは手作業で実施しうるしま
たはそれはイ更々の自動化１たは半自動化装置１ｃ適応
させることができる。

本発明のアッセーをその他の粒子強化比濁アツセー例え
ばアナライトと粒子との１ムＪの結合剤としてＩＳＡ　
’ｉ使用した米国特許出願第３１５，９２２号明細書記
載のものと比較した場合、いくつかの予期せざる利点が
ポリエーテルポリアミンリンカ−の使用から生ずる。

そのような利点の一つは、アッセーの抗体要求が約１０
倍少なくなることである。往々にしてｈｊ体は製造が国
難でありかつ費用がかがるので、ある与えられたシグナ
ル水準の達成に要求される叶のこの減少は有意のコスト
節約を意味しうる。その他の利点は同一シグナル水準の
達成のためにブツセ−中に要求されるｐｗａ量が大約２
のファクターだけ減少することである。実際に要求され
るＰＦｉＧ濃度はポリエーテルポリアミンリンカ−の鎖
長によって変動する。大約選ばれたポリエーテルポリア
ミンＩ−ｉ、ＰＥＧ　ｉ　ｉ減少させ、そして試薬量が
限定されている多くの自動化臨床分析装置へのアラ七−
の適応を単純化する。

アツセーｒＣ要求される抗体の着と要求されるＰＩＧ量
との間には相関的関係が存在している。

抗体要求のそれ以上の減少は、ブツセ−中のＰＦｉＧ量
の上昇によって達成させることができる。

ポリエーテルポリアミンリンカ−の使用がＰＥＧ要求の
減少を招来するので若干のそのような上昇はここでは受
容されうる。

全く予期せざるそして鳶くべきその他の利点はポリエー
テルポリアミン（ＰＩＵＰＡ）リンカ−が使用された場
合、　ｎｓａ　’）ンヵーを有する粒子試薬を使用する
アッセーに比べて、アッセー精度にオイて約４倍の改善
が達成されることである。

蛋白質リンカ−に比べた場合の合成リンカ−の使用から
（４１られる精度のそのような改善は高度に屯侠である
。その理由４変動係数によシ測定した場合の良好な精度
はすべてのイムノアツセーの成功に対して本質的である
。

本発明を説明する以上の例に２いては、すべての部は７
１′ｌ記されていない限りは重ノイ１基準である。

例　１ テ引フイリンアツセー ｔＡｌ　ポリエチレンエーテルグリコールのシトシレー
トエステルの合成 機械的４：、ｔ　Ｊ゛Ｉ：　＋浅、温度ＭＬ　、添加υ
斗および乾煽窒−仁イ囲気奮保持させる系を付した３を
餐三頭フラスコを氷水浴中で冷却させそして乾ｂａ累で
置換させた。この系は反応全体にわたってわずかに窒素
１６圧に保持されていた。トシルクロリドＣ５４１２ｔ
、１．８モル）全フラスコ中に入れ。

次いで１２００ｄのメチレンクロリドオ加えた。

わずかに吸熱的な溶解の俊、ポリエチレンエーテルグリ
コール〔シグマ・ケミカル社製品１１５０、Ｏｒ、０．
７５０モル、Ｍｎ−２００（ヒドロキシル数による）〕
を速やかに加え、そして容器を１５　Ｏｒ、４のメチレ
ンクロリドで６ｔつた。トリエチルアミン（１９１，２
グ、１．８９モル）を次いてその温度を１５〜１８℃に
保ちつつ１局間かけて滴加した。トリエチルアミン容器
ふ・よび添加Ｐ斗（（１５０ｍのメチレンクロリドで洗
った。反応混合物をその日の残りの間１５〜２０℃で規
拌しそして同−温ｌＷに一晩放置した。トリエチルアミ
ン塩酸塩はこの反応の過石（全階にわたって沈殿した。

反応の開始後約２４時間でこの混合物を水浴中で冷却さ
せ、１時間攪拌して丁べての退加のトリエチルアミン塙
酸塩？分離させ、そしてＧ大１ｊされたフィルターフラ
スコ中に濾過した。Ｐ液ｆＬ第一に塩酸の冷却溶液（５
０〇−水中３２ｒｎｌ　ｌｉ；！％　１（０１）次いで
５００−区分景の冷水で２回抽出した。メチレンクロリ
ド溶ｆｆ　’ｚ　１ｌｌｔ水硫酸ナトリウム（２５０Ｆ
　）上で乾燥させ、溶液を乾燥剤から頗瀉させそしてメ
チレンクロリド全フラッシュエバポレーター（生成物の
温度は決して６５℃以上にはさせない）中で蒸発させた
。すべての痕跡量のメチレンクロリドの除去を確実なら
しめるために、残渣を無水の阻害剤不含テトラヒド口フ
ラン２００　ｒｎｌＫ浴’）’Ｅｌさせ、そして次いて
ｒｉ’Ｊ　ＩＳ’ｌ：同−系外下にフラッシュエバボレ
ークー中で除去させた。

（Ｆｌ　ポリエーテルポリアミン（ＰＥＰＡ）の製造前
ｄ己ｔＡＪからのポリエチレンエーテルレジトシレート
２２８ｖを１５００ｒｎｔの純無水阻害剤不含テトラヒ
ドロフランに溶解させ、そしてこの静液全ステンレスス
チールのオートクレーブ中に入れた。このオートクレー
ブ全ノールし、そして無水アンモニア（６０Ｃ１）ｅポ
ンプで汲み入れた。この攪拌混合物を１００ｃに加熱し
、そしてこの温度に自己発生圧力Ｆに４時間保持した。

オートクレーブを察渦まで耐却させ、そして圧力を徐々
に解放した。このポリニーデルポリアミン−ＴＨＦ溶液
は残存トシルクロリドＣ（ＡＩから〕とアンモニアとか
らの生成物である結晶性アンモニウムトシレートおよび
塩化アンモニウムを含有していた。固体を濾過にニジ除
去し、そしテＴＨＦ　ｉフラッシュエバポレーター中で
蒸発させた。残渣をその重−最の４倍の？′よ水６て加
えそしてこの混合物を約１時間水中で冷却させた。パラ
トルエンスルホンアミドが矛盾の沈殿として分離した。

この混合物を一過しそして最初の残渣の重量の’ＡＫ等
しい量の活性炭（ダルコＧ　−６０）を加えた。この水
性混合物を時々攪拌しつつ加熱沸ｊ曙濾ぜ、Ｂ温１で冷
却させ、そして次いでカーボンと除去するために珪藻土
を通して濾過さ（＃／ｊ、６０〜７０℃の浴温でフラッ
シュエバポレーター中で水を除去した。酸滴定により測
′　定した残（ｌ￥のアミン含綾は６．８ｍθｑ／ｇで
アシ、これはｘ＝２．１およびｙ＝約４に相当する（表
ＩＡ参照）。

ｔＣＩ　デオフイリンーポリエーテルボリアミンコンジ
ュゲ−１・の製造 Ｎ−エチル−Ｎ’−（５−ジメテルアミノプロビノト）
カルボンイミｌ’　＋３．ｊ　ｆ寅＋１７Ｊ　（２６０
叩）をシフ　ノ’−ノ＋；（ルｔＨ：　キ９−ｊ　ト（
５０ｍｅ　）中の８−（３−カル、Ｊ：キソプロビル）
　−１，３−ジメチルキザンｒ−７（ベニンスラ・ラボ
ラドリース社製品、５４０１、櫂）の１１ｊ　ｒｔ、に
加えた。そして仁の浴液を２３Ｃで３１１．：ｉ　ｌ１
ｉ１４Ｍ：４　’ｔ≦した。２０ｍのジメチルスルホキ
サイド中前記（、ＢＩからのポリエーテルポリアミン（
ｔ１３Ｆ、７．７　ｍｅｑのアミン）ヲ加え、そして攪
拌を２６℃で更に１８　Ｉ＋−′Ｆ間つづけた。このよ
うにして得られたコンジュゲー）ｉ’４Ｍ１℃で保存し
た。

ｆＤＪ　テオフィリン−ポリエーテルポリアミン粒子試
薬の製造 前記ｔｃ＋からのテオフィリン−ＰＥＰＡコンシュター
　ト溶Ｗ　（２７ｍｌ　）　ｋ　５ｍＭ１ｊ’４１２す
　ト　リ　ラム（４５０ｍ％ｐＨａＤ）および１０　％
　ＧＡＦＡＯ１−６ｉＱ（ＧＡＦ社より入手可能な陰イ
オン付表面活性１１１１を言イｊ−ノーるｕ、　１５　
Ｍ燐酸バッフ　７−５．４　ｗ、ｌと共にＣ昆合した。

０，２Ｍふ・よび０．０２Ｍ水（憤化すトリウムの＋６
５加によってｐｌｌを１０．０〜１０１に潤整した。米
１１ｊ１９許出願第３１５；９２２−号明卸ｊ汁Ｑ例４
に記・戊のようにして製造されたエポキシ′ばＩｌｌと
性ね予誹イラ由−合体粒子ラテックス（１７％１ｊｉ１
体分、６４．８ｒｎｌ）づＩ’　Ｉ’／＜い−（加えそ
してこの１１メ１］物を２時１’ｔｌ伍４４−シつつ７
０しに加ｌゼ（しグこ。

この反応：　＋ｉＩ、自物を冷却し、０．１係ＧＡＦＡ
ＯＲＥ−６１１Ｊ　’ｊＩ：　ｋ”１４する１　５　ｍ
Ｍ　ｊ７ｔｊ　（ｄ　／’ソファー（ｐＨ７，０）６０
Ｏｒｒ＋ｌを加え、そして６１％分坩で、１６時間８０
００　ｒｐｍで遠心させた。土市截°を頗瀉させ、そし
て各−々レットを０，１係ＯＡおＡＯを含有゛ｒる１５
ｍＭメｊ’′ｔＩＳ２バッファー（２００ｍｌ　％ｐＨ
７，０）中で超粋波処理′□Ｊ−ることによって１１）
へミ濁させ、再び１３．００　Ｏｒｐｍで６．５　＋ｒ
、ｙ間遠心させ、上澄液ｋ　ｆ−Ａ瘍きぜ、ヤして谷ペ
レット’ｉ：　５０　ｍｌの最終バッフ７−（０，５５
Ｌ）Ｉ）ＧＡ］ｒＡＯ卦ｊびｏ、　ｏ　１　％チメロツ
ールを２”ｔｊＴる１５ｍＭホスフェート）に再副γ・
；Ｊさせた。各ｉＭ、　Ｆ）を５分間超廿波処理して単
分散粒子１ば濁ｔｙ、（［−生成させた。６個の試ネ・
Ｆヶー緒シヒ混ｆｐ　シで４５０　ｍｌの最終容門とし
、そして０８μフイルターに通した。

（Ｂ２＋　アツセー アツセーは分析テストハック（米国ｔ７エ父付特Ｆｆｉ
　２９，７２５　芳容１１１　）　ｌ（、−Ｃａｃａ＠
　、’）　−”　カ／ｌ／　７ナライザー（デュ、Ｉソ
ン社製品）土で実施された。

０〜４０１Ｌｇ７’ｒｎｌ　ＯＲ知のテオフィリンｇＪ
　Ｉａ’ｔ　’Ｍゼするプールされた人血（’＋￥４υ
μｍ−２目動的ｐこう賎械の′ｊｆ、横ステーションで
試験パックに注入させ、次いで４．９６　ｍの０．１５
Ｍ燐ｊ獄バッファー（ｐＨ７，１３）、１．６％最終′
ａ度を与えるＰＥＧ　ａｏｏｏ（６ｓ、ｏＭｇ）、５、
８　ＱのＤＴＢ、０．０５ｍｔの（）ＡＦＡＯＨＥ　−
６Ｉ　Ｑ溶液（１０％ｗ／ｖ％ｆｊ留水中）およびυ、
　０６ｉ１の１ｊｉＪ記（ＤＪからの粒子試渠２プレー
カー／ミキサー１でパックに〃ｌえた。６Ａ分後、２ｐ
ｔの抗テオフィリン抗体（１０ｍｇ／ｌｔｌ　Ｈ８Ａ　
ｓ　１λ４　Ｎａ０４ｓ　０．０５ＭＫ２ＨＰＯ４％０
．１　％　（Ｗ／Ｖ）　ｋＪａＮ５および０．００２　
％（ｔｖ／Ｖ）チメロサール？き有する浴液（ｐ１１７
．８）で１２４に希釈を加えることによってブレーカ−
／ミキサー…で反応を開始させた。この抗体は３０／１
５と称されるテオフィリンに対するマウスモノクローン
抗体（ハイプリドーマセルラインかう得られる、ＡＴＣ
Ｏの受理婢号ＨＢ８１５２）であ夛、そしてこれは滅菌
濾過腹水として使用された。その・１々、’＋、ｔはこ
こに参照として観きされている米国特Ｈ’ｆ出願と？’
、　４０６．５５４−号明＃１１書に記載されている。

粒子　Ｊｌ集の―敢としての濁りの変化速度を抗体添加
の２９秒および４６秒伝の５４０ｎｍにおける吸収の差
としてｄＣ録した。データは以下の衣用に示されている
。

表　■ テオフィリンによるｉＲＤの阻害 ｕ　２２０ ２．５　１８６ ５．０　１４８ ｉ　ｏ、ｏ　８７ ２０．０　４３ ４０．０　１８ 例　２ テオフィリン−Ｈ８Ａ粒子試薬およびテオフィリン−Ｐ
ＥＰＡ粒子試薬を使用したアッセー性能の比較 テオフィリン−Ｈ８Ａ粒子試必全使用した粒子強化濁シ
阻害イムノアッセーを前記１（Ｅ）に記載のようにして
実施したがただしこの喘）合試料サイズは２０μｔであ
シ、ＰＥＧの最終ａ度は３％であり一そして２８μｔの
未希釈抗体がブレーカ−／ミキサー■で加えられた。

表ＩＶ　ＡはＨ８Ａリンカ−に対して本シロ１刀のポリ
エーテルポリアミンリンカ−を使用しでイ！？ｒ：）＃
た精度（μｇ／Ｉｎｌでの％Ｏ，Ｖ、　、　２０パツク
の平均）を比較している。精／ｆは本発明のリンカ−の
使用によってテオフィリン水準１０μｇ、／ｍｌ　ｂよ
び２０μｔ／ｍｌの両方で約４倍改善された。

表川Ｂは異った結合カリを使用したテオフイリンアツセ
ーにおける３４０ｎｍの濁度の変化速度金比較している
。必−要を抗体量の１４倍の減少に加えて、１≧シグナ
ルおよび分＋ｆｆ１Ｅの両者はＨ８Ａ粒子−を使用した
Ｊ、４合よシも本発明の粒子試薬の開用の１，９合より
良好であった。

我　ＩＶ Ａ、精　度 １０　２．３　９．０ ２０　１、４　６．　Ｏ Ｂ、濁りの阻害 ０　２２０　１５６ ２．５　１８６　１４４ ５．０　１４８　１２５ １０．０　８７　８５ ２０、０　４３　５０ ４０．０　１８　３２ 例　３ テオフイリンアッセー 一連のポリエーテルポリアミン（ｌｊＰＡ）　（Ｈ例１
記載の方法によって抽々の分子８徒のポリエチレンエー
テルグリコールから製）青した。次いでこれらポリエー
テルポリアミンを使用して例１０己戦のようにしてテオ
フィリンね子試藁を製造した。

例１（同のアツセーをぐシかえしたが但し２μｔの代９
ｖこ６μｔの抗体？Ｉ：使用し、ＤＴＥを除ヅトし、そ
してＰ］ｉ！ＧおよびＧＡＢ′ＡＣヲ機械の元填ステー
ションでバッファーと共に加え／ヒ。表Ｖ＋ま出発グリ
コールの分子量の１叔としてのゼロキャリブレータ−水
準の最大シグナルに対してアッセ・−中で要求されるＰ
ＥＧ　８０００（ｉＬ）　ｆＱ　＋ｌＩ　’ｖ湊度が示
されている。分す蛍範囲の低い方および旨い方の端ｒＣ
おいては、合成リンカ−枝子試渠乞使用するアツセーに
おいてはＨ８Ａリンカ−使用の場合よりも一層多量のＰ
ＥＧが要求される。出発グリコールがＭｎ＝１５０また
を１２００（それぞれｚ　ｗ−ｉ訃よび２．１　）　ｋ
有している場合には、　ＰＥＧ要求は２の７アクターだ
け低−Ｆする。中間的分子殖（Ｌ４ｎ　＝　５９０また
は５９５）においでは、ＰＥＧ　要求ｔユ犬約回−であ
る。適当なＸおよびｙイ１１１は表ＩＡ　；ｌ？よひＩ
Ｂから、既知のＭｎ値および我Ｖに与えられている独々
のＰＥＰＡ袈品中のｍｅｑ／、ｑ試料の屋、乞言燻カ）
ら確立させることができる。畳素含ｇは「秋ンー足によ
り法延され１ζ。試料中のすべての小、＋１１物は分析
窒系１圓を埋ｊｉ＋ｉｊ値よシも云少させ”Ｔ−，１：
　りＪｊｌい与かけのｙ　ｋ　ｋ与える結果となる。

この理由の故に、そのようＶＣして計４ｔされたｙ値は
大約のものでるｐセしてラーベての試料にメ」′Ｔる上
限である。

表　Ｖ １０／）　−１＋１　〉４．０ １５０　９．３　４　１．５ ２００　６．８　４　１．５ ３９０　３．７　３　３．［） ５９５　２．７　２　５．。

１、！＋００　０．９３　４　４．０ ２７５０　０．４９　４　＞６．０ （１市場的に入手可能ｆｘ　２，２’−ジアミノエテル
エーテル、Ｘ功０ 例　４ テオフイリンアツセー ＩＡ）　テオフィリンーポリノロビレンエーテルボリア
ミンコンジュゲ−１・の製造 Ｎ−（３−ジメチルアεノプロビル）−Ｎｌ−エチルカ
ルボジイミド塩酸塩（４５５１Ｐ）全ジメチルスルホキ
サイド（４４ｍｌ＋）中の８−（３−カルボキシブロビ
ル）　−１，５−ジメチルキサンチン（５９２１１ｇ）
の溶液に加えた。そしてこの浴ｅ、を２５℃で５時間攪
拌した。４４ｄのジメチルスルホキサイド中のボリヲロ
ビレンエーテルボリアミン（ジエファξンＤ−２３０ｓ
テキサコ・グミカル社製品、１．５６２Ｆ）を加え、そ
して攪拌ケ２６℃で更に１８時間つづけた。このように
して「！１られたコンジュゲート溶液金４０で保存し７
で。

（）３ｊ　テオフイリンーポリプロピレンエーテルボリ
アミン粒子試薬の製造 ＋ｊｉＪ　Ｉｌｌ　（Ａｌ　、ｖｌらのフーオフイリン
−ＰＰＰＡ　コ７ジュゲ）　１．Ｊ　ｉ臣（９（ｌ　ｒ
ｎｌ　）　ｋ　０．１２％（）ＡＦＡＣ！　）Ｕｉｉ　
−６１０（（）ＡＦはより人手１’Ｊ’　Ｈ目ｌ陰イオ
ン性表面活性剤）を　４−　イｆ″′ｆ　る　５ｍＭｍ
Ｈす　ト　リ　ウ　Ａ（１５Ｃ１Ｏｍ／、ｐＨ８，０）
と共に温合した。０．２　Ｍ水酸化ナトリウムの添加に
よってｐＨ全ｉｏ、ｏ＝ｉｏ、１に、すＸ４整した。

この混合物を７０℃に加熱し、そして米国特許出願第５
１５，９２２号明細■例４に記！！４！ｔのようにして
製造されたエポキシ官能性粒子を自利する重合体粒子ラ
テックス（１７％固体力、２１６〃ｌｌ）を２時間攪拌
しつつ加えた。

反応混合物ｋＮ却し、０．１　％　ＧＡＦＡＯｌ１Ｅ−
６１Ｑを含有する１５ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，０
）１５００ゴで希釈し、そして１００μ訃よひ６μフイ
ルターの両方全使用して濾過した。この混合物を高性能
中突繊維超ｐ過系（アミコン社を式Ｄ０１０ＦｉＭ　）
および０．１％ＧＡＦＡＣＲＥ　−６１０全含有する１
５ｒａＭ燐酸ナトリウム（６０１％　Ｉ）Ｈｌ　Ｏ）を
使用した超濾過にかけて未反応コンジュゲートを除去し
た。ラテックス１八１＋濁（Ｗを１５００＋ｉの最Ｐ容
謝とした。

ｔｏ＋　アッセー アツセーは力析テストパック（釆国再交付特ム’ｌ’　
”Ｊ２２９．７２５号ｆｇｊｒ（ｉ）中Ｔ　ａｃａ＠　
ｌ　リ＝　カ／。アナライザー上で実施きれた。Ｄ〜４
０μｇ／ｍｌのＩＣＥ　ｉｆｌ　Ｉａ　ｆｆ　＋７）　
テオフィリン全含有するプールサした人血（宵４０μｔ
ｆｄ：自動的に拭械の充填ステーションでテストノぐツ
ク中に注入させ、次いで４．９１ｍｅの０．１５Ｍ騎酸
メツファー（ｐＨ７，８）、５５１ＩｇのＰｌ！１Ｇ８
０００．６．０　ｍ９のジチオエリスリトール６０ａｌ
　の　ＧＡＦＡＯＲＥ　６　１　０　ｒｇ　？夜　（１
６，７％　、　ｗ／ｖ　。

蒸ｉｊ７水申）ｌ−・よび５２．４μｔの前ｉ尼（ＢＪ
がらの粒子試用をブレーカ−／ξミキサーでＡツクに加
えた。３し分後、前記例１記戦の抗テオフィリン抗イＩ
：　Ｎ　ｆｔ￥　、’５．４８　ｔｔｔ　（１ｆ７１Ｊ
のマウス’１ｍ水流体ｔ−１０ｍ（＜／ｍｌ　ＵＳＡ　
ｓ　１Ｍ　Ｎａ１ｌ　％０．０５Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４，０
，１％（”／Ｖ　）　Ｎ　ａＮ　３および０．００２％
（ｗ／ｖ　）チメロサールと註有する溶液（ｐＨ７，８
）　２４部で希釈するこトニよシ製造）を加えること如
よってブレーカ−／ミキサー■で反応全開始させた。

粒子凝集の画数としての濁シの変化速度を抗体添加の２
９秒後および４６秒後の３４０ｎｍにおける吸収の差と
して記録した。データは以下の表■に示されている。

表　■ テオフィリンによる濁りの阻害 ０　２１６ ２．５　１７２ ５、ｏ　１１９ １０．０　’　７７ ２０．０　５８ ４０．０　１８ 例　５ テオフィリン−ＩＳＡ粒子試薬、ヒよひテオフィリン−
ＰＰＰＡ粒子試粒子試用したアソセー性７４１＝の比較
テオフィリン−Ｉ（ＳＡ粒子試薬を使用した粒子強化濁
り阻害イムノアツセー全例４記載のようにして実施した
が但しこの場合試料サイズは２０μｔであシ、ＰＥＧの
最終濃度は６％であルそして２８μｔの未希釈抗体がプ
レーカー／ミキサー■で加えられた。

表１ｉｔばＨ８Ａリンカ−に対して本発明のポリプロピ
レンポリアミンリンカ−全使用して得られｆｃ　ｒ＊　
Ｉ［（ｔｔｇ／ｍｔ　〕％ａ、Ｖ、　、２０パツクノ”
Ｆ４１）４−１ヒ咬している。積度は本発明のリンカ−
の使用によって約２〜６倍改善された。

表　■ 精度 １０　２．６　９．０ ２　［Ｊ　３．２　６．０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記すなわち （Ａ）　ナトリウムＤ線の波長で１ｌｌ１１定して１．
   ５４以上の屈折率を有する重合体である内側コア、およ
   び （１）　エポキシ、カルボキシおよびアルデヒドよりな
   る群から選ばれた親水性１合体リンカ−と反応しうる官
   能基を有するエチレン性不飽和単士１体、 （２）場合により重合体粒子を実質的に水不俗性とする
   に充分量のその他のエチレン性不飽和単ｉ支体、および （５）外側シェルの１０ｉｉｔ部を越えない内側コアの
   単量体 の重合体であってしかも前記内側コアの存在下の重合に
   より形成された外側シェルを有し、そして大約０．０５
   〜０．１μｍの直径範囲を有している重合体粒子、そし
   て （Ｂ）　実験式 ％式％） （式中ＲｉｔＨおよびＣＲ２よりなる群から選ばれた少
   くとも１員であシ、ｘは０〜７゜であシそしてｙは１〜
   ２ｏである）の親水性重合体リンカ−を介して前記（Ａ
   ）の重合体粒子と共有結合的に結合せしめられた生物学
   的関心のある化合物 から本質的になることを特徴とする、粒子試薬０ ２）　Ｒ＝Ｈである前記特許請求の範囲第１項記載の粒
   子試薬。 ３）リンカ−がプロピレンオキサイド末端閉止されたポ
   リエチレングリコールから導がれる前記特許請求の範囲
   第１項記載の粒子試薬。 ４）　Ｘ＝１〜１５そしてｙ＝１〜１５である前記特許
   請求の範囲第１項記載の粒子試薬。 ５）　Ｘ＝１〜１５そして７＝１〜１５である前記特許
   請求の範囲第２項記載の粒子試薬。 ６）　Ｘ：１〜２そしてｙ＝１〜５である前記特許請求
   の範囲第５拍記載の粒子試薬。 ７）生物学的関心のある化合物を測定するにあたり、 （Ａ）　（１１（ａ）　す）　ＩＪウムＤ線の波長で測
   定して１．５４以上の屈折率を有する重合体である内側
   コアおよび （１）　エポキシ、カルボキシルおよびアルデヒドより
   なる群から選ばれた親 水性重合体リンカ−と反応しうる官 能基を有するエチレン性不飽和単量 体、 （１１）場合によシその粒子を実質的に水不溶性とする
   に充分な量のその他の エチレン性不飽和単量体、および （Ｉｌｌ＞　外側シェルの１０重量部を越えない内側コ
   アの単量体 の重合体であって前記内側コアの存在 下の１合により形成された外側シェル を有し、そして大約００３〜０１μｍの直径範囲を有し
   ている重合体粒子、および（ｂ）実験式 ％式％ （式中ＲはＨおよびＣＨｓよりなる群から選ばれた少く
   とも一つであυ、Ｘは ０〜７０でありそしてｙは１〜２０で ある）の親水性重合体リンカ−を介し て前記重合体粒子と共有結合的に結合 されている生物学的に関心ある化合物 から本質的になる高屈折率を有する粒子試薬、 （２）生物学的関心ある化合物を含有すると考えられる
   液体および （３）凝集剤 を培養し、そして （Ｂ）　凝集から生じた増大された粒子サイズを光学的
   に測定する 各段階を包含することを特徴とする方法。 ３）Ｒ＝Ｈである前記特許請求の範囲第７項記載の方法
   。 ９）Ｘ＝１〜１５そしてｙ＝ｉ〜１５である前記特許請
   求の範囲第８項記載の方法。