JPH0561279B2 - - Google Patents
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Description
請求の範囲
１ 解裂される各−Ｓ−Ｓ−結合が式−Ｓ−Ｓ−
R1およびR2−Ｓ−Ｓ−（式中R1およびR2は同じ
かまたは異なつておりそしてそれぞれ有機残基で
ある）を有する２個の反応性の基に実質上変換さ
れる少なくとも１個のジスルフイツド結合−Ｓ−
Ｓ−（ここで硫黄原子のそれぞれはかかるジスル
フイツド結合少なくとも１個を含有する有機物質
中のそのそれぞれの脂肪族炭素原子に直接共有結
合している）を解裂させるに当り、前記有機物質
を化合物R3−Ｓ−Ｓ−R4と互変異性形態R5−Ｓ
−ＨおよびHR′5＝Ｓにおいてまたは相当する共
鳴安定された陰イオン形態（これら化合物中残基
R3、R4およびR5は (i) すべてが相異するか、２個が等しいかまたは
すべてが等しい有機残基であり、そして (ii)(a) 化合物R3−Ｓ−Ｓ−R4およびR5−Ｓ−Ｈ
中の前記硫黄原子のそれぞれが芳香環中の炭
素原子に結合しておりそして (b) 化合物R3−Ｓ−Ｓ−R4の反応により放出
される化合物R3−Ｓ−ＨまたはR4−Ｓ−Ｈ
および化合物R5−Ｓ−Ｈが一般に行われる
解裂条件下において実質上それらのそれぞれ
の互変異性形態HR′3＝Ｓ、HR′4＝Ｓおよび
HR′5＝Ｓまたは相当する共鳴安定された陰
イオン形態で存在すること、およびR1とR2
はR3、R4およびR5からなる群に属する残基
をそれぞれ構成することと定義される）にお
いて存在しうる化合物との混合物と反応させ
ることにより前記した少なくとも１個の結合
を解裂させることを特徴とする方法。 ２ 有機物質がポリペプチドであることを特徴と
する請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ポリペプチドが免疫グロブリンまたはその断
片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載
の方法。 ４ 免疫グロブリンが抗体またはその抗体活性断
片であることを特徴とする請求の範囲第３項記載
の方法。 ５ R1＝R2＝R3＝R4＝R5であることを特徴とす
る請求の範囲第１または２項記載の方法。 明細書 本発明は少くとも１個のジスルフイツド結合−
Ｓ−Ｓ−（ここで硫黄原子のそれぞれはかかるジ
スルフイツド結合の少くとも１個の含有する有機
物質中のそれぞれの脂肪族炭素原子に直接共有結
合している）を解裂させる方法に関するものであ
り、解裂されたそれぞれの結合−Ｓ−Ｓ−は式−
Ｓ−Ｓ−R1およびR2−Ｓ−Ｓ−（ここでR1および
R2は同じかまたは相異なつておりそしてそれぞ
れ有機残基である）を有する２個の反応性の基に
実質上変換される。本発明はまた脂肪族炭素原子
に共有結合した基−Ｓ−Ｓ−R1および／または
R2−Ｓ−Ｓ−（ここで基R1およびR2は前記の意味
を有する）の少くとも１個を示す有機化合物にも
関する。 脂肪族チオール基（すなわちチオール基が脂肪
族炭素原子に結合している）およびそれから誘導
されるジスルフイツド基は生化学的情況において
重要な役割を有する。チオール基は生理学的条件
下に例えば活性チオエステルのような多数の他の
官能性構造と反応する。チオール基は酵素の活性
部位においてしばしば見出され、その場合これら
は酵素の触媒作用において重要な役割を演じてい
る。ジスルフイツド基はしばしばポリペプチド
（この用語は蛋白質をも包含するものと見なされ
ル）中に存在しそして通常固定要素および配座を
与える要素として作用すると思われる。動的な生
化学的反応の情況における試薬としての天然のジ
スルフイツドにより演じられる役割は比較的知ら
れていないがしかし例えば蛋白質に関しての前記
した配座性質により重大な意味を有すると見做さ
れねばならない（例えば「FEBS Letters」第97
巻第201〜10頁（1979年）参照）。 チオール基とジスルフイツド基の両方を同時に
包含する反応の型はチオール−ジスルフイツド交
換により示されそして下記のように記される： X1−SH＋X2−Ｓ−Ｓ−X3X2−Ｓ−Ｓ−X1 ＋X3−SH （式中X1、X2およびX3は−Ｓ−Ｓ−中の硫黄原
子の一方に結合した脂肪族または芳香族炭素原子
を含有する有機残基である）。 チオール−ジスルフイツド交換反応は生理学的
条件下に迅速に起るが、平衡の条件は所定のジス
ルフイツドの調製的生産には通常好ましくない。
例えば、ポリジスルフイツドをチオール成分と混
合すると、種々のジスルフイツドを含有する単位
の複合混合物を生ずる一連のチオール−ジスルフ
イツド交換反応が速かに起る。もしポリジスルフ
イツドが生物学的に活性な分子である場合は、そ
の活性度が影響される。 例えばアルキルピリジルジスルフイツド型のい
わゆる反応生ジスルフイツドの導入はジスルフイ
ツドの調製を大いに促進させる。反応生ジスルフ
イツドは通常求電子度の増大したジスルフイツド
および去りゆくチオールが安定化された互変異生
チオン形態またはその安定化された陰イオンに変
換されるような性質を有するジスルフイツドを意
味する。この安定化により、去つたチオールが反
対のまたは逆の反応に関与する可能性が否定され
る、例えばアルキルピリジルジスルフイツドの場
合、脂肪族チオール構造は解裂されないが、しか
しチオン構造は解裂される。この方法で、所望の
脂肪族ジスルフイツドの調製に好ましい平衡が得
られる。 チオール−ジスルフイツド交換反応に基づいて
おりそして生物学的に活性な分子の型を包含する
過程は今や生体分子と担体ポリマーとのまたは生
体分子と生体分子との共役において益々使用され
ており、それにより前者の場合では生体分子の溶
解度、分離性、安定性、輸送性のようなそれらの
外部性質が変化されて所定の要件を満たし、一方
後者の場合は多数の生体活性が組み合わさりそし
て例えば免疫学的性質を酵素的性質とまたは薬理
学的性質を回帰性質と協同せしめることになる。
かかる調製はクロマトグラフイー、薬剤、診断上
の分析法およびプロセス科学技術と関連した使用
が見出されるか、またはそれらに関連する将来の
使用が見出されると判断されうる。 チオール基を含有しない成分の間の反応性ジス
ルフイツドによるジスルフイツド共役物の調製に
おける方法論にはそれら成分と特定のチオール化
剤例えばホモシステインチオラクトンおよびチオ
ールイミデートとの反応、または二官能性試薬例
えば二官能性試薬Ｎ−スクシンイミジル−３−
（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートとの反応
がしばしば包含される。従つてこの最後に述べた
化合物により反応性ジスルフイツドが直接例え
ば、蛋白質分子中に導入されることが許容される
が、しかし還元の容易さゆえにチオール基も導入
されうる。 もし成分が脂肪族ジスルフイツド結合（すなわ
ち２個の脂肪族炭素原子間のジスルフイツド結
合）を含有しそして蛋白質に関して全く普通であ
る他の成分とジスルフイツドとして共役すること
が意図される場合、初めに脂肪族ジスルフイツド
結合を還元しそして得られるチオール基を次に他
の成分の反応性ジスルフイツドと反応させること
が原則として可能である（例えば「Immunology
Letters」第２巻第151〜155頁（1980年）または
「Haematologia」第14巻第95〜99頁（1981年）
参照）。 しかしながらこの知られた方法は多くの欠点が
負つている。還元工程は通常低分子量の脂肪族チ
オール化合物を用いて遂行される。ポリジスルフ
イツドの部分的還元を行うには中程度の濃度の低
分子チオール化合物が使用される。しかしながら
チオール−ジスルフイツド交換反応は前記したポ
リジスルフイツド分子内でも開始される。ポリジ
スルフイツドの全還元は高濃度の低分子脂肪族チ
オールを用いて達成されうる（しばしば、変性剤
と共に）。しかしながらかかる反応混合物を後処
理する場合、濃度条件は容易に変化して、部分的
逆反応が起る。さらに、反応し易いチオール構造
が空気で酸化されるのを回避するのが困難になり
がちである。チオール段階での分離を回避しそし
て例えばジピリジルジスルフイツドとの平衡混合
物を抑制する可能性は事実実際的でない、何故な
らジピリジルジスルフイツドは還元剤により消費
され、そして初めに形成された非対称の反応性ジ
スルフイツドが還元されたポリジスルフイツド成
分の再形成を分子間的にそしてまた還元剤と一緒
に開始させるからである。 亜硫酸ナトリウムを用いるスルフイトリシスは
多連鎖ペプチドをポリペプチドフラクシヨンに全
解裂させる蛋白質化学の分野において適用される
ジスルフイツドの古い、知られた解裂法である
（前記引用文献参照）。しかしながらこの方法論は
制御困難であり、そして触媒量の例えばシステイ
ンおよび酸素の使用を必要とする。得られる利点
はこの方法によりＳ−スルホネート構造の保護基
を有するチオール官能基が得られることである。 これら早期の知られた方法で遭遇する欠点の大
部分が本発明により除かれる。本発明によるジス
ルフイツド結合の解裂は解裂が解裂される予定の
少くとも１個の、好ましくは脂肪族ジスルフイツ
ド結合を含有する有機物質を、化合物R3−Ｓ−
Ｓ−R4と互変異性形態R5−Ｓ−ＨおよびHR′5＝
Ｓまたは相当する共鳴安定された陰イオン形態で
存在しうる化合物との混合物と反応させることに
より遂行されることを特徴とする。ここで上記化
合物中残基R3、R4およびR5は (i) それらすべてが相異するか、２個が同一であ
るかまたはすべてが同一である有機残基であ
り、そして (ii)(a) 化合物R3−Ｓ−Ｓ−R4およびR5−Ｓ−Ｈ
において、それらの硫黄原子それぞれは芳香
環中のそれぞれの炭素原子に結合しており、
そして (b) 化合物R3−Ｓ−Ｓ−R4の反応により放出
される化合物R3−Ｓ−ＨまたはR4−Ｓ−Ｈ
および化合物R5−Ｓ−Ｈが一般に行われる
解裂条件下において実質上それらのそれぞれ
の互変異性形態HR′3＝Ｓ、HR′4＝Ｓおよび
HR′5＝Ｓ、または相当する共鳴安定された
陰イオン形態で存在すること、およびR1と
R2はそれぞれR3、R4およびR5からなる群の
残基であることと定義される。 本発明による解裂は一つの段階において少くと
も１個のそのジスルフイツド結合を２個の新規ジ
スルフイツド結合に変換することによりジスルフ
イツド含有化合物を酸化するのであるからこの解
裂は酸化とみなされうる。以前、解裂工程は１個
のジスルフイツド結合の２個のチオール基への還
元を包含するのでその解裂方法は還元的であつ
た。 前記R3−Ｓ−Ｈ、R4−Ｓ−ＨおよびR5−Ｓ−
Ｈはそれらのチオール形態における化合物を表わ
し、そしてHR′3＝Ｓ、HR′4＝ＳおよびHR′5＝Ｓ
はそれらのチオン形態における前記化合物を表わ
す。チオール形態と相当するチオン形態はエノー
ル−ケト互変異性と完全に同じであるチオール−
チオン互変異性の例である。互変異性の二つの型
はよく知られておりそしてsp2−混成炭素原子に
結合したチオール基（ヒドロキシル基）が分子内
的にチオン基（ケト基）に変換されうることを意
味する。この変換は水素が分子内で場所を変え、
一方二重結合は同時に位置を変えた。すなわち
R3、R4およびR5はそれぞれR′3、R′4およびR′5と
は二重結合の位置選定の点でのみ異なることを意
味する。この表示はすべての有機化学者によく知
られている。チオンおよびケトン形態いずれも塩
基性物質によりそれらのそれぞれの共鳴安定され
た、脱プロトン化された陰イオン形態に変換され
うる。前記チオン形態の場合、これら陰イオンは
R′3＝Ｓ、 R′4＝Ｓおよび R′5＝Ｓと表示さ
れる。 一般に行われる解裂条件下では不安定なチオー
ルR3−Ｓ−Ｈ、R4−Ｓ−ＨおよびR5−Ｓ−Ｈは
それらの安定化されたチオン形態または相当する
陰イオン形態で存在するので、以下これらはチオ
ンとして言及されよう。 本発明により遂行される解裂により、一回の工
程で、脂肪族ジスルフイツド結合を得られる反応
性のジスルフイツド構造−Ｓ−Ｓ−R1および−
Ｓ−Ｓ−R2の一方を含有する少くとも１個の化
合物が単離できる程度に解裂工程期間中不活性で
ある２個の反応性ジスルフイツド構造に変換でき
る。 かかる結合１個を有する有機物質中における本
発明による脂肪族ジスルフイツド結合の解裂は概
略的に下記の方法で示されうる。 （式中A1およびA2はそれぞれ有機物質の残留部
分を意味しそして式中破線はA1およびA2が解裂
される予定の−Ｓ−Ｓ−結合以外の結合と場合に
より結合しうることを意味する）。従つて、A1お
よびA2が解裂される予定の−Ｓ−Ｓ−結合以外
の結合とも相互に係合している場合は、１つの新
しい分子が得られる。本発明はまた脂肪族炭素原
子に共有結合した機−Ｓ−Ｓ−R1および／また
はR2−Ｓ−Ｓ−の少くとも１個を示すところの、
かかる解裂から生ずる有機化合物を包含するもの
である。 本発明による前記結合の解裂は極端なPH条件を
適用する必要なく遂行されうる。このことにより
加水分解的副反応が回避されうる。例えば、この
方法で、解裂すべきジスルフイツド結合の加水分
解または他の例えばアミド、ペプチド、ケター
ル、アセタールまたはエステル結合のような加水
分解感受性結合の加水分解を回避することが可能
である。結果として、本発明は脂肪族ジスルフイ
ツド結合を選択的および特異的な様式で２個の反
応性ジスルフイツド構造に変換する結合解裂法を
提供するものである。 この解裂反応はPH依存性であり、そして水性媒
体中PH５〜12で遂行されうる。感受性物質を取扱
う場合副反応が起るのを避けるために、PH値は７
〜11の範囲内にあるべきである。 本発明により得られる最も重要な利点はポリペ
プチドの異なる型のジスルフイツド結合が段階的
に解裂されうるという驚くべき知見に基づくもの
である、すなわち過剰の反応性ジスルフイツド
R3−Ｓ−Ｓ−R4およびHR5＝Ｓの量が増大する
と、それぞれの結合型がそれ自体の個々の過剰に
おいてのみ解裂されるのである。当然、これは残
りの条件が一定に保たれている場合にのみあては
まる。前記知見により単一の生成物、すなわち型
および数が等しいジスルフイツド結合が各分子内
で解裂された生成物が得られうるのでこれは調製
上重要な利点を提供するものである。 従つて本発明による解裂によりポリジスルフイ
ツドのすべてのジスルフイツド結合のうち少くと
も１個のジスルフイツド結合を解裂する方法も提
供される。解裂されたジスルフイツド結合が例え
ばほとんど例外なく少くとも１個のシスチン構造
を含有する蛋白質またはポリペプチドのような生
物学的に活性な巨大分子中に含まれる場合に特に
重要な利点が得られる。これらのような化合物の
場合、生物学的活性は以前の知られたジスルフイ
ツド結合解裂法により与えられるより大きい程度
に保有されうる。かかる普通ならざる高い生物学
的活性を達成しうるという事実は恐らく本発明に
よる方法の間何ら分子間および分子内チオール−
ジスルフイツド交換反応が起らないゆえであろ
う。多分、これは解裂工程中脂肪族チオール基が
何ら存在しないことによるのであろう。かかる基
がとにかく存在するとしても、それは非常に少量
にのみしか存在しない。特に重要な利点はポリジ
スルフイツドが添加された反応性ジスルフイツド
R3−Ｓ−Ｓ−R4と反応しうる遊離のチオール基
を何ら含有しない場合に得られる。低分子量チオ
ール化合物は分子内チオール−ジスルフイツド交
換反応を容易に開始させる。結果として、かかる
化合物は解裂過程中に存在すべきでない。 多数のチオール化合物が水溶液中で自然発生的
にそれらのチオン形態に互変異性化する、すなわ
ちかかる化合物のチオン形態はそれらの対応する
チオール形態より安定である。これに関する１つ
の要件はチオール基の硫黄原子が芳香環中のsp2
−混成炭素原子に結合しているべきであるという
ことである。芳香環がヘテロ原子好ましくは窒素
を包含する場合（すなわちその環が複素環である
場合）、および／または例えばニトロ、シアノお
よびカルボキシからなる群から選択される電子求
引性置換基少くとも１個を有する場合チオン形態
はまださらに安定化される。硫黄原子は奇数の原
子に等しい複素環式芳香環中のヘテロ原子から離
れて局在するのが好ましい。解裂反応に関して
は、チオールR3SH、R4SHおよびR5SHの構造が
それぞれのチオン形態または相当する共鳴安定化
された陰イオン形態への変換および安定化が起る
のを許容するようであることが極度に重要であ
る。これに関しては、安定化は非常に高いレベル
を有するのでチオンおよび陰イオン形態は一般的
に行われる解裂条件下ではチオール−ジスルフイ
ツド交換反応について熱力学的に否定されよう。
その結果、チオール形態の相当するチオンまたは
陰イオン形態への安定化を得るには電子求引性物
質が常に前記非複素環系中に必要とされる。 それらのチオール化合物が一般に行われる解裂
条件下に互変異性または共鳴により自然発生的に
相当するチオン形態に安定化されるR3、R4およ
びR5の例には５−ニトロ−２−ピリジル、５−
カルボキシ−２−ピリジル、２−ピリジル、４−
ピリジル、２−ベンゾチアゾリル、４−ニトロ−
３−カルボキシ−フエニルおよび前記ピリジル基
のＮ−オキサイドが包含される。好ましくは対称
である反応性のジスルフイツド化合物R3−Ｓ−
Ｓ−R4において、R3およびR4はいずれも５−ニ
トロ−２−ピリジル、５−カルボキシ−２−ピリ
ジル、２−ピリジル、４−ピリジル、２−ベンゾ
チアゾリル、４−ニトロ−３−カルボキシ−フエ
ニルおよび前記ピリジル基のＮ−オキサイドから
選択されるのが適当である。これらの基に相当す
る反応性ジスルフイツドR4−Ｓ−Ｓ−R3および
チオンHR′5＝Ｓのいずれも容易に入手でき、従
つてこれらが本発明の解裂法に使用するのに最も
好ましい。 理解されるように、これらの基のいずれかにお
ける水素原子が芳香環の隣に結合した脂肪族炭素
原子を有する置換基で置換される場合、相当する
チオールは次に自然発生的にそのチオン形態に安
定化されよう。 本発明はまた脂肪族ジスルフイツド結合を示す
低分子化合物中のかかる結合の解裂法をも提供す
るものである。かかる化合物の例にはシスチンお
よびそれらのカルボキシルおよびアミノ誘導体は
包含される。もう一つの例はチオクト酸およびそ
のカルボキシル誘導体における−Ｓ−Ｓ−結合の
解裂である。ポリジスルフイツドの配座に影響す
る物質を反応混合物に添加して、それにより解裂
が起る度合いに影響を与えることができる。例え
ば、ポリジスルフイツドが蛋白質である場合、尿
素および／または洗浄剤の添加により高度の解裂
が達成されうる。これら２種の物質は配座を変更
するために水素結合を破壊することにより解裂工
程に影響する。 解裂されるジスルフイツド結合は脂肪族であ
る。これは発明の詳細な説明および特許請求の範
囲のいずれにおいても、結合の硫黄原子それぞれ
が炭素および／または水素以外の他の原子が何ら
結合していないそのそれぞれの脂肪族炭素原子に
結合していることを意味する。従つて、硫黄原子
が結合されうるこれら炭素原子は第一、第二、第
三炭素原子そしてまたメチル基中の炭素原子であ
る。 反応性ジスルフイツドR3−Ｓ−Ｓ−R4および
チオンを選択する場合、選択されるジスルフイツ
ドおよびチオンがR3＝R4＝R5である場合に特別
の利点が得られる。かかる選択により高度に均一
な生成物混合物（R1＝R2＝R3＝R4＝R5）が得ら
れそして容易に入手しうる試薬を利用する。 チオンおよび反応性ジスルフイツドR3−Ｓ−
Ｓ−R4の実際的過剰度の大きさは第一にそれら
の溶解度により判定される。電気的に荷電した
基、例えば負に荷電したカルボキシレート基を含
有するジスルフイツドおよびチオンは電気的に荷
電してないものより水性媒体中で溶解度が高い。
その結果多数のジスルフイツド結合が解裂される
べき場合は溶解度の高い反応性のジスルフイツド
R3−Ｓ−Ｓ−R4およびチオンを選択することが
より好都合である。 ジスルフイツド結合の解裂が非極性溶媒中で遂
行される場合、非極性ジスルフイツドR3−Ｓ−
Ｓ−R4およびチオンはかかる溶媒中における溶
解度が最大なのでこれらが選択されるのが好まし
い。 解裂が達成される程度は反応混合物中における
チオンおよび反応性ジスルフイツドR3−Ｓ−Ｓ
−R4のモル濃度により、および脂肪族ジスルフ
イツド結合の濃度に関するそれらのそれぞれの濃
度により制御される。解裂が遂行される程度は大
過剰のチオンおよび反応性ジスルフイツドR3−
Ｓ−Ｓ−R4により増大されうる。 その結果、本発明によれば、脂肪族ジスルフイ
ツド結合の初期濃度に関するチオンHR′5＝Ｓお
よび反応性のジスルフイツドR3−Ｓ−Ｓ−R4の
モル初期濃度は意図される解裂度が得られるよう
に選択される。 反応を操作するには、反応性ジスルフイツド
R3−Ｓ−Ｓ−R4の初期濃度はモル過剰、例えば
脂肪族ジスルフイツド結合の相当する濃度より
1000倍まで大きいように選択されるべきである。
通常、前記反応性ジスルフイツドの濃度の絶対値
は0.1〜400ｍＭの範囲内に選択される。チオン濃
度は通常脂肪族ジスルフイツド結合の初期濃度よ
り５〜100倍大きいように選択される。これに関
しては、チオン絶対値は0.1〜400ｍＭの範囲内に
あるべきであるが、程よい長さの時間内に所望の
解裂度を得るには、100〜400ｍＭのチオン絶対値
を選択するのがしばしば適当である。前記した範
囲の上限は反応媒体中の反応性ジスルフイツドお
よびチオンの溶解度によりすべて決定される。そ
れらの溶解度が高い場合、それらのそれぞれの濃
度は前記した限界を超えて拡大でき、より大きい
解裂度およびより高い解裂速度の可能性が高くな
る。 正確なモル割合および量はR3、R4およびR5の
選択、および脂肪族ジスルフイツド結合の脂肪族
構造次第であることは理解されよう。しかしなが
らこの分野における平均的技術の一つは、反応が
前記した一般的ガイドライン助けによりいかに制
御されるべきかをよく確立しうる。 ジスルフイツド結合の解裂は水性溶媒中で遂行
されるのが好都合である。種々の試薬（反応性ジ
スルフイツドR3−Ｓ−Ｓ−R4およびチオン）の
溶解度を改良するために種種の溶媒が添加されう
る。当然、添加される溶媒は解裂工程に有害な作
用を有してはならない。例えば、チオールR3−
Ｓ−Ｈ、R4−Ｓ−ＨおよびR5−Ｓ−Ｈのそれぞ
れのチオンへの前記した安定化を損なうべきでな
い。また生物学的活性を保有することが所望され
る場合はかかる活性を損なうことも許されるべき
でない。 その結果、解裂工程は副反応を助成しない温度
で遂行される。生物学的に活性な物質、例えばシ
スチンを含有するポリペプチドに関しては、選択
された温度が、もしその活性が保持されるべきな
らば、ポリペプチドの変性を惹起しないであろう
ことが必須要件である。この方法により解裂され
るジスルフイツド結合の数も温度次第である。 そのジスルフイツド結合が解裂されるべき脂肪
族ジスルフイツド結合を含有する物質は解裂が行
われる液相中に通常溶解しうるが、脂肪族ジスル
フイツド結合を含有する不溶性物質も本発明によ
り解裂されうる。例えば、不溶性の重合体、例え
ばヒドロキシルおよび／またはアミノ基を含有す
る不溶性の多孔質重合体に共有結合した脂肪族ジ
スルフイツド結合を解裂させることが可能であ
る。かかる不溶性のポリジスルフイツドの例には
共有結合された脂肪族ジスルフイツド基が置換さ
れているところのアガロース、エピクロロヒドリ
ンで交叉結合されたデキストラン、ポリ（ヒドロ
キシメタクリレート）等が包含される。本発明に
より得られる生成物はそれらの例が以下に掲げら
れる種々の分野で使用されうる。 導入されたジスルフイツド構造R1−Ｓ−Ｓ−
およびR2−Ｓ−Ｓ−はいずれも脂肪族チオール
基に反応性でありそしてそれゆえ解裂生成物をチ
オール−ジスルフイツド交換反応によりチオール
含有化合物と結合させるのに使用されうる。かく
して得らた生成物はいわゆる共役物である。共役
物なる用語は一般に共有により結合された２種類
の化合物を意味する。 本発明によりジスルフイツド結合を解裂させた
場合に得られる生成物（以下解裂生成物と呼ばれ
る）から生成されうる共役物の重要な型は分析上
指摘されうる化合物が少くとも１個のジスルフイ
ツド結合が解裂された配位子または受体と共役し
た場合に何が得られるかということである。受体
または配位子はここでは相互に生体特異的親和性
を有する化合物の対を意味する。かかる対の例に
は抗原−抗体（ハプテン）、蛋白質Ａ−IgG（免疫
複合物）、レクチン−炭水化物、チロキシン−
TBG、酵素−基質、酵素−補酵素等が包含され
る。理解されるように、それらの生体特異的活性
を保有している配位子または受体の断片もまた配
位子または受体と見なされよう。 分析的に指摘されうる化合物への言及は共役物
またはそれから遊離されたもののいずれかにおい
て検出されうる化合物に関する。かかる化合物の
例は酵素的に活性な物質（すなわち酵素、酵素基
質、補因子、補基質、補酵素等）および螢光物
質、燐光性物質、化学ルミネセンス物質、放射性
物質、金属含有化合物等（例えばシヤル・アー
ル・エフ（Schall R.F.）氏他の「Clin Chim」
第27巻第1157〜81頁（1981年）参照）である。 分析的に指摘されうる基を含有する共役物は
種々の物質を定量的および定性的に検出するのに
使用されうる。抗体と分析的に指摘されうる化合
物との間の共役物は、例えば、対応する天然の抗
体または抗原または抗体が対応するハプテンの検
定に使用されうる。この点で、検定は哺乳動物か
ら採つた液体試料、例えば検定すべき物質が溶解
された形態で存在する試料中にて遂行されうる。
US−Ａ−3817837号およびUS−Ａ−4231999号明
細書の特許請求の範囲および前記特許の中に技術
の状況として記載された種々の異種および同種の
方法に対してこの点で詳細な記述がなされうる。
前記共役物はまたその共役物が生体特異的親和性
を有する、細胞に結合したかまたは細胞小器官に
結合した配位子および受体の検定にも使用されう
る。前記共役物はまたその共役物が生体特異的親
和性を示す細胞結合されたかまたは細胞小器官結
合された配位子および受体の検定にも使用されう
る。これは、なかんずく、種々の顕微鏡的方法を
用いて行われうる。 共役物のもう一つの型は解裂生成物が不溶性担
体上のチオール基と反応しうる場合に得られるも
のである。解裂生成物がジスルフイツド含有受体
または配位子から導かれる場合、アフイニテイク
ロマトグラフイーおよび前記異種検定法のための
固定相として特に良く適した共役物が得られう
る。 共役物の第三の型は受体が本発明により解裂さ
れそしてチオールを含有する治療上活性な化合物
と共役された場合に得られるものである、例えば
EP−Ａ−0023401号、EP−Ａ−0017507号、EP
−Ａ−0023779号に記載されたと同様の共役物で
ある。もし受体が癌細胞のような特殊な型の細胞
（いわゆる標的細胞）に対する抗体である場合、
共役物は哺乳動物に投与された場合その標的細胞
と選択的に結合しよう。それゆえ治療上活性な化
合物はより効率的である筈である。 生成されうる共役物の他のありうる型のうちで
は免疫賦与目的のためのジスルフイツド共役物が
あげられうる。かかる共役物は解裂されうるジス
ルフイツド結合を含有する蛋白質抗原から生成さ
れうる。本発明により結合が解裂されたのに続
き、解裂生成物をチオールを含有する溶性のまた
は不溶性の担体と反応させる場合に共役物が形成
される。 本発明によれば、得られた解裂生成物は共役物
を予め形成させることなく直接使用することもで
きる。例えば、EP−Ａ−0064040号およびEP−
Ａ−0063109号から、R1−Ｓ−Ｓ−型の非対称の
反応性ジスルフイツド構造を含有する治療上活性
な化合物はこの構造を有しない相当する治療上活
性な化合物と比較して長期に亘る治療効果を示し
うることが知られる。不可逆的に化合物の活性を
破壊することなく本発明により解裂されうる治療
上活性なジスルフイツド化合物は、従つて、本発
明による新規な方法で治療活性が延長された期間
効力がある化合物に変換されうる。 先に、本発明により得られうる治療上活性な化
合物について記述がなされた。これら生成物が投
与される場合はいつでも、治療上活性な薬量が与
えられる。用いられる製剤は場合により医薬上受
容されうる担体およびまた場合により適当なアジ
ユバントをも含有しうる乳濁液、溶液、錠剤等の
形態をとりうる。共役物は皮下または静脈注射に
より投与されるのが好ましい。治療上活性な解裂
生成物は同じ経路で投与されうるが、しかし前記
解裂生成物、ならびに共役物にとつて他の経路に
よる投与も可能である。 理解されるように、解裂生成物の場合、構造
R1−Ｓ−Ｓ−およびR2−Ｓ−Ｓ−中にとり込ま
れたそれぞれの性質それ自体が直接用いられう
る。 非対称の反応性ジスルフイツド構造を導入する
ための従来知られた方法に対する本発明による方
法により与えられる最大の利点は生物学的に活性
なポリジスルフイツド、例えば免疫グロブリン特
に抗体のようなシスチン含有ポリペプチドに関し
て得られる。本発明による解裂法によりそれぞれ
の分子中の１個のそして同じジスルフイツド結合
を解裂させることが可能である。存在する結合の
総数の一部分のみが解裂される場合、例えば抗体
のような免疫グロブリンにおいて１個、２個また
は３個の結合が解裂される場合、ポリペプチドの
第三構造を従来知られた方法により得られるそれ
より大きな程度に保持することが可能である。こ
のことはこれらのような場合、解裂生成物は導入
された構造の分子中における位置選定に関して特
に同種であることを意味する。このことはまた、
例えば、すべての抗体の抗原結合部分が同じ方向
を指している良好な免疫吸着剤を生成しうるよう
に、特に同種の共役物の形成をも来す。このこと
はまた他の共役物にもあてはまる。同種性は同じ
細胞系列に由来する抗体が解裂および共役される
場合、すなわちいわゆるモノクローナル抗体が用
いられる場合にさらに増大されうる。 本発明が用いられうる種々の使用法についての
前記記述は例示のためにのみ掲げられるのであり
そしていかなる様にも本発明の範囲を限定するこ
とを意味するものではない。このことは以下に掲
げられる例についても真実である。 例 １ IgG中のジスルフイツド結合の解裂 免疫吸着剤で精製した羊の抗家兎IgG抗血清を
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミドで交叉結
合されたアリルデキストラン〔セフアクリル
（Sephacryl）（登録商標）Ｓ−300、スウエーデ
ン国ウプサラ（Uppsala）のPharmacia Fine
Chemicals AB社から入手〕上でゲル過するこ
とによりIgG型の免疫グロブリンを羊から調製し
た。IgG抗体（28μM）を0.21M塩化ナトリウム
および10％エタノールを含有する40ｍＭの燐酸ナ
トリウム緩衝液中５mlの容量において５ｍＭの
２，2′−ジピリジルジスルフイツドおよび種々の
濃度の２−チオピリドン（第１表、第１欄参照）
と23℃で24時間保温培養した。反応に続き、反応
混合物をPH8.5の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液中で
エピクロロヒドリンで交叉結合されたデキストラ
ン〔スウエーデン国、ウプサラのPharmacia
Fine Chemicals社製のセフアデツクス
（sephadex）（登録商標）Ｇ−25M〕を含有する
カラム上分離し、蛋白フラクシヨンを集めた。２
−チオピリドンに解裂されうる基の含量を
「Biochem J.」第173巻第723〜737頁（1968年）
の記載に従い測定した（第１表第２欄参照）。下
記の結果が得られた。 第１表 ２−チオピリドン IgG当量当りの２−チオ（ｍＭ） ピリジル構造の当量 12.5 0.89 25 1.23 50 1.52 100 1.86 200 2.00 例 ２ IgG種類の家兎の抗ヒトIgE抗体断片中のジス
ルフイツド結合の解裂 ヒトIgEのFc−断片（N.D.）を用いて家兎を免
疫することによりIgG種類の家兎−抗ヒト−IgE
抗体を調製した。IgE分子のFc部分のDE2領域に
対する抗IgE抗体を得るためにIgEの固定された
ペプチド断片上に免疫吸着させることにより抗体
を精製した（「Advances in Immunology」第13
巻（1971年）（AP））。PH4.5の酢酸ナトリウム緩
衝液1.0ml中の精製された抗体2.07mgをペプシン
（米国ニユージヤージー州Freeholdの
Worthington Biochemical Corporation社製の
名称３、４、23）50μｇを用い37℃で24時間にわ
たり解裂させた（「Handbook of Experimental
Immunology」Wein6−20〜６−22）。 次にPH11.2の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液を用
いて溶液のPHを8.0に調製することによりペプシ
ンを破壊した（約750μ）。２−チオピリドン
（ドイツ連邦共和国SteinheimのEga−Chemie社
製品）24mgおよび２，2′−ピリジルジスルフイツ
ド（スイス国BuchsのFluka AG社製品）2.4mgを
溶液に加え、次にこれを23℃で18時間「端から端
まで」回転させた。遠心分離に続き、反応混合物
を0.3M食塩水中のSephacryl Ｓ−300約200mlを
充填したカラムで分離した。IgGのFab′断片の分
子量に相当する56000ｇ／モルに当る分子量を有
する主要蛋白質ピークを集め（「Handbook of
Experimental Immunology」Wein6−20〜６−
22）そしてPM−10フイルター上25mlの濃縮用セ
ル（米国マサチユーセツツ州Lexingtonの
Amicon Corp社製12型）中N2気体環境の下に濃
縮した。A280＝1.09（cmセル）を有する濃縮物0.5
mlが得られた。２−チオピリドンに解裂されうる
基の含量はジチオトレイトール（米国ミズーリ州
セントルイスのSigma Chemical Company社製
品）を用いる還元に続き343nｍでの吸光度検定
により17・10-6Mと測定された。置換度（断片各
当量につき解裂されて２−チオピリドンを形成し
うる基の当量）は1.3であつた（「Biochem.J.」第
173巻第723〜737頁（1978年）参照）。280nｍで
の断片の吸光度をとればIgGのそれＡ１％ 280＝13.8
（１cmセル）と同じであつた。 例 ３ 不溶性の脂肪族ジスルフイツドの解裂 アガロースゲル〔スウエーデン国ウプサラの
Pharmacia Fine Chemicals社製セフアロース
（sepharose）（登録商標）6B〕をブルツクレウル
スト（Brocklehurst）氏他により「Biochem J.」
第133巻第573〜584頁（1973年）に記載されてい
るようにしてチオ硫酸ナトリウムと共に１−クロ
ロ−２，３−エポキシプロパン（ゲル３ｇ当り試
薬0.45ml）で処理しそしてジチオトレイトールで
還元した。得られるチオールアガロースゲル（ア
ガロース１ｇ当りチオール基約750μ当量）を次
に水中で過酸化水素を用いて酸化してジスルフイ
ツド−アガロースゲルを形成させた。アガロース
濃度は２％（ｗ／ｖ）、過酸化水素濃度0.1Mそし
て反応時間は60分であつた。この酸化に続き、ア
ガロースゲルを水および50％エタノールを添加し
たPH9.0の0.05M燐酸ナトリウム緩衝液で洗つた。
次にジスルフイツドゲルを50％エタノール中PH
9.0で23℃で撹拌下に２−チオピリドン（1.0M）
および２，2′−ジピリジルジスルフイツド
（0.5M）と120分間反応せしめた。次にこのゲル
を５％エタノールおよび水で洗つた。生成物を還
元的解裂させたのち343nｍで２−チオピリドン
を測光検定することにより分析した（「Acta
Chemica Scandinavica」B29巻第471〜474頁
（1975年））。このものはアガロース１ｇ当り635μ
当量の２−チオピリジル構造を含有していた。 例 ４ キモトリプシノゲン中のジスルフイツド結合の
解裂 キモトリプシノゲンＡ（米国マサチユーセツツ
州BedfordのMillipore Corp社製品）20mgをPH
9.0の1.0M硼酸ナトリウム緩衝液0.5ml中に溶解さ
せ、次に1.86ｍM2，2′−ジピリジルジスルフイ
ツド−16.3ｍM2−チオピリドン4.5mlを加えた。
この溶液を22、30および37℃で80時間保温培養し
た。反応混合物を遠心分離したのちPH7.0の0.1M
燐酸ナトリウム緩衝液中エピクロロヒドリンで交
叉結合されたデキストラン（スウエーデン国ウプ
サラのPharmacia Fine Chemicals AB社製
Sephadex Ｇ−25M）を充填したカラム上脱塩
した、反応の結果はA280の検定およびジチオトレ
イトールにより解裂された２−チオピリドンの
343nｍでの吸光度測定により確立された
（「Biochem.J.」第173巻第723〜737頁（1978
年））。 下記の結果が得られた。 第２表 チオピリジル構造の当量 反応温度／キモトリプシノゲン当量 ℃ 0.15 22 0.42 30 2.0 37 例 ５ IgGの断片中のジスルフイツド結合の解裂 家兎のIgG（デンマーク国BirkerodのMiles
scandinavia社製品）をPH4.5の0.1M酢酸ナトリ
ウム緩衝液中ペプシン（１：100w／ｗ）を用い
て37℃で24時間破砕した。反応混合物からＮ，
N′−メチレンビスアクリルアミドで交叉結合さ
れたアリルデキストラン〔Sephacryl Ｓ−300、
スウエーデン国ウプサラ（Uppsala）の
Pharmacia Fine Chemicals AB社から入手〕を
充填したガラム上Ｆ（ab′）2断片を分離した
（「Handbook of Experimental Immunology」
Wein6−20〜６−22）。断片の濃度はA280測定に
より判定された。Ａ１％ 280＝1.38（１cmセル）。2.4
％エタノールおよび2.0ｍＭの２，2′−ジピリジ
ルジスルフイツド（スイス国BuchsのFluka AG
社製品）および種々の濃度の２−チオピリドンを
有するPH8.0の0.1M燐酸ナトリウム溶液中のＦ
（ab′）2−断片23.3μMの溶液を23℃で種々の時間
保温培養した。エピクロロヒドリンで交叉結合さ
れたデキストラン〔スウエーデン国ウプサラの
Pharmacia Fine Chemicals社製のSephadex
Ｇ−25F〕の床で脱塩することにより反応を中断
させ、蛋白質フラクシヨンを集めそしてその蛋白
質含量に関し（A280）および還元的に解裂されう
る２−チオピリドンの含量（A343）に関し分析し
た（「Biochem.J.」第173巻第723〜737頁（1978
年））。置換度（＝断片当量当りの２−チオピリジ
ルジスルフイツド構造の当量数）を計算した。 下記の結果が得られた。
R1およびR2−Ｓ−Ｓ−（式中R1およびR2は同じ
かまたは異なつておりそしてそれぞれ有機残基で
ある）を有する２個の反応性の基に実質上変換さ
れる少なくとも１個のジスルフイツド結合−Ｓ−
Ｓ−（ここで硫黄原子のそれぞれはかかるジスル
フイツド結合少なくとも１個を含有する有機物質
中のそのそれぞれの脂肪族炭素原子に直接共有結
合している）を解裂させるに当り、前記有機物質
を化合物R3−Ｓ−Ｓ−R4と互変異性形態R5−Ｓ
−ＨおよびHR′5＝Ｓにおいてまたは相当する共
鳴安定された陰イオン形態（これら化合物中残基
R3、R4およびR5は (i) すべてが相異するか、２個が等しいかまたは
すべてが等しい有機残基であり、そして (ii)(a) 化合物R3−Ｓ−Ｓ−R4およびR5−Ｓ−Ｈ
中の前記硫黄原子のそれぞれが芳香環中の炭
素原子に結合しておりそして (b) 化合物R3−Ｓ−Ｓ−R4の反応により放出
される化合物R3−Ｓ−ＨまたはR4−Ｓ−Ｈ
および化合物R5−Ｓ−Ｈが一般に行われる
解裂条件下において実質上それらのそれぞれ
の互変異性形態HR′3＝Ｓ、HR′4＝Ｓおよび
HR′5＝Ｓまたは相当する共鳴安定された陰
イオン形態で存在すること、およびR1とR2
はR3、R4およびR5からなる群に属する残基
をそれぞれ構成することと定義される）にお
いて存在しうる化合物との混合物と反応させ
ることにより前記した少なくとも１個の結合
を解裂させることを特徴とする方法。 ２ 有機物質がポリペプチドであることを特徴と
する請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ポリペプチドが免疫グロブリンまたはその断
片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載
の方法。 ４ 免疫グロブリンが抗体またはその抗体活性断
片であることを特徴とする請求の範囲第３項記載
の方法。 ５ R1＝R2＝R3＝R4＝R5であることを特徴とす
る請求の範囲第１または２項記載の方法。 明細書 本発明は少くとも１個のジスルフイツド結合−
Ｓ−Ｓ−（ここで硫黄原子のそれぞれはかかるジ
スルフイツド結合の少くとも１個の含有する有機
物質中のそれぞれの脂肪族炭素原子に直接共有結
合している）を解裂させる方法に関するものであ
り、解裂されたそれぞれの結合−Ｓ−Ｓ−は式−
Ｓ−Ｓ−R1およびR2−Ｓ−Ｓ−（ここでR1および
R2は同じかまたは相異なつておりそしてそれぞ
れ有機残基である）を有する２個の反応性の基に
実質上変換される。本発明はまた脂肪族炭素原子
に共有結合した基−Ｓ−Ｓ−R1および／または
R2−Ｓ−Ｓ−（ここで基R1およびR2は前記の意味
を有する）の少くとも１個を示す有機化合物にも
関する。 脂肪族チオール基（すなわちチオール基が脂肪
族炭素原子に結合している）およびそれから誘導
されるジスルフイツド基は生化学的情況において
重要な役割を有する。チオール基は生理学的条件
下に例えば活性チオエステルのような多数の他の
官能性構造と反応する。チオール基は酵素の活性
部位においてしばしば見出され、その場合これら
は酵素の触媒作用において重要な役割を演じてい
る。ジスルフイツド基はしばしばポリペプチド
（この用語は蛋白質をも包含するものと見なされ
ル）中に存在しそして通常固定要素および配座を
与える要素として作用すると思われる。動的な生
化学的反応の情況における試薬としての天然のジ
スルフイツドにより演じられる役割は比較的知ら
れていないがしかし例えば蛋白質に関しての前記
した配座性質により重大な意味を有すると見做さ
れねばならない（例えば「FEBS Letters」第97
巻第201〜10頁（1979年）参照）。 チオール基とジスルフイツド基の両方を同時に
包含する反応の型はチオール−ジスルフイツド交
換により示されそして下記のように記される： X1−SH＋X2−Ｓ−Ｓ−X3X2−Ｓ−Ｓ−X1 ＋X3−SH （式中X1、X2およびX3は−Ｓ−Ｓ−中の硫黄原
子の一方に結合した脂肪族または芳香族炭素原子
を含有する有機残基である）。 チオール−ジスルフイツド交換反応は生理学的
条件下に迅速に起るが、平衡の条件は所定のジス
ルフイツドの調製的生産には通常好ましくない。
例えば、ポリジスルフイツドをチオール成分と混
合すると、種々のジスルフイツドを含有する単位
の複合混合物を生ずる一連のチオール−ジスルフ
イツド交換反応が速かに起る。もしポリジスルフ
イツドが生物学的に活性な分子である場合は、そ
の活性度が影響される。 例えばアルキルピリジルジスルフイツド型のい
わゆる反応生ジスルフイツドの導入はジスルフイ
ツドの調製を大いに促進させる。反応生ジスルフ
イツドは通常求電子度の増大したジスルフイツド
および去りゆくチオールが安定化された互変異生
チオン形態またはその安定化された陰イオンに変
換されるような性質を有するジスルフイツドを意
味する。この安定化により、去つたチオールが反
対のまたは逆の反応に関与する可能性が否定され
る、例えばアルキルピリジルジスルフイツドの場
合、脂肪族チオール構造は解裂されないが、しか
しチオン構造は解裂される。この方法で、所望の
脂肪族ジスルフイツドの調製に好ましい平衡が得
られる。 チオール−ジスルフイツド交換反応に基づいて
おりそして生物学的に活性な分子の型を包含する
過程は今や生体分子と担体ポリマーとのまたは生
体分子と生体分子との共役において益々使用され
ており、それにより前者の場合では生体分子の溶
解度、分離性、安定性、輸送性のようなそれらの
外部性質が変化されて所定の要件を満たし、一方
後者の場合は多数の生体活性が組み合わさりそし
て例えば免疫学的性質を酵素的性質とまたは薬理
学的性質を回帰性質と協同せしめることになる。
かかる調製はクロマトグラフイー、薬剤、診断上
の分析法およびプロセス科学技術と関連した使用
が見出されるか、またはそれらに関連する将来の
使用が見出されると判断されうる。 チオール基を含有しない成分の間の反応性ジス
ルフイツドによるジスルフイツド共役物の調製に
おける方法論にはそれら成分と特定のチオール化
剤例えばホモシステインチオラクトンおよびチオ
ールイミデートとの反応、または二官能性試薬例
えば二官能性試薬Ｎ−スクシンイミジル−３−
（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートとの反応
がしばしば包含される。従つてこの最後に述べた
化合物により反応性ジスルフイツドが直接例え
ば、蛋白質分子中に導入されることが許容される
が、しかし還元の容易さゆえにチオール基も導入
されうる。 もし成分が脂肪族ジスルフイツド結合（すなわ
ち２個の脂肪族炭素原子間のジスルフイツド結
合）を含有しそして蛋白質に関して全く普通であ
る他の成分とジスルフイツドとして共役すること
が意図される場合、初めに脂肪族ジスルフイツド
結合を還元しそして得られるチオール基を次に他
の成分の反応性ジスルフイツドと反応させること
が原則として可能である（例えば「Immunology
Letters」第２巻第151〜155頁（1980年）または
「Haematologia」第14巻第95〜99頁（1981年）
参照）。 しかしながらこの知られた方法は多くの欠点が
負つている。還元工程は通常低分子量の脂肪族チ
オール化合物を用いて遂行される。ポリジスルフ
イツドの部分的還元を行うには中程度の濃度の低
分子チオール化合物が使用される。しかしながら
チオール−ジスルフイツド交換反応は前記したポ
リジスルフイツド分子内でも開始される。ポリジ
スルフイツドの全還元は高濃度の低分子脂肪族チ
オールを用いて達成されうる（しばしば、変性剤
と共に）。しかしながらかかる反応混合物を後処
理する場合、濃度条件は容易に変化して、部分的
逆反応が起る。さらに、反応し易いチオール構造
が空気で酸化されるのを回避するのが困難になり
がちである。チオール段階での分離を回避しそし
て例えばジピリジルジスルフイツドとの平衡混合
物を抑制する可能性は事実実際的でない、何故な
らジピリジルジスルフイツドは還元剤により消費
され、そして初めに形成された非対称の反応性ジ
スルフイツドが還元されたポリジスルフイツド成
分の再形成を分子間的にそしてまた還元剤と一緒
に開始させるからである。 亜硫酸ナトリウムを用いるスルフイトリシスは
多連鎖ペプチドをポリペプチドフラクシヨンに全
解裂させる蛋白質化学の分野において適用される
ジスルフイツドの古い、知られた解裂法である
（前記引用文献参照）。しかしながらこの方法論は
制御困難であり、そして触媒量の例えばシステイ
ンおよび酸素の使用を必要とする。得られる利点
はこの方法によりＳ−スルホネート構造の保護基
を有するチオール官能基が得られることである。 これら早期の知られた方法で遭遇する欠点の大
部分が本発明により除かれる。本発明によるジス
ルフイツド結合の解裂は解裂が解裂される予定の
少くとも１個の、好ましくは脂肪族ジスルフイツ
ド結合を含有する有機物質を、化合物R3−Ｓ−
Ｓ−R4と互変異性形態R5−Ｓ−ＨおよびHR′5＝
Ｓまたは相当する共鳴安定された陰イオン形態で
存在しうる化合物との混合物と反応させることに
より遂行されることを特徴とする。ここで上記化
合物中残基R3、R4およびR5は (i) それらすべてが相異するか、２個が同一であ
るかまたはすべてが同一である有機残基であ
り、そして (ii)(a) 化合物R3−Ｓ−Ｓ−R4およびR5−Ｓ−Ｈ
において、それらの硫黄原子それぞれは芳香
環中のそれぞれの炭素原子に結合しており、
そして (b) 化合物R3−Ｓ−Ｓ−R4の反応により放出
される化合物R3−Ｓ−ＨまたはR4−Ｓ−Ｈ
および化合物R5−Ｓ−Ｈが一般に行われる
解裂条件下において実質上それらのそれぞれ
の互変異性形態HR′3＝Ｓ、HR′4＝Ｓおよび
HR′5＝Ｓ、または相当する共鳴安定された
陰イオン形態で存在すること、およびR1と
R2はそれぞれR3、R4およびR5からなる群の
残基であることと定義される。 本発明による解裂は一つの段階において少くと
も１個のそのジスルフイツド結合を２個の新規ジ
スルフイツド結合に変換することによりジスルフ
イツド含有化合物を酸化するのであるからこの解
裂は酸化とみなされうる。以前、解裂工程は１個
のジスルフイツド結合の２個のチオール基への還
元を包含するのでその解裂方法は還元的であつ
た。 前記R3−Ｓ−Ｈ、R4−Ｓ−ＨおよびR5−Ｓ−
Ｈはそれらのチオール形態における化合物を表わ
し、そしてHR′3＝Ｓ、HR′4＝ＳおよびHR′5＝Ｓ
はそれらのチオン形態における前記化合物を表わ
す。チオール形態と相当するチオン形態はエノー
ル−ケト互変異性と完全に同じであるチオール−
チオン互変異性の例である。互変異性の二つの型
はよく知られておりそしてsp2−混成炭素原子に
結合したチオール基（ヒドロキシル基）が分子内
的にチオン基（ケト基）に変換されうることを意
味する。この変換は水素が分子内で場所を変え、
一方二重結合は同時に位置を変えた。すなわち
R3、R4およびR5はそれぞれR′3、R′4およびR′5と
は二重結合の位置選定の点でのみ異なることを意
味する。この表示はすべての有機化学者によく知
られている。チオンおよびケトン形態いずれも塩
基性物質によりそれらのそれぞれの共鳴安定され
た、脱プロトン化された陰イオン形態に変換され
うる。前記チオン形態の場合、これら陰イオンは
R′3＝Ｓ、 R′4＝Ｓおよび R′5＝Ｓと表示さ
れる。 一般に行われる解裂条件下では不安定なチオー
ルR3−Ｓ−Ｈ、R4−Ｓ−ＨおよびR5−Ｓ−Ｈは
それらの安定化されたチオン形態または相当する
陰イオン形態で存在するので、以下これらはチオ
ンとして言及されよう。 本発明により遂行される解裂により、一回の工
程で、脂肪族ジスルフイツド結合を得られる反応
性のジスルフイツド構造−Ｓ−Ｓ−R1および−
Ｓ−Ｓ−R2の一方を含有する少くとも１個の化
合物が単離できる程度に解裂工程期間中不活性で
ある２個の反応性ジスルフイツド構造に変換でき
る。 かかる結合１個を有する有機物質中における本
発明による脂肪族ジスルフイツド結合の解裂は概
略的に下記の方法で示されうる。 （式中A1およびA2はそれぞれ有機物質の残留部
分を意味しそして式中破線はA1およびA2が解裂
される予定の−Ｓ−Ｓ−結合以外の結合と場合に
より結合しうることを意味する）。従つて、A1お
よびA2が解裂される予定の−Ｓ−Ｓ−結合以外
の結合とも相互に係合している場合は、１つの新
しい分子が得られる。本発明はまた脂肪族炭素原
子に共有結合した機−Ｓ−Ｓ−R1および／また
はR2−Ｓ−Ｓ−の少くとも１個を示すところの、
かかる解裂から生ずる有機化合物を包含するもの
である。 本発明による前記結合の解裂は極端なPH条件を
適用する必要なく遂行されうる。このことにより
加水分解的副反応が回避されうる。例えば、この
方法で、解裂すべきジスルフイツド結合の加水分
解または他の例えばアミド、ペプチド、ケター
ル、アセタールまたはエステル結合のような加水
分解感受性結合の加水分解を回避することが可能
である。結果として、本発明は脂肪族ジスルフイ
ツド結合を選択的および特異的な様式で２個の反
応性ジスルフイツド構造に変換する結合解裂法を
提供するものである。 この解裂反応はPH依存性であり、そして水性媒
体中PH５〜12で遂行されうる。感受性物質を取扱
う場合副反応が起るのを避けるために、PH値は７
〜11の範囲内にあるべきである。 本発明により得られる最も重要な利点はポリペ
プチドの異なる型のジスルフイツド結合が段階的
に解裂されうるという驚くべき知見に基づくもの
である、すなわち過剰の反応性ジスルフイツド
R3−Ｓ−Ｓ−R4およびHR5＝Ｓの量が増大する
と、それぞれの結合型がそれ自体の個々の過剰に
おいてのみ解裂されるのである。当然、これは残
りの条件が一定に保たれている場合にのみあては
まる。前記知見により単一の生成物、すなわち型
および数が等しいジスルフイツド結合が各分子内
で解裂された生成物が得られうるのでこれは調製
上重要な利点を提供するものである。 従つて本発明による解裂によりポリジスルフイ
ツドのすべてのジスルフイツド結合のうち少くと
も１個のジスルフイツド結合を解裂する方法も提
供される。解裂されたジスルフイツド結合が例え
ばほとんど例外なく少くとも１個のシスチン構造
を含有する蛋白質またはポリペプチドのような生
物学的に活性な巨大分子中に含まれる場合に特に
重要な利点が得られる。これらのような化合物の
場合、生物学的活性は以前の知られたジスルフイ
ツド結合解裂法により与えられるより大きい程度
に保有されうる。かかる普通ならざる高い生物学
的活性を達成しうるという事実は恐らく本発明に
よる方法の間何ら分子間および分子内チオール−
ジスルフイツド交換反応が起らないゆえであろ
う。多分、これは解裂工程中脂肪族チオール基が
何ら存在しないことによるのであろう。かかる基
がとにかく存在するとしても、それは非常に少量
にのみしか存在しない。特に重要な利点はポリジ
スルフイツドが添加された反応性ジスルフイツド
R3−Ｓ−Ｓ−R4と反応しうる遊離のチオール基
を何ら含有しない場合に得られる。低分子量チオ
ール化合物は分子内チオール−ジスルフイツド交
換反応を容易に開始させる。結果として、かかる
化合物は解裂過程中に存在すべきでない。 多数のチオール化合物が水溶液中で自然発生的
にそれらのチオン形態に互変異性化する、すなわ
ちかかる化合物のチオン形態はそれらの対応する
チオール形態より安定である。これに関する１つ
の要件はチオール基の硫黄原子が芳香環中のsp2
−混成炭素原子に結合しているべきであるという
ことである。芳香環がヘテロ原子好ましくは窒素
を包含する場合（すなわちその環が複素環である
場合）、および／または例えばニトロ、シアノお
よびカルボキシからなる群から選択される電子求
引性置換基少くとも１個を有する場合チオン形態
はまださらに安定化される。硫黄原子は奇数の原
子に等しい複素環式芳香環中のヘテロ原子から離
れて局在するのが好ましい。解裂反応に関して
は、チオールR3SH、R4SHおよびR5SHの構造が
それぞれのチオン形態または相当する共鳴安定化
された陰イオン形態への変換および安定化が起る
のを許容するようであることが極度に重要であ
る。これに関しては、安定化は非常に高いレベル
を有するのでチオンおよび陰イオン形態は一般的
に行われる解裂条件下ではチオール−ジスルフイ
ツド交換反応について熱力学的に否定されよう。
その結果、チオール形態の相当するチオンまたは
陰イオン形態への安定化を得るには電子求引性物
質が常に前記非複素環系中に必要とされる。 それらのチオール化合物が一般に行われる解裂
条件下に互変異性または共鳴により自然発生的に
相当するチオン形態に安定化されるR3、R4およ
びR5の例には５−ニトロ−２−ピリジル、５−
カルボキシ−２−ピリジル、２−ピリジル、４−
ピリジル、２−ベンゾチアゾリル、４−ニトロ−
３−カルボキシ−フエニルおよび前記ピリジル基
のＮ−オキサイドが包含される。好ましくは対称
である反応性のジスルフイツド化合物R3−Ｓ−
Ｓ−R4において、R3およびR4はいずれも５−ニ
トロ−２−ピリジル、５−カルボキシ−２−ピリ
ジル、２−ピリジル、４−ピリジル、２−ベンゾ
チアゾリル、４−ニトロ−３−カルボキシ−フエ
ニルおよび前記ピリジル基のＮ−オキサイドから
選択されるのが適当である。これらの基に相当す
る反応性ジスルフイツドR4−Ｓ−Ｓ−R3および
チオンHR′5＝Ｓのいずれも容易に入手でき、従
つてこれらが本発明の解裂法に使用するのに最も
好ましい。 理解されるように、これらの基のいずれかにお
ける水素原子が芳香環の隣に結合した脂肪族炭素
原子を有する置換基で置換される場合、相当する
チオールは次に自然発生的にそのチオン形態に安
定化されよう。 本発明はまた脂肪族ジスルフイツド結合を示す
低分子化合物中のかかる結合の解裂法をも提供す
るものである。かかる化合物の例にはシスチンお
よびそれらのカルボキシルおよびアミノ誘導体は
包含される。もう一つの例はチオクト酸およびそ
のカルボキシル誘導体における−Ｓ−Ｓ−結合の
解裂である。ポリジスルフイツドの配座に影響す
る物質を反応混合物に添加して、それにより解裂
が起る度合いに影響を与えることができる。例え
ば、ポリジスルフイツドが蛋白質である場合、尿
素および／または洗浄剤の添加により高度の解裂
が達成されうる。これら２種の物質は配座を変更
するために水素結合を破壊することにより解裂工
程に影響する。 解裂されるジスルフイツド結合は脂肪族であ
る。これは発明の詳細な説明および特許請求の範
囲のいずれにおいても、結合の硫黄原子それぞれ
が炭素および／または水素以外の他の原子が何ら
結合していないそのそれぞれの脂肪族炭素原子に
結合していることを意味する。従つて、硫黄原子
が結合されうるこれら炭素原子は第一、第二、第
三炭素原子そしてまたメチル基中の炭素原子であ
る。 反応性ジスルフイツドR3−Ｓ−Ｓ−R4および
チオンを選択する場合、選択されるジスルフイツ
ドおよびチオンがR3＝R4＝R5である場合に特別
の利点が得られる。かかる選択により高度に均一
な生成物混合物（R1＝R2＝R3＝R4＝R5）が得ら
れそして容易に入手しうる試薬を利用する。 チオンおよび反応性ジスルフイツドR3−Ｓ−
Ｓ−R4の実際的過剰度の大きさは第一にそれら
の溶解度により判定される。電気的に荷電した
基、例えば負に荷電したカルボキシレート基を含
有するジスルフイツドおよびチオンは電気的に荷
電してないものより水性媒体中で溶解度が高い。
その結果多数のジスルフイツド結合が解裂される
べき場合は溶解度の高い反応性のジスルフイツド
R3−Ｓ−Ｓ−R4およびチオンを選択することが
より好都合である。 ジスルフイツド結合の解裂が非極性溶媒中で遂
行される場合、非極性ジスルフイツドR3−Ｓ−
Ｓ−R4およびチオンはかかる溶媒中における溶
解度が最大なのでこれらが選択されるのが好まし
い。 解裂が達成される程度は反応混合物中における
チオンおよび反応性ジスルフイツドR3−Ｓ−Ｓ
−R4のモル濃度により、および脂肪族ジスルフ
イツド結合の濃度に関するそれらのそれぞれの濃
度により制御される。解裂が遂行される程度は大
過剰のチオンおよび反応性ジスルフイツドR3−
Ｓ−Ｓ−R4により増大されうる。 その結果、本発明によれば、脂肪族ジスルフイ
ツド結合の初期濃度に関するチオンHR′5＝Ｓお
よび反応性のジスルフイツドR3−Ｓ−Ｓ−R4の
モル初期濃度は意図される解裂度が得られるよう
に選択される。 反応を操作するには、反応性ジスルフイツド
R3−Ｓ−Ｓ−R4の初期濃度はモル過剰、例えば
脂肪族ジスルフイツド結合の相当する濃度より
1000倍まで大きいように選択されるべきである。
通常、前記反応性ジスルフイツドの濃度の絶対値
は0.1〜400ｍＭの範囲内に選択される。チオン濃
度は通常脂肪族ジスルフイツド結合の初期濃度よ
り５〜100倍大きいように選択される。これに関
しては、チオン絶対値は0.1〜400ｍＭの範囲内に
あるべきであるが、程よい長さの時間内に所望の
解裂度を得るには、100〜400ｍＭのチオン絶対値
を選択するのがしばしば適当である。前記した範
囲の上限は反応媒体中の反応性ジスルフイツドお
よびチオンの溶解度によりすべて決定される。そ
れらの溶解度が高い場合、それらのそれぞれの濃
度は前記した限界を超えて拡大でき、より大きい
解裂度およびより高い解裂速度の可能性が高くな
る。 正確なモル割合および量はR3、R4およびR5の
選択、および脂肪族ジスルフイツド結合の脂肪族
構造次第であることは理解されよう。しかしなが
らこの分野における平均的技術の一つは、反応が
前記した一般的ガイドライン助けによりいかに制
御されるべきかをよく確立しうる。 ジスルフイツド結合の解裂は水性溶媒中で遂行
されるのが好都合である。種々の試薬（反応性ジ
スルフイツドR3−Ｓ−Ｓ−R4およびチオン）の
溶解度を改良するために種種の溶媒が添加されう
る。当然、添加される溶媒は解裂工程に有害な作
用を有してはならない。例えば、チオールR3−
Ｓ−Ｈ、R4−Ｓ−ＨおよびR5−Ｓ−Ｈのそれぞ
れのチオンへの前記した安定化を損なうべきでな
い。また生物学的活性を保有することが所望され
る場合はかかる活性を損なうことも許されるべき
でない。 その結果、解裂工程は副反応を助成しない温度
で遂行される。生物学的に活性な物質、例えばシ
スチンを含有するポリペプチドに関しては、選択
された温度が、もしその活性が保持されるべきな
らば、ポリペプチドの変性を惹起しないであろう
ことが必須要件である。この方法により解裂され
るジスルフイツド結合の数も温度次第である。 そのジスルフイツド結合が解裂されるべき脂肪
族ジスルフイツド結合を含有する物質は解裂が行
われる液相中に通常溶解しうるが、脂肪族ジスル
フイツド結合を含有する不溶性物質も本発明によ
り解裂されうる。例えば、不溶性の重合体、例え
ばヒドロキシルおよび／またはアミノ基を含有す
る不溶性の多孔質重合体に共有結合した脂肪族ジ
スルフイツド結合を解裂させることが可能であ
る。かかる不溶性のポリジスルフイツドの例には
共有結合された脂肪族ジスルフイツド基が置換さ
れているところのアガロース、エピクロロヒドリ
ンで交叉結合されたデキストラン、ポリ（ヒドロ
キシメタクリレート）等が包含される。本発明に
より得られる生成物はそれらの例が以下に掲げら
れる種々の分野で使用されうる。 導入されたジスルフイツド構造R1−Ｓ−Ｓ−
およびR2−Ｓ−Ｓ−はいずれも脂肪族チオール
基に反応性でありそしてそれゆえ解裂生成物をチ
オール−ジスルフイツド交換反応によりチオール
含有化合物と結合させるのに使用されうる。かく
して得らた生成物はいわゆる共役物である。共役
物なる用語は一般に共有により結合された２種類
の化合物を意味する。 本発明によりジスルフイツド結合を解裂させた
場合に得られる生成物（以下解裂生成物と呼ばれ
る）から生成されうる共役物の重要な型は分析上
指摘されうる化合物が少くとも１個のジスルフイ
ツド結合が解裂された配位子または受体と共役し
た場合に何が得られるかということである。受体
または配位子はここでは相互に生体特異的親和性
を有する化合物の対を意味する。かかる対の例に
は抗原−抗体（ハプテン）、蛋白質Ａ−IgG（免疫
複合物）、レクチン−炭水化物、チロキシン−
TBG、酵素−基質、酵素−補酵素等が包含され
る。理解されるように、それらの生体特異的活性
を保有している配位子または受体の断片もまた配
位子または受体と見なされよう。 分析的に指摘されうる化合物への言及は共役物
またはそれから遊離されたもののいずれかにおい
て検出されうる化合物に関する。かかる化合物の
例は酵素的に活性な物質（すなわち酵素、酵素基
質、補因子、補基質、補酵素等）および螢光物
質、燐光性物質、化学ルミネセンス物質、放射性
物質、金属含有化合物等（例えばシヤル・アー
ル・エフ（Schall R.F.）氏他の「Clin Chim」
第27巻第1157〜81頁（1981年）参照）である。 分析的に指摘されうる基を含有する共役物は
種々の物質を定量的および定性的に検出するのに
使用されうる。抗体と分析的に指摘されうる化合
物との間の共役物は、例えば、対応する天然の抗
体または抗原または抗体が対応するハプテンの検
定に使用されうる。この点で、検定は哺乳動物か
ら採つた液体試料、例えば検定すべき物質が溶解
された形態で存在する試料中にて遂行されうる。
US−Ａ−3817837号およびUS−Ａ−4231999号明
細書の特許請求の範囲および前記特許の中に技術
の状況として記載された種々の異種および同種の
方法に対してこの点で詳細な記述がなされうる。
前記共役物はまたその共役物が生体特異的親和性
を有する、細胞に結合したかまたは細胞小器官に
結合した配位子および受体の検定にも使用されう
る。前記共役物はまたその共役物が生体特異的親
和性を示す細胞結合されたかまたは細胞小器官結
合された配位子および受体の検定にも使用されう
る。これは、なかんずく、種々の顕微鏡的方法を
用いて行われうる。 共役物のもう一つの型は解裂生成物が不溶性担
体上のチオール基と反応しうる場合に得られるも
のである。解裂生成物がジスルフイツド含有受体
または配位子から導かれる場合、アフイニテイク
ロマトグラフイーおよび前記異種検定法のための
固定相として特に良く適した共役物が得られう
る。 共役物の第三の型は受体が本発明により解裂さ
れそしてチオールを含有する治療上活性な化合物
と共役された場合に得られるものである、例えば
EP−Ａ−0023401号、EP−Ａ−0017507号、EP
−Ａ−0023779号に記載されたと同様の共役物で
ある。もし受体が癌細胞のような特殊な型の細胞
（いわゆる標的細胞）に対する抗体である場合、
共役物は哺乳動物に投与された場合その標的細胞
と選択的に結合しよう。それゆえ治療上活性な化
合物はより効率的である筈である。 生成されうる共役物の他のありうる型のうちで
は免疫賦与目的のためのジスルフイツド共役物が
あげられうる。かかる共役物は解裂されうるジス
ルフイツド結合を含有する蛋白質抗原から生成さ
れうる。本発明により結合が解裂されたのに続
き、解裂生成物をチオールを含有する溶性のまた
は不溶性の担体と反応させる場合に共役物が形成
される。 本発明によれば、得られた解裂生成物は共役物
を予め形成させることなく直接使用することもで
きる。例えば、EP−Ａ−0064040号およびEP−
Ａ−0063109号から、R1−Ｓ−Ｓ−型の非対称の
反応性ジスルフイツド構造を含有する治療上活性
な化合物はこの構造を有しない相当する治療上活
性な化合物と比較して長期に亘る治療効果を示し
うることが知られる。不可逆的に化合物の活性を
破壊することなく本発明により解裂されうる治療
上活性なジスルフイツド化合物は、従つて、本発
明による新規な方法で治療活性が延長された期間
効力がある化合物に変換されうる。 先に、本発明により得られうる治療上活性な化
合物について記述がなされた。これら生成物が投
与される場合はいつでも、治療上活性な薬量が与
えられる。用いられる製剤は場合により医薬上受
容されうる担体およびまた場合により適当なアジ
ユバントをも含有しうる乳濁液、溶液、錠剤等の
形態をとりうる。共役物は皮下または静脈注射に
より投与されるのが好ましい。治療上活性な解裂
生成物は同じ経路で投与されうるが、しかし前記
解裂生成物、ならびに共役物にとつて他の経路に
よる投与も可能である。 理解されるように、解裂生成物の場合、構造
R1−Ｓ−Ｓ−およびR2−Ｓ−Ｓ−中にとり込ま
れたそれぞれの性質それ自体が直接用いられう
る。 非対称の反応性ジスルフイツド構造を導入する
ための従来知られた方法に対する本発明による方
法により与えられる最大の利点は生物学的に活性
なポリジスルフイツド、例えば免疫グロブリン特
に抗体のようなシスチン含有ポリペプチドに関し
て得られる。本発明による解裂法によりそれぞれ
の分子中の１個のそして同じジスルフイツド結合
を解裂させることが可能である。存在する結合の
総数の一部分のみが解裂される場合、例えば抗体
のような免疫グロブリンにおいて１個、２個また
は３個の結合が解裂される場合、ポリペプチドの
第三構造を従来知られた方法により得られるそれ
より大きな程度に保持することが可能である。こ
のことはこれらのような場合、解裂生成物は導入
された構造の分子中における位置選定に関して特
に同種であることを意味する。このことはまた、
例えば、すべての抗体の抗原結合部分が同じ方向
を指している良好な免疫吸着剤を生成しうるよう
に、特に同種の共役物の形成をも来す。このこと
はまた他の共役物にもあてはまる。同種性は同じ
細胞系列に由来する抗体が解裂および共役される
場合、すなわちいわゆるモノクローナル抗体が用
いられる場合にさらに増大されうる。 本発明が用いられうる種々の使用法についての
前記記述は例示のためにのみ掲げられるのであり
そしていかなる様にも本発明の範囲を限定するこ
とを意味するものではない。このことは以下に掲
げられる例についても真実である。 例 １ IgG中のジスルフイツド結合の解裂 免疫吸着剤で精製した羊の抗家兎IgG抗血清を
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミドで交叉結
合されたアリルデキストラン〔セフアクリル
（Sephacryl）（登録商標）Ｓ−300、スウエーデ
ン国ウプサラ（Uppsala）のPharmacia Fine
Chemicals AB社から入手〕上でゲル過するこ
とによりIgG型の免疫グロブリンを羊から調製し
た。IgG抗体（28μM）を0.21M塩化ナトリウム
および10％エタノールを含有する40ｍＭの燐酸ナ
トリウム緩衝液中５mlの容量において５ｍＭの
２，2′−ジピリジルジスルフイツドおよび種々の
濃度の２−チオピリドン（第１表、第１欄参照）
と23℃で24時間保温培養した。反応に続き、反応
混合物をPH8.5の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液中で
エピクロロヒドリンで交叉結合されたデキストラ
ン〔スウエーデン国、ウプサラのPharmacia
Fine Chemicals社製のセフアデツクス
（sephadex）（登録商標）Ｇ−25M〕を含有する
カラム上分離し、蛋白フラクシヨンを集めた。２
−チオピリドンに解裂されうる基の含量を
「Biochem J.」第173巻第723〜737頁（1968年）
の記載に従い測定した（第１表第２欄参照）。下
記の結果が得られた。 第１表 ２−チオピリドン IgG当量当りの２−チオ（ｍＭ） ピリジル構造の当量 12.5 0.89 25 1.23 50 1.52 100 1.86 200 2.00 例 ２ IgG種類の家兎の抗ヒトIgE抗体断片中のジス
ルフイツド結合の解裂 ヒトIgEのFc−断片（N.D.）を用いて家兎を免
疫することによりIgG種類の家兎−抗ヒト−IgE
抗体を調製した。IgE分子のFc部分のDE2領域に
対する抗IgE抗体を得るためにIgEの固定された
ペプチド断片上に免疫吸着させることにより抗体
を精製した（「Advances in Immunology」第13
巻（1971年）（AP））。PH4.5の酢酸ナトリウム緩
衝液1.0ml中の精製された抗体2.07mgをペプシン
（米国ニユージヤージー州Freeholdの
Worthington Biochemical Corporation社製の
名称３、４、23）50μｇを用い37℃で24時間にわ
たり解裂させた（「Handbook of Experimental
Immunology」Wein6−20〜６−22）。 次にPH11.2の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液を用
いて溶液のPHを8.0に調製することによりペプシ
ンを破壊した（約750μ）。２−チオピリドン
（ドイツ連邦共和国SteinheimのEga−Chemie社
製品）24mgおよび２，2′−ピリジルジスルフイツ
ド（スイス国BuchsのFluka AG社製品）2.4mgを
溶液に加え、次にこれを23℃で18時間「端から端
まで」回転させた。遠心分離に続き、反応混合物
を0.3M食塩水中のSephacryl Ｓ−300約200mlを
充填したカラムで分離した。IgGのFab′断片の分
子量に相当する56000ｇ／モルに当る分子量を有
する主要蛋白質ピークを集め（「Handbook of
Experimental Immunology」Wein6−20〜６−
22）そしてPM−10フイルター上25mlの濃縮用セ
ル（米国マサチユーセツツ州Lexingtonの
Amicon Corp社製12型）中N2気体環境の下に濃
縮した。A280＝1.09（cmセル）を有する濃縮物0.5
mlが得られた。２−チオピリドンに解裂されうる
基の含量はジチオトレイトール（米国ミズーリ州
セントルイスのSigma Chemical Company社製
品）を用いる還元に続き343nｍでの吸光度検定
により17・10-6Mと測定された。置換度（断片各
当量につき解裂されて２−チオピリドンを形成し
うる基の当量）は1.3であつた（「Biochem.J.」第
173巻第723〜737頁（1978年）参照）。280nｍで
の断片の吸光度をとればIgGのそれＡ１％ 280＝13.8
（１cmセル）と同じであつた。 例 ３ 不溶性の脂肪族ジスルフイツドの解裂 アガロースゲル〔スウエーデン国ウプサラの
Pharmacia Fine Chemicals社製セフアロース
（sepharose）（登録商標）6B〕をブルツクレウル
スト（Brocklehurst）氏他により「Biochem J.」
第133巻第573〜584頁（1973年）に記載されてい
るようにしてチオ硫酸ナトリウムと共に１−クロ
ロ−２，３−エポキシプロパン（ゲル３ｇ当り試
薬0.45ml）で処理しそしてジチオトレイトールで
還元した。得られるチオールアガロースゲル（ア
ガロース１ｇ当りチオール基約750μ当量）を次
に水中で過酸化水素を用いて酸化してジスルフイ
ツド−アガロースゲルを形成させた。アガロース
濃度は２％（ｗ／ｖ）、過酸化水素濃度0.1Mそし
て反応時間は60分であつた。この酸化に続き、ア
ガロースゲルを水および50％エタノールを添加し
たPH9.0の0.05M燐酸ナトリウム緩衝液で洗つた。
次にジスルフイツドゲルを50％エタノール中PH
9.0で23℃で撹拌下に２−チオピリドン（1.0M）
および２，2′−ジピリジルジスルフイツド
（0.5M）と120分間反応せしめた。次にこのゲル
を５％エタノールおよび水で洗つた。生成物を還
元的解裂させたのち343nｍで２−チオピリドン
を測光検定することにより分析した（「Acta
Chemica Scandinavica」B29巻第471〜474頁
（1975年））。このものはアガロース１ｇ当り635μ
当量の２−チオピリジル構造を含有していた。 例 ４ キモトリプシノゲン中のジスルフイツド結合の
解裂 キモトリプシノゲンＡ（米国マサチユーセツツ
州BedfordのMillipore Corp社製品）20mgをPH
9.0の1.0M硼酸ナトリウム緩衝液0.5ml中に溶解さ
せ、次に1.86ｍM2，2′−ジピリジルジスルフイ
ツド−16.3ｍM2−チオピリドン4.5mlを加えた。
この溶液を22、30および37℃で80時間保温培養し
た。反応混合物を遠心分離したのちPH7.0の0.1M
燐酸ナトリウム緩衝液中エピクロロヒドリンで交
叉結合されたデキストラン（スウエーデン国ウプ
サラのPharmacia Fine Chemicals AB社製
Sephadex Ｇ−25M）を充填したカラム上脱塩
した、反応の結果はA280の検定およびジチオトレ
イトールにより解裂された２−チオピリドンの
343nｍでの吸光度測定により確立された
（「Biochem.J.」第173巻第723〜737頁（1978
年））。 下記の結果が得られた。 第２表 チオピリジル構造の当量 反応温度／キモトリプシノゲン当量 ℃ 0.15 22 0.42 30 2.0 37 例 ５ IgGの断片中のジスルフイツド結合の解裂 家兎のIgG（デンマーク国BirkerodのMiles
scandinavia社製品）をPH4.5の0.1M酢酸ナトリ
ウム緩衝液中ペプシン（１：100w／ｗ）を用い
て37℃で24時間破砕した。反応混合物からＮ，
N′−メチレンビスアクリルアミドで交叉結合さ
れたアリルデキストラン〔Sephacryl Ｓ−300、
スウエーデン国ウプサラ（Uppsala）の
Pharmacia Fine Chemicals AB社から入手〕を
充填したガラム上Ｆ（ab′）2断片を分離した
（「Handbook of Experimental Immunology」
Wein6−20〜６−22）。断片の濃度はA280測定に
より判定された。Ａ１％ 280＝1.38（１cmセル）。2.4
％エタノールおよび2.0ｍＭの２，2′−ジピリジ
ルジスルフイツド（スイス国BuchsのFluka AG
社製品）および種々の濃度の２−チオピリドンを
有するPH8.0の0.1M燐酸ナトリウム溶液中のＦ
（ab′）2−断片23.3μMの溶液を23℃で種々の時間
保温培養した。エピクロロヒドリンで交叉結合さ
れたデキストラン〔スウエーデン国ウプサラの
Pharmacia Fine Chemicals社製のSephadex
Ｇ−25F〕の床で脱塩することにより反応を中断
させ、蛋白質フラクシヨンを集めそしてその蛋白
質含量に関し（A280）および還元的に解裂されう
る２−チオピリドンの含量（A343）に関し分析し
た（「Biochem.J.」第173巻第723〜737頁（1978
年））。置換度（＝断片当量当りの２−チオピリジ
ルジスルフイツド構造の当量数）を計算した。 下記の結果が得られた。
【表】
例 ６
酸化されたグルタチオン中のジスルフイツド結
合の解裂 ２−チオピリドン2.27ミリモル、２，2′−ジピ
リジルジスルフイツド2.27ミリモルおよび酸化型
グルタチオン（スイス国LucerneのCalbiochem
AG社製品）0.23ミリモルを33％エタノール45ml
中に溶解させ、次に2.0M水酸化ナトリウムを添
加してPH8.1となした。40℃で４時間反応させた
のち濃酢酸200μを加え、次に溶液を回転蒸発
器で蒸発させて部分的に結晶化した溶液４〜５ml
を得た。上澄み液を3000×ｇで10分間遠心分離し
た。残留する結晶を蒸留水４mlで浸出し、次にこ
の溶液を前記した方法で遠心分離した。合した遠
心分離した溶液（7.3ml）をベンゼン３mlずつで
２回抽出し、次に水相を回転蒸発器中で蒸発乾固
させた。結晶をエタノール２ml、水１mlおよび濃
酢酸100μの混合物中に溶解させた。溶液600μ
を薄層プレート（ドイツ連邦共和国ダルムシユ
タツトのMerck AG社製Merck DC−Alufolien
シリカゲル40）上に置き、これをベンゼン／酢
酸／エタノール／水（10％：10％：60％：20％）
を用いて展開した。薄層プレート上のRf0.38を有
するプレートをかきとり、次にこの粉末を水４ml
で抽出した。この溶液を3000×ｇで10分間遠心分
離しそして蒸発させた。この蒸発工程後に残る結
晶をエタノール1000μ、水500μおよび酢酸
50μの混合物中に溶解させた。不溶の物質をデ
カンテーシヨンして除き、次にこの溶液を回転蒸
発器で蒸発乾固させた。 生成物を還元的に２−チオピリドンに解裂され
うる基の含量に関して（「Biochem.J.」第173巻
第723〜737頁（1978年））およびムーア−シユタ
インス（Moore−Steins）法によりアミノ酸に関
して分析した。 この生成物はシステイン１モル当り還元的に解
裂されうる２−チオピリドン１モルを含有するこ
とが判明した。同じことは生成物の残りのアミノ
酸すなわちグルタミン酸およびグリシンにもあて
はまつた。 生成物を薄層プレート（ドイツ連邦共和国ダル
ムシユタツトのMerck AG社製Merck DC−
Alufolienシリカゲル−60）上、参照としての２
−チオピリドン、２，2′−ジピリジルジスルフイ
ツドおよび酸化されたグルタチオンを用いて分析
した。 移動相としてはベンゼン／酢酸／エタノール／
水（10／10／60／20％）が用いられた。クロマト
グラフイーに続き、薄層を沃素およびニンヒドリ
ンを用いてそれぞれ発色させた。
合の解裂 ２−チオピリドン2.27ミリモル、２，2′−ジピ
リジルジスルフイツド2.27ミリモルおよび酸化型
グルタチオン（スイス国LucerneのCalbiochem
AG社製品）0.23ミリモルを33％エタノール45ml
中に溶解させ、次に2.0M水酸化ナトリウムを添
加してPH8.1となした。40℃で４時間反応させた
のち濃酢酸200μを加え、次に溶液を回転蒸発
器で蒸発させて部分的に結晶化した溶液４〜５ml
を得た。上澄み液を3000×ｇで10分間遠心分離し
た。残留する結晶を蒸留水４mlで浸出し、次にこ
の溶液を前記した方法で遠心分離した。合した遠
心分離した溶液（7.3ml）をベンゼン３mlずつで
２回抽出し、次に水相を回転蒸発器中で蒸発乾固
させた。結晶をエタノール２ml、水１mlおよび濃
酢酸100μの混合物中に溶解させた。溶液600μ
を薄層プレート（ドイツ連邦共和国ダルムシユ
タツトのMerck AG社製Merck DC−Alufolien
シリカゲル40）上に置き、これをベンゼン／酢
酸／エタノール／水（10％：10％：60％：20％）
を用いて展開した。薄層プレート上のRf0.38を有
するプレートをかきとり、次にこの粉末を水４ml
で抽出した。この溶液を3000×ｇで10分間遠心分
離しそして蒸発させた。この蒸発工程後に残る結
晶をエタノール1000μ、水500μおよび酢酸
50μの混合物中に溶解させた。不溶の物質をデ
カンテーシヨンして除き、次にこの溶液を回転蒸
発器で蒸発乾固させた。 生成物を還元的に２−チオピリドンに解裂され
うる基の含量に関して（「Biochem.J.」第173巻
第723〜737頁（1978年））およびムーア−シユタ
インス（Moore−Steins）法によりアミノ酸に関
して分析した。 この生成物はシステイン１モル当り還元的に解
裂されうる２−チオピリドン１モルを含有するこ
とが判明した。同じことは生成物の残りのアミノ
酸すなわちグルタミン酸およびグリシンにもあて
はまつた。 生成物を薄層プレート（ドイツ連邦共和国ダル
ムシユタツトのMerck AG社製Merck DC−
Alufolienシリカゲル−60）上、参照としての２
−チオピリドン、２，2′−ジピリジルジスルフイ
ツドおよび酸化されたグルタチオンを用いて分析
した。 移動相としてはベンゼン／酢酸／エタノール／
水（10／10／60／20％）が用いられた。クロマト
グラフイーに続き、薄層を沃素およびニンヒドリ
ンを用いてそれぞれ発色させた。
【表】
チオン
【表】
グルタチオン
すべての試料それぞれは薄層の展開に続き１個
の着色のみを生じた。 例 ７ 抗体の断片とβ−ガラクトシダーゼとの共役：
血清中のIgE−力価の検定における共役物の使
用 大腸菌（E.Coli）〔米国ミズーリ州セントルイ
スのシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma
Chemical Company）社製Sigma32.1.23〕から
のβ−ガラクトシダーゼをピリジルジスルフイツ
ド−アガロースゲル〔スウエーデン国、ウプサラ
のPharmacia Fine Chemicals AB社製の活性化
されたチオールSepharose 4B〕上共有クロマト
グラフイーにより精製した（「Biochem.J.」第
133巻第573〜584頁（1973年））。酵素はPH8.0でゲ
ルで吸着されそして２ｍＭ塩化マグネシウムを含
有するPH8.0の0.5Mメルカプトエタノールで脱着
される。脱着に続き、２ｍＭの塩化マグネシウム
を添加したPH8.0の0.2M燐酸ナトリウム緩衝液
中、エピクロロヒドリンで交叉結合されたデキス
トラン〔スウエーデン国、ウプサラの
Pharmacia Fine Chemicals AB社製Sephadex
Ｇ−25M〕を充填したカラムで脱塩した。酵素
１当量当りチオール基24当量のチオール置換度を
有する酵素2.36μMを含有する溶液が得られた。
この酵素溶液1.4mlを、チオール−ジスルフイツ
ド交換反応により共役させるために（「Biochem.
J.」第173巻第723〜737頁（1978年））、家兎の抗
ヒトIgE抗体（例２参照）のチオピリジルジスル
フイツドを含有する断片と混合した。＋４℃で96
時間反応させたのち反応混合物を、0.3Mの食塩
水および0.02％のナトリウムアジトを添加したPH
7.4の20ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中のＮ，N′−
メチレン−ビスアクリルアミドで交叉結合したア
リルデキストラン〔スウエーデン国、ウプサラの
Pharmacia Fine Chemicals AB社製Sephacryl
Ｓ−300〕109mlを充填したカラムでクロマトグ
ラフイーした。A280＝0.038を有する39.4〜55.2ml
なる範囲の溶出容量プールを集めた。このプール
を、0.3M食塩水、0.1％ヒト血清アルブミン〔米
国、ミズーリ州セントルイスのSigma Chemical
Company社製のsigma A2386〕、0.1％のトウイ
ーン20および0.02％のナトリウムアジドを添加し
たPH7.4の20ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中に40倍
に希釈した。次にこの希釈したプールをフアデジ
ム（Phadezym）（登録商標）IgE PRIST試験器
具一式〔スウエーデン国、ウプサラのフアルマシ
アダイアグノステイクス（Pharmacia
Diagnostics）AB社製品〕からの構成分を用いて
試験した。この試験はIgE試験について示される
教示に従い実施されるが、しかし前記試験器具一
式中に包含されるβ−ガラクトシダーゼ−抗IgE
抗体共役物を希釈されたプールで置換した。前記
共役物と同じ緩衝液中に希釈した41430u IgE／
mlを有するEJ血清を標準物として使用した。 Phadezym IgE PRIST試験は参照として操
作した。 0.5〜80kU／の領域のIgE濃度を有する臨床
的な血清試料を検定すると系列の間に高い相関が
みられた。このプールの場合、試験中に担体とし
て包含されるセルロースマトリツクス上への酵素
活性の非特異的吸着は参照において得られた吸着
の半分しかなかつた。 例 ８ ５，5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）
および５−チオ−２−ニトロ安息香酸を用いる
IgE中のジスルフイツドの解裂 ５，5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）
（以下DTNBと略記する）の76ｍＭ溶液（PH8.1の
0.1M燐酸ナトリウム中）をジチオトレイトール
（以下DDTと略記する）に関して14ｍＭとなして
DTNBおよび５−チオ−２−ニトロ安息香酸
（以下TNBと略記する）を含有する溶液をその場
で生成させる。この反応混合物はTNBに関して
28ｍＭでありそしてDTNBに関して62ｍＭであ
つた。TNBに関して0.65ｍＭでありそして
DTNBに関して12ｍＭである溶液を同じ方法で
調製した。次にPH8.0の0.1M燐酸ナトリウム緩衝
液中の家兎IgG〔デンマーク国、BirkerodのMiles
Scandinavia社製品〕の1.75・10-4M溶液0.2mlを
試薬混合物の0.8mlずつに添加した。反応混合物
をPH8.0の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液中のエピク
ロロヒドリンで交叉結合されたデキストラン（ス
ウエーデン国ウプサラのPharmacia Fine
Chemicals AB社製Sephadex Ｇ−25）を充填
したカラム上で種々の時間後に脱塩した。蛋白フ
ラクシヨンを集め、次いでこれらフラクシヨンの
蛋白質含量およびその中の還元的にTNBに解裂
されうる基の数を測定した。測定された濃度間の
比率を置換度（IgG1当量当りTNBに解裂されう
る基の当量数）として示す。
すべての試料それぞれは薄層の展開に続き１個
の着色のみを生じた。 例 ７ 抗体の断片とβ−ガラクトシダーゼとの共役：
血清中のIgE−力価の検定における共役物の使
用 大腸菌（E.Coli）〔米国ミズーリ州セントルイ
スのシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma
Chemical Company）社製Sigma32.1.23〕から
のβ−ガラクトシダーゼをピリジルジスルフイツ
ド−アガロースゲル〔スウエーデン国、ウプサラ
のPharmacia Fine Chemicals AB社製の活性化
されたチオールSepharose 4B〕上共有クロマト
グラフイーにより精製した（「Biochem.J.」第
133巻第573〜584頁（1973年））。酵素はPH8.0でゲ
ルで吸着されそして２ｍＭ塩化マグネシウムを含
有するPH8.0の0.5Mメルカプトエタノールで脱着
される。脱着に続き、２ｍＭの塩化マグネシウム
を添加したPH8.0の0.2M燐酸ナトリウム緩衝液
中、エピクロロヒドリンで交叉結合されたデキス
トラン〔スウエーデン国、ウプサラの
Pharmacia Fine Chemicals AB社製Sephadex
Ｇ−25M〕を充填したカラムで脱塩した。酵素
１当量当りチオール基24当量のチオール置換度を
有する酵素2.36μMを含有する溶液が得られた。
この酵素溶液1.4mlを、チオール−ジスルフイツ
ド交換反応により共役させるために（「Biochem.
J.」第173巻第723〜737頁（1978年））、家兎の抗
ヒトIgE抗体（例２参照）のチオピリジルジスル
フイツドを含有する断片と混合した。＋４℃で96
時間反応させたのち反応混合物を、0.3Mの食塩
水および0.02％のナトリウムアジトを添加したPH
7.4の20ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中のＮ，N′−
メチレン−ビスアクリルアミドで交叉結合したア
リルデキストラン〔スウエーデン国、ウプサラの
Pharmacia Fine Chemicals AB社製Sephacryl
Ｓ−300〕109mlを充填したカラムでクロマトグ
ラフイーした。A280＝0.038を有する39.4〜55.2ml
なる範囲の溶出容量プールを集めた。このプール
を、0.3M食塩水、0.1％ヒト血清アルブミン〔米
国、ミズーリ州セントルイスのSigma Chemical
Company社製のsigma A2386〕、0.1％のトウイ
ーン20および0.02％のナトリウムアジドを添加し
たPH7.4の20ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中に40倍
に希釈した。次にこの希釈したプールをフアデジ
ム（Phadezym）（登録商標）IgE PRIST試験器
具一式〔スウエーデン国、ウプサラのフアルマシ
アダイアグノステイクス（Pharmacia
Diagnostics）AB社製品〕からの構成分を用いて
試験した。この試験はIgE試験について示される
教示に従い実施されるが、しかし前記試験器具一
式中に包含されるβ−ガラクトシダーゼ−抗IgE
抗体共役物を希釈されたプールで置換した。前記
共役物と同じ緩衝液中に希釈した41430u IgE／
mlを有するEJ血清を標準物として使用した。 Phadezym IgE PRIST試験は参照として操
作した。 0.5〜80kU／の領域のIgE濃度を有する臨床
的な血清試料を検定すると系列の間に高い相関が
みられた。このプールの場合、試験中に担体とし
て包含されるセルロースマトリツクス上への酵素
活性の非特異的吸着は参照において得られた吸着
の半分しかなかつた。 例 ８ ５，5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）
および５−チオ−２−ニトロ安息香酸を用いる
IgE中のジスルフイツドの解裂 ５，5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）
（以下DTNBと略記する）の76ｍＭ溶液（PH8.1の
0.1M燐酸ナトリウム中）をジチオトレイトール
（以下DDTと略記する）に関して14ｍＭとなして
DTNBおよび５−チオ−２−ニトロ安息香酸
（以下TNBと略記する）を含有する溶液をその場
で生成させる。この反応混合物はTNBに関して
28ｍＭでありそしてDTNBに関して62ｍＭであ
つた。TNBに関して0.65ｍＭでありそして
DTNBに関して12ｍＭである溶液を同じ方法で
調製した。次にPH8.0の0.1M燐酸ナトリウム緩衝
液中の家兎IgG〔デンマーク国、BirkerodのMiles
Scandinavia社製品〕の1.75・10-4M溶液0.2mlを
試薬混合物の0.8mlずつに添加した。反応混合物
をPH8.0の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液中のエピク
ロロヒドリンで交叉結合されたデキストラン（ス
ウエーデン国ウプサラのPharmacia Fine
Chemicals AB社製Sephadex Ｇ−25）を充填
したカラム上で種々の時間後に脱塩した。蛋白フ
ラクシヨンを集め、次いでこれらフラクシヨンの
蛋白質含量およびその中の還元的にTNBに解裂
されうる基の数を測定した。測定された濃度間の
比率を置換度（IgG1当量当りTNBに解裂されう
る基の当量数）として示す。
【表】
例 ９
６，6′−ジチオニコチン酸（Ｃ−PDS）および
６−チオニコチン酸（Ｃ−TP）を用いる羊か
らのIgG中のジスルフイツドの解裂 下記第６表に従い種々のPH−値を有する0.1M
燐酸ナトリウム中のＣ−PDS（ドイツ連邦共和
国、シユタインハイムのEga−Chemie社製品）
の37ｍＭ溶液中に、Ｃ−PDS溶液の５ｍＭフラ
クシヨンを相当するチオン、Ｃ−TPの10ｍＭに
還元するために最終濃度５ｍＭとなるまでジチオ
トレイトールを加えた。ジチオトレイトールは溶
液中のジスルフイツドを相当する還元型に定量的
に還元する（「Biochem.」第３巻第480頁（1964
年））。蒸留水中の羊のIgG（デンマーク国、
BirkerodのMiles Scandinavia社製品）の1.44×
10-4M溶液0.1mlをこれらの試薬溶液0.4mlずつに
添加した。この溶液を23℃で18時間培養し、しか
るのちPH8.1の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液中エピ
クロロヒドリンで交叉結合されたデキストラン
（スウエーデン国、ウプサラのPharmacia Fine
Chemicals AB社製のSephadex Ｇ−25Fine）
を充填したカラム上で脱塩し、蛋白質フラクシヨ
ンを集めた。フラクシヨンの蛋白質含量およびそ
の中の還元的にＣ−TPに解裂されうる基の量を
次に分光測光的に測定し、そして次に置換度の値
を計算した。下記モル吸光率を用いた。 Ｃ−TPについてE342＝9400 IgGについてE280＝221000 導入されたＣ−TP各当量につきIgGのE280に
E280＝6000を添加した。 第６表 基の当量／IgG当量培養PH 置換度（Ｃ−TPに解裂されうる 6.9 1.15 7.6 2.56 7.9 2.90 8.5 3.46 9.0 3.82 9.8 4.12
６−チオニコチン酸（Ｃ−TP）を用いる羊か
らのIgG中のジスルフイツドの解裂 下記第６表に従い種々のPH−値を有する0.1M
燐酸ナトリウム中のＣ−PDS（ドイツ連邦共和
国、シユタインハイムのEga−Chemie社製品）
の37ｍＭ溶液中に、Ｃ−PDS溶液の５ｍＭフラ
クシヨンを相当するチオン、Ｃ−TPの10ｍＭに
還元するために最終濃度５ｍＭとなるまでジチオ
トレイトールを加えた。ジチオトレイトールは溶
液中のジスルフイツドを相当する還元型に定量的
に還元する（「Biochem.」第３巻第480頁（1964
年））。蒸留水中の羊のIgG（デンマーク国、
BirkerodのMiles Scandinavia社製品）の1.44×
10-4M溶液0.1mlをこれらの試薬溶液0.4mlずつに
添加した。この溶液を23℃で18時間培養し、しか
るのちPH8.1の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液中エピ
クロロヒドリンで交叉結合されたデキストラン
（スウエーデン国、ウプサラのPharmacia Fine
Chemicals AB社製のSephadex Ｇ−25Fine）
を充填したカラム上で脱塩し、蛋白質フラクシヨ
ンを集めた。フラクシヨンの蛋白質含量およびそ
の中の還元的にＣ−TPに解裂されうる基の量を
次に分光測光的に測定し、そして次に置換度の値
を計算した。下記モル吸光率を用いた。 Ｃ−TPについてE342＝9400 IgGについてE280＝221000 導入されたＣ−TP各当量につきIgGのE280に
E280＝6000を添加した。 第６表 基の当量／IgG当量培養PH 置換度（Ｃ−TPに解裂されうる 6.9 1.15 7.6 2.56 7.9 2.90 8.5 3.46 9.0 3.82 9.8 4.12
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