JPH0235943B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ リガンド及びアンチリガンドから成る特異的
結合対の一構成員である被分析物質を含むと考え
られるサンプル中の該被分析物質の存在を測定す
る方法であつて、標識物質で標識された構成員を
含むシグナル形成系及び多イオン性の荷電した構
成員を用いることによつて、該荷電した構成員と
該標識された構成員との平均距離の変化に基く検
出可能なシグナルを被分析物質の量に関連して得
ることを特徴とし、ここで前記標識物質は荷電基
の影響を受け荷電環境の変化により性質を変えて
検出可能なシグナルを生成するものであり、且つ
次の工程： 水性アツセイ媒体中において、(1)該サンプル、
(2)該荷電した構成員、(3)該標識された構成員及び
(4)該シグナル形成系の任意の追加成分を合し〔前
記(1)、(2)及び(3)の内の少なくとも１つはリガンド
であり、そして少なくとも１つはアンチリガンド
である〕、これによつて該荷電した構成員と該標
識された構成員との間に複合体を形成せしめ；そ
して 該シグナル形成系によつて形成された検出可能
なシグナルを、既知量の被分析物質を含むアツセ
イ媒体中に形成されたシグナルと比較して測定す
る； を含んでなる被分析物質の存在の測定方法。 ２ 前記アツセイ媒体のPHが約５乃至11の範囲に
あり、且つ該荷電した構成員が多数の負に荷電し
た酸素原子を有する請求の範囲第１項に記載の方
法。 ３ 前記負電荷の少なくとも一部がカルボキシ基
である請求の範囲第２項に記載の方法。 ４ 前記負電荷の少なくとも一部がフエノール基
である請求の範囲第１項に記載の方法。 ５ 前記標識物質が酵素である請求の範囲第１項
乃至第４項のいずれか１項に記載の方法。 ６ 前記シグナル形成系が高分子の荷電した基質
を含む請求の範囲第５項に記載の方法。 ７ 前記標識物質が蛍光物質である請求の範囲第
１項乃至第４項のいずれか１項に記載の方法。 ８ リガンド及びアンチリガンドから成る特異的
結合対の一構成員である被分析物質を含むと考え
られるサンプル中の該被分析物質の存在を測定す
る方法であつて、標識物質である酵素で標識され
た構成員を含むシグナル形成系及び多イオン性の
荷電した構成員を用いることによつて、該荷電し
た構成員と該酵素との平均距離の変化に基く検出
可能なシグナルを被分析物質の量に関連して得る
ことを特徴とし、且つ次の工程： 水性アツセイ媒体中において、(1)該サンプル、
(2)該荷電した構成員、(3)該標識された構成員、な
らびに(4)該酵素の基質及び補因子を合し〔前記
(1)、(2)及び(3)の内の少なくとも１つはリガンドで
あり、そして少なくとも１つのアンチリガンドで
ある〕、これによつて該荷電した構成員と該標識
された構成員との間に複合体を形成せしめ；そし
て 該酵素によつて形成された検出可能なシグナル
を、既知量の被分析物質を含むアツセイ媒体中に
形成されたシグナルと比較して測定する； を含んでなる請求の範囲第１項に記載の被分析物
質の存在の測定方法。 ９ 前記基質が高分子の荷電した基質である請求
の範囲第８項に記載の方法。 １０ 前記の高分子の荷電した基質が前記荷電し
た構成員と反対の電荷を有する請求の範囲第９項
に記載の方法。 １１ 前記水性媒体のPHが約５乃至10の範囲にあ
る請求の範囲第８項乃至第１０項のいずれか１項
に記載の方法。 １２ 前記荷電した構成員が多数のカルボキシ基
を有する請求の範囲第８項乃至第１０項のいずれ
か１項に記載の方法。 １３ 前記荷電した構成員が多数のフエノール基
を有する請求の範囲第８項乃至第１０項のいずれ
か１項に記載の方法。 １４ リガンド及びアンチリガンドから成る特異
的結合対の一構成員である被分析物質を含むと考
えられるサンプル中の該被分析物質の存在を測定
する方法であつて、標識物質である蛍光物質で標
識された構成員を含むシグナル形成系及び多イオ
ン性の荷電した構成員を用いることによつて、該
荷電した構成員と該蛍光物質との平均距離の変化
に基く検出可能なシグナルを被分析物質の量に関
連して得ることを特徴とし、且つ次の工程： 水性アツセイ媒体中において、(1)該サンプル、
(2)該荷電した構成員及び(3)該蛍光物質で標識され
た構成員を合し〔前記(1)、(2)及び(3)の内の少なく
とも１つはリガンドであり、そして少なくとも１
つはアンチリガンドである〕、これによつて該荷
電した構成員と該標識された構成員との間に複合
体を形成せしめ；そして 該シグナル形成系によつて形成された検出可能
なシグナルを、既知量の被分析物質を含むアツセ
イ媒体中に形成されたシグナルと比較して測定す
る； を含んでなる請求の範囲第１項に記載の被分析物
質の存在の測定方法。 １５ 前記被分析物質がリガンドである請求の範
囲第８項又は第１４項のいずれかに記載の方法。 １６ 前記被分析物質がアンチリガンドである請
求の範囲第８項又は第１４項のいずれかに記載の
方法。 １７ 抗原蛋白質及び該抗原蛋白質に対する抗体
から成る特異的結合対の一構成員である該抗原蛋
白質を含むと考えられるサンプル中の該抗原蛋白
質の存在を測定する方法であつて、該抗体に結合
した酵素である標識された構成員を含むシグナル
形成系及び多数のカルボキシル基で置換された該
抗体である多イオン性の荷電した構成員を用いる
ことによつて、該荷電した構成員と該標識された
構成員との平均距離の変化に基く検出可能なシグ
ナルを抗原蛋白質の量に関連して得ることを特徴
とし、且つ次の工程： 水性媒体中において、(1)該サンプル、(2)該荷電
した構成員、(3)該標識された構成員及び(4)該酵素
の基質及び補因子を合し；そして 該シグナル形成系によつて形成された検出可能
なシグナルを、既知量の該蛋白質抗原を含むアツ
セイ媒体中で形成されたシグナルと比較して測定
する； を含んでなる抗原蛋白質の存在の測定方法である
請求の範囲第１項に記載の被分析物質の存在の測
定方法。 １８ 前記酵素がβ−ガラクトシダーゼであり且
つ前記基質が多数のｏ−ニトロフエニルガラクト
シド基を有する正に荷電した高分子基質である請
求の範囲第１７項に記載の方法。 １９ 抗原蛋白質及び該抗原蛋白質に対する抗体
から成る特異的結合対の一構成員である該抗原蛋
白質を含むと考えられるサンプル中の該抗原蛋白
質の存在を測定する方法であつて、該抗体に結合
した酵素である標識された構成員を含むシグナル
形成系及び多数のフエノール基で置換された該抗
体である多イオン性の荷電した構成員を用いるこ
とによつて、該荷電した構成員と該標識された構
成員との平均距離の変化に基く検出可能なシグナ
ルを抗原蛋白質の量に関連して得ることを特徴と
し、且つ次の工程： 水性媒体中において、(1)該サンプル、(2)該荷電
した構成員、(3)該標識された構成員及び(4)該酵素
の基質及び補因子を合し；そして 該シグナル形成系によつて形成された検出可能
なシグナルを、既知量の該蛋白質抗原を含むアツ
セイ媒体中で形成されたシグナルと比較して測定
する； を含んでなる抗原蛋白質の存在の測定方法である
請求の範囲第１項に記載の被分析物質の存在の測
定方法。 ２０ 前記酵素がβ−ガラクトシダーゼであり且
つ前記基質が多数のｏ−ニトロフエニルガラクト
シド基を有する正に荷電した高分子基質である請
求の範囲第１９項に記載の方法。 ２１ イムノアツセイのために有用な組成物であ
つて、 (1) リガンド及びアンチリガンドから成る特異的
結合対の修飾された構成員であつて標識物質に
より標識された構成員を包含するもの；及び (2) アツセイ条件下で荷電する複数の官能基によ
り置換された荷電構成員； を含んでなり、該標識物質は該荷電官能基の影響
を受け荷電環境の変化により性質を変えて検出可
能なシグナルを生成するものであり、そして該荷
電構成員と該標識された構成員との相対比が被分
析物の濃度に対応する検出可能なシグナルのレベ
ルを実質上最適にするものである、ことを特徴と
するイムノアツセイ用組成物。 ２２ 前記荷電構成員がポリカルボキシメチル置
換アンチリガンドであり、そして前記標識された
構成員がβ−ガラクトシダーゼ置換アンチリガン
ドである請求の範囲第２１項に記載のアツセイ組
成物。 ２３ 多数のｏ−ニトロフエニルガラクトシド基
を有する前記β−ガラクトシダーゼの正に荷電し
た高分子基質をさらに含む請求の範囲第２１項に
記載のアツセイ組成物。 ２４ 前記荷電した構成員がポリフエノール置換
アンチリガンドであり且つ前記シグナル標識構成
員がβ−ガラクトシダーゼで標識されたアンチリ
ガンドである請求の範囲第２１項に記載のアツセ
イ組成物。 ２５ 多数のｏ−ニトロフエニルガラクトシド基
を有する正に荷電した高分子基質を含む請求の範
囲第２４項に記載のアツセイ組成物。 発明の背景 発明の分野 蛋白質結合アツセイもしくはイムノアツセイは
これまで徹底的な研究及び商業化の主題であつ
た。極めて低濃度で、通常はミリリツトルあたり
数ミリグラム未満で存在する、関心を抱かれてい
る、特に生理学的関心を抱かれている薬物もしく
は他の化合物を特異的に定量できるという事実
は、臨床研究室において新たな機会を切り開い
た。治療薬投与もしくは薬物嗜癖を監視して病的
状態を迅速且つ能率的に測定できるという事実且
つストレスの間の患者の状態を監視できるという
事実は健康管理の改善に重要な機会を与えた。 臨床研究室におけるアツセイにはしばしば、比
較的狭い範囲において高い感度のみならず高い精
度が要求される。従つて、より高い感度、非特異
的効果への反応の減少及びより容易且つ簡易なプ
ロトコールを提供することによつてこれらの要求
を認める新しい手法が開発されつつある。さら
に、抗原の多くは不純な形でしか得られず、純粋
な形で得るには高いコストを伴う。従つて、アツ
セイは、抗原が不純であるかもしれないという可
能性に適合させなければならない。抗原の注射に
よつて得られる抗体は当該抗体としては全蛋白質
の約30重量％未満、またはしばしば約20重量％未
満であることはこのような状況に相応している。
抗体組成物との反応に関与する試薬を調製する場
合には、多量の夾雑物の存在を考慮しなければな
らない。アツセイを開発する際に考慮すべきその
他の事柄は、インキユベーシヨンの必要性及び回
数、インキユベーシヨンに必要な期間、測定に必
要な期間、外生因子に対する測定感度、試薬の安
定性、試薬の処方等である。 先行技術の記載 米国特許第3996345号は発色物質対…螢光物質
及び消光物質…の使用を述べており、該発色物質
対は特異的結合対の異なる構成員に結合し、その
結果、相互作用し合う距離内の螢光物質及び消光
物質の量は媒体中の被分析物質（analyte）の量
に左右されることが記載されている。米国特許第
3935074号は、少なくとも２つの抗原決定基を有
する試薬に２つの抗体が同時には結合できないと
いう事実に依存するイムノアツセイを述べてい
る。1978年４月５日に出願された同時係属出願第
893650号は、イムノアツセイにおいて２つの酵素
を結びつける概念を教示しており、該酵素の基質
または生成物が検出可能なシグナルの形成にいろ
いろな点で関係し、該酵素の配置が媒体中の被分
析物質の量に関係することが述べられている。
1977年７月14日に出願された同時係属出願第
815632号は、抗原に結合する標識物質の高分子調
節因子の使用を教示しており、標識された抗体が
抗原に結合する時に該調節因子の標識物質への接
近が阻害されることが述べられている。1977年７
月14日に出願された同時係属出願第815487号は、
酵素イムノアツセイを開示しており、該酵素イム
ノアツセイにおいては、リガンド（ligand）が酵
素で標識され、抗体が該リガンドに結合すると酵
素阻害剤の酵素への接近が阻害される。1978年11
月24日に出願された同時係属出願第964099号は、
高分子粒子を使用して該高分子粒子に結合した標
識物質と溶液中の遊離形の標識物質とを区別する
方法を開示しており、該高分子粒子に結合した標
識物質の量は媒体中の被分析物質の量と相関し、
そして観測される、検出可能なシグナルは粒子と
媒体の間における標識物質の分布に左右されるこ
とが述べられている。米国特許第3817837号は均
一系酵素イムノアツセイを記載している。 発明の要約 特異的結合対の構成員、すなわち、リガンド
（ligand）及び受容体（アンチリガンド）を含む
蛋白質結合アツセイが提供される。この方法にお
ける第１の試薬として、前記構成員の１つはアツ
セイ条件下において正電荷もしくは負電荷を生ず
ることのできる多数のイオン化性官能成分で置換
されている。第２の構成員は、同一または同種の
構成員であり、アツセイ条件下において検出可能
なシグナルを形成することのできるシグナル形成
系の一成分で標識される。 シグナル形成系によつて形成されたシグナル
は、荷電した第１の構成員から生ずる電界の配置
によつて影響を受ける。被分析物質に関連して構
成員を適当に選択することによつて、アツセイ媒
体中の第１構成員と第２構成員との平均距離の変
化は、アツセイ媒体中の被分析物質の量と関連す
ることができる。すなわち、観測されるシグナル
は、アツセイ媒体中の被分析物質の量に関連する
ことができる。既知量の被分析物質を含む適当な
標準を用いることにより、被分析物質の濃度と観
測されるシグナルのレベルとの間の関係を確立す
ることができる。 さらに、アツセイのための試薬、ならびにアツ
セイの感度または被分析物質濃度の変動へのアツ
セイの反応のレベルを実質的に最適にする試薬の
組み合わせが提供される。 特定の態様の記載 本発明は、特異的結合対、すなわち、リガンド
及び受容体を含む蛋白質結合アツセイに関する。
本発明の基礎は、２つの試薬の接近をアツセイ媒
体中の被分析物質量と関係づけることにある。第
１の試薬は、所定PHの水性環境中に荷電した場を
生ずるように多数のイオン電荷で修飾された特異
的結合対の第１の構成員である。第２の構成員は
単一もしくは多成分シグナル形成系の一成分であ
る標識物質で修飾されており、観測されるシグナ
ルのレベルは、荷電した構成員によつて作られる
場へのシグナル形成系の配置に依存する。この場
は、アツセイ媒体中のある種のイオンの局在濃度
を増加または減少させることによつてシグナル形
成系に影響を与え、アツセイ媒体中のイオン濃度
は観測されるシグナルのレベルに影響を与える。
被分析物質ならびに第１及び第２の構成員の他に
シグナル形成系の性質に応じて他の物質を加える
こともできる。 特異的結合対の同種構成員の結合により、２も
しくはそれ以上の、通常は３もしくはそれ以上の
構成員を含む複合体が形成される。抗体及び抗原
は多価であるため、複合体は、抗体及び抗原の網
目構造を形成するために広げることができ、それ
によつて多数のシグナル標識物質及びイオン電荷
を、相互作用が起こり得るように接近させること
ができる。 本発明を論じるに当り、以下の順をとりたい。
まず最初に、アツセイ法を考究する。次いで、使
用される物質に関する種々の用語を規定する定義
を述べる。次いで、被分析物質、シグナル形成系
及び荷電した構成員に関して物質を論じる。次い
で、本方法の利用に関する実験及び証明を論じ
る。 アツセイ法 本方法に従い、被分析物質；アツセイ条件下で
実質的にイオン化する多数のイオン化性基を有す
る試薬；標識された試薬（標識物質はシグナル形
成系の一構成員である）、及び；任意の必要な追
加成分を緩衝化した水性媒体中で合する。次い
で、観測されるシグナルを読み取りそして既知量
の被分析物質を含むアツセイ媒体と比較すること
ができる。 被分析物質はリガンド及びその同種の受容体か
ら成る特異的結合対の一員であり、リガンド及び
受容体のいずれも被分析物質であることができ
る。アツセイ媒体は通常は水性であり、通常は最
適アツセイ感度を概ね提供するのに中程度のPHま
で充分に緩衝化されている。アツセイはアツセイ
成分または生成物を分離せずに実施する。 水性媒体は単に水であつてもよいし、あるいは
０乃至40容量％の補助溶剤、普通は極性溶剤、通
常はアルコール類、エーテル類等を含む炭素数が
１乃至６、より普通には１乃至４の酸素化有機溶
剤を含むことができる。 媒体のPHは普通は約４乃至11、より普通には約
５乃至10、好ましくは約6.5乃至9.5である。PH
は、受容体による特異的結合の有意なレベルを保
持すると同時に被分析物質濃度の変動に対するシ
グナル形成系の感度または反応を最適化するよう
に選ぶ。 所望のPHを達成し且つ測定の間においてそのPH
を保持するために種々の緩衝剤を用いることがで
きる。緩衝剤としては、硼酸塩、燐酸塩、炭酸
塩、トリス、バルビタール等を挙げることができ
る。使用する緩衝剤は本発明に決定的ではない
が、個々のアツセイにおいては１もしくは２種の
緩衝剤が好ましい。 アツセイを実施するのには通常、中程度の温度
を用い、測定期間には、特に速度の測定のために
は、通常、一定の温度を用いる。インキユベーシ
ヨン温度は通常約５〜45℃、より普通には約15〜
40℃である。測定の間の温度は一般に約10〜50
℃、より普通には約15〜40℃である。 アツセイすることのできる被分析物質の濃度は
一般に約10^-4〜10^-15M、より普通には約16^-6〜
10^-13Mである。アツセイが定性的であるか、半
定量的であるかまたは定量的であるかというこ
と、その検出法及び当該被分析物質の濃度のよう
な考慮すべき事柄が通常、その他の試薬の濃度を
決定するであろう。 アツセイ媒体中の種々の試薬の濃度が一般に被
分析物質の当該濃度範囲によつて決定されるのに
対し、各試薬の最終濃度は通常、その範囲におい
てアツセイの感度を最適化するように経験的に決
定される。すなわち、重要な被分析物質の濃度の
変動は、正確に測定できるシグナルの差を提供す
べきである。 被分析物質と相互作用する特異的結合対の構成
員の全結合部位は試薬の性質に依存して、すなわ
ち、試薬が被分析物質と同一であるか異なるかに
より、広く変化する。たとえば、両試薬が受容体
であつてもよいし、あるいは両試薬がリガンドで
あつてもよいし、あるいは試薬の一方がリガンド
で他方が受容体であつてもよい。少なくとも１つ
の試薬は被分析物質と相互作用する結合剤であ
る。 アツセイ媒体中の結合部位に基づく被分析物質
に対する標識された試薬の比は一般に、被分析物
質の濃度範囲において、被分析物質の結合部位あ
たり標識された試薬の結合部位約0.5乃至約100
個、普通は約１乃至50個、より普通には約１乃至
20個である。全ての部位が等しくは利用できない
ため、これらの構成員に飽和時に利用できる部位
を述べる。 これらの数字は、最も重要と思われる比を単に
例示するつもりで述べたものであることに留意さ
れたい。この比は、測定法（平衡または速度）、
標識された試薬の結合定数、被分析物質の濃度、
荷電効果に対するシグナル形成系の感度、リガン
ドの性質及びシグナルを検出できる感度に応じて
変化する。 荷電した構成員の、標識された構成員に対する
モル比はまた、標識物質の性質、荷電効果に対す
る標識物質の感度及びリガンドの性質に応じて変
化させることもできる。通常は、荷電した構成員
の標識された構成員に対するモル比は約0.5〜
100：１、より普通には約１〜20：１である。こ
のモル比は、そのプロトコール、添加順、標識物
質の性質、相対結合親和性等に応じて、極めて驚
異的に変化することができる。 添加順は広く変化させることができる。ただ
し、多成分シグナル形成系の成分全てを同時には
添加しないことが多い。通常は、シグナル形成系
の一成分で標識された構成員をアツセイ媒体中に
加えてから、シグナル形成系のその他の成分の少
なくとも１つを加える。このことは、酵素が標識
物質であり且つその他の成分が基質及び補因子で
ある場合に特に当てはまる。 ２つの試薬構成員は被分析物質に同時に加えて
もよいし連続して加えてもよい。荷電した構成員
に先立つてシグナル形成系標識物質を加えるのが
好ましい場合が多い。２つの試薬は、プロトコー
ルの性質に応じて、単一組成物としてまたは別個
の組成物として提供することができる。 ２つの特定のプロトコールを例示的に示すこと
ができる。第１のプロトコールは、シグナル形成
系で標識された構成員を被分析物質に添加しそし
て該シグナル形成系が少なくとも平衡に近づくの
に充分な時間インキユベートすることを含む。次
いで、この混合物に荷電した構成員を添加すれば
よく、これと同時にまたはその後直ちにシグナル
形成系の任意の追加成分を加えてもよい。 別のプロトコールは、シグナル形成系で標識さ
れた構成員及び荷電した構成員を実質的同時に添
加し、そして必要に応じてインキユベーシヨンを
行なうかまたは行なわないというものである。望
ましくは、シグナル抑制剤、すなわち、シグナル
形成系標識物質と相互作用する物質を添加するこ
とにより、シグナル形成系で標識された構成員が
その同種の構成員に結合しない場合にはシグナル
の形成を阻害することができる。 被分析物質は、荷電した構成員とシグナル標識
構成員とを近づけるかそれらの分離を促進するよ
うに働くことができる。たとえば、被分析物質が
抗原またはポリ（リガンド類似体）であり且つ２
つの試薬構成員が抗体である場合には、被分析物
質は、限られた濃度範囲内では、該構成員が溶液
中に遊離形とて拡散している場合に比べて概して
２つの試薬構成員をより接近させるように働くで
あろう。他方、被分析物質が抗原であり且つシグ
ナル標識構成員が抗原である場合には、被分析物
質とシグナル標識構成員とは荷電した抗体に対し
て競合するであろう。 アツセイ媒体の調製には１もしくはそれ以上の
インキユベーシヨン工程を含めることができる。
たとえば、抗原被分析物質は標識された受容体と
共にインキユベートするのが望ましい。さらに、
使用するその他の試薬の性質によつては、第２の
インキユベーシヨン工程を行なうことが望まし
い。インキユベーシヨン期間を用いるか否か及び
インキユベーシヨン期間の長さは、定量法…速度
または平衡…及び受容体のリガンドへの結合速度
にかなり依存する。通常は、インキユベーシヨン
工程の時間は約0.5分乃至６時間、より普通には
約５分乃至１時間の範囲である。インキユベーシ
ヨン温度は一般に約４乃至50℃、より普通には約
15乃至37℃の範囲である。 試薬を合した後、シグナルを測定する。測定法
は通常は電磁線、特に紫外線、可視光線、中でも
特に可視光線（吸収であつても発光であつてもよ
い）の観測である。望ましくは、螢光の場合に
は、放射される光は400nｍ以上、より望ましく
は450nｍ以上、好ましくは500nｍ以上の波長を
有するべきである。吸収の場合には、吸収は通
常、約250〜900nｍ、より普通には約325〜650n
ｍの範囲にある。 シグナルを観測する温度は一般に約10〜50℃、
より普通には約15〜40℃の範囲にある。 既知量の被分析物質を含む標準アツセイ媒体を
調製できる。次いで、標準アツセイ媒体について
観測されるシグナルをプロツトして濃度をシグナ
ルに関連づけることができる。標準曲線が確立さ
れると、シグナルは直接、被分析物質の濃度に関
係づけることができる。 シグナルの測定時間は、速度法を用いるか平衡
法を用いるか、要求される感度、シグナル形成系
の性質等に応じて変化する。速度法の場合には、
読みと読みとの間の時間は一般に約５秒乃至６時
間、通常は約10秒乃至１時間である。平衡法の場
合には、定常状態に達した後は一回の読みで充分
であり、あるいは任意の都合のよい時間間隔での
２個の読みで充分である。 定 義 被分析物質−測定されるべき化合物もしくは組
成物であつて、リガンド；単一の化合物または少
なくとも１つの共通のエピトピツク部位もしくは
抗原決定基を共有する複数の化合物、または；受
容体であることができる。 特異的結合対−２つの異なる分子であつて、分
子の一方は、その表面またはキヤビテイ中に、他
方の分子の特定の空間的及び極性構造に特異的に
結合する領域を有する。特異的結合対の構成員と
はリガンド及び受容体（アンチリガンド）を指
す。 リガンド−任意の有機化合物であつて、これに
対して受容体が天然に存在するかまたは製造でき
るもの。 受容体（アンチリガンド）−分子の特定の空間
的及び極性構造、すなわち、抗原決定基もしくは
エピトピツク部位を認識することのできる任意の
化合物または組成物。受容体としては天然の受容
体、たとえば、チロキシン結合グロブリン、抗
体、Fabフラグメント、酵素、レクチン等を挙げ
ることができる。 リガンド類似体−受容体について類似のリガン
ドと競合することのできる修飾されたリガンドで
あり、該修飾はリガンド類似体を別の分子に結合
する手段を提供するものである。リガンド上の利
用可能な官能成分によつては、リガンド類似体を
標的（hub）または標識物質に結合させる結合に
より水素を置換する以上に、リガンド類似体はリ
ガンドと異なるかもしれない。 ポリ（リガンド−類似体）−共有結合で（しば
しば標的核に）結合された多数のリガンド。標的
核は、通常はヒドロキシ、アミノ、メルカプト、
エチレン等のような官能基を多数、結合部位とし
て有する多官能価物質、通常は高分子物質であ
る。標的核は、水溶性であつても水不溶性であつ
てもよいが通常は水溶性である。標的核の分子量
は普通は少なくとも約10000、通常は少なくとも
約35000であるが、1000万以上、通常は600000以
下、より普通には300000以下である。標的核とし
ては、多糖類、蛋白質を含むポリペプチド、核
酸、イオン交換樹脂等を挙げることができる。水
不溶性標的核としては、ガラス、付加重合体及び
重縮合体（架橋及び非架橋）、天然粒子等を挙げ
ることができ、これらはいずれも多数の官能成分
を有するかまたは官能付与をすることができる。 シグナル形成系−シグナル形成系は１もしくは
それ以上の成分を有することができ、一成分は１
つの特異的結合対構成員に結合する。シグナル形
成系は測定可能なシグナルを形成し、このシグナ
ルは外部手段、通常は電磁線の測定によつて検出
可能である。本発明において、シグナル形成系に
よつて形成される、観測されるシグナルのレベル
は、荷電した構成員の標識された構成員への接近
に敏感である。ほとんどの場合、シグナル形成系
は酵素及び発色物質を含む。この発色物質として
は、紫外域または可視域の光を吸収する染料、燐
光物質、螢光物質及び化学発光物質を挙げること
ができる。酵素は通常、紫外域もしくは可視域の
光を吸収する物質の形成もしくは破壊または螢光
物質もしくは化学発光物質による放射光の直接的
もしくは間接的形成に関わる。 標識物質−別の分子に結合する任意の分子、特
にシグナル形成系の一構成員。本発明において、
標識物質は特異的結合対の一構成員に結合するシ
グナル形成系成分であり、シグナル標識物質と称
される。 標識されたリガンド−特異的結合対のリガンド
構成員（リガンド類似体）とシグナル形成系の一
構成員との複合体であつて、これは共有結合また
は非共有結合しており、共有結合をしている場合
には結合、結合性基または標的核によつて結合し
ている。標識されたリガンドは、１もしくはそれ
以上のリガンドもしくは１もしくはそれ以上の標
識物質または各々複数のリガンド及び標識物質を
含むことができ、各々複数のリガンド及び標識物
質を含む標識されたリガンドを、ポリ（リガンド
類似体）−ポリ標識物質と称する。 標識された受容体−受容体とシグナル形成系の
一構成員との複合体であつて、受容体とシグナル
形成系の一構成員とは共有結合または非共有結合
しており、１もしくはそれ以上の受容体が標識物
質に結合できる場合または１もしくはそれ以上の
標識物質が受容体に結合できる場合には通常は結
合性基によつて共有結合している。 荷電した構成員−特異的結合対の可溶性の一構
成員、普通は受容体、より普通には抗体であつ
て、同電荷（負電荷または正電荷）の複数の官能
成分で共有結合的にまたは非共有結合的に置換さ
れることによりポリイオン性であるために特定の
電荷の比較的高い局在密度を生ずることができ、
これは単一の構成員であつても互いに結合した複
数の構成員であつてもよい。 物 質 本アツセイに用いる成分は、特異的結合対の一
構成員である被分析物質、シグナル標識構成員、
シグナル形成系の任意の追加成分、荷電した構成
員及び場合により受容体またはポリ（リガンド類
似体）である。 被分析物質 本発明のリガンド被分析物質は、モノエピトピ
ツクまたはポリエピトピツクであることを特徴と
する。ポリエピトピツクリガンド被分析物質は通
常、ポリ（アミノ酸）類、すなわち、ポリペプチ
ド及び蛋白質、多糖類、及びそれらの組み合わせ
である。このような組み合わせとしては、細菌、
ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、
核、細胞膜等を挙げることができる。 ほとんどの場合、本発明に使用するポリエピト
ピツクリガンドは分子量が少なくとも約5000、よ
り普通には少なくとも約10000である。ポリ（ア
ミノ酸）類の場合には、当該ポリ（アミノ酸）は
一般に分子量が約5000乃至5000000、より普通に
は約20000乃至1000000であり、ホルモンの場合に
は分子量が通常約5000乃至60000の範囲にある。 同様な構造上の特徴を有する蛋白質、特定の生
物学的機能を有する蛋白質、特殊な微生物、特に
疾病を引き起こす微生物に関連する蛋白質等の群
に関して、種々の蛋白質考えられる。 構造によつて関連づけられる蛋白質の種類は以
下の通りである： プロタミン類 ヒストン類 アルブミン類 グロブリン類 硬蛋白質類 燐蛋白質類 粘蛋白質類 色素蛋白質類 リポ蛋白質類 核蛋白質類 糖蛋白質類 プロテオグリカン類 分類されていない蛋白質（たとえば、ソマトト
ロピン、プロラクチン、インシユリン、ペプシ
ン） ヒト血漿中にある多数の蛋白質は臨床的に重要
であり、そのような蛋白質としては以下のものを
挙げることができる： プレアルブミン アルブミン α₁−リポ蛋白質 α₁−酸性糖蛋白 α₁−抗トリプシン α−糖蛋白 トランスコルチン ４，6S−ポストアルブミン トリプトフアン欠乏α₁−糖蛋白 α₁X−糖蛋白 チロキシン結合グロブリン インター−α−トリプシン−インヒビター G_c−グロブリン （G_c１−１） （G_c２−１） （G_c２−２） ハプトグロビン （H_p１−１） （H_p２−１） （H_p２−２） セルロプラズミン コリンエステラーゼ α₂−リポ蛋白質 ミオグロビン Ｃ−反応性蛋白質 α₂−高分子グロブリン α₂−HS−糖蛋白 Zn−α₂−糖蛋白 α₂−ノイラミノ−糖蛋白 赤血球蛋白質 β−リポ蛋白質 トランスフエリン 凝血酵素 フイブリノゲン プラスミノゲン β₂−糖蛋白質 β₂−糖蛋白質 免疫グロブリンＧ （IgG）もしくはγG−グロブリン 分子式：γ₂κ₂もしくはγ₂λ₂ 免疫グロブリンＡ （IgA）もしくはγA−グロブリン 分子式：（α₂κ₂）ⁿもしくは（α₂λ₂）ⁿ 免疫グロブリンＭ （IgM）もしくはγM−グロブリン 分子式：（μ₂κ₂）⁵もしくは（μ₂λ₂）⁵ 免疫グロブリンＤ （IgD）もしくはγD−グロブリン（γD） プロコンバーチン 抗血友病性グロブリン（AHG） クリスマス因子、血漿トロンボプラスチン成
分（PTC） スチユアルト−プラウア−因子、アウトプロ
トロンビン XI 血漿トロンボプラスチン前駆体（PTA） XII ハーゲマン因子 フイブリン安定化因子 重要な蛋白質ホルモンとしては以下のものを挙
げることができる： ペプチド及び蛋白質ホルモン 上皮小体ホルモン（パラトルモン） チロカルシトニン インシユリン グルカゴン レラキシン エリトロポエチン メラノトロピン（メラニン細胞刺激ホルモン；
インテルメジン） ソマトトロピン（成長ホルモン） コルチコトロピン（副腎皮質刺激ホルモン） 向甲状腺ホルモン 卵胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン） 向黄体向乳腺ホルモン（ルテオトロピン、プロ
ラクチン） ゴナドトロピン（絨毛ゴナドトロピン） 組織ホルモン セクレチン ガストリン アンギオテンジン及び ブラジキニン ヒト胎盤ラクトゲン 下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン バゾプレツシン 放出因子（RF） CRF、LRF、TRF、ソマトトロピン−RF、
GRF、FSH−RF、MIF 注目すべき他の高分子物質はムコ多糖類及び多
糖類である。 微生物に由来する抗原多糖類としては以下のも
のを挙げることができる：

【表】

【表】 アツセイされる微生物は、そのままでもよい
し、溶解してもよいし、すりつぶしてもよいしあ
るいは破砕してもよい。たとえば抽出によつて得
られた組成物または部分をアツセイすることがで
きる。当該微生物としては以下のものを挙げるこ
とができる： コリネバクテリウム類 コリネバクテリウム・ジフテリア
（Corynebacterium diptheriae） 肺炎菌類 ジプロコツカス・ニユーモニア（Diplococcus
pneumoniae） 連鎖球菌類 化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogens） 猩紅熱連鎖球菌（Streptococcus salivarus） ブドウ球菌類 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus） 白色ブドウ球菌（Staphylococcus albus） ナイセリア類 髄膜炎菌（Neisseria meningitidis） ナイセリア・ゴノリエ（Neisseria
gonorrheae）

【表】

〔式中、Receptorは別の分子に対する特異的受容体であり、蛋白質であり、すなわち抗体であり； Ｒは結合または連結性基、通常は炭素数が約１乃至10、より普通には約１乃至６であり且つさらに０乃至６個、普通には０乃至４個のヘテロ原子を有することのできる結合または連結基であり、該ヘテロ原子は酸素、窒素または硫黄であり、該酸素はオキシまたはオキソとして存在し、該窒素はアミノまたはアミドとして存在しそして該硫黄はチオまたはチオノとして存在し； ＸはPH約４乃至11、普通には５乃至10、好ましくは6.5乃至9.5において電荷を有することのできる官能成分であり、アミノまたはカルボキシ、スルホネート、スルフエート、ホスホネート、ホスフエート及びフエノキシを含むオキシ酸であることができ；そして ｎは少なくとも１であり、通常はReceptorの分子量を20000で除した値からReceptorの分子量を500で除した値までの範囲、より普通にはReceptorの分子量を10000で除した値からReceptorの分子量を1000で除した値までの範囲にある〕

特に、Receptorは抗体、IgGであり、Ｒは１−
オキソアルキレン（オキソ基はアミド結合し、ア
ルキレン基は炭素数が２乃至６、普通には２乃至
４である）であり、そしてＸはカルボキシであ
る。 以下の例を説明として記載するが、これらは限
定するために記載するのではない。 実 験 特に断わらない限り、温度は全て摂氏である。
また、特に断わらない限り、部及びパーセントは
重量部及び重量パーセントであるが、液体混合物
は容量部及び容量パーセントで表わす。以下の略
字を用いる： PBS、N₃、Mg−燐酸塩で緩衝化した生理食塩
水、0.10ｍＭ PO₄、PH7.0、0.128M NaCl、５
ｍＭアジ化ナトリウム、１ｍＭ Mg（酢酸塩と
して）； DMF−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド； NHS−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド； RSA−家兎血清アルブミン（１mg／ml）； DEAE−ジエチルアミノエチル； RT−室温； EDCI−エチルジメチルアミノプロピルカルボ
ジイミド； ONPG−ｏ−ニトロフエニルガラクトシド。 例 １ β−ガラクトシダーゼの羊抗（ヒトIgG）（羊
抗HIgG）への結合 Ａ β−ガラクトシダーゼを次のようにして製造
した。β−ガラクトシダーゼ〔ベーリンガー
（Boehringer）150797、8.5mg／ml〕の10mlのア
リコートを10分間遠心分離し、そして沈澱物を
３mlのPBS、N₃、Mg中に溶解せしめた。次い
で、この混合物に100ｍＭジチオエリトリトー
ル0.3mlを加え、そして混合物を室温で１時間
インキユベートし、然る後に、PBS、N₃、Mg
で平衡化した総容量390mlの2.6×75cmバイオゲ
ル（Biogel）A5M（200〜400メツシユ）上でク
ロマトグラフ処理した。この溶液を12ml／時間
の速度で溶離し、そして各80滴のフラクシヨン
（５ml）を回収した。試験管39〜44を容量28.9
mlまでプールした。濃度は1.47mg／mlであつ
た。次いで、酵素をアツセイすると、蛋白質
477μ／mgの活性を有することがわかつた。 Ｂ 羊抗HIgG血清を等容量の飽和硫酸アンモニ
ウムで沈降せしめた。沈降物は0.01M燐酸塩
（PH6.5）154mlに対する透析後、最終容量中に
溶解した。IgGフラクシヨンをさらに、同一燐
酸塩溶媒で平衡化したDEAE−セフアデツクス
A50の５×60cmカラム（1178ml）上でクロマト
グラフ処理することによつて精製した。電気泳
動パターン及び蛋白質の収率に基づき、IgGは
まだ全量は溶離されていないことを確認したの
で、さらにカラムから、0.15M NaClを添加し
た緩衝液で約150ml／時間の速度で溶離させた。
各25mlのフラクシヨンを回収した。フラクシヨ
ン133〜142をプールして容量250mlとした。
280nｍにおける吸収に基づき、この濃度は9.96
mg／mlであることがわかつた。蛋白質を目的の
抗体についてアツセイした。この抗体は、約18
％の全蛋白質に基づき抗体の特異活性のために
1.78mg／mlの濃度で存在することがわかる。蛋
白質を等容量の硫酸アンモニウムによつて沈降
せしめそしてPBS、N₃、Mg中に溶解せしめる
ことによつて、蛋白質35mg／mlを含む溶液を得
た。 Ｃ 抗HIgGの35.3mg／ml溶液1.8mlにｍ−マレイ
ミド安息香酸NHSエステル60μ（10mg／ml
DMF）を加え、そして混合物を室温に30分間
放置し、次いで1M酢酸ナトリウム（PH５）
0.18mlを添加した。次いで、反応混合物を室温
で１時間、（脱気された）20ｍＭ酢酸ナトリウ
ム（PH５）、0.15M NaCl500mlに対して２回透
析した。β−ガラクトシダーゼ（1.47mg／ml）
の５ml溶液に0.5M燐酸塩（PH７）0.2mlを加
え、次いでこれに前記反応混合物２mlを31.1
mg／mlの濃度で加え、そして混合物を室温で４
時間インキユベートした。10ｍＭシステイン−
HCl0.2mlの添加しそしてさらに0.5時間インキ
ユベートすることによつて反応を停止させて、
7.4mlの最終容量を得た。この生成物を、PBS、
N₃、Mgで平衡化したバイオゲルA5Mカラム
（2.6×75cm、398ml）上でクロマトグラフ処離
し、同溶媒で12ml／時間の速度で溶離し、各５
mlのフラクシヨンを回収した。フラクシヨン24
〜33を回収して、280nｍにおける光学密度が
0.540で且つ酵素に対する抗体のモル比が約
５：１である容量50mlを得た。β−ガラクトシ
ダーゼの濃度は121μｇ／mlであり、羊IgGの濃
度は213μｇ／mlであることがわかつた。酵素
のアツセイには、10μのフラクシヨンを
PBS、N₃、Mg、RSA0.5mlと0.4ml緩衝液中20
ｍＭ ONPG0.1mlとの組み合わせ中に溶解さ
せて用い、基質添加後10乃至20秒の間隔で37゜
で420nｍにおいて速度を測定した。 Ｄ 前記手法を以下のようにして繰り返した。
HIgGに対する羊抗血清（35.3mg蛋白質／ml）
1.8μにｍ−マレイミド安息香酸NHSエステ
ルの32ｍＭ溶液60μを加え、この混合物を
RTにおいて30分間撹拌した。1.0M NaOAc
（PH5.0）0.18μを添加した後、溶液をRTにお
いて１時間、２×500μの（脱気した）20ｍ
Ｍ NaOAc、PH5.0、0.15M NaCl500μに対
して２回透析した。β−ガラクトシダーゼ
（1.47mg／ml）５mlに0.5M PO₄、PH7.0 0.2μ、
次いで前記溶液（31.1μｇ／ml）3μを加え、
そして混合物をRTにおいて４時間インキユベ
ートした。10ｍＭシステインHCl0.2μを添加
し、次いで0.5時間インキユベートすることに
よつて反応を停止させた。生成物を、PBS、
N₃、Mgで平衡化したバイオゲルA5M（2.6×75
cm）上でクロマトグラフ処理した。溶離は同一
溶媒を用いて12ml／時間の速度で行ない、各
5μのフラクシヨンを回収し、フラクシヨン
24〜33をプールした。ｏ−ニトロフエニルガラ
クトシド（ONPG）を基質とする酵素の活性
と比較した結合体の活性は96％であることがわ
かつた。他方、DX2000（デキストラン2M分子
量2000000）に結合したONPGとの比較活性は
38.6％であつた。アツセイは、結合体10μ、
PBS、N₃、Mg、RSA0.9ml及び基質（20ｍＭ
ONPG）0.1mlのアツセイ溶液を用いて37℃
で行ない、読みは420nｍで行なつた。 例 ２ 羊抗（ヒトIgG）のスクシニル化 羊抗（ヒトIgG）（35.3mg／ml）５mlを室温で一
夜0.1M Na₂HPO₄0.5に対し３回透析した後、
得られた5.3ml（187.1mg）をNa₂HPO₄溶液４ml
で希釈し、これに撹拌しながら ¹⁴C−無水コハク
酸の1M溶液250μを加えた。1M水酸化ナトリ
ウムの添加によりPHを7.5以上に保つた。加えた
総容量は400μであつた。0.5時間後、水酸化ナ
トリウムによりPH８に調整した1Mヒドロキシル
アミン−HCl1mlを加え、そして混合物を室温で
30分間インキユベートし、然る後に、室温で一夜
PBS、N₃、Mg0.5に対して５回透析を行なつ
た。最終容量は10.7mlで、その濃度は17.4mg／ml
であつた。 例 ３ 羊抗（HIgG）のフルオレスセイン標識 ヒトIgGに対する羊抗血清（５ml、176.5mg、羊
IgG）をRTにおいて一夜0.1M Na₂CO₃緩衝液、
PH9.0 500mlに対して３回透析を行なつた。透析
用緩衝液（3.75ml）を加えて全容量を8.65mlとし
た。この蛋白質溶液（54mg、0.33μmole）に50
mg／mlフルオレスセインイソチオシアネート
DMF溶液（フルオレスセイン／蛋白質モル比
9.2）25μを加え、そして混合物を暗所でRTに
おいて撹拌した。生成物を、セフアデツクス
G25M上でPBS PH6.8N₃、Mgを用いてゲル過
して、Ｆ／Ｐ比6.8の標識された蛋白質7.3mlを得
た。 例 ４ デキストラン40−ONPG Ａ メチル３−ヒドロキシ−４−ニトロベンゾエ
ート（） 塩化アセチル（25ml）を添加したメタノール
（1250ml）に３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息
香酸（）（100.3ｇ、純度95％、0.53モル）を
加えた。固体は２日間の間に溶解した。６日
後、溶液を過して、未溶解の不純物を除去し
た。溶液を蒸発せしめて、粗製エステルを得
た。結晶を数回にわけて回収した。最後の回収
は容量50mlから行なつた。採取した結晶を合
し、メタノール（150ml）から再結晶した。エ
ステル（）を黄茶色結晶（融点：89〜91゜）
として２回の回収で得た（98.7ｇ、0.50モル）。 Ｂ メチル３−（２，3.4.6−テトラアセチル−β
−ガラクトシルオキシ）−４−ニトロベンゾエ
ート（） アセトブロモガラクトース（）（100.1ｇ、
純度95％、0.23モル）及び３−ヒドロキシ−４
−ニトロ安息香酸メチル（）（45.5ｇ、0.23
モル）をアセトニトリル（600ml）中に溶解せ
しめた。撹拌された溶液に酸化銀（30ｇ、0.26
当量）を加えた。黒色固体は徐々に灰色に変わ
つた。10分後、追加の酸化銀（20ｇ、0.17当
量）を加えた。さらに20分間撹拌を続けた。反
応混合物をセライト（Celite）パツドで過し
て、銀塩を除去した。液を蒸発せしめて、粗
製茶色結晶物質（115ｇ）を得た。この物質を
エタノール（400ml）から再結晶した。オフホ
ワイトの結晶（融点：150〜152゜）を２回の回
収で得た（99.6ｇ、0.19モル、収率83％） Ｃ メチル３−β−ガラクトシルオキシ−４−ニ
トロベンゾエート（） テトラアセテート（119ｇ、0.226モル）を
メタノール（1000ml）に加えた。固体が溶解す
るまで混合物を60゜で加熱した。次いで、トリ
エチルアミン（25ml）を加え、そしてこの溶液
を60゜でさらに２時間加熱した。この溶液を蒸
発せしめることにより、粗製固体生成物を数回
にわけて回収し、最後のものは容量20mlから回
収した。粗製物質は、さらに精製することなし
に、次の反応に使用した。 Ｄ ３−β−ガラクトシルオキシ−４−ニトロ安
息香酸（） 撹拌しながら、粗製エステル（前記反応に
おいて119ｇのテトラアセテートから調製）
を1N NaOH（1500ml）に加えた。15分後、こ
のエステルは溶解しそして加水分解した。この
溶液を濃HClで中和して、PH7.5の濁つた橙色
の溶液を得た。この溶液を過によつて清澄化
し、次いで1N HCl（250ml）で酸性化して、PH
３〜3.5の薄黄色溶液を得た。沈澱した酸を
過によつて回収した。これを水（20ml）で洗
浄して光沢のある白色針状結晶（34.7ｇ）を得
た。水性母液を容量800mlまで濃縮し、そして
PH２に酸性化した。追加量の粗製酸を得た。こ
れをメタノール（150ml）から再結晶して針状
結晶（7.7ｇ）を得た。精製した酸の全収量
は42.4ｇ（123ミリモル）であつた。融点：172
〜174゜ Ｅ ３−β−ガラクトシルオキシ−４−ニトロ安
息香酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（） ３−β−ガラクトシルオキシ−４−ニトロ安
息香酸（55.2ｇ、0.160モル）、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド（20ｇ、0.174モル）及びEDCI
（35ｇ、0.183モル）をDMF（200ml）中に溶解
せしめた。２時間後、TLC−（10−20％
MeOH／CHCl₃）によれば反応は完了してい
た。目的化合物の他に微量の不純物が含まれ
ていた。この溶液は、さらに処理せずに用い
た。 Ｆ カルボキシメチル化デキストランT40 デキストランT40（分子量〜40000、101ｇ）
を1.25M水性クロロ酢酸ナトリウム（500ml）
中に溶解せしめた。これに2.5M水酸化ナトリ
ウム水溶液500ml）を加えた。この溶液を80〜
85゜で３時間加熱した。 反応混合物を冷却せしめた。この撹拌された
反応混合物にエタノール（１）を徐々に加え
た。350mlを加えた後にデキストランが沈澱し
始めた。追加のエタノール２を加えて完全な
沈澱を保証した。 沈澱物はガムとして分離した。上清を容易に
デカントした。さらに３回沈澱させることによ
つてデキストランを精製した。これらは以下の
ようにして実施した。ガムを水（750ml）中に
溶解せしめた。次いで、永続的な濁りが溶液中
に見られるまでエタノール（３）をゆつくり
加え、次いでより急速に加えた。次いで、デキ
ストランのガム状沈澱物を一夜沈降せしめた。
得られた生成物は、約20％のグルコース単位が
カルボキシルメチル化されていた。 Ｇ アミノ−デキストランT40（） カルボキシメチル化デキストランT40（ガム
として、デキストランT40から調製）を水
（250ml）中に溶解せしめた。これに、Ｎ，
N′−ビス−（３−アミノプロピル）−ピペラジ
ン（400ｇ、2.00モル）の塩酸（8.52ミリモ
ル／ｇの680ｇ、5.80モル）を加えた。得られ
た溶液に水（250ml）中EDCI（201ｇ、1.05モ
ル）を加えた。反応混合物を室温で22時間貯蔵
した。この期間の最後に、エタノール（３）
を加えた。1.5を加えた後、デキストランが
沈降し始めた。 さらに２回の沈澱により、アミノデキストラ
ンを精製した。これらは前記と同様にして実施
した。最後の沈澱により乳状懸濁液を得た。こ
れは、臭化リチウム（25ｇ）のエタノール
（250ml）中溶液の添加によつて凝固及び沈降し
た。得られたガムを１に稀釈した。これはア
ミノ基が104ｍＭあることがわかつた。 Ｈ ONPG−デキストランT40 アミノデキストラン（104ｍＭの１、104
ミリモル）の溶液をK₂HPO₄（89ｇ、0.5モル）
で処理して、PH８〜8.1に緩衝化された溶液を
得た。これに、NHSエステル（酸から前
述のようにして調製、160ミリモル）のDMF溶
液をゆつくり加えた。得られた溶液を室温で24
時間貯蔵した。エタノール（３）の添加によ
つてデキストランを沈澱せしめた。エタノール
350mlの添加後に沈澱が始まつた。沈澱物を一
夜沈降せしめた。 すでに前述した方法に従つて、さらに２回の
沈澱によりデキストランを精製した。最終ガム
を水（１）中に溶解せしめた。この溶液を、
最初に多孔度が中程度のガラスフリツトに通し
て、次いで0.8μミリポア（Millipore）フイル
ターを通して過することによつて清澄化し
た。 得られた溶液を２に稀釈した。サンプルを
１：121に稀釈した。サンプルは、A₃₂₀＝1.15
であつた。E₃₂₀＝2700に基づき、ONPGの濃度
は52ｍＭであつた。 この溶液を、NaN₃（0.65ｇ）を添加すること
によつて保存した。この物質を約1/2を凍結乾
燥した。残留物の再構成は満足なものであつ
た。 本発明を証明するために以下のアツセイを実施
した。第１のアツセイにおいては、緩衝液は
PBS、N₃、Mg、RSAであり、使用溶液は緩衝
液中10μｇ／mlの酵素溶液（例1C）、0.2mg／mlの
ヒトIgG及び17.4mg／mlのスクシニル化抗体（コ
ハク酸基の平均数は蛋白質モルあたり48個）であ
つた。基質は、ジ（３−アミノプロピル）ピペラ
ジンスペーサーによりデキストラン（分子量
40000）に結合したｏ−ニトロフエニルガラクト
シジルエーテルであり、そのデキストランはあら
かじめクロロ酢酸ナトリウムで修飾した。基質
は、PBS、N₃、Mg中４ｍＭ ONPGの濃度で用
いた。 プロトコールは、酵素−抗体結合物0.05ml及び
緩衝液0.10mlと適当な濃度のヒトIgG0.05ml及び
緩衝液0.10mlとを合わせて、混合物を室温で３時
間インキユベートすることを含む。次いで、この
混合物にスクシニル化された抗体0.1ml及び緩衝
液0.25mlを加え、その後直ちに（15分後に）基質
溶液0.10mlと緩衝液0.25mlとを加えた。基質を添
加してから10秒後及び40秒後に測定を行なつた。
この測定は37℃において実施し、読みは420nｍ
で行なつた。次の表は、種々のHIgG稀釈度及び
スクシニル化抗体稀釈度での結果を示す。スクシ
ニル化抗体稀釈度は記載した緩衝液中の最終溶量
に対して１容量の抗体溶液である。

【表】 前記表から明らかなように、スクシニル化抗体
の濃度を増加させると、所定濃度のヒトIgGにお
ける観測される加水分解速度が実質的に増大し、
そしてヒトIgG濃度の変化の結果、速度の変化が
おこる、すなわち、ヒトIgGの濃度が増加すると
速度が増大する。 第２のアツセイにおいては、荷電した構成員の
負電荷源としてフルオレセインを用いた。アツセ
イは、酵素結合体（例1D）50μを緩衝液
（PBS、N₃、Mg、RSA）0.2ml中HIgG50μとを
合し、そしてこの混合物をRTにおいて１時間イ
ンキユベートすることにより実施した。次いで、
この混合物にフルオレセインで標識された抗
（HIgG）100μ及び緩衝液0.25μを加え、混合
物をRTで15秒間インキユベートし、そして４ｍ
Ｍ ONPG100μをPBS、N₃、Mg＋0.25μ緩
衝液中デキストラン（分子量40000）に結合させ
た。読みは37゜において420nｍで行ない、基質添
加後40秒の読みから基質添加後10秒の読みを差し
引いた。次の表はその結果を示す。 第４表 HIgG稀釈度 速 度 （0.2μｇ／ml） （分^-1） ∞ 0.398 4096 0.418 1024 0.448 256 0.502 64 0.582 16 0.624 ４ 0.726 １ 0.828 前記結果から明らかなように、使用した濃度範
囲において速度の２倍の増加が観測される。２つ
の負電荷を有する荷電したフルオレセインは速度
を変えることができ、抗原HIgGへの結合によつ
て酵素に接近した時にはβ−グルコシダーゼのタ
ーンオーバー速度の実測値を増加する。 次の２つのアツセイにおいては、抗原に結合し
ないで残る酵素の阻害剤として抗酵素を用いた。
混合物を、前記の酵素−抗体結合体1.5ml及び
１：16に稀釈されたスクシニル化抗体1.5mlから
調製した。適当なヒトIgG溶液0.05mlに前記混合
物0.10mlを加え、そして(1)数分以内に抗酵素0.05
mlを加えるかあるいは(2)混合物をインキユベート
した後抗酵素0.05mlを加えた。いずれの場合に
も、次いで、混合物を室温で１時間インキユベー
トし、然る後に４ｍＭ ONPG−デキストラン
40結合物0.10ml及び緩衝液0.7mlを加え、読みを
37℃において420nｍで10秒後及び40秒後に行な
つた。次に観測された結果を示す。抗酵素は、酵
素結合部位の全てを実質的に飽和するのに充分な
濃度で緩衝液中に用いた。

【表】

【表】 前記結果から明らかなように、ヒトIgGの広範
囲の濃度変化によつて、極めて短時間、すなわち
30秒１回に測定された速度の実測値にはかなりの
変化がある。すなわち、抗体と抗原とを相互作用
させた後、簡易で且つ迅速な分光光度法によつて
抗原、すなわちヒトIgGを迅速に測定できる。 さらに、抗原との結合に関与しない酵素結合物
からのバツクグラウンドの実質的除去によつてア
ツセイの精度を増大することができる。このよう
にして、観測された結果は、被分析物質の同種抗
体以外のものに結合した酵素による非特異作用及
び結果の変動にはより鋭敏でない。 本発明は、不純な抗体を標識し且つそれを極め
て少量の被分析物質の測定のための鋭敏なアツセ
イに用いることのできる方法を提供する。この方
法は、複数の抗体を結合させることによつて、当
該リガンドに対する、抗体と結合した標識物質の
割合が大きくなるようにすることを含む。荷電し
た構成員に接近したシグナル標識物質から得られ
るシグナルは、荷電した構成員によつて影響され
ないシグナル標識物質から得られるシグナルとは
実質的に異なる。すなわち、当該抗リガンドに直
接的または間接的に結合した標識物質と抗血清中
に存在する他の蛋白質に結合した標識物質とは実
質的に区別される。 本発明によれば、種々の被分析物質を測定する
ための簡易、鋭敏且つ迅速なアツセイが提供され
る。この手法によれば、広範囲の種々の標識物質
を使用でき、この方法では標識物質は水性媒体中
の電界の存在によつて影響されることができる。
この電界は、アツセイ媒体の条件下においてイオ
ン化する多数の置換基で特異的結合対の構成員を
修飾して、比較的に高濃度の電荷環境を作ること
によつて供給される。 当該被分析物質に対する抗体を試薬として用い
る本方法は証明され、抗体に対する抗体を万能試
薬として用いそして抗抗体を修飾して荷電または
標識物質を提供することができるであろうことは
明白である。このように、被分析物質によつて結
合された標識物質及び電荷の数を増幅または増殖
させることができる。この手法は、比較的に純粋
な抗−抗体を入手できる場合に最も効果的に使用
できる。 前記発明は、理解をより明白にするために説明
及び例によつてある程度詳細に述べたが、添付し
た請求の範囲の範囲内において若干の変化及び修
正を実施できることは明白であろう。