JPS60501310A

JPS60501310A - ジスルフイツド結合の解裂法

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Publication number: JPS60501310A
Application number: JP59502191A
Authority: JP
Inventors: アクセン，ロルフ・エリーク・アクセル・ヴエルネル; カールソン，ヤン・ペル・エリーク; ドレヴイン，ホーカン・ニルス・イングヴエ
Original assignee: フア−マシア・アクチエボラ−グ
Priority date: 1983-05-17
Filing date: 1984-05-16
Publication date: 1985-08-15
Also published as: DE3466874D1; SE8302758L; WO1984004525A1; SE8302758D0; EP0128885B1; EP0128885A1; ATE30314T1; US4647655A; JPH0561279B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ジスルフイツド結合の解裂法およびそれにより得られる化合物本発明）ま少くとも１個のジスルフイツド結合−５−Ｓ−（ここで硫黄原子のそれぞれはかかるジスルフイツド結合の少くとも１個を含有する有機物質中のそれぞれの脂肪族炭素原子に直接共有結合している）を解裂させる方法に関するものであり、解裂されたそれぞれの結合−５−Ｓ−は式−８−８−ＲｊおよびＲ２− ８−８−（ここでＲ１およびＲ２は同じかまたは相異なっておりそしてそれぞれ有機残基である）を有する２個の反応性の基に実質上変換される。本発明はまた脂肪族炭素原子に共有結合した基−８−８−Ｒ１および／またはＲ２−９−８− （ここで基Ｒ１およびＲ２は前記の意味を有する）の少くとも１個を示す有機化合物にも関する。

脂肪族チオール基（すなわちチオール基が脂肪族炭素原子に結合している）およびそれから誘導されるジスルフイツド基は生化学的情況において重要な役割を有する。

チオール基は生理学的条件下に例えば活性チオエステルのよう、な多数の他の官能性構造と反応する。チオール基は酵素の活性部位においてしばしば見出され、その場合これらは酵素の触媒作用において重要な役割を演じている。ジスルフイツド基はしばしばポリＲプチド（この用語は蛋白質をも包含するものと見なされる）中に存在しそして螺固定要素および配座を与える要素として作用（２）すると思われる。動的な生化学的反応の情況における試薬としての天然のジスルフイツドにより演じられる役割は比較的知られていないがしかし例えば蛋白質に関しての前記した配座性質により重大な意味を有すると見做されねばならない（例えばｒＦｇＢｓ　ＬｅｔｔｅｒｓＪ第９７巻第２０１〜１０頁（１９７９年）参照）。

チオール基とジスルフイツド基の両方を同時に包含する反応の型はチオールージスルフイツド交換により示されそして下記のように記される゛Ｘｌ−８Ｈ４−Ｘ２−８−３−Ｘ３：　ｘ２−ｓ−ｓ−ｘ１＋Ｘ３−８Ｈ（式中Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は−５−ｓ−中の硫黄原子の一方に結合した脂肪族または芳香族炭素原子を含有する有機残基である）。

チオールージスルフイツド交換反応は生理学的条件下に迅速に起るが、平衡の条件は所定のジスルフイソドの調製的生産には通常好ましくない。例えば、ポリジスルフイツドをチオール成分と混合すると、種々のジスルフイツドを含有する単位の複合混合物を生ずる一連のチオールージスルフイツド交換反応が速かに起る。もしポリジスルフイツドが生物学的に活性な分子である場合は、その活性度が影響される。

例えばアルキルピリジルジスルフイツド型のいわゆる反応性ジスルフイツドの導入はジスルフイツドの調製を太いに促進させる。反応性ジスルフイツドは通常求電子度の増大したジスルフイツドおよび去りゆくチオールが安定化された互変異性チオン形態またはその安定化された陰イオンに変換されるような性質を有するジスルフイツドを意味する。この安定化により、去ったチオールが反対のまたは逆の反応に関与する可能性が否定される、伝えばアルキルピリジルジスルフイツドの場合、脂肪族チオール構造は解裂されないが、しかしチオン構造は解裂される。この方法で、所望の脂肪族ジスルフイツドの調製に好ましい平衡が得られる。

チオールージスルフイツド交換反応に基づいておりそして生物学的に活性な分子の型を包含する過程は今や生体分子と担体ポリマーとのまたは生体分子と生体分子との共役において益々使用されており、それにより前者の場合では生体分子の溶解度、分離性、安定性、輸送性のようなそれらの外部性質が変化されて所定の要件を満たし、一方後者の場合は多数の生体活性が組み合わさりそして例えば免疫学的性質を酵素的性質とまたは薬理学的性質を回帰性質と協力せしめることになる。かかる調製はクロマトグラフィー、薬剤、診断上の分析法およびプロセス科学技術と関連した使用が見出されるか、またはそれらに関連する将来の使用が見出されろと判断されうる。

チオール基を含有しない成分の間の反応性ジスルフイツドによるジスルフイツド共役物の調製における方法論にはそれら成分と特定のチオール化剤例えばホモシスティンチオラクトンおよびチオールイミデートとの反応、または二官能性試薬例よばニア官能性試薬Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−ゾロビオネートとの反応がしばしば包含される。従ってこの最後に述べた化合物により反応性ジスルシイッドが直接例えば、蛋白質分子中に導入されることが許容されるが、しかし還元の容易さゆえにチオール基も導入されうる。

もし成分が脂肪族ジスルフイツド結合（すなわち２個の脂肪族炭素原子間のジスルフイソド結合）を含有しそ１−て蛋白質に関して全く普通である他の成分とジスルフイソドとして共役することが意図される場合、初めに脂肪族ジスルフイッド結合を還元しそして得られるチオール基を次に他の成分の反応性ジスルフイツドと反応させることが原則として可能である（倒起ばｒ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ　Ｊ第２巻第１５１〜１５５頁（１９８（１年）またはｒ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ　Ｊ第１４巻第９５〜９９頁（１９８１年）参照）。

しかしながらこの知られた方法は多（の欠点を負っている。還元工程・ま通常低分子量の脂肪族チオール化合物を用いて遂行される。ポリジスルフイツドの部分的還元を行うには中程度の濃度の低分子チオール化合物が使用される。しかしながらチオールージスルフイツド交換反応は前記（−だポリジスルフイツド分子内でも開始される。

ポリジスルフイソドの全還元は高濃度の低分子脂肪族チオールを用いて達成されうる（しばしば、変性剤と共に）。

しかしながらかかる反応混合物を後処理する場合、濃度条件は容易に変化して、部分的逆反応が起る。さらに。

反応し易いチオール構造が空気で酸化されるのを回避するのが困難になりがちである。チオール段階での分離を回避しそして例えばジピリジルジスルフィッドとの〒衡混合物を抑制する可能性は事実実際的でない、何故ならジピリジルジスルフィッドは還元剤により消費され、そして初めに形成された非対称の反応性ジスルフィソドが還元されたポリジスルフィッド成分の再形成を分子間的にそしてまた還元剤と一緒に開始させるからである。

亜硫酸ナトリウムを用いるスルフィトリシスは多連鎖はゾチドをポリベゾチドフラクションに全解裂させる蛋白化学の分野において適用されるジスルフィッドの古い、知られた解裂法である（前記引用文献参照）。しかしながらこの方法論は制御困難であり、そして触媒量の例えばシステインおよび酸素の使用を必要とする。得られる利へはこの方法によりＳ−スルホネート構造の保護基を有するチオール官能基が得られることである。

これら早期つ知られた方法で遭遇する欠点の大部分が本発明により除かれる。本発明によるジスルフィッド結合の解裂は解裂が解裂される予定の少くとも１個の、好ましくは脂肪族ジスルフイノド結合を含有する有機物質を、化合物Ｒ５−８ −８−Ｒ４と互変異性形態Ｒ５−８−Ｈおよび）ＩＲ’５＝Ｓまたは相当する共鳴安定された陰イオン形態で存在しうる化合物との混合物と反応させることにより遂行されることを特徴とする。ここで上記化合物中残基Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は（６）１）それらすべてが相異なるか、２個が同一であるかまたはすべてが同一である有機残基であり、そしてｉｉ　Ｘａ）　化合物Ｒ３−８−Ｓ−Ｒ４およびＲ５− ８−Ｈにおいて、それらの硫黄原子それぞれは芳香環中のそれぞれの炭素原子に結合しており、そして（ｂ）　化合物Ｒ５−８−８−Ｒ４の反応により放出される化合物Ｒ３−８−ＨまたはＲ４−８−Ｈおよび化合物Ｒ５−８−Ｈが一般に湘れる解裂条件下において実質上それらのそれぞれの互変異性形態ＨＲ’５＝Ｓ　、　Ｈ，Ｒ’４＝ＳおよびＨＲｊ＝Ｓ　、または相当する共鳴安定された陰イオン形態で存在すること、およびＲ１とＲ２はそれぞれＲ３，Ｒ４およびＲ５からなる群の残基であることと定義される。

本発明による解裂は一つの段階において少くとも１個のそのジスルフイノド結合を２個の新規ジスルフイソド結合に変換することによりジスルフイツド含有化合物を酸化するのであるからこの解裂は酸化とみなされうる。

以前、解裂工程は１個のジスルフイノド結合の２個のチオール基への還元を包含するのでその解裂方法は還元的であった。

前記Ｒ３−８−Ｈ、Ｒ４−８−ＨおよびＲ５−８−Ｈはそれらのチオール形押におｈる化合物を表わし、そしてＨＲ’３＝Ｓ、　ＨＲ’４＝ＳおよびＨＲ’５＝Ｓはそれらのチオン形態における前記化合物を表わす。チオール形態と相当するチオン形態、・まエノール−ケト互変異性と完全に同じであるチオール−チオン互変異性の例である。互変異性の二つの型はよく知られ（７）ておりそして５ｐ２−混成炭素原子に結合したチオール基（ヒドロキシル基）が分子内的にチオン基（ケト基）に変換されうることを意味する。この変換は水素が分子内で場所を変え、一方二重結合は同時に位置を変えた。すなわちＲ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれＲ′６、Ｒ′４およびＲ’５とは二重結合の位置選定の点でのみ異なることを意味する。

この表示はすべての有機化学者によく知られている。チオンおよびケトン形態いずれも塩基性物質によりそれらのそれぞれの共鳴安定された、脱プロトン化された陰イオン形態に変換されうる。前記チオン形態の場合、これら陰イオンはＯＲ ’３＝Ｓ　、　ＯＲ’４＝８およびＯＲ’５＝Ｓと表示される。

一般に行われる解裂条件下では不安定なチオールＲ５−８−Ｈ１Ｒ４−８−ＨおよびＲ５−８−Ｈはそれらの安定化されたチオン形態または相当する陰イオン形態で存在するので、以下これらはチオンとして言及されよう。

本発明により遂行される解裂により、−回の工程で、脂肪族ジスルフイツド結合を得られる反応性のジスルフイツド構造−８−８−Ｒｊおよび−８−８−Ｒ２の一方を含有する少くとも１個の化合物が単離できる程度に解裂工程期間中不活性である２個の反応性ジスルフイツド構造に変換できる。

かかる結合１個を含有する有機物質中における本発明による脂肪族ジスルフイツド結合の解裂、・ま概略的疋下記の方法で示されうる。

（８）（式中Ａ１およびＡ２はそれぞれ有機物質の残留部分を意味しそして式中破線はＡ１およびＡ２が解裂される予定の−５−Ｓ−結合以外の結合と場合により結合しうろことを意味する）。従ってｔ’　ＡｊおよびＡ２が解裂される゛予定の− ５−Ｓ−結合以外の結合とも相互に結合している場合は、１つの新しい分子が得、られる。本発明）ままだ脂肪族炭素原子に共有結合した基−８−８−Ｒｊおよび／またはＲ２−８−８−の少くとも１個な示すところの、かがる解裂がら生ずる有機化合物を包含するものである。

本発明による前記結合の解裂は極端なｐＨ条件を適用する必要なく遂行されうる。このことにより加水分解的副反応が回避されうる。倒起ば、この方法で、解裂すべきジスルフイツド結合の加水分解または他の例えばアミド、はプチド、ケタール、アセタールまたはエステル結合のような加水分解感受性結合の加水分解を回避することが可能である。結果として、本発明１・１脂肪族ジスルフィッド結合を選択的および特異的な様式で２個の反応性ジスルフイソド構造に変換する結合解裂法を提供するものである。

この解裂反応はｐＨ依存性であり、そして水性媒体中ｐＨ５〜１２で遂行されうる。感受性物質を取扱う場合副反応が起るのを避けるために、Ｉ）Ｈ値は７〜１１の範囲内にあるべきである。

本発明により得られる最も重要な利点はポＩＪ　Ｏゾチドの異なる型のジスルフイツド結合が段階的に解裂されう（９）　符表昭ＧＯ−５０１３１０（４）るという驚くべき知見に基づくものである、すなわち過剰つ反応性ジスルフイツドＲ３−８−８−Ｒ４およびＨＲ５＝ｓの量が増大すると、それぞれの結合型がそれ自体の個々の過剰においてのみ解裂されるのである。当然、これは残りの条件が一定に保たれている場合にのみあてはまる。前記知見により単一の生成物、すなわち型および数が等しいジスルフイツド結合が各分子内で解裂された生成物が得られうるのでこれは調製上重要な利点を提供するものである。

従って本発明による解裂によりポリジスルフイノドのすべてのジスルフイツド結合のうち少くとも１個のジスルフイツド結合を解裂する方法も提供される。解裂されたジスルフイツド結合が例えばほとんど例外なく少くとも１個のシスチン構造を含有する蛋白質またはポ＋）　：、０チドのような生物学的に活性な巨大分子中に含ずれる場合に特に重要な利点が得られる。これらのような化合物の場合、生物学的活性は以前の知られたジスルフイソド結合解裂法により与えられるより大きい程度に保有されうる。かかる普通ならざる高い生物学的活性を達成し５、るという事実は恐らく本発明による方法の間何ら分子間および分子内チオールージスルフィット交換反応が起らないゆえであろう。多分、これは解裂工程牛脂肪族チオール基が何ら存在しないことによるのであろう。かかる基がとにかく存在するとしても、それは非常に少量にのみしか存在しない。特に重要な利点はヂリジスルフイツ（１０）しうる遊離のチオール基？何ら含有しない場合に得られる。低分子量チオール化合物は分子内チオールージスルフイツド交換反応を容易に開始させる。結果として、かかる化合物は解裂過程中は存在すべきでない。

多数つチオール化合物が水溶液中で自然発生的にそれらのチオン形態に互変異性化する、すなわちかかる化合物のチオン形態はそれらの対応するチオール形態より安定である。これに関する１つの要件はチオール基の硫黄原子が芳香環中０６ｐ２−混成炭素原子に結合しているべきであるということである。芳香環かへテロ原子好ましる場合）、および／または例えばニトロ、シアンおよびカルボキシからなる群から選択される電子求引性置換基少くとも１個を有する場合チオン形態はまださらに安定化される。硫黄原子は奇数の原子に等しい複素環式芳香環中のへテロ原子から離れて局在するのが好ましい。解裂反応に関しては、チオールＲ５５Ｈ、Ｒ４５ＨおよびＲ５ＢＨの構造がそれぞれのチオン形態または相当する共鳴安定化された陰イオン形態への変換および安定化が起るのを許容するようでｂることが桓度に重要である。これに関しては、安定化は非常に高いレベルを有するのでチオンおよび陰イオン形態は一般的に行われる解裂条件下ではチオールージスルフイツド交換反応について熱力学的に否定されよう。その結果、チオール形態の相当するチオン（１１）または陰イオン形態への安定化を得るには電子求引性物質が常に前記非複素環系中に必要とされる。

それらのチオール化合物が一般に行われる解裂条件下に互変異性または共鳴により自然発生的に相当するチオン形態に安定化されるＪ、Ｒ４およびＲ５の例には５−ニトロ−２−１リジル、５−カルボキシ−２−ピリジル、２−ピリジル、４ −ピリジル、２−ベンゾチアゾリル、４−ニトロ−３−カルボキシ−フェニルおよび前記ピリである反応性のジスルフイツド化合物Ｒ３−８−８−Ｒ４において、Ｒ５およびＲ４はいずれも５−ニトロ−２−ピリジル、５−カルボキン−２− ピリジル、２−ピリジル、４−ピリジル、２−ベンゾチアゾリル、４−ニトロ− ろ−カルボキシ−フェニルおよび前記ピリジル基のＮ−オキサイドから選択されるのが適当である。これらの基に相当する反応性ジスルフイツドＲ４−８−８− Ｒ５およびチオンＨＲ’５＝Ｓのいずれも容易に入手でき、従ってこれらが本発明の解裂法に使用するのに最も好ましい。

理解されるように、これらの基のいずれかにおける水素原子が芳香環の隣に結合した脂肪族炭素原子を有する置換基で置換される場合、相当するチオールは次に自然発生的にそのチオン形態に安定化されよう。

本発明はまた脂肪族ジスルフイツド結合を示す低分子化合物中のかかる結合の解裂法をも提供するものである。

かかる化７合物の例にはシスチンおよびそれらのカルボギシルおよびアミン誘導体が包含される。もう一つの例はチオクト酸およびそのカルボキシル誘導体におけるーＳ−Ｓ〜結合の解裂である。ホ＋）ジスルフィッドの配座に影響する物質を反応混合物に添加して、それにより解裂が起る度合いに影響を与えることができる。例えば、ポリジスルフィソドが蛋白質である場合、尿素および／または洗浄剤の添加により高度の解裂が達成されうる。これら２種の物質は配座を変更するために水素結合を破壊することにより解裂工程に影響する。

解裂されるジスルフィッド結合は脂肪族である。これは発明の詳細な説明および特許請求の範囲のいずれにおいても、結合の硫黄原子それぞれが炭素および／または水素以外の他の原子が何ら結合していないそのそれぞれの脂肪族炭素原子に結合していることを意味する。従って、硫黄原子が結合されうるこれら炭素原子は第一、第二、第三炭素原子そしてまたメチル基中の炭素原子である。

反応性ジスルフイツドＲ３−８−８−Ｒ４およびチオンを選択する場合、選択されるジスルフィッドおよびチオンがＲ３−Ｒ４＝Ｒ５である場合に特別の利点が得られる。かがる選択により電度に均一な生成物混合物（Ｒ＋＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ＋＝Ｒｓ）が得られそして容易に入手しうる試薬を利用する。

チオンおよび反応性ジスルフィソドＲ５−８−８−Ｒ４の実際的過剰度の大きさは第一にそれらの溶解度により判定される。電気的に荷電した基、例えば負に荷電したカルボキシレート基を含有するジスルフィッドおよびチオンは電気的に荷電してないものより水性媒体中で溶解度が高い。その結果多数のジスルフィッド結合が解裂されるべき場合は溶解度の高い反応性のジスルフィッドＲ３−８−８ −Ｒ４およびチオンを選択することがより好都合である。

ジスルフイッド結合の解裂が非極性溶媒中で遂行される場合、非極性ジスルフィッドＲ３−８−８−Ｒ４およびチオンはかかる溶媒中における溶解度が最大なのでこれらが選択されるのが好ましい。

解裂が達成される程度は反応混合物中におけるチオンおよび反応性ジスルフィッドＲ３−８−８−Ｒ４のモル濃１１により、および脂肪族ジスルフィッド結合の濃度に関するそれらのそれぞれの濃度により制御される。解裂が遂行される程度は大過剰のチオンおよび反応性ジスルフィッドｎ５−８−’５−Ｒ４により増大されうる。

その結果、本発明によれば、脂肪族ジスルフィッド結合の初′Ｍ濃度に関するチオンＨＲ’ｓ＝８および反応性のジスルフイツドＲ５−８−８−Ｒ４のモル初期濃度は意図される解裂度が得られるように選択される。

反応を操作するには、反応性ジスルフィッドＲ５−８−８−Ｒ４の初期濃度はモル過剰、例えば脂肪族ジスルフィッド結合の相当する濃度より１０００倍まで大きいように選択されるべきである。通常、前記反応性ジスルフィッドの濃度の絶対値は０１〜４００　ｒｎＭの範囲内に選択される。チオン濃度は通常脂肪族ジスルフィッド結合の初期濃度より５〜１００倍太きいように選択される。これに関しては、チオン絶対値は０１〜４００ｍＭの範囲内にあるべきであるが、程よい長さの時間内に所望の解裂度を得るには、１００〜４００　ｍＭのチオン絶対値を選択するのがしばしば適当である。前記した範囲の上限は反応媒体中の反応性ジスルフイソドおよびチオンの溶解度によりすべて決定される。それらの溶解度が高い場合、それらのそれぞれの濃度は前記した限界を超えて拡大でき、より大きい解裂度およびより高い解裂速度の可能性が高くなる。

正確なモル割合および量はＲ５，Ｒ４およびＲ５の選択、および脂肪族ジスルフィット結合の脂肪族構造次第であることは理解されよう。しかしながらこの分野における平均的技術の一つは、反応が前記した一般的ガイドラインの助けによりいかに制御されるべきかをよく確立しりる。

ジスルフイツド結合の解裂は水性溶媒中で遂行されるのが好都合である。種々の試薬（反応性ジスルフイツドＲ５−８−８−Ｒ４およびチオン）の溶解度を改良するために種種の溶媒が添加されうる。当然、添加される溶媒は解裂工程に有害な作用を有してはならない。例えば、チオールＲろ−８−１（、’　Ｒ４−３− ＨおよびＲ５−８−Ｈのそれぞれのチオンへの前記した安定化を損なうべきでない。また生物学的活性を保有することが所望される場合はかかる活性を損なうことも許されるべきでない。

その結果、解裂工程は副反応を助成しない温度で遂行（１５）される。生物学的に活性な物質、例えばシスチンを含有するポリＲプチトに関しては、選択された温度が、もしその活性が保持されるべきならば、ポリハプチトの変性を惹起しないであろうことが必須要件である。この方法により解裂されるジスルフィッド結合の数も温度次第である。

そのジスルフィッド結合が解裂されるべき脂肪族ジスルフイツド結合を含有する物質は解裂が行われる液相中に通常溶解しうるが、脂肪族ジスルフィッド結合を含有する不溶性物質も本発明により解裂されうる。例えば、不溶性の重合体、例えばヒドロキシルおよび／またはアミノ基を含有する不溶性の多孔質重合体□に共有結合した脂肪族ジスルフィッド結合を解裂させることが可能である。かかる不溶性のポリジスルフィッドの例には共有結合された脂肪族ジスルフィッド基が置換されているところのアガロース、エビクロロヒドリンで交叉結合されたデキストラン、ポリ（ヒドロキシメタクリレート）等が包含される。本発明により得られる生成物はそれらの例が以下に掲げられる種々の分野で使用されうる。

導入されたジス及１イツト構造Ｒ１−Ｂ　−Ｂ−およヒＲ２−ｓ　−ｓ−はいずれも脂肪族チオール基に反応性でありそしてそれゆえ解裂生成物をチオールージスルフィッド交換反応によりチオール含有化合物と結合させるのに使用されうる。

かくして得られた生成物はいわゆる共役物である。共役物なる用語は一般に共有により結合された２種類の化合物を意味する。

本発明によりジスルフイツド結合を解裂させた場合に得られる生成物（以下解裂生成物と呼ばれる）から生成され５る共役物の重要な型は分析上指摘されうる化合物が少くとも１個のジスルフイツド結合が解裂された配位子または受体と共役した場合に何が得られるかということである。受体または配位子はここでは相互に生体特異的親和性を有する化合物の対を意味する。かかる対の例には抗原−抗体（ハプテン）、蛋白質Ａ−工ｇＧ　（免疫複合物）、レクチン−炭水化物、チロキシン−ＴＢＧ　、酵素−基質、酵素−補酵素等が包含される。理解されるように、それらの生体特異的活性を保有している配位子または受体の断片もまた配位子または受体と見なされよう。

分析的に指摘されうる化合物への言及は共役物またはそれから遊離されたもののいずれかにおいて検出されうる化合物に関する。かかる化合物の例は酵素的に活性な物質（すなわち酵素、酵素基質、補因子、補基質、補酵素等）および螢光物質、燐光性物質、化学ルミネセンス物質、放射性物質、金属含有化合物等（例えばシャル・アール・エフ（Ｓｃｈａｌｌ　Ｒ，Ｆ、　）代地のｒｃ１ｉｎＣｈｉｍＪ第２７巻第１１５７〜８１頁（１１９８１年）参照）である。

分析的に指摘されうる基を含有する共役物は種々の物質を定量的および定性的に検出するのに使用されうる。

抗体と分析的に指摘されうる化合物との間の共役物は、例えば、対応する天然の抗体または抗原または抗体が対応するハシテンの検定に使用されうる。この点で、検定は哺乳動物から採った液体試料、例えば検定すべき物質が溶解された形態で存在する試料中にて遂行されうる。

ＵＳ−Ａ−６，８１７，８３７号およびＵＳ−Ａ　−４，２３１，９９９号明細書の特許請求の範囲および前記特許の中に技術の状況として記載された種々の異種および同種の方法に対してこの点で詳細な記述がなされうる。前記共役物はまたその共役物が生体特異的親和性を有する、細胞に結合したかまたは細胞小器官に結合した配位子および受体の検定にも使用されうる。前記共役物はまたその共役物が生体特異的親和性を示す細胞結合されたかまたは細胞小器官結合された配位子および受体の検定にも使用されうる。これは、なかんずく、種々の顕微鏡的方法を用いて行われうる。

共役物のもう一つの型は解裂生成物が不溶性担体上のチオール基と反応し５る場合に得られろものである。解裂生成物がジスルフイツド含有受体または配位子から導かれる場合、アフイニテイクロマトグラフイーおよび前記異種検定法のための固定相として特に良く適した共役物が得られうる。

共役物の第三の型は受体が本発明により解裂されそしてチオールを含有する治療上活性な化合物と共役された場合に得られるものである、例えばｇｐ−Ａ−０，０２３，４０１号、ＥｐＬＡ−ｏ、ｏ　１７，５０７号、ＥＰ−Ａ　−０，０２３，７７９号に記載された”と同様の共役物である。もし受体が癌細胞のような特殊な型の細胞（いセ、ゆる標的細胞）に対する抗体である場合、（１８）共役物は咄乳動物に投与された場合その標的細胞と選択的に結合しよう。それゆえ治療上活性な化合物はより効率的である筈である。

生成されうる共役物の他のありうる型のうちでは免疫賦与目的のためのジスルフィツド共役物があげられうる。

かかる共役物は解裂されうるジスルフィッド結合を含有する蛋白質抗原から生成されうる。本発明により結合が解裂されたのに続き、解裂生成物をチオールを含有する溶性のまたは不溶性の担体と反応させる場合に共役物が形成される。

本発明によれば、得られた解裂生成物は共役物を予め形成させることなく直接使用することもできる。例えば、ＥＰ−Ａ−０，０６４，０４０号およびＥＰ−Ａ　−０，０６３，１０９号から、Ｒｊ−８−８−型の非対称の反応性ジスルフィノド構造を含有する治療上活性な化合物はこの構造を有しない相当するしうろことが知られる。不可逆的に化合物の活性を破壊することなく本発明により解裂されうる治療上活性なジスルフイツド化合物は、従って、本発明による新規な方法で治療活性が延長された期間効力がある化合物に変換されうる。

先に、本発明により得られうる治療上活性な化合物について記述がなされた。これら生成物が投与される場合はいつでも、治療上活性な薬量が与えられる。用いられる製剤は場合により医薬上受容されうる担体およびまた場合により適当なアジュバントをも含有し５る乳濁液、溶液、錠剤等の形態をとり５る。共役物は皮下または静脈注射により投与されるのが好ましい。治療上活性な解裂生成物は同じ経路で投与されうるが、しかし前記解裂生成物、ならびに共役物にとって他の経路による投与も可能である。

理解されるように、解裂生成物の場合、構造Ｒｊ−８−８−およびＲ２−８−８ −中にとり込まれたそれぞれの性質それ自体が直接用いられうる。

非対称の反応性ジスルフィット構造を導入するための従来知られた方法に対する本発明による方法により与えられる最大の利点は生物学的に活性なポリジスルフイツド、例えば免疫グロブリン特に抗体のようなシスチン含有ポリペプチドに関して得られる。本発明による解裂法によりそれぞれの分子中の１個のそして同じジスルフイツド結合を解裂させることが可能である。存在する結合の総数の一部分のみが解裂される場合、例えば抗体のような免疫グロブリンにおいて１個、２個または６個の結合が解裂される場合、ポリペプチドの第三構造を従来知られた方法により得られるそれより大きな程度に保持することが可能である。このことはこれらのような場合、解裂生成物は導入された構造の分子中における位置選定に関して特に同種であることを意味する。このことはまた、例えば、すべての抗体の抗原結合部分が同じ方向を・　指して見録良好な免疫吸着剤を生成しうろように、特に同種の共役物゛の形成をも来す。このことはまた他の共役物にもあてはまる。同種性は同じ細胞系列に由来する抗体が解裂および共役される場合、すなわちいわゆるモノクローナル抗体が用いられる場合にさらに増大されうる。

本発明が用いられうる種々の使用法についての前記記述は例示のためにのみ掲げられるのでありそしていがなる様にも本発明の範囲を限定することを意味するものではない。このことは以下に掲げられる例についても真実免疫吸着剤で精製した羊の抗家兎ＩｇＧ抗血清をＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドで交叉結合されたアリルデキストラン〔七フアクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　（登録商標）ｓ−３００ｉ　スウェーデン国つプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）のＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃ！ｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ社から入手〕上でゲル濾過することによりＩｇＧ型の免疫グロブリンを羊から調製した。ＩｇＧ抗体（２８μＭ）を０．２１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０チエタノールを含有する４３ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液中５−の容量において５ｍＭの２，２′−ジピリジルジスルフイツドおよび種々の濃度の２？チオピリドン（第１表、第１欄参照）と２６℃で２４時間保温培養した。反応に続き、反応混合物をｐＨ８，５の０．１　Ｍ燐酸すｌ’Ｊウム緩衝液中でエピクロロヒドリンで交叉結合されたデキストラン〔スウェーデン国、ウプザラのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製のセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　（登録商標）　Ｇ−２５Ｍ：］を含有するカラム上分離し、蛋白フラクションを集めた。２−チオビリドンに解裂され５る基の含量をｒＢｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　Ｊ第１７６巻第７２６〜７６７頁（１９６８年）の記載に従い測定した（第１表第２欄参照）。下記の結果が得られた。

２００　２・００！ヒ）　ＩｇＥのＦｃ−断片（Ｎ、Ｄ、　）を用いて家兎を免疫することによりＩｇ［）種類の家兎−抗ヒ）　−ＩｇＥ抗体を調製したＩｇＥ分子のＦｃ部分のＤＫ２領域に対する抗ＩｇＫ抗体を得イ）ためにＩｇＥの固定されたはプチド断片上に免疫吸着させることにより抗体を精製した（　ｒＡｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＪ第１６巻（１９７１年）（ＡＰ））。ｐＨ４，５の酢酸ナトリウム緩衝液１．０ｒｎｌ中の精製された抗体２．０７＋ｎｇをベゾ／ン（米国ニューシャーシー州ＦｒｅｅｈｏｌｄのＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃ　ｏ　ｒ　ｐ…ｔ　ｉ　ｏ　ｎ社製の名称３．−４．２３　）　５０μ７を用い６７℃で２４時間にわたり解裂させた（　ｒ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ＫｘｐｅｒｉｍｅｎｔａＩＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙｊ　Ｗｅｉｎ　６− ２０〜６−２２　）。

次にｐＨ１１，２の０．１　Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液を用いて溶液のｐＨを８０に調製することによりＲプシンを破壊した（約７５０μμ）。２−チオピリドン（ドイツ連邦共和国ＳｔｅｉｎｈｅｉｍのＥｇａ−Ｃｈｅｍｉｅ社製品）　２４　ｍｑおよび２，２′−ピリジルジスルフイソド（スイス国ＢｕｃｈｓＯＦｌｕｋａ　ＡＧ社製品）２．４ｒｎｙを溶液に加え、次にこれを２６℃で１８時間「端から端まで」回転させた。遠心分離に続き、反応混合物を０．６Ｍ食塩水中の５ｅｐｈａｃｒｙｌ”　Ｓ−３００約２００７を充填したカラムで分離した。ＩｇＧのＦａｂ’断片の分子量に相当する５６０００ｙ１モルに当る分子量を有する主要蛋白質ピークを集め（ｒＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏ−１０ｇｙＪ　Ｗｅｉｎ　６−２０〜６−２２　）そしてＰＭ−１０フィルター上２５ｍ１の濃縮用セル（米国マザチューセツツ州Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ　＋７）Ａｍｊｃｏｎ　Ｃｏｒｐ社製１２型）中Ｎ２気体環境の下に濃縮した。

Ａ２８０　＝　１．０９（１ｃｍセル）を有する濃縮物０５−が得られた。２− チオピリドンに解裂されうる基の含量はジチオトレイトール（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ〕、　００ｍｐａｎ７社製品）を用いる還元に続き３４３　ｎｍでの吸光度検定により１７・ＩＦ’Ｍと測定された。置換度（断片各当量につき解裂されて２−チオピリドンを形成しうる基の当量）は１６であった（　ｒＢｉｏｃｈｅｍ、　、Ｔ、Ｊ第１７３巻第７２６〜７３７頁（１９７８年）参照）。２８０ｎｍでの断片の吸光度をとればＩｇＧのそれＡ↓ ｔＤ＝　１３．８　（１ｍセル）（２６）アガロースゲル〔スウェーデン国つプサラのＰｈａｒｍａｃ　１ａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製セファロース（Ｓｅｐｈ、ａｒｏｓｅ）　（登録商標）６Ｂ〕をプルノクレウルスト（Ｂｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔ）代地によりｒＢｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　ｊ第１３３巻第５７６〜５８４頁（１９７３年）に記載されているようにしてチオ硫酸ナトリウムと共に１＝クロロ−２，６−ニポキシプロ・ξ ノ（ゲル６７当り試薬０４５１ｎｌ）で処理しそしてジチオトレイトールで還元した。

得られるチオールアガロースゲル（アガロース１７当りいて酸化してジスルフイソドーアガロースゲルを形成させた。アガロース濃度は２％（ｗ／ｖ　）　、過酸化水素濃度０．１Ｍそして反応時間は６０分であった。この酸化に続き、アガロースゲルを水および５０係エタノールを添加したｐＨ９，０の００５Ｍ燐酸すｌ−ＩＪウム緩衝液で洗った。次にジスルフイソドゲルを５０％エタノール中ｐＨ９，０で２３℃で撹拌下に２−チオピリドン（１，０Ｍ）および２．２’−ジピリジルジスルフィソド（０，５Ｍ　）と１２０分間反応せしめた。次にこのゲルを５チエタノールおよび水で洗った。生成物を還元的解裂させたのち３４３ｎｍで２−チＣｈｅｍｉｃａ　５ｃａｎｄｉｎａｖｉｃａＪ　Ｂ　２９巻第４７１〜４７４頁（１９７５年））。このものし；アガロース１２当り６３５μ当量の２−チオビリジル構造を含有していた。

キモトリプシノゲンＡ（米国マサチューセツソ州ＢｅｄｆｏｒｄのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃ０ｒｐ社製品）２０〜をｐＨ９，０の１．０Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液０．５　ｍｌ、中に溶解させ、次に１、８６　ｍＭ　２．２’−ジヒ０リジルジスルフィット−１６，３ｍＭ２−チオピリドン４．５　ｍｌを加えた。この溶液を２２．３０および６７℃で８０時間保温培養した。反応混合物を遠心分離したのちｐＨ７，０００，１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中エピクロロヒドリンで交叉結合されたデキストラウン（スウェーデン国ウシザラのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ社製Ｓθｐｈａｄｅｘ［Ｆ］Ｇ−２５Ｍ　）を充填したカラム上脱塩した。

反応の結果はＡ２８０の検定およびジチオトレイトールにより解裂された２−チオピリドンの３４３　ｎｍでの吸光度測定により確立された（　ｒＢｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、Ｊ　第１７３巻第７２３〜７３７頁（１９７８年））。

下記の結果が得られた。

２５例！５ＩｇＧの断片中のジスルフイノト結合の解裂家兎のＩｇＧ〔デンマーク国ＢｉｒｋｅｒｏａのＭｉｌ、ｅＳＳｃａｎｄ〕、ｎａｖｉａ社製品）をｐＨ４，５の０．１　Ｍ酢酸す）　ｌ）つ１３緩衝夜中−セプシン（１：　１００　ｗ／ｗ　）を用いて６７℃で２４時間破砕しブ、二。

反応混合物からＮ、Ｎ’−メチし／ンビスアクリルアミドで交叉結合されたアリルデキストラン［５ｅｐｈａｃｒｙｌ■Ｓ−３００、スウェーデン国つプサラ（Ｕｐｐｅａｌａ）のＰｈａｒｍａｃｊ、ａ　ＦｉｎｅＣ！ｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ社から入手〕を充填したカラノ、　Ｊ：　Ｆ（ａｂつ２断片を分離した（　ｒＨａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｋｘｐｅｒｉｍｏｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏ−１０ｇｙＪ　Ｗｅｉｎ　６−２０〜６−２２　）　ｏ断１４−の濃度はＡ２８０測定によ１係り判定された。Ａ２８ｏ＝１．３８（１αセル）。２４係エタノールおよび２．３　ｍＭの２．２′−ジピリジルジスルフイツド（スイス国ＢｕｃｈｓのＦｌｕｋａ　ＡＧ社製品）および種々の濃度の２−チオピリドンを有するｐＨ８，０の０．１　Ｍ燐酸ナトリウム溶液中のＦ（ａｂ’　）２　−断片２３．３μＭの溶液を２３℃で種々の時間保温培養した。エビクロロヒドリンで交叉結合されたデキストラン〔スウェーデン国つプサラのＰｈａｒｒｎａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製の５ｅｐｈａｄｅｘ”　Ｇ−２５Ｆ　：］の床で脱塩することにより反応を中断させ、蛋白質フラクションを集めそしてその蛋白質含量に関しくＡ２Ｂ［］）および還元的に解裂されうる２−チオ上０リドンの含量（Ａ５４３）に関し分析した（　ｒＢｉ、ｏｃｈｅｍ、Ｊ、」第１７３巻第７２３〜７３７頁（１９７８年））。

置換度（−断片当量当りの２−チオピリジルジスルフイソド構造の当量数）を計算した。

下記の結−果が得られた。

（２６）５．４　２，０７　２．８３　’２，３２　２．６０１０．７　２，１０　２，７６　２，２７　２．４５２１．５　１，８１　２，６６　２，２５　２．４９２−チオピリドン２２７ミリモル、２．２’−ジビリジルジスルフイツド２．２７　ミリモルおよび酸化型グルタチオン（スイス国ＬｕＣｅｒｎｅのＣ！ａｌｂｉｏｃ’ｈｅｍ　ＡＧ社製品）０２６ミリモルを６６％エタノール４５ｍ１中に溶解させ、次に２、０　Ｍ水酸化ナトリウムを添加してｐＨ８，１となした。４０℃で４時間反応させたのち濃酢酸２００μ℃を刃口え、次に溶液を回転蒸発器で蒸発させて部分的に結晶化した溶液４〜５ｍ１！を得た。上澄み液を３０００ｘｙで１０分間遠心分離した。残留する結晶を蒸留水４−で浸出し、次にこの溶液を前記した方法で遠１・分離した。合した遠心分離したｍ　液（７，３ｍｌ　）をベンゼン３−ずつで２回抽出し、次に水相を回転蒸発器中で蒸発乾固させた。結晶をエタノール２ｍｌ、水１−および濃酢酸１００１Ｊの混合物中に溶解させた。溶液６００μ２を薄層プレート（ドイツ連邦共和国ダルムシュタットのＭｅｒｃｋ　ＡＧ社製Ｍｅｒｃｋ　ＤＯ−Ａｌｕｆｏｌｉｅｎシリカゲル４０）上に置き、これをベンゼン／酢酸／エタノール／水（１０係、１０％：６０チ°２０％）を用いて展開した。薄層プレート上のＲｆＯ，３８を有するプレートをかきとり、次にこの粉末を水４　ｍｌで抽出した。この溶液を３０００Ｘｒで１０分間遠心分離しそして蒸発させた。この蒸発工程後に残る結晶をエタノール１０００μ１１水５００μ℃および酢酸５０μλの混合物中に溶解させた。不溶の物質をデカンテーションして除き、次にこの溶液を回転蒸発器で蒸発乾固させた。

生成物な還元的に２−チオピリドンに解裂されうる基の含量に関して（ｒＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、Ｊ第１７６巻第７２３〜７６７頁（１９７８年））およびムーアーシニタインス（Ｍｏｏｒｅ−８ｔｅｉｎｓ　）法によりアミノ酸に関して分析した。

この生成物はシスティン１モル陥り還元的に解裂されうる２−チオピリドン１モルを含有することが判明したつ同じことは生成物の残りのアミノ酸すなわちグルタミン酸およびグリシンにもあてはまった。

生成物を薄層プレート〔ドイツ連邦共和国ダルムシュタソトＯＭｅｒｃｋ　ＡＧ社製Ｍｅｒｃｋ　ＤＯ−Ａ〕、ｕｆｏｌｉｅｎンリカゲルー６０）上、参照としての２−チオピリドン、２．２’−ジビリジルジスルフイツドおよび酸化されたグルタチオンを用（・て分析した。

移動相としてはベンゼン／酢酸／エタノール／水（１０／１０／６０／２０％）が用いられた。クロマトグラフィーに続き、薄層を沃素および二／ヒドリンを用いてそれぞれ発色させた。

（２８）２−チオピリドン　０．７９　沃　素２．２′−ジピリジルジスルフイソド　０．８４　沃　素酸比されたグルタチオン　０．１１　ニンヒドリン２−チオピリジルグルタチオン　０．４６　沃素ニンヒドリンすべての試料それぞれは薄層の展開に続き１個の着色グマ・ケミカル・カン、Ｃニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｏｏｍｐａ、ｎｙ　）社製Ｓｉｇｍａ　３２．１．２３　：］からの］β−ガラクトシダーをピリジルジスルフイツドーアガロースゲル〔スウェーデン国、ウシザラのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃ！ｈｅｍｉｃａｌＳＡＢ社製の活性化されたチオール５ｅｐｈａｒｏｓｅ［Ｆ］４Ｂ〕上共有クロマトグラフィーにより精製した（　ｒＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ’、　Ｊ第１３３９５７３〜５８４頁（１９７３年））。酵素はｐＨ８，０でゲルに吸着されそして２ｒｎｌＡ塩化マグネシウムを含有するｐＨ８，０００゜５Ｍメルカプトエタノールで脱着される。脱着に続き、２ｍＭの塩化マグネシウムを添加したｐＨ８，０の０．２　Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中、エビクロロヒドリンで交叉結合されたデキストラン〔スウェーデン国、ウシザラのＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ社製ＳｅｐｈａｄｅｘｏＧ −２５Ｍ　：］を充填した（２９）　符表昭６０−５０１３１０　（９）カラムで脱塩した。酵素１当量当りチオール基２４当量のチオール置換度を有する酵素２．６６μＭを含有する溶液が得られた。この酵素溶液１．４ｍｌを、チオールージスルフイソド交換反応により共役させるために（ｒＢｉｏｃｈｅｎｎ、Ｊ、ｊ第１７６巻第７２３〜７６７頁（１９７８年））、家兎の抗ヒトエｇＥ抗体（例２参照）のチオピリジルジスルフィソドを含有する断片と混合した。＋４℃で９６時間反応させたのち反応混合物を、０３Ｍの食塩水および０．０２％のナトリウムアジドを添加したｐＨ７４の２ＱｍＭ燐酸す）　ＩＪウム緩衝液中のＮ、Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミドで交叉結合したアリルデキストラン〔スウェーデン国、ウプサラのＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ社製５ｅｐｈａｃｒｙｌ■Ｓ−３００：ｌｌ　１０９−を充填したカラムでクロマトグラフィーした。Ａ２８０　＝　０．０３８を有する６９．４〜５５２ｒｎ１．なる範囲の溶出容量プールを集めた。このプールを、０６Ｍ食塩水、ｏ、１％ヒト血清アルブミン［米国、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ　（１！ｈｅ凪ｃａ］００ｍｐａｎｙ社製のＳｉｇｍａ　Ａ　２３８６　］　、　０．１％のトウイーン２０および００２％のナトリウムアジドを添加したｐＨ７，，４０２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中に４０倍に希釈しガ。次にこの希釈したプールをファデジム（Ｐｈａｄｅｚｙｍ）　（登碌商標）工ｇＥ　ＰＲ工ＳＴ試験器具一式〔スウェーデン国、ウシザラのファルマシアダイアグノスティクス（ＰｈａｒｍａｃｉａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　ＡＢ社製品〕からの構成分を用い試験した。

この試験はＩｇＥ試験について示される教示に従い実施されるが、しかし前記試験器具一式中に包含されるβ−ガ、（３０）ラクトシダーゼー抗ＩｇＥ抗体共役物を希釈されたプールで置換した。前記共役物と同じ緩衝液中に希釈した４１４３０ｕ　Ｘｇ、Ｂ７−を有するＥＪ血清を標準物として使用した。。

ＰｈａｄｅｚｙｍｏＩｇＥ　ＰＲ工ＳＴ試験は参照としＣ操作した。

０５〜８３　ｋＵ／Ｎの領域の工ｇＥ濃度を有するＣ犀杓な＋ｍ　’ｔ？試料を検定すると系列り間にニー：（・′１自　′、らｌ＋’、＝Ｊのつ°ノゾールの場合、試験中に２師＜−１こ・′・野゛、−す＋　’ｌ−、！し　−スマトリックス上への酵ギ活ネ・′・“−′く・／−１つゼ・７二名゛′、。

おいて得られた吸着の半分１７／：ｌ’ｌ−戸・　ノーチオ−２−二トロ安息香酸を用いるＩｇＫ中のジスルフイ５．５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（以下ＤＴＮＢと略記する）の７６　ｍＭ　溶液（ｐＨ８，１の０．１　Ｍ燐酸ナトリウム中）をジチオトレイトール（以下ＤＤＴと略記する）に関して１４ｍＭとなしてＤＴＮＢおよび５−チオ−２−二トロ安息香酸（以下ＴＮＢと略記する）を含有する溶液をその場で生成させる。この反応混合物はＴＮＢに関して２８ｍＭでありそしてＤＴＮＢに関して６２ｍＭであった。ＴＮＢに関して１０．６５　ｍＭでありそしてＤＴＮＢに関して１２ｍＭである溶液を同じ方法で調製した。次にｐＨ８，０の０．１Ｍ燐酸すトリウム緩衝液中の家兎ｘｇａ　Ｃデンマーク国、　ＢｉｒｋｅｒｏｄのＭｉｌｅｓ　５ｃａｎｄｉｎａｖｉａ社製品〕の１．７５−１０−’Ｍ溶液０２−を試薬混合物の０．８　ｍｌ、ずつに添加した。反応混合物をｐ）（（６１）８．０の０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中のエビクロロヒドリンで交叉結合されたデキストラン（スウェーデン国つノサラのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ社製５ｅｐｈ、ａｄｅｘｅ））−２５）を充填したカラム上で種々の時間後に脱塩した。

・ヨフラクションを集め、次いでこれらフラクションの′１質含量およびその中の還元的にＴＮＢに解裂さ１？′Ｌ５る】数を測定した。測定された濃度間の比率を、置換度、　１ｇ０１当量当りＴＮＢに解裂されうる基の当量数）とし１２０　１．０８　４．４１８０　１．３４　４．７３７５　１．７９　’　５．３１９ｘ６０　２．３２　６０下記第６表に従１・種々のｐＨ−値を有する０、　１　Ｍ燐酸ナトリウム中のＣ −ＰＤＥＩ　（ドイツ連邦共和国、シュタイン・・イムのＥｇａ−ｃｈｅｍｉｅ社製品）の３７　ｍＭ溶液中に、Ｃ！　−ＰＤＳ溶液の５ｍＭフラクションを相当するチオン、Ｉ：！−ＴＰの１１０ｎ１に還元するために最終濃度５　ｍＭとなるまでジチオトレイトールを加えた。ジチオトレイト−ルは゛溶液中のジスルフイツドを相当する還元型に定数的に還元する（　ｒＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ第６巻第４８０頁（１９６４年））。蒸留水中の羊の工ｇＣ＋（デンマーク国、ＢｉｒｋｅｒｏｄのＭｉ〕、ｅｓ　５ｃａｎｄｉｎａｖｉａ社製品）の１．４４　ｘ　１０−’Ｍ　溶液０．１　ｍｔ、をこれら試薬溶液０、４　ｍｌずつに添加した。この溶液を２６℃で１８時間培養し、しかるのちｐＨ８，１のＱ、　４　Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中エヒ０クロロヒドリンで交叉結合されたデキストラン（スウェーデン国１．ウプサラのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌｓＡＢ社製の５ｅｐｈａｄｅｘ”　Ｇ−２５Ｆｉｎｓ　）を充彎したカラム上で脱塩し、蛋白質フラクションを集めた。フラクションの蛋白質含量およびその中の還元的にＣ−ＴＰに解裂されうる基の量を次に分光測光的に測定し、そして次に置換度の値を計算した。下記モル吸光率を用いた。

Ｃ−ＴＰについてＩＪ４２＝９４００ ■ｇＧについてＥ２ａｏ＝２２１０００導入されたＣ−ＴＰ各当量につき馳ＧのＥ２８０にに２８０−６０００を３添加した。

第６表９、８４．１２図面の簡単な説明；１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃｉ、４　識別記号　庁内整理番号ス・イングヴ工　（番地なし）特則３６０−５０１３１０　（１１）

Claims

【特許請求の範囲】１　解裂される各−５−ｓ−結合が式−８−８−ＲｊおよびＲ２−８−８−（式中Ｒ１およびＲ２は同じかまたは異なっておりそしてそれぞれ有機残基である）を有する２個の）反応性の基に実質−１−変換される少くとも１個のジスルフイツド結合−５−Ｓ−（ここで硫黄原子のそれぞれはかかるジスルフイツド結合少くとも１個を含有する有機物質中のそのそれぞれの脂肪族炭素原子に直接共有結合している）を解裂させるに当り、前記有機物質を化合物Ｒ３−５−８−Ｒ４と互変異性形態Ｒ５−８−ＨおよびＨＲ’５＝Ｓにおいてまたは相当する共鳴安定された陰イオン形態（これら化合物中残基Ｒ５、Ｒ４およびＲ５は１）すべてが相異するか、２個が等しいかまたはすべてが等しい有機残基であり、そしてｉｉ　）　ａ、　）　化合物Ｒ３−８−８−Ｒ４およびＲ５−８−Ｈ中の前記硫黄原子のそれぞれが芳香環中の炭素原子に結合しておりそしてｂ）化合物Ｒ３−８−６−Ｒ４の反応により放出される化合物Ｒ３−５−ＨまたはＲ４−８−Ｈおよび化合物Ｒ５−８−Ｈが一般に行われる反応条件下において実質上それらのそれぞれの互変異性形態ＨＲ’３＝Ｓ　、ＨＲ’４＝８およびＨＲ’５＝８または相当する共鳴安定された陰イオン形態で存在すること、およびＲ１とＲ２はＲ３，Ｒ４およびＲ５からなる群に属する残基をそれぞれ構成することと定義される）において存在しうる化合物との混合物と反応させることにより前記した少くとも１個の結合を解裂させることを特徴とする方法。２　有機物質がポＩＪ　Ｒプチドであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。３　ポリＲプチドが免疫グロブリンまたはその断片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法っ４　免疫グロブリンが抗体またはその抗体活性断片であることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法っ５Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒｓであることを特徴とする請求の範囲第１または２項記載の方法。６　有機物質を化合物Ｒ３−８−８−Ｒ４と互変異性形態Ｒ５−８−ＨおよびＨＲ’５＝８または相当する共鳴安定された陰イオン形態で存在しうる化合物（ここで−ヒ記化合物中残基Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は１）それらすべてが相異なるか、２個が同一であるかまたはすべてが同一である有機残基であり、そして１ｉ）ａ）　化合物Ｒ３−８−８−Ｒ４およびＲ５−８ −Ｈにおいて、前記硫黄原子それぞれは芳香環中の炭素原子に結合しており、そしてｂ）化合物Ｒ３−３−６−Ｒ４の反応により放出される化合物Ｒ３−８−ＨおよびＲ４−８−Ｈおよび化合物Ｒ５−８−Ｈが一般に行われる解裂条件下に実質上それらのそれぞれの互変異性形態ＨＲ′ろ−８、ＨＲ’４　＝ＳおよびＨＲ’５＝Ｓまたは相当する共鳴安定された陰イオン形態で存在すること、およびＲ１とＲ２は％　Ｒ４およびＲ５からなる群に属する残基をそれぞれ構成するものと定義される）との混合物と反応させることにより少くとも１個のジスルフイツド結合−５−Ｓ−（ここで硫黄原子のそれぞれはかかるジスルフイツド結合の少くとも１個を含有する有機物質中のそれぞれの脂肪族炭素原子に直接共有結合している）を解裂させることにより得られることを特徴とする、脂肪族炭素原子に共有結合した基−８−８−Ｒ１および／またはＲ２−８−８−（式中Ｒ１およびＲ２は同一であるかまたは相Ｕなっておりそしてそれぞれ有機残基である）の少（とも１個を示す有機化合物。